Molekularna Genetika Skripta by Jernej[1]

Molekularna

genetika

~ 2 ~ Aedificator fecit AD MMII.

KKaazzaalloo

Nukleinske kisline ...................................................................................................................... 4 Struktura nukleinskih kislin ................................................................................................... 4

Dodatno zvitje .................................................................................................................... 6 Sekundarna struktura ssRNA ............................................................................................. 7 Genom ................................................................................................................................ 8

Gen ............................................................................................................................................. 9 Razlike v organizaciji prokariontskih in evkariontskih genov............................................. 10 Strukura evkariontskih genov............................................................................................... 11

Pol I geni .......................................................................................................................... 11 Pol II geni ......................................................................................................................... 12 Pol III geni........................................................................................................................ 13 Mitohondrijski geni .......................................................................................................... 13 Kloroplastni geni .............................................................................................................. 14

Podvojevanje DNA in RNA................................................................................................. 15 Dvosmerna θ-replikacija .................................................................................................. 16 Enosmerna θ-replikacija................................................................................................... 16 Enosmerna D-replikacija.................................................................................................. 18 Kotaleči se krog (rolling circle) ....................................................................................... 19 Dvosmerna θ-replikacija s kotalečim se krogom ............................................................. 20 Vezava proteinov.............................................................................................................. 20 Dvosmerno linearno podvojevanje................................................................................... 20

Potek replikacije dsDNA...................................................................................................... 21 Replikacija pri E. coli....................................................................................................... 22

Mutacije in popravljalni mehanizmi ........................................................................................ 25 Popravljanje napak ............................................................................................................... 26

Direktno popravljanje....................................................................................................... 26 Izrezovalno popravljanje .................................................................................................. 27

Uvr sistem .................................................................................................................... 27 Glikozilazni sistem....................................................................................................... 27

Popravljanje napačnega parjenja...................................................................................... 27 Prednostno popravljanje............................................................................................... 28 Dam-popravljanje......................................................................................................... 28

Tolerančni sistemi ............................................................................................................ 28 Rekombinacijsko popravljanje..................................................................................... 28

Rekombinacija.......................................................................................................................... 30 Homologna rekombinacija ................................................................................................... 30

Modeli homologne rekombinacije ................................................................................... 30 Bakterijska homologna rekombinacija............................................................................. 31 Genska konverzija ............................................................................................................ 33

Mestno-specifična rekombinacija ........................................................................................ 33 Transpozicija ........................................................................................................................ 34

Transpozicij je več vrst .................................................................................................... 35 Insercijske sekvence (IS).................................................................................................. 36 Sestavljeni Tn................................................................................................................... 36 Evkariontski Tn ................................................................................................................ 37 Retrotranspozoni (retropozoni) ........................................................................................ 38

Sinteza RNA............................................................................................................................. 40 Zgradba RNA-polimeraze pri E. coli ................................................................................... 41

Zgradba bakterijskega promotorja ....................................................................................... 42 Terminacija........................................................................................................................... 42

Regulacija genske ekspresije.................................................................................................... 44 O delovanju represorjev in aktivatorjev ............................................................................... 44 Regulacija na ravni transkripcije.......................................................................................... 46

Lac operon........................................................................................................................ 46 Ara operon........................................................................................................................ 47 Regulacija SOS genov...................................................................................................... 48 Regulacija z izbiro σ-podenote ........................................................................................ 48 Genetska polarnost ........................................................................................................... 48 Antiterminacija................................................................................................................. 49

Regulacija z antiterminacijskimi faktorji ..................................................................... 49 Regulacija s sekundarno strukturo mRNA - atenuacija ............................................... 50

Regulacija na ravni transkripcije in translacije .................................................................... 52 Gvanozin tetrafosfat in gvanozin pentafosfat................................................................... 52

Regulacija na ravni stabilnosti in procesiranja mRNA ........................................................ 53 Stabilnost mRNA ............................................................................................................. 53 Procesiranje mRNA.......................................................................................................... 53

Regulacija na ravni translacije ............................................................................................. 54 Ribosomska regulacija ..................................................................................................... 54 Regulacija s translacijskimi represorji ............................................................................. 54 Avtogena regulacija.......................................................................................................... 54 Regulacija s sekundarno strukturo mRNA....................................................................... 55 Avtogena regulacija sinteze RF2...................................................................................... 55 Regulacija s komplementarno RNA................................................................................. 56

Regulacija s proteolizo ......................................................................................................... 57 Translacija ................................................................................................................................ 58

Struktura tRNA .................................................................................................................... 58 Struktura ribosomov............................................................................................................. 60 Genski kod............................................................................................................................ 62 Potek translacije ................................................................................................................... 63

Iniciacija ........................................................................................................................... 63 Elongacija......................................................................................................................... 64 Terminacija....................................................................................................................... 64

Zgradba prokariontske in evkariontske mRNA ................................................................... 65 Supresije ................................................................................................................................... 66

Intragenska supresija ............................................................................................................ 66 Intergenske (ekstragenske) supresije.................................................................................... 66 Supresorske tRNA................................................................................................................ 66

Struktura genoma pri višjih evkariontih................................................................................... 68 Zgradba kromosomov .......................................................................................................... 69 Zgradba nukleosomov .......................................................................................................... 72

Slika 2: Struktura DNA. Prikazane so tudi vodikove vezi, ki se lahko tvorijo med posameznimi bazami.

Slika 1: Propeller-twist

NNuukklleeiinnsskkee kkiissll iinnee

SSStttrrruuukkktttuuurrraaa nnnuuukkkllleeeiiinnnssskkkiiihhh kkkiiisssllliiinnn Nukleinske kisline so lahko

glede na svojo zgradbo bodisi ribonukleinske bodisi deoksiribonukleinske. Izraz izhaja iz latinskega izraza za jedro, nucleus - grški prevod istega izraza je karion (od tu izraz prokarionti in evkarionti), kjer se oba tipa nukleinskih kislin nahajata. Nekateri tipi nukleinskih kislin se lahko nahajajo tudi izven celičnega jedra.

DNA je pri vseh organizmih razen RNA virusov glavna nosilka dednih informacij.

Po zgradbi so nukleinske kisline

linearni polimeri nukleotidov, ki so med sabo povezani s

fosfodiestrskimi vezmi. Nukleotid je sestavljen iz fosfatne skupine, na katero je vezan ribozni sladkor (riboza ali deoksiriboza). Na ribozni sladkor je lahko vezana ena od petih organskih baz: adenin, timin, citozin, gvanin in uracil. Pri pisanju se deoksiribonukleotide označi z dNTP, ribonukleotide pa kot rNTP. V RNA je namesto timina uracil. Nukleozid je sestavljen samo iz organske baze in riboznega sladkorja. Dušikova baza se lahko veže na sladkor na mesto 1', preko dušika na mestu N1 (piridinska baza - Py) ali N9 (purinska baza - Pu). Purinski bazi sta: adenin (A), gvanin (G). Pirimidinske baze so: citozin (C), timin (T), uracil (U). Dušikove baze so lahko modificirane, najpogostejše modifikacije so metilacije adenina pri bakterijah v N6-metil-dA in citozina, ki je prisotna tako pri prokariontih kot pri evkariontih. Citozin se modificira v reakciji do 5-metil-dC. Modificirani nukleotidi so zelo pogosti v tRNA. Dušikove baze v DNA ne ležijo v isti ravnini, ampak so rahlo obrnjene ena glede na drugo; ta

pojav se imenuje propeller twist (12° pri parih A-T in 7° pri parih G-C).

Nukleotidi so med sabo povezani s fosfodiestrskimi vezmi, ki se tvorijo med hidroksilno skupino na 3'-mestu sladkorja prvega nukleotida in fosfatno skupino na 5'-mestu naslednjega sladkorja. Zaporedje nukleotidov se zato vedno podaja od 5'-konca do 3'-konca, torej tako, kot poteka sinteza

vodilne verige pri replikaciji DNA..

Pri fizioloških pogojih in pH so nukleinske kisline polianioni zaradi negativnega naboja fosfatnih skupin. Negativen naboj v raztopini nevtralizirajo kovinski ioni (najpogosteje Mg2+), v celicah so to bazični proteini - histoni.

DNA v celicah je običajno dvoverižna - ds (double stranded), redkeje enoverižna ss (single stranded); v zadnjem primeru jo stabilizirajo SSB-proteini (single-strand binding proteini), o katerih bo več govora kasneje. RNA v celicah je praviloma v enoverižni obliki, krajši odseki so lahko v dvoverižni obliki, kar je posledica parjenja komplementarnih baz.

Struktura DNA je bila odkrita leta 1953, ko sta Watson in Crick na podlagi že prej poznanih Chargaffovih pravil (število A=T in C=G), ugotovljenih prednostnih keto tavtomernih oblik baz in dejstva, da ima DNA strukturo heliksa (difrakcija rentgenskih žarkov, Franklin in Wilkins), predpostavila, da ima DNA strukturo dvojne vijačnice (dvojnega heliksa).

Struktura DNA je stabilna zaradi velikega števila vodikovih vezi, ki se lahko tvorijo med organskimi bazami: med adeninom in timinom se lahko tvorita dve, med gvaninom in citozinom pa tri. Zanimivo je dejstvo, da je število parov G-C zelo veliko pri hipertermofilnih bakterijah. Ker je vodikovih vezi več, je taka DNA bolj odporna na višjo temperaturo. S spreminjanjem odstotka parov G-C je moč tudi spreminjati tališče začetnikov (primerjev) pri PCR reakciji, kar je pomembno, ker je s tem mogoče povsem prilagoditi začetnike uporabljeni polimerazi.

Kljub vsemu pa struktura DNA ni statična. V odvisnosti od okolja (pH, koncentracija ionov, prisotnost vode, proteinov) in zaporedja nukleotidov lahko DNA zavzame različne konformacije, ki so opisane v Tabeli 1.

Slika 3: Različne oblike DNA. Njihove lastnosti so v Tabeli 1.

B-DNA A-DNA Z-DNA heliks desni desni levi oblika dolga, tanka kratka, široka podaljšana, tanka dvig na navoj v nm 3,4 2,8 4,5 premer v nm 1,9 2,3 1,8 število bp/zavoj 10,4 11 12 orientacija glikozidne vezi anti anti anti pri Py, sin pri Pu Tabela 1: Lastnosti najpogostejših tipov DNA

B-oblika predstavlja idealno strukturo običajne DNA. Dejanska struktura je odvisna od okolja in zaporedja nukleotidov. RNA B-oblike ne more tvoriti zaradi steričnih ovir, ki jih predstavlja hidroksilna skupina na 2'-mestu na riboznem sladkorju, tvori pa lahko A-obliko. Z-DNA je bila opažena samo in vitro pri visokih koncentracijah soli in pri zaporedjih (Pu-Py)n, v organizmih je verjetno zelo redka. In vitro so bile odkrite še druge oblike (C, D, E).

DNA v raztopini je dinamična, saj se zvija, razteza, upogiba.

Dodatno zvitje

DNA v človeških celicah je dolga približno 1,8 metra. V celico se lahko pakira samo tako, da se dodatno zvije. Dodatno zvitje je bilo opaženo praktično pri vseh organizmih. Do njega pride tako, da se DNA navije okoli svoje osi. DNA v organizmih je običajno negativno dodatno zvita.

Dodatno zvitje omogočajo topoizomeraze, ki lahko začasno cepijo bodisi eno bodisi obe verigi DNA:

- topoizomeraze I - začasno prekinejo eno verigo DNA → odvija DNA

- topoizomeraze II - giraze - začasno prekinejo obe verigi DNA → zvija DNA

Slika 5: DNA v E. coli

Slika 4: Človeška topoizomeraza I v kompleksu z DNA.

Sekundarna struktura ssRNA

Določeni deli RNA se lahko med sabo komplementirajo in tvorijo daljše ali krajše dvoverižne odseke. Gibbsova prosta energija za to reakcijo je negativna.

Pri nastanku teh struktur so po padajoči jakosti interakcije udeleženi pari: GC > AU (~ AT) > GU.

Poleg heliksa lahko RNA tvori še elemente sekundarne strukture:

- steblo (stem) v dvoverižni obliki

- zanke: proste, končne, notranje, razvejitvene

- izbokline

- lasnice (hairpin)

RNA lahko zavzame tudi terciarno strukturo, ki je prisotna v tRNA, kjer je sekundarna struktura v obliki lista detelje (cloverleaf), terciarna pa v obliki črke L. Določeni deli tRNA imajo konstantno sestavo, drugi deli se močno spreminjajo od ene tRNA do druge.

Slika 6: Sekundarna struktura tRNA.Določeni deli tRNA imajo konstantno sestavo (invariant), spet drugi se spreminjajo(semi-invariant) ali so celo odsotni (absent), kar lepo sledi iz slike.

Obstaja več različnih vrst genoma:

- nDNA: genom, ki se nahaja v celičnem jedru - mtDNA: genom mitohondrijev - ctDNA: genom kloroplastov - dsDNA: genom bakterij - ss, ds DNA/RNA: genom virusov

Oblika genoma in njegova velikost sta v neposredni zvezi s stopnjo evolucijskega razvoja posameznega organizma in njegovim načinom življenja. Kar sledi v naslednji tabeli, je prikaz velikosti in tipov genomov pri nekaterih organizmih.

tip genoma organizem število bp/nt število genov oblika genoma

krožna ssRNA viroidi 359 0 genom je v obliki palčke, rastlinski paraziti; PSTVd

STNV 1300 1 1 protein kapside; satelitski virus rabi pomoč helper virusa

TMV 6400 4 pri TMV je bilo ugotovljeno, da lahko virusi kristalizirajo ssRNA

virus gripe 13500 12 linearna molekula, podvržena mutacijam; genom fragmentiran

dsRNA reovirus 23000 22 linearen, a fragmentiran parvovirus 5000 5 linearen ssDNA

ΦX174 53878 11 krožen; prvega posekvenirali bakteriofag λ 48502 60 linearen, pri replikaciji ciklizira

SV40 5226 6 krožen dsDNA vakcinia

virus 192000 300 linearen; verigi med sabo kovalentno povezani

mikoplazme < 106 500 najmanjše glive bakterije $ 107 3000 E. coli

nevretenčarji # 108 15000 morska vetrnica sesalci 3 × 109 > 25000 človek: 3,3 × 109

rastline < 1011 < 50000 C. sativa

Slika 7: Struktura PSTVd viroida, ki lahko obstaja v hudi (severe) ali mili (mild) obliki, ki se med sabo razlikujeta v mutacijah na treh mestih, ki so označena. Molekula viroida je krožna, vendar daje zaradi mnogih vodikovih vezi vtis, da je linearna.

Tabela 2: Genomi se razlikujejo tako po tipu nukleinske kisline, njeni dolžini in številu genov, ki jih le-ta kodira. Možne so tudi razlike v organizaciji genomov.

GGeenn

Gen je osnovna enota dednosti, ki vsebuje informacijo za določeno polipeptidno verigo ali RNA.

Gen je funkcionalna enota kodirajoče ali nekodirajoče regije. Podoben izraz za gen je cistron, vendar se nanaša na protein. Cistron je mogoče dobiti s komplementacijskim testom.

Geni se prepisujejo v različne tipe RNA, ki se nato lahko prevedejo v proteine. Mogoče je tudi, da se RNA z reverzno transkriptazo prevede nazaj v DNA. To je centralna dogma molekularne biologije.

Slika 8: S cis/trans komplementacijskim testom se ugotavlja, kako relativna konfiguracija vpliva na ekspresijo. Pri dvojnih heterozigotih se dve mutaciji na istem genu pokažeta, če sta gena v trans konfiguraciji. Če sta v cis konfiguraciji, se mutacija ne pokaže.

Slika 9: Shematski prikaz centralne dogme molekularne biologije

RRRaaazzzllliiikkkeee vvv ooorrrgggaaannniiizzzaaaccciiijjjiii ppprrroookkkaaarrriiiooonnntttssskkkiiihhh iiinnn eeevvvkkkaaarrriiiooonnntttssskkkiiihhh gggeeennnooovvv

Ne samo, da se prokariontska celica razlikuje od evkariontske v prisotnih celičnih strukturah, ampak se ta razlika kaže tudi v organizaciji genoma pri obeh tipih celic.

Prokariontski geni so večinoma policistronski, kar pomeni, da RNA-prepis vsebuje informacijo za več proteinov/polipeptidnih verig. Pri bakterijah tak policistronski gen predstavlja operon. Operon je enota bakterijske genske ekspresije, katere prepis se regulira in vsebuje tako kontrolne kot strukturne elemente, ki jih prepoznava regulatorni protein. Geni pri prokariontih so brez intronov, zaradi česar je mogoče slediti zaporedju aminokislin v nukleotidih na DNA. Pri arhejah so prisotni introni v rRNA in tRNA. Pogosto se zgodi, da je posamezen gen prisoten v samo eni kopiji na genom; izjema so rRNA geni. Medgenske regije v takem genomu so kratke, dolžine 10 bp, medtem ko so regije operonov med sabo ločene s 50-200 bp. Geni se velikokrat prekrivajo. Regulatorne regije so blizu gena in so enostavne. Ker je genom majhen, je moč sklepati, da se velika večina informacije prepiše v RNA.

Bakterijske gene prepisuje samo ena RNA polimeraza.

Genomi evkariontov so bolj kompleksni. Njihova kompleksnost je povezana z razvojem celičnega jedra in tkiv. Geni so večinoma monocistronski z introni. Prednost intronov je v tem, da njihov različen izrez omogoča, da se iz enega gena sintetizira več različnih produktov, npr. pri nastajanju protiteles, sintezi steroidnih hormonov. Proces izrezovanja intronov se imenuje splicing. Regulacija genske ekspresije je zapletena in vključuje še mnoge dodatne molekule, ojačevalna zaporedja (enhancerje), ipd.

Zaradi enostavnosti prokariontskih genov se bo nadaljni pregled osredotočil na gene evkariontov.

Slika 10: Transkripcija rRNA genov. Jasno je viden začetek transkripcije in DNA matrica.

SSStttrrruuukkkuuurrraaa eeevvvkkkaaarrriiiooonnntttssskkkiiihhh gggeeennnooovvv Glavni kriterij za razdelitev evkariontskih genov je njihovo nahajanje znotraj celice:

- jedrni geni (n) se nahajajo v celičnem jedru

- mitohondrijski geni (mt)

- kloroplastni (ct)

Ti geni se prepisujejo z različnimi RNA-polimerazami. Pri evkariontih gene prepisujejo tri jedrne RNA-polimeraze, ena mitohondrijska in ena ali dve klorpoplastni.

a) Struktura bakterijskih RNA-polimeraz: - pri fagu T7: polipeptidna veriga z maso 98 kDa, ki zadostuje za osnovno polimerazno funkcijo

in je petkrat bolj učinkovita od bakterijske.

- pri E. coli: pet podenot (α2ββ'σ) z maso okoli 480 kDa.

b) Evkarionti:

Gene pri evkariontih prepisujejo tri RNA-polimeraze (Pol I, II, III). Vsaka je sestavljena iz desetih do dvanajstih podenot. Masa celotnega enicma je približno 500 kDa. Nekatere podenote so skupne vsem trem encimom, druge so specifične. Encimi prepoznavajo različne promotorje in operatorje, na njihovo delovanje vplivajo različni regulacijski faktorji, kar v končni fazi poveča ali zmanjša ekspresijo določenega gena.

Pol I geni

DNA-polimeraza I (Pol I) prepisuje rRNA gene. Prepisovanje rRNA genov poteka v jedrcu (nucleolus); območje genov, znotraj katerega se izoblikuje jedrce, se imenuje nukleolarni organizator. Gen je sestavljen iz 18S-5,8S-28S rRNA. Geni so večinoma v večih skupinah, ki imajo notranjo tandemsko ureditev. Med posameznimi odseki rRNA so regije, ki se izrežejo. Tako nastanejo snoRNP (small nucleolar ribonuclear particle).

Slika 11: Shema tandema - transkripcijske enote znotraj grozda (clustra) rRNA genov. Pred in znotraj gena so spacerji, ki se izrežejo in iz njih nastanejo snoRNP.

Promotorske regije med posameznimi geni so slabo ohranjene. Med tandemi so intergenske regije z osnovnim promotorjem, pred katerim se nahaja vmesni promotor in enhancer.

Različne rRNA (razen 5S) se prepišejo v obliki skupnega prekurzorja (45S), ki je fosforiliran na 5'-koncu (5'-ppp). Procesiranje RNA poteka v jedrcu. Introni se lahko izrežejo tudi samostojno - brez encimov. Tako je bilo ugotovljeno, da imajo nekatere RNA tudi določeno katalitično aktivnost. Take RNA se imenujejo ribocimi in naj bi po nekaterih teorijah predstavljale prve encime. Dejansko se izkaže, da je za delovanje ribosoma dovolj samo rRNA, ki ga sestavlja.

Pol II geni

RNA-polimeraza II (Pol II) prepisuje mRNA in večino snRNA (small nuclear RNA).

Posebnost Pol II je velika podenota (M = 230 kDa), katere C-terminal vsebuje ponovitve heptapeptida YSPTSPS (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser), pri sesalcih se to zaporedje ponovi kar 52×. Fosforilacija heptapeptida je znak za začetek prepisovanja. Za svoje delovanje potrebuje encim še več splošnih faktorjev prepisa (GTF) in še okoli deset drugih proteinov (TFIIX, X=A, B, C, ...) TFIIH je recimo faktor za fosforilacijo heptapeptida na C-terminalnem koncu.

Geni, ki jih prepisuje Pol II navadno vsebujejo introne, katerih dolžina in število so lahko različni. Promotorske sekvence so večinoma kratke in se nahajajo pred kodirajočo regijo in vsebujejo sekvence za vezavo različnih transkripcijskih faktorjev. Osnovne komponente promotorja so tako:

- TATA zaporedje na mestu -25 (pri bakterijah na -10)

- zaporedje CAAT

- GC-oktamerno zaporedje

- GRE, CRE (Gene Response Element, cAMP Response Element) so regulatorni elementi, na katere se vežejo DNA-vezavni elementi

- AP1, AP2 so ojačevalna zaporedja, ki so pred ALI za genom in delujejo v obeh orientacijah (ni pomembno ali je npr. ACCCCGG ali GGCCCCA)

- cis regulacijski elementi se prepišejo/delujejo iz iste verige DNA, trans se prepišejo/delujejo iz druge verige DNA

Slika 12: Struktura promotorja. Razdalja med elementi AP1/AP2 in GRE/CRE je lahko tudi več kb.

Izkaže se, da ima vsak gen svoje značilnosti: promotor, enhancer, ipd.

Prepis se začne približno 25 nt za TATA sekvenco. Prepisovanje poteka preko nukleosoma. Introni se prepišejo in kasneje natančno izrežejo. Po prepisu pride do modifikacije 3'- in 5'-konca (3':poliA, 5': ppp, 7'-Me-G). Iniciatorska regija na mRNA ima naslednjo obliko: Py2CA1+Py5.

Slika 13: Modifikacija 3'-konca mRNA in nastanek čepice (cap).

Slika 14: Genska mapa živalskega mitohondrija. Puščice označujejo smer prepisa. Izkaže se, da se samo gen za citokrom b prepisuje v obratni smeri od vseh.

Pol III geni

RNA-polimeraza III (Pol III) prepisuje gene za tRNA, 5S rRNA in nekatere druge manjše rRNA. Geni za tRNA vsebujejo majhen intron (en nukleotid) na 3'-koncu in so v večih skupinah, ki so razporejene po genomu. V vsaki skupini so različne vrste tRNA, od 10 do več kot 100 genov za vsako vrsto (pri človeku več skupin, skupno 1300 genov). Geni za 5S rRNA so tandemsko urejeni v eni (človek, 200 genov) ali večih skupinah. Promotorji so večinoma sredi kodirajoče regije (interni), pred geni so regulatorne regije. Prepis je 5'-ppp. Intron na pre-tRNA se izreže na poseben način, signal zanj dajejo eksoni.

Mitohondrijski geni živali rastline

15 – 20 kb pri nižjih organizmih introni zgradba 200 – 250 kb

nekateri geni z introni na vsaki verigi po 1 promotor

regulacija večinoma post-translacijska

regulatorna regija več promotorjev

mtRNA-polimeraza monomer; podoben fagni T7

prepis policistronski mRNA ima poliA rep

prepis

mtRNA-polimeraza slabo poznana; tudi monomer

večinoma monocistronski mRNA nima poliA repa

posebna genska koda: UGA → Trp, sicer stop

Tabela 3: Razlika v organizaciji mitohondrijskega genoma živali in rastlin

Pri živalih se promotorja za težko (H) in lahko (L) verigo nahajata na nasprotnih verigah: oriL leži na H-verigi, oriH pa na L-verigi. Na območju D-zanke ni nobenega gena.

Mitohondrijski genom vretenčarjev kodira: 13 proteinov, 12S in 16S rRNA in 22 tRNA. Genom mitohondrija je bil verjetno v začetku večji, vendar se je tekom evolucije del informacije preselil v okvir jedrne DNA.

Kloroplastni geni

Genom kloroplasta je velik 120 – 150 kb in vsebuje približno 120 genov, od katerih imajo nekateri introne. Promotorske regije so tako podobne tistim v E. coli, da je mogoče doseči ekspresijo kloroplastnih genov v celicah E. coli. RNA-polimeraza (lahko sta tudi dve) je sestavljena iz večih podenot in je po zgradbi podobna bakterijski. Geni se večinoma prepisujejo policistronsko. Kloroplastni geni kodirajo 4 rRNA, 30 tRNA in približno petdeset proteinov. Podrobna vsebina sledi iz Tabele 4.

Mitohondrijski in kloroplastni genomi spadajo med t.i. subgenome, ki niso vezani na celično jedro.

Tabela 4: Produkti kloroplastnih genov. Za precej genov še ni ugotovljeno, kaj kodirajo.

PPPooodddvvvooojjjeeevvvaaannnjjjeee DDDNNNAAA iiinnn RRRNNNAAA Pred vsako celično delitvijo se mora genom enkrat natančno podvojiti. Podvojevanje DNA torej

pripravi celico na naslednjo delitev. Dokler se DNA podvaja, do celične delitve ne more priti.

V grobem je celični cikel možno razdeliti na dva dela:

- M-faza - delitev celice

- interfaza - večina časa:

faza trajanje v urah DNA G1 6 - 12 2n S 6 - 8 2n → 4n

G2 3 - 4 4n Tabela 5: Okvirno trajanje posameznih faz celičnega cikla (G - gap, S - synthesis). 2n je diploiden genom. 4n je podvojeni diploidni genom.

Nekatere celice (npr. eritrociti) so v G0 fazi, ko se celica ne deli, ampak miruje.

Replikon je enota DNA, ki se lahko samostojno podvojuje, ker vsebuje mesto začetka podvojevanja (ori - origin ali ARS - autonomously replicating sequence), njegova splošna značilnost je veliko število AT parov. Replikon vsebuje tudi mesto konca replikacije. Prokarionti imajo samo en replikon, pri evkariontih je to število mnogo večje, N × 102 - N × 104. Pri replikaciji največkrat nastane ena kopija izvirne DNA (kromosomi evkariontov in prokariontov), nastane lahko tudi več kopij, kar velja za plazmide, mtDNA in ctDNA.

Pri replikaciji nastanejo replikacijske vilice. To je mesto, kjer pride do začetka replikacije z razmikom obeh verig DNA. Replikacija je glede na smer lahko enosmerna ali dvosmerna. Pod elektronskim mikroskopom se vidi replikacijsko oko, pri krožni DNA pride do nastanka θ-strukture.

Replikacija DNA je semikonzervativna. Dokaz za to je gojenje bakterij na gojišču, ki je bogato z 15N (težkim dušikom). Pri izolaciji in centrifugiranju DNA teh bakterij nastane ena proga, ki ustreza DNA,

Slika 15: Prikaz problemov, ki se pojavijo pri replikaciji. Poleg težav, ki jih prinaša sinteza verige v smeri 3'-5', je tu še problem linearnih replikonov, kjer se mora encim še pravočasno ustaviti. Tretji problem so krožni genomi, kjer mora replikacijski sistem ugotoviti, kje naj ustavi replikacijo.

ki ima v bazah 15N. Če del teh bakterij preselimo na gojišče z “normalnim” dušikom, 14N, in čez čas izoliramo DNA bakterij, bomo dobili eno progo, ki ustreza DNA, ki ima v eni verigi 14N in v drugi 15N. V drugi generaciji bosta progi dve: prva ustreza DNA z 14N, druga pa DNA, ki ima v eni verigi 15N in v drugi 14N. Tudi pri naslednjih generacijah sta vedno prisotni dve progi. Spreminja se samo razmerje med obema tipoma DNA.

a) Podvojevanje RNA:

Krožna ssRNA viroidov naj bi se vsaj delno podvajala po principu kotalečega se kolesa.

RNA virusi imajo povečini njim lastne replikaze, izjema so retrovirusi, ki se podvajajo preko dsDNA intermediata.

b) Podvojevanje DNA

DNA virusi pogosto uporabljajo celične DNA-polimeraze (izjema sta faga T4, T7).

Pri podvojevanju DNA naletimo na dva zanimiva problema. Če je DNA recimo krožna, je vprašanje, kako naj DNA-polimeraza ugotovi, kje naj konča podvojevanje. Pri linearnih replikonih je ta problem replikacija njihovih koncev, kar se rešuje s telomerazami. Drugi problem pri replikaciji je podvojevanje verige, ki teče v smeri od 5' proti 3'. Sinteza te verige namreč teče v smeri 3' proti 5'.

Dvosmerna θ-replikacija

Tako se podvojuje genom E. coli, ki je prikazan na Sliki 16. Mesto začetka replikacije se imenuje oriC in je veliko 245 bp. Replikacija se ustavi na ter sekvencah, ki so dolge približno 23 bp. Če zaradi takšnega ali drugačnega razloga ena od DNA-polimeraz “pohiti”, se njeno gibanje na ter sekvencah upočasni; zdi se, kot bi encim “jecljal”. Hitrost replikacije je 300 nt/s (pri bakterijah). Na podoben način poteka replikacija nekaterih plazmidov.

Enosmerna θ-replikacija

Poznana je pri plazmidih ColE1 in pMB1 (izvor pUC plazmidov). Plazmida sta v celicah nekompatibilna zaradi podobnih sekvenc za začetek replikacije, kar pomeni, da ko se celica deli, se plazmida ne podvojita. Rezultat tega je, da ima ena hčerinska celica en plazmid, druga pa drugi plazmid.

Slika 16:Dvosmerna θ-replikacija pri E. coli

Enosmerna D-replikacija

Z enosmerno D-replikacijo se podvojuje mtDNA. Pri vretenčarski mtDNA razlikujemo dve (komplementarni) verigi. Težka veriga (H-strand) ima za razliko od lahke verige (L-strand) večjo vsebnost baz G+T. Pri replikaciji mtDNA se najprej (z mesta oriH, ki leži na L-verigi v področju D-zanke, takoj za promotorjem LSP) sintetizira H-veriga, imenovana tudi vodilna veriga. Ko nastajajoča H-veriga doseže dolžino približno 2/3 kroga dvoverižne mtDNA, pride do mesta oriL, ki je na (stari) H-verigi, in se v nasprotni smeri začne še sinteza L-verige.

Slika 17: Potek enosmerne θ-replikacije pri mtDNA. Napisa H in L je potrebno zamenjati, da slika ustreza dejanskemu poteku.

Kotaleči se krog (rolling circle)

Preko kotalečega se kroga se podvojujejo krožni ssDNA virusi (M13, ΦX174) in nekateri plazmidi. DNA se najprej pretvori v dsDNA obliko. Replikacijo po principu kotalečega se kolesa srečamo pri:

- enoverižnih krožnih fagih, ki se pretvorijo v dvoverižno obliko (t.i. replicating form). Na DNA se najprej sintetizira kratek RNA-začetnik, ki mu sledi sinteza druge verige z DNA-polimerazo. Po prekinitvi ene v verige v dvoverižni obliki pride do sinteze na 3'-koncu in kotalečega se kroga.

- prenosu določenih pDNA (plazmidnih DNA) iz ene bakterije v drugo.

Slika 18: Shematski prikaz replikacije po principu kotalečega se kolesa

Slika 19: Novo sintetizirana DNA je vidna kot rep

Dvosmerna θ-replikacija s kotalečim se krogom

Z dvosmerno θ-replikacijo, ki ji sledi kotaleči se krog, se podvajata λ-fag in herpes virus. Genom obeh je dsDNA. Najprej poteče ciklizacija, ki jo omogočajo cos mesta na 5'-koncu DNA. Pri podvojevanju po principu kotalečega se kolesa se tvorijo konkatemere. Konkatemere so molekule DNA, ki so podobne členkom na verižici - se pravi so med sabo povezane. Po cepitvi se konkatemere pakirajo v virusne partikle.

Vezava proteinov

Vezava proteinov je prisotna pri adenovirusih in Φ29 (linearna dsDNA). Na 5'-konec DNA je kovalentno vezan 55K protein (preko serina na citozin), ki ga izpodrine 80K protein, ki že nosi prvo bazo (C) bodoče komplementarne verige.

Dvosmerno linearno podvojevanje

Dvosmerno linearno se podvojujejo evkariontske jedrne DNA. Pri kvasovkah se replikacija prične na ARS sekvencah, medtem ko pri ostalih višjih organizmih še ni jasno, če gre za specifična zaporedja ali ne. Konce ( splošna oblika (TTAGGG)n ) replicirajo telomeraze po posebnem mehanizmu. Hitrost replikacije je 30 nt/s, kar je desetkrat manj kot pri E.coli.

Slika 20: Kompleks 55K in 80K proteina

PPPooottteeekkk rrreeepppllliiikkkaaaccciiijjjeee dddsssDDDNNNAAA Osnovne faze replikacije DNA so:

- iniciacija, kjer sodeluje proteinski kompleks primosom

- elongacija, kjer sodeluje proteinski kompleks repliosom

- terminacija

Osnovni encimi za sintezo DNA so DNA-polimeraze. V E. coli je poznanih pet, pri sesalcih je do sedaj znanih dvanajst. Vse DNA-polimeraze potrebujejo za začetek sinteze nove verige kratek začetnik - oligonukleotid. Sinteza nove verige teče vedno v smeri 5'→ 3'.

I monomera, M = 103 kDa popravljanje DNA, pomožna funkcija II monomera, M = 90 kDa popravljanje DNA III heteromultimera, M = 900 kDa replikazna funkcija IV monomera V heteromultimera SOS odgovor, popravljanje DNA

Tabela 6: DNA-polimeraze pri E. coli in njihove funkcije v replikaciji α začetek, sinteza zaostajajoče verige δ sinteza vodilne verige β ε

popravljanje DNA

γ replikacija mtDNA ξ, η, θ, ι, κ, λ, µ popravljanje DNA Tabela 7: Sesalske DNA-polimeraze in njihove funkcije pri replikacije

Pri replikaciji sodeluje več različnih proteinov. Novo verigo sintetizirajo DNA-polimeraze, verigi DNA razvijajo DNA-helikaze, torzijske napetosti sproščajo DNA-topoizomeraze, razvito enojno verigo stabilizirajo SSB-proteini, razvitje začetkov replikacije omogočijo ori-vezavni proteini, začetnike sintetizirajo primaze in za ligacijo fragmentov skrbijo ligaze.

Študij podvojevanja DNA in odkrivanje posameznih komponent replikacije sta potekala s pomočjo temperaturno občutljivih mutant, ki so pogojno letalne mutante, rastejo lahko namreč le v ozkem temperaturnem območju. Temperaturno občutljive mutante imajo mutirane dna gene. Obstajata dve vrsti dna mutant:

- hitre-stop (quick-stop) imajo okvaro elongacije

- počasne-stop (slow-stop) imajo okvaro iniciacije (dlje časa rastejo)

Replikacija je zelo natančen proces. Samo parjenje baz je dovolj za “samo” 1/1000 napaka/bp. Z replikacijo je ta vrednost dosti nižja, 1/106, kar je posledica 3'-eksonukleazne aktivnosti, ki omogoča ponovno branje in zamenjavo nepravilne baze (proofreading). Obe aktivnosti, polimerazna in eksonukleazna, potekata na različnih delih encima. Reverzna transkriptaza nima možnosti kontrolnega branja, enako velja tudi za nekatere DNA-polimeraze. Nekatere DNA-polimeraze imajo tudi 5'-eksonukleazno aktivnost.

Pri proteolitski cepitvi DNA-polimeraze I in vitro nastaneta dva fragmenta. Večji, Klenow fragment, ima polimerazno in 3'-eksonukleazno aktivnost, manjši fragment ima samo 5'-eksonukleazno

aktivnost. Celoten encim lahko sintetizira DNA samo na mestih prekinitve ene verige tako, da najprej poteče razgradnja stare verige DNA (“nick” translacija).

Nobena DNA-polimeraza ne more začeti de novo sinteze DNA. Za začetek je nujno potreben začetni oligonukleotid, ki je lahko bodisi DNA, RNA ali protein:

- kratek RNA začetnik za celično DNA, nekatere viruse in plazmide

- obstoječa RNA za retroviruse

- veriga DNA pri “nick” translaciji in kotalečem se krogu

- proteini z vezano bazo pri adenovirusih

Ena od verig se sintetizira kontinuirno (vodilna veriga), druga veriga v sintezi zaostaja in je sestavljena iz Okazakijevih fragmentov (1.000-2.000 nt), vsakega začenja začetnik (10 nt).

Pri bakterijah je osnovna replikaza DNA-polimeraza III, vloga DNA-polimeraze I je v razgradnji RNA-primerjev in zapolnitvi nastalih vrzeli. Okazakijeve fragmente poveže s kovalentno vezjo DNA-ligaza.

Replikacija pri E. coli 1. Iniciacija:

Pri E. coli mesto oriC vsebuje 11 GATC palindromnih mest, ki se pred začetkom replikacije metilirajo (GATC, dam metilaza)

Mesto oriC vsebuje dva pomembna odseka. Enega predstavljajo štiri ponovitve po devet baznih parov, drugega pa tri ponovitve po trinajst baznih parov (zaporedje bogato z AT). Najprej se na , 4 × 9 bp oriC veže 20-40 monomer DnaA proteina, nastane zaprti kompleks. DNA se ovije okoli tega proteinskega jedra. Sledi razvitje DNA v območju 3 × 13 bp ponovitev in nastanek odprtega kompleksa.

Na takšen odprt kompleks se veže heksameren DnaB protein (helikazna funkcija), povezan s šestimi monomerami DnaC proteina, ko nastanejo replikacijske vilice. V tem procesu sodelujejo še: giraza, SSB-protein in protein Hu. Vsi ti proteini tvorijo predzačetni kompleks (prepriming complex). DNA se razvije v dolžini < 60 bp. Proteina DnaJ in DnaK verjetno omogočata sprostitev tega kompleksa in dejanski začetek replikacije.

Slika 21:Shematski prikaz nick-translacije

V tem preprostem primeru (oriC) je primosom v bistvu le DnaB protein, ki je predhodno v kompleksu z DNA-primazo. DnaB razvija DNA heliks in aktivira DnaG - primazo, ki sintetizira kratke RNA začetnike. V drugih primerih (ΦX174) so v primosomu še nekateri drugi proteini (PriA, PriB, PriC, DnaT, DnaB, DnaC). Primosom začenja sintezo Okazakijevih fragmentov, po DNA potuje v nasprotni smeri od sinteze vodilne verige. Pri vodilni verigi se sintetizira RNA-začetnik le na začetku.

Za replikacijo in z njo povezane procese je potrebna energija ATP.

2. Elongacija Bakterijska DNA-polimeraza III opravlja sintezo

obeh verig. Sestavljena je iz sedemnajstih podenot in verjetno deluje kot asimetrična dimera:

2× (αεθτβ2) + γδδ 'χψ .

α sinteza ε kontrolno branje θ sestava kompleksa τ tvorba dimere β γ

prepozna DNA, skrbi za interakcijo z DNA

Tabela 8: Vloga podenot pri DNA-polimerazi III

Predpostavljeni model delovanja

Polovica encima z DnaB (helikazo) je potrebna za sintezo zaostajajoče verige, druga polovica pa za sintezo vodilne verige. Ena molekula holoencima, ki je približno enako velika kot mala podenota ribosoma, lahko sintetizira več tisoč nukleotidov. Celoten replisom vključuje še druge proteine.

Slika 22: Shematski prikaz pre-priming reakcije

3. Terminacija

Pri E. coli se na ter sekvence (~ 23 bp) veže produkt tus gena in ustavi replikacijo.

Slika 23: Struktura DNA polimeraze III po vezavi na DNA

Slika 24: Gibanje replikacijskih vilic pri E. coli in terminacija replikacije.

MMuuttaaccii jjee iinn ppoopprraavvll jjaallnnii

mmeehhaanniizzmmii

Mutacija je proces, pri katerem pride do spremembe genetskega materiala, ki se lahko odrazi na fenotipu organizma. Organizem, gen, zaporedje z mutacijo je mutant/-a.

Obstaja več tipov mutacij in sicer so lahko na nivoju:

delecija insercija gena substitucija

točkovne mutacije - tranzicije: Pu → Pu - transverzije: Pu → Py ali Py → Pu

delecija duplikacija inverzija kromosoma

translokacija anevploidija Downov sindrom: trisomija 21. kromosoma genoma poliploidija podvojitev celotne garniture kromosomov

Tabela 9: Pregled mutacij glede na velikost in nekatere posledice

Manjše mutacije so bolj pogoste od večjih; substitucija > delecija > insercija.

Pri mutacijah je treba omeniti še pojem alel, ki predstavlja različno obliko istega gena, npr. gen za oči, alel za modre, rjave, ...

Do mutacij lahko pride pri/zaradi:

- replikaciji DNA

- spontanih mutacij na vročih točkah (hot spots); npr. demetilacija 5-Me-C → T ali oksidativna deaminacija C → U.

- delovanja retrovirusov in transpozicijskih elementov

- fizikalnih mutagenov: ionizirajoče sevanje, UV

- napačnega popravljanja poškodb na DNA

- kemičnih mutagenov:

- DNA-reaktivne kemikalije

- analogi baz: 5-bromo-uracil

- analogi bp: premik bralnega okvirja (frameshift)

Analogi baz so nevarni zato, ker se lahko komplementirajo tako s Pu kot Py, preferenčne vezave tipa A-T in G-C ni, zato prihaja do napak pri replikaciji takšne DNA.

Mutacije se delijo tudi glede na tip celic, v katerih pride do mutacije. Če pride do mutacij v somatskih celicah, se to odraža na fenotipu posameznika bolj redko, nevarnejše so mutacije v spolnih celicah, ker se dedujejo. Ni vsaka mutacija negativna!

Mutatorji so geni, ki lahko povečajo število mutacij, njihovi produkti so vključeni v mehanizme popravljanja DNA. Mutatorji so lahko tudi geni, ki so neposredno vključeni v proces replikacije, npr. ε-podenota DNA-Pol III, gen za ε-podenoto je mutator.

PPPoooppprrraaavvvllljjjaaannnjjjeee nnnaaapppaaakkk Procesi popravljanja so najbolj raziskani pri E. coli. Domnevati je mogoče, da so procesi znotraj

drugih celic oziroma organizmov podobni.

Bakterijska celica ima na voljo več popravljalnih mehanizmov:

- direktno popravljanje (direct repair) - izrezovalno popravljanje (excision reapir) - popravljanje napačnega parjenja (mismatch repair) - tolerančni sistem (rekombinacijsko popravljanje, SOS-odgovor)

Direktno popravljanje

Direktno popravljanje je razmeroma redko. Gre za preprosto odstranitev poškodbe oziroma povratno reakcijo, ki vzpostavi prvotno stanje:

- DNA-polimeraze imajo sposobnost kontrolnega branja → 3'-eksonukleazna aktivnost

- Fotoliaza (produkt phr gena) omogoča reaktivacijo pirimidinskih dimerov ob prisotnosti vidne svetlobe

- O6-metilgvanin transferaza (ada gen) odstrani metilno skupino iz gvanina in tudi s sladkorno-fosfatnega ogrodja; ena molekula encima ireverzibilno veže eno metilno skupino.

Slika 25: Posledice napačnega parjenja baz, ki jih povzroči 2-bromouracil

Izrezovalno popravljanje

Obstaja več različnih sistemov izrezovalnega popravljanja, ki jim je skupno:

- določen sistem prepozna okvarjeno ali nepravilno sparjeno bazo in jo izreže

- odstranitev dela okvarjene verige (5'-eksonukleaza)

- sinteza nove verige ob delovanju DNA-Pol I in DNA-ligaze

UUUvvvrrr sssiiisssttteeemmm DNA cepi UvrABC endonukleaza: dimera UvrAB prepozna poškodbo. UvrA disociira, veže se

UvrC. Vezavi sledi prekinitev verige sedem nukleotidov pred poškodbo in štiri nukleotide po poškodbi. Pri razvijanju sodeluje UvrD. Tako nastala vrzel je velika ~ 12 nt. Sledi delovanje DNA-pol I in ligaze.

GGGllliiikkkooozzziiilllaaazzznnniii sssiiisssttteeemmm Različne glikozilaze odstranijo določeno spremenjeno bazo z deoksiriboze. Pred nastalo vrzeljo - AP

mestom - cepi AP-endonukleaza in s tem omogoči delovanje DNA-pol I in ligaze.

Popravljanje napačnega parjenja

Posledici napačnega parjenja baz sta lahko dve:

- poškodba privede do nenaravne baze, ki navadno povzroči delno spremembo v strukturi dsDNA, kar omogoči prepoznavanje in zamenjavo

- poškodba povzroči zamenjavo v eno od običajnih baz; popravljalni mehanizmi morajo popraviti bazo v pravi verigi, sicer pride od mutacije.

Slika 26: Delovanje Uvr sistema pri popravljanju napak na DNA.

PPPrrreeedddnnnooossstttnnnooo pppoooppprrraaavvvllljjjaaannnjjjeee Zamenjava T v primeru nepravilnih G:T in C:T povezav. Aktivirajo se geni mutL, mutS in VsrDNA.

DDDaaammm---pppoooppprrraaavvvllljjjaaannnjjjeee Poseben sistem (missmatch correction system, geni mutH,L,S → MutHLS, UvrD) prepozna napačno

parjenje v bližini dam metilacijskih mest, ko nova veriga še ni metilirana in odstrani vmesni del. Sledi delovanje DNA-polimeraze III. Mehanizem je naslednji: dve dimeri MutS se vežeta na mesto z napačnim parjenjem baz. Na MutS2 se vežeta dimera MutL. Sledi translokacija do prvega GATC mesta, kjer se na nastali kompleks veže MutH (endonukleaza). Napačna baza se izreže. Sledi delovanje DNA-pol III in ligaze.

Tolerančni sistemi

RRReeekkkooommmbbbiiinnnaaaccciiijjjssskkkooo pppoooppprrraaavvvllljjjaaannnjjjeee Okvaro na DNA DNA-Pol III pri replikaciji preskoči. Nastala vrzel se zapolni z ustreznim

fragmentom iz druge verige, ki se je podvojila brez prekinitve. Končno se zapolni še tako nastala nova vrzel. V tem sistemu je udeležen RecA protein, ki sicer sodeluje pri homologni rekombinaciji.

Slika 27: Funkcije posameznih komponent, ki so udeležene pri dam popravljanju

a) Popravljanje z napako (error-prone, SOS-repair) → mutageno popravljanje

Pri podvojevanju se nasproti modificirane baze vgradi nekomplementarna baza. Na tak način se lahko prepreči še hujša poškodba (bypass sinteza). Sodeluje RecA, UmuC in UmuD. Operon umuDC se aktivira pri SOS-odgovoru bakterij na večje poškodbe DNA. Svoj delež pri tem procesu ima tudi DNA-pol III.

RecA aktivira UmuD v UmuD'. Dve monomeri UmuD' se povežeta z UmuC v DNA-polimerazo V. Ob tem sodeluje še DimB = DNA-polimeraza IV. Po svoji strukturi je DimB podoben UmuC.

b) SOS-odgovor

RecA vpliva na popravljanje napak na indirekten način pri indukciji SOS-genov. Ko se zaradi poškodbe aktivira RecA, ta povzroči cepitev LexA-represorja, ki preprečuje prepis različnih genov, vključno z recA, lexA. Celoten SOS-odgovor je zelo učinkovit, se hitro vključi in izključi.

Pri SOS-odgovoru se navadno poveča število mutacij, pogosto pride do indukcije nekaterih profagov.

Slika 28: Retrieval sistem oziroma rekombinacijsko popravljanje pri E. coli

RReekkoommbbiinnaaccii jjaa

Rekombinacija je eden od osnovnih reguliranih celičnih procesov, ki omogoča:

- genetsko variabilnost: ločevanje pozitivnih od negativnih mutacij in s tem posledično boljšo evolucijo

- popravljanje poškodovane DNA

- možnost regulacije genske ekspresije → tehnologija rekombinantne DNA

V splošnem je lahko rekombinacija treh tipov:

- homologna (splošna) rekombinacija; npr. pri prvi mejotski delitvi

- mestno specifična rekombinacija, ki poteče pri integraciji fagnega genoma

- transpozicija, kjer gre za prenos genskega materiala znotraj genoma, sekvenčna podobnost ni pogoj

HHHooommmooolllooogggnnnaaa rrreeekkkooommmbbbiiinnnaaaccciiijjjaaa Homologna rekombinacija je mogoča med regijami DNA z enakim ali zelo podobnim zaporedjem.

Do nje pride po nastanku prekinitev v eni ali obeh verigah DNA. Pri rekombinaciji pride do parjenja komplementarnih baz v predelu ssDNA.

Proces rekombinacije je viden pod mikroskopom v prvi fazi mejoze v obliki kiazem na kromosomih, kjer prihaja do križanja kromosomov (crossing over). Gre za fizične prelome in ponovne združitve delov kromosoma (breakage and reunion). Pogostost rekombinacije ni enaka vzdolž celotnega kromosoma. V predelu heterokromatina je manjša, odvisna je tudi od tipa celic: pri oogenezi je štirikrat bolj pogosta kot pri spermatogenezi.

Na molekularnem nivoju sta v leptotenu profaze prve mejotske delitve prisotni po dve sestrski kromatidi na homolognem kromosomu, skupno torej štiri DNA dupleksi. V pahitenu pride do rekombinacije med dvema sestrskima (homolognima) kromatidama. Področja parjenja so kiazme.

Pri prokariontih mora biti dolžina regije, ki je udeležena pri homologni rekombinaciji, vsaj 75 baznih parov. Za samo komplementarno parjenje ssDNA zadošča že zaporedje desetih baznih parov.

Modeli homologne rekombinacije - klasični Hollidayev model

Najprej pride do prekinitve ene verige v vsakem od obeh dupleksov DNA, sledi navzkrižna povezava prekinjenih verig. Nastala Hollidayeva struktura se lahko reši na več načinov:

• do druge prekinitve pride na isti verigi → → DNA vsebuje hibridne regije

• do druge prekinitve pride na drugi verigi → → DNA vsebuje izmenjane dele dvojne verige

Slika 29: Hollidayeva struktura

- model dvojne prekinitve

Model dvojne prekinitve je bolj verjeten. V začetku pride do prekinitve obeh verig (DSB - double strand break) recipientske DNA z endonukleazo, sledi eksonukleazno delovanje in nato napad 3'-konca ene verige v homologno regijo donorske dsDNA. Prihaja do ponovne sinteze na obeh dupleksih DNA, informacijo zanjo daje v obeh primerih donorska DNA, ob tem lahko pride do delne izgube informacij.

Bakterijska homologna rekombinacija

Pri bakterijski homologni rekombinaciji gre večinoma za izmenjavo manjših delov DNA. Predpogoj za rekombinacijo je del DNA z enoverižno strukturo in prostim 3'-koncem. Poti za potek je več.

V genomu E. coli so posebna zapredja χ (“chi”, 5'-GCTGGTGG-3') na vsakih 5 - 10 kbp, ki stimulirajo rekombinacijo, niso pa zanjo neobhodno potrebna. Na teh mestih pride do prekinitve ene verige z eksonukleazo V, ki je produkt recBCD genov.

Slika 30: Rekombinacija lahko poteče na dva načina. Rezultat pri prvem so izmenjane regije ssDNA , pri drugi pa izmenjane regije dsDNA.

Pri rekombinaciji ima ključno vlogo encim RecA. Monomere tega proteina tvorijo nit v obliki dvojnega heliksa, na katerega se navije ssDNA, sledi prepoznavanje podobnih regij z drugo verigo v dsDNA (nastane trojni heliks DNA). Spremeni se tudi struktura DNA, ki postane 1,5× bolj raztegnjena kot sicer.

Sledi razvijanje tripleksa in zamenjava ene verige v dupleksu z verigo ssDNA. Nastala struktura potuje od mesta razvejitve ob porabi ATP. Pri potovanju sodeluje še RuvA, ki prepozna Hollidayevo strukturo, na verigo DNA se veže v obliki tetramere. Pomembno funkcijo ima še RuvB protein, ki ima ATPazno funkcijo in je odgovoren za potovanje strukture vzdolž DNA. Hitrost potovanja strukture je 10-20 bp/s. Naposled Hollidayevo strukturo reši RuvC.

Pri evkariontih so že bili odkriti proteini, ki imajo podobno funkcijo kot RecA v E. coli, njihova struktura in delovanje sta drugačni.

Slika 31: RecBCD se veže na prelom v dvojni verigi DNA. RecBCD odvija DNA in deluje kot eksonukleaza. Na chi sekvencah se encim ustavi in endonukleaza cepi eno od verig. RecD nato disociira, RecBC pa nadaljuje kot helikaza.

Slika 32: Potovanje Hollidayeve strukture omogočata proteina RuvA in RuvB.

Slika 33: Integracija / ekscizija faga v bakterijski genom poteče v več fazah.

Genska konverzija

Homologna rekombinacija je običajno recipročna, včasih pa pride do nerecipročnosti. Pri mejozi npr. dobimo običajno dve kopiji očetovega in dve kopiji materinega alela (razmerje 2:2), v redkih primerih lahko pride od razmerja 3:1 oziroma genske konverzije. Pri konverziji sodelujeta homologna rekombinacija in DNA-popravljanje. Vzrok za gensko konverzijo je v napačnem popravljanju ene od verig hibridne DNA.

Genska konverzija ima velik pomen za evolucijo. Omogoča namreč, da se gen obdrži v večih kopijah, ki se lahko nato razvijajo samostojno.

MMMeeessstttnnnooo---ssspppeeeccciiifffiiičččnnnaaa rrreeekkkooommmbbbiiinnnaaaccciiijjjaaa Mestno-specifična rekombinacija se pojavlja pri fagih, ki imajo lahko tako litično ali lizogeno fazo.

Prehod med obema fazama vključuje:

- integracijo faga v bakterijski kromosom in prehod v lizogeno fazo

- ekscizijo (izrez) iz kromosoma in omogoči litično fazo

V integracijo sta vključeni po dve mesti z oznako att (attachment). Prvo mesto attB - attλ se nahaja na bakterijskem kromosomu in je večinoma veliko okrog 23 bp. Drugo mesto, attP, je dolgo 240 bp. Integracija lahko poteka tudi brez mesta attλ, vendar je stopnja integracije tisočkrat manjša.

Obe mesti imata enako osnovno sekvenco petnajstih baznih parov, ki jo obdajata specifični sekvenci ob straneh. V ekscizijo sta vključeni še mesti attL in attR. Pri integraciji/eksciziji sodelujeta še IHF (integration host factor) in Xis (ekscizionaza). Integracijo/ekscizijo pogojuje količina integraze/ekscizionaze.

Integracija poteka tako, da se okoli več molekul integraze, ki ima tudi topoizomerazno aktivnost, in IHF navije mesto attP, nastala struktura je intasom. Sledi prepoznavanje mesta attB. Pri integraciji najprej pride do zaporedne asimetrične prekinitve na attP

oziroma attB na razdalji sedmih baz. Sledi razrešitev strukture.

Mestno specifična rekombinacija je pomembna pri regulaciji ekspresije nekaterih genov in tvorbi različnih genov za

protitelesa.

TTTrrraaannnssspppooozzziiiccciiijjjaaa Transpozicija predstavlja premik transpozicijskega elementa, transpozona - TE, na novo mesto v

genomu in je neodvisna od podobnosti sekvenc donorja in recipienta.

TE so interni genomski vektorji, ki omogočajo direktne ali indirektne preureditve genoma. Vplivajo lahko tudi na ekspresijo genov. Transpozicija poteka tako pri prokariontih kot evkariontih.

Transpozicijske elemente lahko razdelimo na:

- transpozone, ki se prenašajo preko DNA: insercijske sekvence-IS, sestavljeni Tn, evkariontski Tn

- retropozone, ki se prenašajo preko RNA intermediatov in so bolj ali manj podobni retrovirusom

Slika 34: Nekaj tipov insercijskih sekvenc s tarčnimi mesti

Slika 36: Potek nereplikativne transpozicije.

Transpozicija največkrat poteče v treh fazah:

1. Asimetrična prekinitev tarčne DNA

2. Združitev Tn na mestih enoverižnih koncev

3. Zapolnitev vrzeli

Transpozicij je več vrst 1. Replikativna transpozicija:

Pri replikativni transpoziciji pride do podvojitve TE. Ena kopija ostane na prvotnem mestu, druga se vgradi na tarčno mesto, kar se zgodi preko kointegrata.

Sodelujeta transpozaza, ki deluje na koncih izvirnega TE, in resolvaza, ki deluje na kopijo TE. Na tak način se premikajo TnA transpozoni: Tn3, Tn1000, ki imajo na koncih samo obrnjeno zaporedje.

Slika 35: Potek replikativne transpozicije

2. Nereplikativna transpozicija:

Pri nereplikativni transpoziciji preide TE iz donorskega mesta na tarčno. Za ta način prenosa zadošča le transpozaza. Na tak način se premikajo: IS, Tn5, Tn10. Omeniti velja element IS1 pri fagu Mu, ki se lahko prenaša bodisi replikativno ali nereplikativno. V tem primeru se DNA stopničasto prereže, konca Tn se lahko povežeta navzkrižno (strand transfer complex) lahko pa nastane kointegrat.

3. Konjugativna transpozicija:

Transpozon se s stopničastim rezom izreže iz donorske molekule DNA in tvori zaprti krožni intermediat. Sledi intracelularna ali intercelularna transpozicija (s konjugacijo). Tarčna mesta niso niti specifična niti homologna, gre za upognjeno DNA. Na mestu vstavitve se tarčno mesto podvoji. Gre za podoben mehanizem kot pri integraciji λ-faga, le da tu običajno ni podobnosti v mestih, ki so rekombinirana. Transpozonske rekombinaze so podobne integrazi. Konjugativni transpozoni so promiskuitetni, ker prenašajo rezistenco na antibiotike.

Insercijske sekvence (IS)

IS so najbolj preprosti TE. Njihova velikost je ~ 1000 bp. Na obeh koncih imajo kratke, 10-40 bp dolge, obrnjene ponovitve. Tarčna mesta so lahko naključna (npr. IS1) ali bolj določena zaporedja. Na mestih vstavitve povzročijo kratke direktne ponovitve. IS so neodvisni elementi in vsebujejo gene za lastno transpozicijo, med njimi je tudi gen za transpozazo.

Sestavljeni Tn

Sestavljeni Tn so večji in imajo osrednji specifični del, t.i. potnik (passenger), ki največkrat vsebuje gene za rezistenco na antibiotike. Na obeh koncih Tn so direktne ali obrnjene IS. Sestavljeni Tn so: Tn5, ki vsebuje gen kanR, in Tn10, ki vsebuje gen tetR.

Slika 37: Direktne ponovitve na koncih transpozona nastanejo s stopničastim rezom v tarčni DNA.

Slika 38: Transpozoni iz družine TnA imajo več genov. Značilnost TnA so insercijske sekvence na koncih. Odsotne so direktne ponovitve.

Evkariontski Tn

Prototip vseh evkariontskih transpozonov je Tn916. Pri evkariontih se imenujejo “kontrolni elementi”, odkrila jih je B. McClintock pri koruzi.

Obstaja več tipov kontrolnih elementov:

- avtonomni elementi, ki se prenašajo sami, osnovna komponenta je gen za transpozazo, prisotni so lahko še drugi - neavtonomni geni

- neavtonomni elementi, ki nastanejo iz avtonomnih z delecijo ali kakšno drugo spremembo, ki inaktivira transpozazni gen, a ohrani tarčna mesta za delovanje transpozaze

Posledica delovanja kontrolnih elementov je hibridna disgeneza. Do hibridne disgeneze pride pri križanju nekaterih sort vinske mušice. Posledice hibridne disgeneze so: mutacije, aberacije kromosomov, nepravilna ločitev kromosomov pri mejozi in sterilnost. Pri vinski mušici sta bila ugotovljena dva sistema. Pri prvem sistemu je moč vinske mušice razdeliti v tip I (inducer) in R (reducer). Sterilnost se pojavi pri križanju tipa I (%) s tipom R (&), obratno ne velja. Drugi sistem razdeli mušice na tip P (paternal) in tip M (maternal). Tudi tu križanje P (%) z M (&) povzroči disgenezo, obratno pa ne.

Slika 39: Družine kontrolnih elementov

Retrotranspozoni (retropozoni)

Retropozone je mogoče razdeliti na dve skupini:

- virusna skupina, ki vsebuje bralni okvir za reverzno transkriptazo / integrazo in ima na terminih direktne ponovitve, njihova nadaljna delitev je:

• LTR - long terminal repeat, primera sta Ty pri kvasovkah in copia pri D. melanogaster • non-LTR, primer je LINE - long interspersed element

Virusna skupina se od retrovirusov razlikuje v tem, da ne pride do litične faze v celicah, virusna skupina je retrovirusom podobna v mehanizmu, ki ga uporablja pri transpoziciji.

- nevirusna skupina je nastala iz virusne. V genomu je take retropozone mogoče prepoznati po terminih, vmesni del ne kodira ničesar. Ta tip retropozonov je verjetno nastal iz celičnih transkriptov preko neznanega encima.

Bistvene razlike med obema skupinama retropozonov so povzete v Sliki 41.

Slika 41: Sistematska razdelitev retropozonov in osnovne značilnosti posameznih tipov

V človeškem genomu velik del ponovitev predstavljajo približno tristo baznih parov dolge ponovitve, med katerimi so poljubna zaporedja DNA. Te sekvence cepi prbližno 170 bp od začetka endonukleaza Alu I (AG↓CT). V haploidnem genomu je približno 300.000 takih ponovitev, kar pomeni, da se tako zaporedje pojavi na vsakih 6 kb genoma. Podobne sekvence so bile odkrite tudi pri miših (družina B1) in hrčku (Alu-equivalent family) in v drugih sesalcih.

Alu sekvenca je povezana s 7S RNA, ki je del SRP (signal recognition particle - sekvenca na začetku polipeptidne verige, ki usmerja protein na določeno mesto znotraj celice) zaradi tega ima oznako 7SL (7S-like) RNA in ustreza 90 bazam na 5' terminalnem delu Alu-sekvence, zadnjih 40 baz na 3'-koncu pa ustreza desnemu delu Alu. Vmesni del nima homologije. 7SL RNA je kodirana na genih, ki jih aktivno prepisuje DNA-polimeraza III. Možno je torej, da so Alu sekvence nastale z inaktivacijo 7SL RNA.

Slika 40: Retropozoni lahko vsebujejo gene, ki kodirajo različne encime. Poleg tega so lahko prisotni tudi zapisi v drugih bralnih okvirjih (ORF).

Retropozon LINES L1 se prenaša preko RNA intermediata, ki se prevede v dva proteina, ki se vežeta na lastno mRNA.

Transpozicija je pomembna zato, ker omogoča primitivno rekombinacijo in regulacijo genske ekspresije, obenem pa omogoča evolucijo genov in genomov. Možno je, da so se virusi razvili ravno iz transpozicijskih elementov. Možno razvojno pot prikazuje shema:

IS → Tn → plazmid → Φ, retropozoni, virusi

Slika 42: Retropozoni lahko nosijo gene v različnih bralnih okvirjih.

SSiinntteezzaa RRNNAA

Transkripcija je proces sinteze verige RNA, ki je po sekvenci enaka kodirajoči verigi DNA. V tem procesu druga veriga DNA služi kot matrica. Obenem je transkripcija tudi edini način sinteze celične RNA.

Promotor je regija na DNA, na katero se veže RNA-polimeraza na začetku transkripcije. V zadnjem času se sicer zdi, da je na DNA vedno vezan določen delež RNA-polimeraz, ki pa ne morejo začeti transkripcije.

Transkripcijski start ima oznako +1, glede na ta start so definirani pojmi upstream (pred +1), downstream (po +1) oziroma bližnje (proksimalno) in daljno (distalno).

Enota transkripcije DNA vključuje vse sekvence, ki se nahajajo med promotorjem in terminatorjem. Definicija velja za primarni transkript DNA.

Transkripcijski mehurček predstavlja zaporedje štirinajstih baz, ki so razvite in se prepisujejo. RNA-DNA hibrid je dolg 8-9 bp.

Hitrost transkripcije je 40 nt/s (bakterije pri 37°C), pri istih organizmih je hitrost translacije 15 aa/s in replikacije 800 nt/s.

Transkripcija poteče v večih fazah:

1. Prepoznavanje matrice, za katero je značilna vezava RNA-polimeraze na promotor in lokalno razvitje DNA.

2. Iniciacija, ko pride do sinteze prvih nekaj fosfatnih vezi - do devet nukleotidov

3. Elongacija je rast enojne verige RNA, za katero je značilno hitro premikanje transkripcijskega mehurčka vzdolž DNA.

4. Terminacija je zaključek sinteze RNA, ki ga povzroči terminacijsko zaporedje na DNA.

Slika 43: Transkripcija tipičnega Po II gena. Jasno je vidna DNA. mRNA ni vidna, ker se prevaja v protein na ribosomih.

ZZZgggrrraaadddbbbaaa RRRNNNAAA---pppooollliiimmmeeerrraaazzzeee ppprrriii EEE... cccooollliii RNA-polimeraza pri E. coli je sestavljena iz petih podenot (α2ββ'σ) in deluje kot heteromultimera.

V grobem je moč strukturo encima razdeliti na jedro encima in σ-faktor.

V encimu ima vsaka podenota določeno vlogo, ki je prikazana v tabeli:

σ prepoznavanje promotorja, po iniciaciji se sprosti β vezava nukleotida (rNTP) β' vezava DNA

α sestavljanje jedra in interakcija s promotorjem in nekaterimi regulatornimi proteini

Tabela 10: Vloga podenot v RNA-polimerazi E. coli

Jedro encima ima splošno afiniteto do DNA. Vezava σ-faktorja zmanjša to afiniteto za faktor 104× in za tisočkrat poveča afiniteto do promotorja. Kompleks RNA-polimeraze z DNA je lahko v treh oblikah. V fazi elongacije RNA-polimeraza ne potuje enakomerno po DNA, prednji del potuje kontinuirno, zadnji del encima zaostaja. Zdi se, kot bi encim pednjal.

Slika 44: Zgornja shema prikazuje dele RNA-polimeraze

Slika 45: V stopnji iniciacije je RNA-polimeraza daljša, v fazi elongacije se encim “skrajša”.

ZZZgggrrraaadddbbbaaa bbbaaakkkttteeerrriiijjjssskkkeeegggaaa ppprrrooommmoootttooorrrjjjaaa Za bakterijski promotor v splošnem velja, da:

1. je prvi nukleotid v mRNA večinoma Pu,

2. je na mestu -10 heksamerno zaporedje TATAAT - Pribnowo zaporedje,

3. je na mestu -35 heksamerno zaporedje TTGACA,

4. je razdalja med TATAAT in TTGACA 16-18 bp.

Mesto -35 je mesto prepoznavanja DNA s strani RNA-polimeraze, ko nastane zaprt kompleks. Na mestu -10 se DNA razvije in nastane odprti kompleks.

Encim se najprej veže na mesto -35, tej vezavi sledi vezava na mestu -10, kjer pride do razvitja dvanajstih baznih parov ( -9 do +3).

Pri transkripciji imajo pomembno vlogo topoizomeraze:

- giraza (topoizomeraza II) deluje pred RNA-polimerazo in uvaja dodatno negativno zvitje - topoizomeraza I deluje za RNA-polimerazo in uvaja dodatno pozitivno zvitje

σ-faktor ima pomembno funkcijo pri regulaciji transkripcije. Ker njegova vezava na jedro encima RNA-polimeraze spremeni njeno afiniteto do DNA, je mogoče sklepati, da je mogoče z izbiro σ-faktorja izvajati določeno kontrolo nad prepisovanjem DNA. Ugotovljeno je bilo, da ima E. coli tri različne σ-faktorje:

- σ70 je splošni faktor transkripcije - σ32 je faktor, ki se veže na RNA-polimerazo v primeru vročinskega šoka in sproži prepis genov za

HSP (heat shock protein), ki stabilizirajo strukturo celičnih proteinov. - σ54 sproži prepis genov v primeru dušikovega stradanja

B. subtilis ima približno deset različnih σ-faktorjev. Več σ-faktorjev imajo tudi virusi, kar jim omogoča uporabo celičnih encimov za sintezo virusnih proteinov in obenem tudi kontrolo nad potekom infekcije - na določeni stopnji se mora npr. zmanjšati sinteza proteinov plašča in se mora začeti sinteza drugih proteinov.

TTTeeerrrmmmiiinnnaaaccciiijjjaaa Terminacija je zaključek sinteze RNA. Za zaključek

transkripcije je značilno, da se RNA sprosti z encima, obenem se tudi encim sprosti z DNA. Glede na način terminacije tako ločimo:

- od ρ-faktorja (rho) neodvisno terminacijo:

Na koncu gena, ki ga prepisuje RNA-polimeraza, se nahaja palindromna sekvenca G-C parov, ki omogoča, da se ob prepisu v RNA tvori steblo na slednji. Palindromni sekvenci sledi zaporedje šestih adeninov (na DNA) oziroma šestih uracilov (prepis A v RNA). Nastalo steblo na RNA ustavi RNA-polimerazo, šibke interakcije A (na DNA)-U (na RNA) povzročijo sprostitev encima, RNA in DNA.

Slika 46: Lasnica na mRNA nastane pri od ρ-neodvisni terminaciji.

- od ρ-odvisno terminacijo:

Splošna značilnost tega tipa terminacije je regija, ki se nahaja 50-90 nt pred koncem RNA in je bogata s citozini, ki jih prepoznava ρ-faktor, ki deluje kot heksamera. ρ-faktor potuje po RNA in dohiti RNA-polimerazo, ki jo zaustavi šibko steblo. Kompleks se sprosti ob porabi ATP.

Pri evkariontih še ni natančno znano, kako pride do terminacije transkripcije. Zdi se, da na terminacijo vpliva sekundarna struktura RNA in zaporedje baz, še posebej uracilov, v RNA-prepisih.

Slika 47: Vezava ρ-faktorja. NusA je pomožna molekula, ki lahko sodeluje pri transkripciji.

RReegguullaaccii jjaa ggeennsskkee eekksspprreessii jjee

Regulacija sinteze/aktivnosti proteinov lahko poteka:

- na ravni transkripcije

- na ravni procesiranja RNA

- na ravni translacije

- post-translacijsko

Vse kaže, da je tako pri prokariontih kot pri evkariontih najpomembnejša regulacija na ravni transkripcije.

Geni so lahko glede na funkcijo produktov, ki jih kodirajo:

- strukturni: kodirajo strukturne proteine, encime - regulatorni: kodirajo regulatorne proteine, ki vplivajo na transkripcijo

Regulatorni proteini so trans-delujoči faktorji, ki se vežejo na cis-delujoča mesta (zaporedja DNA ali RNA). Njihov vpliv na ekspresijo je pozitiven ali negativen. Trans-delujoči faktor (lahko je gen, RNA, ali protein) vpliva na prepis na nasprotni verigi. Cis-delujoča mesta so mesta, ki vplivajo na transkripcijo v okviru verige, na kateri se nahajajo, kot so npr. elementi AP1, AP2, GRE, CRE.

Glede na kontrolo njihove ekspresije ločimo:

- konstitutivne gene, ki so regulirani samo s promotorjem; mednje sodijo hišni (house-keeping) geni

- kontrolirani geni, ki jih regulirajo trans-delujoči faktorji; regulacija je lahko bodisi pozitivna ali negativna; geni so lahko inducibilni ali represibilni

Za negativno regulacijo velja, da je gen aktiven, dokler ga na izključi represor. Mutacija v genu za represor povzroči konstitutivno ekspresijo takega gena - odvisna je samo od promotorja.

Pri pozitivni regulaciji je gen aktiven, ko ga aktivira aktivator - apoinduktor. Če pride do mutacije v genu za aktivator, se gen ne eksprimira več.

Nekateri regulatorni proteini imajo dvojno vlogo, lahko so represorji IN aktivatorji. Pri bakterijah je genska regulacija v splošnem negativna, pri evkariontih pa pozitivna.

OOO dddeeelllooovvvaaannnjjjuuu rrreeeppprrreeesssooorrrjjjeeevvv iiinnn aaakkktttiiivvvaaatttooorrrjjjeeevvv

Represor se veže na operator, ki je v bližini promotorja ali se celo z njim prekriva. Tako inducibilni kot represibilni geni so lahko negativno, pozitivno regulirani:

a) Indukcija - Induktor inaktivira represor, npr. sistem laktoza-lac represor.

- Induktor aktivira aktivator, npr. sistem cAMP-CRP.

b) Represijo: - Korepresor aktivira represor, npr. Trp-represor.

- Korepresor inaktivira aktivator.

Induktor oziroma korepresor pogosto povzroči alosterično spremembo regulatornega proteina in ga s tem aktivira/inaktivira. V drugih primerih lahko aktivacija poteče preko fosforilacije ali celo oksidacije v nekaterih primerih.

Slika 48: Kontrolno vezje

Slika 49: Struktura Lac-represorja

RRReeeggguuulllaaaccciiijjjaaa nnnaaa rrraaavvvnnniii tttrrraaannnssskkkrrriiipppccciiijjjeee

Lac operon

Lac operon je primer inducibilnega operona. Za negativno regulacijo skrbi lac-represor (homotetramer), za pozitivno pa protein CAP - CRP (catabolite activator protein - cAMP receptor protein).

Lac operon kodira naslednje proteine:

- lacZ za β-galaktozidazo - lacY za β-galaktozidno permeazo - lacA za β-galaktozidno transacetilazo - lacI za laktozni represor, ki se eksprimira konstantno

Vezava lac-represorja na operatorsko sekvenco povzroči nastanek zanke na DNA, znotraj katere se veže še CAP.

Represor se sprosti ob vezavi induktorja - laktoze. Izkaže, da je lahko sladkor katerakoli alolaktoza. Pri raziskavah genske ekspresije v E. coli so raziskovalci uporabljali IPTG - izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozo, ki deluje kot induktor, vendar se v celicah ne razgrajuje.

Pozitivna regulacija poteka s CRP. CRP aktivira povišan nivo cAMP, ki kaže na pomanjkanje glukoze. Ko je namreč v gojišču glukoza, je nivo cAMP zelo nizek, po čemer je mogoče sklepati, da eden od katabolitov glukoze inhibira delovanje adenilat ciklaze, ki sintetizira cAMP. CRP je tudi

pozitivni regulator gal in ara operonov, gre za t.i. glukozno-občutljive operone. Posledica tega sistema je tudi, da se v gojišču najprej preferenčno

porablja glukoza, ko te zmanjka pa drugi metaboliti. Ta način regulacije preprečuje nepotrebno prepisovanje operonov. Zadnja stopnja regulacije poteka na nivoju laktozne permeaze, ki skrbi za vnos laktoze v celico. Ta encim - transporter mora biti fosforiliran, če naj funkcionira. Sklep: če je v gojišču glukoza, je nivo cAMP zelo nizek, sinteza cAMP je nizka. Ker se cAMP sintetizira iz ATP, je malo tudi fosfatnih skupin. Permeaza zato ni fosforilirana in zato ni aktivna. Posledica: če sta v gojišču glukoza in laktoza, se bo v celico prenašala samo glukoza.

Še nekaj besed o strukturi CRP. CRP je sestavljen iz dveh enakih podenot (2 × 22,5 kDa). Na vsaki podenoti dve kratki α-vijačnici tvorita helix-turn-helix motiv, ki prepoznava dve obmejni zaporedji TGTGA, ki ležita 22 bp pred PO-regijo (P-promotor, O-operator). Prisotnost HTH-motiva je eden od znakov, ki kažejo, da se protein lahko veže na DNA.

Ara operon

Pri ara operonu sodeluje pri regulaciji še C-protein, ki je lahko pozitivni ali negativni regulator. Negativno regulira prepisovanje lastnega gena - gre torej za avtoregulacijo - in genov za metabolizem arabinoze. Če na C-protein ni vezana arabinoza, deluje kot represor. Če se na C-protein veže arabinoza, deluje kot aktivator. Za aktivacijo transkripcije, ki poteče z vezavo na PBAD, mora priti še do vezave cAMP na CRP. Gen za C-protein se prepisuje v obratni smeri od ostalih genov ara operona.

CRP sodi med splošne aktivatorje, ki regulirajo gene, katerih transkripti so potrebni samo v določenih pogojih; npr. pomanjkanje glukoze, fosfata, dušika. Specifični aktivatorji se uporabljajo tudi za gene, katerih produkti sodelujejo v metabolizmu določenih spojin, npr. arabinoza, maltoza, serin, ipd.

Slika 50: Vezava induktorja spremeni strukturo represorja tako, da se ne more več vezati na DNA.

Slika 51: Delovanje LexA-represorja

Regulacija SOS genov

RecA je induktor, ki povzroči cepitev LexA-represorja, ki reprimira različne SOS-gene, celo lastnega, in gene za RecA. Po cepitvi se poveča koncentracija RecA, ki popravlja DNA z rekombinacijo. Poveča se tudi koncentracija drugih proteinov, ki popravljajo DNA. Tisti operatorji, ki šibko vežejo LexA-represor, se inducirajo že pri šibkih poškodbah, kar zniža nivo LexA le malo. Geni, ki močno vežejo LexA-represor, se inducirajo pri težjih poškodbah.

Regulacija z izbiro σ-podenote

Splošni geni se prepisujejo z uporabo σ70 podenote. Če so celice izpostavljene temperaturnemu šoku, se geni prepisujejo s σ32 podenoto. V primeru dušikovega stradanja poteka prepisovanje s σ54 podenoto. Na podoben način je regulirana transkripcija virusnih genov.

Genetska polarnost

Genetska polarnost pomeni različno prepisovanje genov enega in istega operona. Prepisovanje je odvisno od razdalje med koncem enega gena in začetkom drugega. Večja je ta razdalja, večja je polarnost - slabši je prepis naslednjega gena. Prvi stop kodon ustavi translacijo, ribosom disociira in dostop ρ-faktorja je lažji. Večina večjih genov ima od ρ-faktorja odvisno terminacijo.

Polarnost preprečuje jalovo prepisovanje genov pri stradanju.

Antiterminacija

Antiterminacija lahko poteka preko dveh mehanizmov:

- z antiterminacijskimi faktorji, ki se vežejo na RNA-polimerazo in povzročijo, da se transkripcija nadaljuje tudi preko terminacijskih sekvenc

- s sekundarno strukturo mRNA; nastane lasnica, RNA-polimeraza zato disociira in konča transkripcijo. V primeru, da se na mRNA veže faktor, se lasnica ne tvori in transkripcija se nadaljuje.

RRReeeggguuulllaaaccciiijjjaaa zzz aaannntttiiittteeerrrmmmiiinnnaaaccciiijjjssskkkiiimmmiii fffaaakkktttooorrrjjjiii Regulacija z antiterminacijskimi faktorji je relativno redka. Primer zanjo je λ-fag, kjer sta bila

odkrita dva antiterminacijska faktorja:

- faktor N, ki povzroči prepis kasnejših zgodnjih genov preko terminatorjev tL1 in tR1

- faktor Q, ki povzroči prepis poznih genov preko terminatorja kasnejših zgodnjih genov.

Pri bakterijah je ta način regulacije prisoten pri rRNA operonih (rm geni, NusB-S10). Antiterminacijski faktorji lahko tudi povečajo učinkovitost Nus (N-utilization substance) faktorjev. Splošni transkripcijski faktor NusA se tako veže na jedro encima RNA-polimeraza po disociaciji σ -faktorja in ostaja z njo povezan vse do terminacije.

Slika 52: Primerjava terminacije in antiterminacije.

Slika 53: Princip atenuacije

RRReeeggguuulllaaaccciiijjjaaa sss ssseeekkkuuunnndddaaarrrnnnooo ssstttrrruuukkktttuuurrrooo mmmRRRNNNAAA --- aaattteeennnuuuaaaccciiijjjaaa Atenuator je notranji terminator na začetku transkripcijske enote.

Primer regulacije z atenuacijo je trp operon, ki je sestavljen iz petih strukturnih genov, ki kodirajo encime za sintezo triptofana. Regulacija transkripcije poteka v sedemdesetih odstotkih preko triptofanskega represorja, deset odstotkov regulacije predstavlja atenuacija.

V obeh primerih na transkripcijo vpliva raven triptofana, ki deluje kot korepresor, obenem pa omogoča notranjo terminacijo prepisa.

Slika 54: Regulacija z atenuacijo na primeru triptofanskega operona

Začetni del mRNA prepisa, ki je dolg 140 nt, kodira vodilni peptid iz štirinajstih aminokislin. Sledi stop kodon, ki se kmalu konča s terminacijskim steblom (steblo 3||4) - atenuatorjem. Zaporedje

nukleotidov na področju te vodilne sekvence kaže štiri komplementarne regije, ki omogočajo tvorbo različnih stebel: 1||2, 2||3 in 3||4. Če se tvori steblo 2||3, se steblo 3||4 ne more.

Možnosti za tvorbo stebla je več, vse so odvisne od nivoja triptofana:

- malo triptofana:

Če je malo triptofana, je malo tudi Trp-tRNA. Ko pride ribosom do dveh Trp kodonov v regiji 1, se zato ustavi; tvori se steblo 2||3, ki onemogoča nastanek atenuatorja (3||4). RNA-polimeraza lahko prepiše gene EDCBA.

- dovolj triptofana:

Če je dovolj triptofana, gre ribosom hitreje preko regije 1 in se ustavi v regiji 2, kar omogoči tvorbo atenuatorja. Prepis se ustavi po koncu vodilne sekvence.

- stradanje:

Pri stradanju manjkajo še nekatere druge aminokisline. Tvorita se stebli 1||2 in 3||4. Prevod se takoj konča, prepis je s tem blokiran.

Atenuacija je prisotna tudi pri drugih operonih, ki kodirajo encime za sintezo aminokislin; Thr, His, Phe, Leu, ...

RRReeeggguuulllaaaccciiijjjaaa nnnaaa rrraaavvvnnniii tttrrraaannnssskkkrrriiipppccciiijjjeee iiinnn tttrrraaannnssslllaaaccciiijjjeee

Gvanozin tetrafosfat in gvanozin pentafosfat

(p)ppGpp je splošni signal za stradanje in predstavlja enega od odgovorov na težavne razmere v bakterijski celici (t.i. stringent response). Spojini sodita med alarmone (alarmne hormone), podobno kot cAMP-pomanjkanje glukoze, AppppA-pomanjkanje tRNA, ZTP-pomanjkanje fosfata. Po sintezi (p)ppGpp se proteinska sinteza hitro zniža na 5%-10% predhodne ravni. Do odgovora na težavne razmere pride, ko se na A-mesto ribosoma veže nenabita tRNA (brez aminokisline), kar privede do zaustavitve sinteze proteina oziroma do praznega teka (idling reaction). Prisotnost nenabite tRNA povzroči, da protein RelA sintetizira (p)ppGpp in sprosti tRNA z ribosoma.

ppGpp vpliva na:

• prepisovanje: - zniža sintezo rRNA in tRNA - zmanjša ekspresijo enih genov in stimulira ekspresijo proteinov,

ki so potrebni v primeru stradanja

• prevajanje: zmanjša hitrost sinteze proteinov tako, da vpliva na aktivnost ribosomskih proteinov, ki katalizirajo tvorbo peptidne vezi; L11 je velika podenota ribosomskega proteina, ki ga aktivira RelA s pomočjo konformacijske spremembe prvega.

Slika 55: ppGpp lahko nastaja po dveh različnih poteh:

- iz GTP in ATP, kar je glavna pot - iz GDP in ATP, ki je manjša pot

RRReeeggguuulllaaaccciiijjjaaa nnnaaa rrraaavvvnnniii ssstttaaabbbiiilllnnnooossstttiii iiinnn ppprrroooccceeesssiiirrraaannnjjjaaa mmmRRRNNNAAA

Stabilnost mRNA

Povprečna življenjska doba mRNA v E. coli je kratka t½ ~ 2 min pri 37°C. Encimski razgradnji sledi fosforilacija nukleotidov in njihova ponovna uporaba. mRNA za pomembne proteine so zelo stabilne. Razloga sta dva:

- ribosomi na mRNA onemogočajo dostop Rnazam - odsotnost signalov, ki jih prepoznavajo določene Rnaze; npr. Rnaza III prepoznava določen tip

lasnic

Procesiranje mRNA

Procesiranje mRNA pri evkariontih vključuje izrezovanje intronov in transport mRNA iz jedra v citoplazmo, pri bakterijah je to cepitev policistronskih mRNA

a) Prepisovanje zgodnjih genov pri fagu T7

Najprej se prepiše policistronska mRNA, ki se z Rnazo III cepi v pet mRNA. Šele cepitev na koncu gena 1,2 omogoča translacijo bicistronske 1.1/1.2 mRNA. Necepljena mRNA tvori sekundarno strukturo, ki onemogoča iniciacijo translacije 1.1 mRNA. Produkt cepitve so tako 4 monocistronske mRNA in 1 bicistronska - 1.1/1.2 .

Slika 56: Zgodnji geni pri fagu T7 se prepisuje v obliki policistronske mRNA. Šele ustrezna cepitev omogoči prepis genov.

b) pre-rRNA

Pri E. coli sedem rrn operonov kodira 16S-23S-5S rRNA. V teh operonih je tudi zapis za tRNA. Prekurzorska 30S RNA se najprej cepi z Rnazo III, tej cepitvi sledi cepitev z ostalimi Rnazami, ki omogočijo tvorbo končnih oblik rRNA in tRNA.

RRReeeggguuulllaaaccciiijjjaaa nnnaaa rrraaavvvnnniii tttrrraaannnssslllaaaccciiijjjeee Kontrola na ravni translacije običajno poteka na stopnji iniciacije in terminacije podobno kot pri

transkripciji.

Ribosomska regulacija

Pri translaciji proteinov iz ene policistronske mRNA se proteini sintetizirajo v padajočem molskem razmerju; pri lac operonu je tako: β-galaktozidaza : permeaza : transacetilaza = 1 : 1/2 : 1/5.

Razloga za to sta:

- po branju prvega stop kodona odpade nekaj ribosomov - različna hitrost vezave ribosomov na RBS (ribosome binding site) na mRNA

Na prevajanje vplivajo tudi kodoni za redke tRNA, ko mora ribosom dlje časa čakati.

Regulacija s translacijskimi represorji

Nekateri regulatorni proteini se vežejo na RBS in preprečijo vezavo ribosoma. Pri fagu T4 vezava RegA proteina prepreči translacijo različnih zgodnjih mRNA. Pri RNA fagu R17 protein plašča prepreči translacijo mRNA za replikazo.

Avtogena regulacija • na primeru policistronskega operona

Avtogena regulacija tega tipa je prisotna pri genih, ki so povezani s proteinsko sintezo. Gre za operone, ki vključujejo gene za ribosomske proteine, nekatere translacijske faktorje (EF) in nekatere podenote RNA-polimeraze. Eden od genskih produktov je r-protein (S1, S2, ...), ki se veže na sprednji del svoje mRNA in s tem prepreči translacijo zapisov, ki sledijo (negativna avtogena regulacija). S tem ustavi tudi svojo lastno sintezo.

Slika 57: Cepitev pre-rRNA pri E. coli

Povezava s sintezo rRNA je naslednja:

- ko je na razpolago rRNA (16S, 23S, 5,8S), pride do povezave r-proteinov z njo in translacija r-proteinov se lahko nadaljuje.

- če ni rRNA, se r-protein akumulira v celici in blokira translacijo lastne mRNA

Določeni geni v takšni policistronski enoti so neodvisni od te regulacije (npr. za β in β ' podenoto RNA-polimeraze v rif operonu), izjema je tudi r-protein L7/L12, ki je prisoten v štirih kopijah na ribosom in se prevaja bolj učinkovito od ostalih.

• na primeru monocistronskega gena

DNA-polimeraza faga T4 inhibira translacijo lastne mRNA z vezavo na mRNA v področju Shine-Dalgarno sekvence, na katero se sicer veže ribosom.

Regulacija s sekundarno strukturo mRNA

Struktura mRNA v predelu RBS in začetnega dela kodirajočega zaporedja omogoča boljšo/slabšo vezavo ribosoma in s tem boljšo/slabšo sintezo proteina, kar je zelo pomembno pri ekspresiji rekombinantnih proteinov v bakterijah.

Regulacijo s sekundarno strukturo najbolje ilustrira sinteza adenin metilaze, ki je kodirana na plazmidih nekaterih Gram-pozitivnih bakterij. Adenin metilaza metilira adenin v 23S rRNA, kar prepreči vezavo antibiotika eritromicina. Tvorijo se podobna stebla kot pri atenuaciji, le da gre v tem primeru za kontrolo začetka proteinske sinteze.

Možnosti sta torej dve:

1) Eritromicina ni v gojišču:

Ribosom zlahka prevede vodilni peptid in zapusti mRNA. Tvorita se stebli 1||2 in 3||4, kar onemogoči dostop ribosomu do iniciacijskega kodona.

2) Eritromicin je prisoten v gojišču:

Zaradi antibiotika se upočasni prevajanje vodilnega peptida, kar omogoči tvorbo stebla 2||3. Steblo 3||4 se ne more tvoriti. Omogočen je dostop drugega ribosoma do začetnega kodona metilaze. Na tem mestu je smotrno predpostaviti, da je v celici vedno nekaj rezistentnih ribosomov.

Ko je dovolj rezistentnih ribosomov, se noben več ne ustavi in sinteza metilaze se konča.

Avtogena regulacija sinteze RF2

RF2 prepoznava stop kodona UGA in UAA (RF1 pa UAA in UAG). Pri mRNA za RF2 je prvih 25 aminokislin v pravem ORF, naslednje pa so v +1. Po kodonih za 25 aminokislin sledijo baze UGAC, ki se pri kompletni sintezi prevedejo v Asp s premikom bralnega okvirja.

Situaciji sta lahko dve:

1) Dovolj RF2: Z ribosoma se sprosti prvih 25 aminokislin. RF2 prepoznava tudi lastni UGA kodon. V celici ni funkcionalnega RF2, razen že sintetiziranega.

2) Malo RF2: Sprostitev peptida zamuja, zato je dovolj časa za premik bralnega okvirja. Translacija se nadaljuje do končnega stop kodona UAG, ki ga prepoznava RF1. RF1 takšne kontrole nima.

Regulacija s komplementarno RNA

Pri regulaciji s komplementarno RNA gre za vezavo ssRNA (antisense) na mRNA bodisi neposredno v predelu začetka translacije bodisi kje drugje, kar vpliva na strukturo RNA.

Primer takšne regulacije je sinteza porina OmpF (outer membrane porine), ki se skupaj z micRNA sintetizirata kot odgovor na spremembo v osmolarnosti medija, ki jo zazna EnvZ. Pri povečanju osmolarnosti EnvZ aktivira OmpR, ki je pozitivni regulator genov ompC in micF. Produkt micF gena je RNA dolžine 174 nukleotidov z imenom micRNA (mRNA-interfering-complementary RNA), ki je komplementarna predelu na mRNA za OmpF, ki vključuje SD in AUG kodon. Tvori se RNA-RNA heliks, ki prepreči translacijo ompF mRNA.

Slika 58: Regulacija s komplementarno RNA

RRReeeggguuulllaaaccciiijjjaaa sss ppprrrooottteeeooollliiizzzooo Nekateri bakterijski proteini so bolj stabilni, kar je posledica primarne strukture in kompaktne

terciarne strukture, drugi proteini (LexA-represor, λ-represor, SulA) so manj stabilni in se hitro razgradijo.

Protein SulA je inhibitor celične delitve in je produkt SOS-genov. SulA cepi proteinaza Lon, ki odstranjuje nezrele in prekratke proteine. Po indukciji SOS-genov, se SulA akumulira in prepreči delitev celice. Po popravi poškodbe SulA ni več potreben, njegov gen je reprimiran z represosorjem LexA. Lon proteinaza SulA hitro razgradi. Lon mutante so letalno občutljive na UV. Pri obsevanju z UV pride namreč do cepitve LexA-represorja in sinteze SulA. Ko UV sevanja ni več, se SulA ne razgradi in celica se ne more deliti in kasneje propade.

TTrraannssllaaccii jjaa

Translacija - prevod je proces, pri katerem se informacija iz mRNA prevede v zaporedje aminokislin. V tem procesu sodelujejo vsi glavni tipi RNA in sicer: rRNA - glavna komponenta ribosomov, tRNA - prenaša aminokisline in mRNA - nosi informacijo za zaporedje aminokislin.

SSStttrrruuukkktttuuurrraaa tttRRRNNNAAA

tRNA ima sekundarno strukturo v obliki štiri/petperesnega lista detelje, listi predstavljajo t.i. roke, ki so:

- roka D (dihidrouridin) - antikodonska roka - dodatna roka, ki je lahko različno dolga - roka TψC (ψ - psevdouridin) - akceptorska roka (zaporedje -CCA-3')

Za tRNA so značilne modificirane baze, poleg prej omenjenih je tu še kvevozin, ki je derivat gvanozina. Pregled modificranih baz sledi. Zaradi modificiranih baz je možna tvorba drugačnih, šibkejših povezav med bazami: G-U, G-ψ, A-ψ).

tRNA ima terciarno strukturo v obliki črke L. Celotna tRNA je dolga 74-95 nt.

Posamezna aminokislina se veže na 2' ali 3' hidroksilno skupino riboze zadnjega nukleotida v procesu, ki ga katalizirajo aminoacil-tRNA sintetaze ob prisotnosti ATP. Posamezna tRNA-sintetaza prepozna določeno aminokislino in vse različne tRNA (in posledično vse antikodone na njih), ki jo lahko vežejo. Pomen določene tRNA je “napisan” v antikodonu, ne pa v aminokislini, ki jo ta tRNA prenaša.

Slika 59: Sekundarna in terciarna struktura tRNA

Slika 60: Modificiranih baz je več. Modificirane baze se pojavljajo v tRNA in nekaterih tipih rRNA, zlasti tistih, ki sestavljajo ribosom. Z rdečo barve so označene modifikacije. Skrajno levo so narisane izvorne baze. Modifikacija malenkost spremeni kemijske lastnosti prokurzorske baze, kar je pomembno npr. pri interakcijah kodon-antikodon. Siva barva vezi nakazuje mesto vezave na ribozni sladkor.

SSStttrrruuukkktttuuurrraaa rrriiibbbooosssooommmooovvv Translacija poteka na ribonukleoproteinskih partiklih - ribosomih, ki so različnih velikosti:

- pri prokariontih je njihova masa 70S (30S + 50S) - pri evkariontih je njihova masa 80S (40S + 60S)

Vsak ribosom je sestavljen iz dveh podenot, ki in vitro asociirata ob zvišanju koncentracije Mg2+ in disociirata ob njenem znižanju. Pri sintezi proteinov je lahko na eni mRNA več ribosomov, ki jo prevajajo, nastala struktura je polisom. Bakterijski polisomi so daljši, evkariontski so krajši - povprečno 8 ribosomov na molekulo RNA. En ribosom prekrije območje 30-35 nt. Sintetizirani protein se prične zvijati že ob koncu sinteze.

bakterijski ribosom (70S) evkariontski ribosom (80S)

mala podenota 30S : 16S rRNA 21 proteinov

40S : 18S rRNA 33 proteinov

velika podenota

50S : 23S rRNA 5S rRNA 31 proteinov; L7 v 4 kopijah

60S : 28S rRNA 5,8 rRNA ~ začetku 23S rRNA 5S rRNA

Tabela 11: Razlika v strukturi bakterijskih in prokariontskih ribosomov

Masa ribosoma je več kot 1000 kDa, pri čemer dve tretjini k celotni masi prispevajo rRNA, le tretjina odpade na proteine. V ribosomih je prisotnih 80% vseh rRNA v celici.

Ribosomi organelov so drugačni od citosolnih; v mitohondrijskih ribosomih tako ni 5S in 5,8 rRNA. Pri delovanju se konformacija ribosoma spreminja, porablja se GTP. Prevajanje se vrši na stiku obeh podenot.

S primerjavo primarnih struktur rRNA pri podobnih organizmih je bilo ugotovljeno, kakšna bi naj bila sekundarna struktura ribosoma. Pokazalo se je, da so kratki odseki - manj kot 8 bp - v dvoverižni obliki. Modeli so bili tudi preverjeni na celih ribosomih s primerjavo 3D-struktur, specifičnimi modifikacijami in delovanjem nukleaz in specifičnih proteinov. Nekatere baze v rRNA so metilirane. 16S rRNA ima štiri domene, ki imajo točno določeno mesto v mali podenoti. Ribosom se delno sestavi že pri transkripciji.

Študij proteinske sinteze poteka s pomočjo antibiotikov, ki inhibirajo posamezne stopnje translacije:

- inciacija: streptomicin - elongacija: kiromicin, puromicin - peptidil transferazno delovanje: eritromicin, kloramfenikol - translokacija: fuzidna kislina

Ribosom je sestavljen iz translacijske in izhodne domene. Izhodna domena sodeluje pri vezavi ribosoma na membrano (gER pri evkariontih). Na translacijski domeni so aktivna mesta P, A, peptidil transferazno, in mesto za vezavo mRNA, EF-G, EF-Tu in 5S rRNA.

Slika 61: Polisomi

Možnost napake pri translaciji ( < 10-5) je veliko manjša od možnosti napačnega parjenja kodon-antikodon, ker ima ribosom tudi kontrolno branje, pri katerem delno sodelujejo tudi translacijski faktorji. Verjetnost vezave napačne aminokisline na tRNA z aa-tRNAaa-sintetazo je tudi < 10-5.

Slika 62(zgoraj): Mala podenota 30S ribosoma pod elektronskim mikroskopom

Slika 63: 16S rRNA, ki je ena od komponent ribosoma, je sestavljena iz štirih domen. Vsaka domena ima določeno funkcijo pri translaciji.

GGGeeennnssskkkiii kkkoooddd Na mestu kodona je lahko katerakoli kombinacija treh nukleotidov. Genetska koda je bila razvozlana

s pomočjo sintetičnih polinukleotidov in vezave radioaktivno označenih aa-tRNA (Nirenberg in Matthaei, 1961). Vseh možnih kombinacij nukleotidov je 64, od tega tri odpadejo, ker predstavljajo stop kodone (UAA, UGA UAG). Se pravi, da velik del aminokislin kodira več kodonov - degeneracija genskega koda. Povprečno aminokislino kodirajo trije kodoni, izjemi sta Met in Trp. Kodoni, ki kodirajo isto aminokislino, so sinonimni. Pokaže se, da se kodoni med sabo največkrat razlikujejo v bazi, ki je na mestu 3 v kodonu. Pogosto je ta baza inozin, ki lahko tvori več vodikovih vezi (za razliko od A-T, G-C).

Skoraj popolna univerzalnost genetske kode kaže na to, da se je pojavila že zelo zgodaj v evoluciji. Do odstopanj pride v mitohondrijih: UGG → Trp, UGA → Trp (sicer je to stop): v mitohondrijih vretenčarjev delujeta AGA in AGG kot stop kodona.

Slika 64: Genski kod

PPPooottteeekkk tttrrraaannnssslllaaaccciiijjjeee Sinteza proteinov poteče v treh fazah:

1) Iniciacija je počasna faza, ki traja do nastanka prve peptidne vezi. V tej fazi se ribosom veže na mRNA in nastane iniciacijski kompleks.

2) Elongacija je hitra faza sinteze peptidnih vezi 3) Terminacija je faza, v kateri se sintetizirani protein sprosti z ribosoma, ki ob tem disociira na

obe podenoti.

Sinteza proteinov je energijsko potraten proces, porablja se energija GTP. Zaradi potratnosti tega procesa imajo celice veliko mehanizmov, ki preprečujejo nepotrebno sintezo .

Na mRNA se najprej veže mala podenota ribosoma, ki pokrije območje desetih kodonov (30 nt). Na ribosomu sta dve mesti za vezavo tRNA, ki sodelujta pri tvorbi peptidnih vezi:

- mesto A, aminoacilno, na katerega se veže aa-tRNA - mesto P, peptidilno, na katerega se veže peptidil-tRNA, ki je pred mestom A.

Obe mesti ležita na veliki podenoti ribosoma. Tretje mesto, mesto E, sodeluje pri sprostitvi deaminoacilirane tRNA z ribosoma. tRNA se na ribosomu premika v isti smeri kot mRNA: A → P → E.

Iniciacija

V bakterijah je večina ribosomov vključenih v sintezo proteinov. Del ribosomov je prostih, pri čemer gre za dinamično ravnotežje 70S kompleksa in obeh podenot. Pri iniciaciji sodelujejo iniciacijski faktorji: IF-1, IF-2 in IF-3.

Proces vezave ribosoma na mRNA poteče v treh fazah:

a) Najprej se 30S podenota poveže z IF-3. Sledi vezava na RBS mesto in nastanek iniciacijskega kompleksa.

b) Po disociaciji IF-3 se lahko na 30S podenoto veže še 50S podenota.

IF-3 ima tako dvojno vlogo:

a) stabilizira prosto 30S podenoto b) poskrbi za vezavo male podenote na mRNA

IF-2 je pomemben pri vezavi iniciatorske t-RNA (formil-Met-tRNAf ). IF-1 stabilizira iniciacijski

kompleks.

Mesto za vezavo ribosoma (RBS) pri prokariontih je sestavljeno iz dveh delov:

- Shine-Dalgarnovega zaporedja (AGGAGG), ki je komplementarno 3' koncu 16S rRNA - začetni kodon AUG, redkeje GUG, UUG

Prva aminokislina pri sintezi vseh bakterijskih proteinov je formil-metionin (f-Met). Formilacija poteče po vezavi Met na tRNA. Začetni metionin se pri veliko proteinih post-translacijsko odstrani s specifično deformilazo oziroma aminopeptidazo. Kodona GUG in UUG, ki lahko služita kot iniciatorska, se interno bereta kot Val oziroma Leu. Vsi evkariontski proteini se pričnejo z Met.

Zakaj ravno Met? S poskusi je bilo ugotovljeno, da na stabilnost določenega proteina močno vpliva njegova primarna struktura. Nekatere aminokisline protein stabilizirajo, druge destabilizirajo, tretje nimajo nobenega učinka. Stabilizacija je največja, če je aminokislina metionin.

Po tvorbi iniciatorskega kompleksa se na delno P-mesto na ribosomu veže f-Met-tRNAf, pri čemer sodeluje IF-2 (eden od G-proteinov - GTP vezavnih proteinov). Temu sledi vezava večje podenote in vezava aa-tRNAaa na A-mesto. Pri vezavi 50S podenote se cepi GTP.

Iniciacija pri evkariontih je drugačna. AUG je skoraj vedno začetni kodon, donor začetnega Met je Met-tRNAi. Shine-Dalgarnovega zaporedja ni. Mala podenota se veže na 5'-konec mRNA in potuje do iniciacijskega kodona, nato se veže še 60S podenota. Pri iniciaciji sodeluje več iniciacijskih faktorjev, eIF.

Elongacija

Pri elongaciji sodeluje veliko elongacijskih faktorjev, EF in eEF. Proces poteče v treh fazah:

a) Vezava aa-tRNAaa na ribosom b) Prenos polipeptidne verige c) Premik ribosoma za en kodon naprej

ad a) Pri bakterijah je pri vezavi aa-tRNAaa na ribosom vključen EF-Tu-GTP, ki se reciklira s pomočjo EF-Ts; proces je znan pod imenom gvanilatna izmenjava. EF-Tu sodi med GTP-vezavne proteine.

ad b) Pri vzpostavitvi peptidne vezi pride do prenosa polipeptidne verige peptidil-tRNA iz mesta P na aa-tRNA na mestu A. Velika podenota ima torej peptidil-transferazno aktivnost.

ad c) V tretji fazi se ribosom pomakne za en kodon vzdolž mRNA. tRNA se sprosti, v proces je vključen EF-G. Pri sprostitvi tRNA se porablja energija GTP. Pri bakterijah sodeluje pri sintezi proteinov tudi 4,5S rRNA, ki je predhodnik SRP.

Evkarionti imajo proteine s podobno funkcijo: eEF-1α, eEF-1βγ ter eEF-2. Po vezavi se cepi GTP.

Terminacija

V bakterijah več sprostitvenih faktorjev prepoznava stop kodon. RF1 prepoznava UAA in UAG, RF2 pa UGA in UAA. Pri tem sodeluje tudi RF3 (G-protein!) in RF4 - RRF - ribosome recycling factor.

Pomembni faktorji sodelujejo tudi pri evkariontski terminaciji: eRF1 in eRF3 (GTP!).

Na tem mestu velja omeniti molekulsko mimikrijo, se pravi, da molekule oponašajo molekule: EF-G oponaša EF-Tu-GTP, isto molekulo oponašajo tudi RF1, RF2, RF3 in RRF.

Slika 65: Na policistronski mRNA se lahko geni prepisujejo neodvisno eden od drugega.

ZZZgggrrraaadddbbbaaa ppprrroookkkaaarrriiiooonnntttssskkkeee iiinnn eeevvvkkkaaarrriiiooonnntttssskkkeee mmmRRRNNNAAA

Večina razlik med obema tipoma mRNA izhaja iz različne organizacije obeh tipov celic in posameznih enot transkripcije. Prokariontska mRNA je enostavnejša, vendar vzrok ni v naknadni poenostavitvi, ampak v dejstvu, da so se prokarionti tekom evolucije pojavili prej. Zaradi njihovega načina življenja je ta organizacija optimalna.

prokarionti evkarionti (RNA-pol II) transkripcijska enota policistronska monocistronska 5'-konec ppp-5' metilirana kapica;5'Gppp-5' tvorba 3'-konca s terminacijo prepisa s cepitvijo 3'-konec zadnja baza mRNA poliA rep introni odsotni; izjeme arheje prisotni transport ni nujen nujen vezava na ribosom Shine-Dalgarno najprej 5'-konec translacija hitrejša - 15 aa/s počasnejša - 2 aa/s t½ nekaj minut daljši polisomi daljši krajši transkripcija, translacija, degradacija obenem prostorsko ločene,

vendar obenem Tabela 12: Razlike v organizaciji mRNA pri prokarionith in evkariontih

Razdalja med cistroni (intercistronska regija) in sekundarna struktura mRNA igrata pomembno vlogo pri iniciaciji translacije. Čeprav je translacija pri evkariontih zapletena, jo je mogoče izvajati in vitro v brezceličnih sistemih, oocitah Xenopus levis (krastača).

Sintezo poliA repa, s formalno oznako poli(A)+, katalizira encim poli (A)-polimeraza, ki na 3'-konec RNA transkripta doda približno 200 A. Ko mRNA pride v citoplazmo, se ta rep postopoma krajša; poliA rep torej podaljša življenjsko dobo mRNA v celici. mRNA za histone nimajo poliA repa.

Dodajanje G na 5'-konec evkariontske mRNA katalizira gvanilil-transferaza. Struktura, ki tako nastane, se imenuje kapica (cap) in vsebuje povezavo 5'-ppp-5'. Na mestu 7' je G metiliran, dodatno sta lahko metilirani tudi naslednji dve bazi. Prva baza je običajno purin.

SSuupprreessii jjee

Že pred nekaj poglavji je bilo omenjeno, kako delujejo celični mehanizmi, ki odpravljajo mutacije. Eden od način popravljanja mutacij so tudi supresorske mutacije, ki so lahko bodisi intragenske (znotraj) genske ali intergenske (medgenske).

Supresorski geni omogočajo supresijo mutacij v drugih genih. Delujejo tako, da kodirajo različne molekule, ki so vključene v translacijo:

- supresorske tRNA - ribosomski proteini, ki lahko šibko suprimirajo

nesmiselne in drugo-smiselne mutacije - aminoacil-tRNA sintetaze - encimi, ki modificirajo tRNA; večinoma gre za

supresorsko mutacijo v antikodonu ali blizu njega - elongacijski faktorji

Supresorski geni imajo posreden vpliv na mutiran gen: spremenjena (mutirana) mRNA se prevede tako, da se negativni učinek mutacije kompenzira v največji možni meri.

Spremembo kodona povzročijo bodisi nesmiselne (nonsense) bodisi drugosmiselne (missense) mutacije. Produkti prvih so krajši, navadno nefunkcionalni proteini, produkti drugih so pogosto temperaturno občutljivi proteini, npr. abnormalni hemoglobini.

IIInnntttrrraaagggeeennnssskkkaaa sssuuuppprrreeesssiiijjjaaa Pri intragenski supresiji se lahko delecija enega nukleotida kompenzira tako, da se v bližini, navzdol

od mesta delecije, vstavi en nukleotid. Posledica take mutacije je protein, ki ima zamenjanih le nekaj aminokislin, kar velikokrat ne vpliva bistveno na delovanje proteina.

IIInnnttteeerrrgggeeennnssskkkeee (((eeekkkssstttrrraaagggeeennnssskkkeee))) sssuuuppprrreeesssiiijjjeee Intergensko supresijo navadno vršijo tRNA, kjer predstavlja supresorska mutacija spremembo

antikodona tako, da prepozna mutiran kodon in se vstavi aminokislina, ki še omogoča funkcionalnost proteina. Primarna mutacija je torej v proteinskem genu ali mRNA, sekundarna mutacija, ki popravi vpliv te mutacije, je v antikodonu tRNA.

SSSuuuppprrreeesssooorrrssskkkeee tttRRRNNNAAA a) Supresija nesmiselnih mutacij

Obstajajo tri skupine supresorjev, vsakemu terminacijskemu kodonu ustreza ena. V E. coli je vsaj šest supresorskih tRNA, ki so sposobne prepoznati kodon UAG, njihov antikodon je največkrat CUA← (puščica označuje smer branja), do katerega je prišlo s točkasto mutacijo v divjem tipu.

Primer: Mutacija kodona UUG → UAG. Spremenjeni kodon prepozna supresorska Tyr-tRNATyr, ki ima mutiran kodon GUA← v CUA←. V končni fazi se namesto Leu oziroma stop vgradi Tyr. Supresorska tRNA tekmuje za vezavo na stop kodon s sprostitvenima faktorjema.

b) Supresija drugosmiselnih mutacij

Drugosmiselne mutacije je moč suprimirati tako, da se kljub mutaciji vstavi pravilna aminokislina, ali z vstavitvijo aminokisline, ki je še sprejemljiva za protein.

Primer: Mutacija kodona GGA → AGA. Spremenjeni kodon prepozna supresorska Gly-tRNA, ki ima mutiran antikodon UCC ← UCU. Končni rezultat je vgradnja Gly namesto Arg. Supresija je torej delna. Spremenjeni kodon AGA prepoznavata tako Arg-tRNAArg kot supresorska Gly-tRNAGly.

c) Supresija spremembe bralnega okvirja

Če pride do insercije ali delecije nukleotida, supresorska tRNA omogoči ponovno vzpostavitev pravega bralnega okvirja. V splošnem se translacija v napačnem bralnem okvirju prezgodaj konča oziroma je v večini primerov blokirana, ker so vsi bralni okvirji razen “pravega” blokirani z velikim številom stop kodonov.

Primer: supresorska Gly-tRNA, ki ima v antiokodonu CCCC←, omogoči vzpostavitev pravega bralnega okvirja.

Slika 66: Tretji učinek, ki ga imajo lahko supresorske tRNA, je, da sinteza proteina poteče preko stop kodona. Posledica take sinteze so daljši proteini.

SSttrruukkttuurraa ggeennoommaa pprrii vviiššjj iihh

eevvkkaarriioonnttiihh

Evkariontski genom je sestavljen iz:

1) visoko ponavljajočih se zaporedij, ki so enostavna, dolga 10-100 bp in so pogosto tandemsko urejena. Gre za t.i. satelitsko DNA, katere del se nahaja v področju centromer. Visoko ponavljajoča se zaporedja sestavljajo mini in mikrosateliti, ki so zelo variabilni, še posebej mikrosateliti, kar se uporablja pri ugotavljanju očetovstva. Visoko ponavljajoča se zaporedja zavzemajo manj kot deset odstotkov celotnega genoma.

2) zmerno ponavljajočih se zaporedij, ki so razmetana po genomu in so prisotna v manjšem številu kopij. Primeri teh zaporedij vključujejo TE, kot so L1-elementi, Alu I ponovitve. V človeškem genomu zazvemajo 30-50% celotnega genoma.

3) Neponavljajočih se zaporedij, ki zavzemajo 40-60% človeškega genoma, kar ustreza od 30-40000 genov. V določenem tipu celic (tkivu) evkariontov je hkrati aktivnih od deset do dvajset tisoč genov. V praksi se izkaže, da le 25% od tega dejansko ustreza genom. Od te četrtine le 1% zavzemajo eksoni, vse ostalo so introni. Sklep: Velik del čoveškega genoma ne kodira ničesar! Ogromen presežek sekvenc, ki ne kodirajo ničesar, nad dejanskimi geni je pomembna varovalka, ki omogoča, da se velik del mutacij sploh ne pozna, ker potečejo na kakšnem ponavljajočem se zaporedju ali intronu.

Slika 67: Analiza vsebnosti posameznih elementov genoma pri človeku in drugih organizmih pokaže, da velik del genoma vseh organizmov vsebuje znatne deleže ponovitev.

Slika 68: Zankasta vlakna, ki nastanejo pri lizi celice E. coli

ZZZgggrrraaadddbbbaaa kkkrrrooommmooosssooommmooovvv Haploidni evkariontski genom sestavlja

DNA, ki je dolga okoli 4 cm. Celoten diploidni genom človeka znotraj ene celice je torej dolg 1,8 metra. Dedni material je v celici zelo učinkovito pakiran. Gostota DNA v celici je kar 100 mg/mL, pri celični delitvi se ta gostota še poveča. Gostota bakerijske DNA je desetkrat manjša.

Genetski material je v bakterijah viden v obliki nukleoida, v evkariontskem jedru je viden v interfazi celične delitve kot kromatin, ki je sestavljen iz kompleksa DNA-proteini.

Pri lizi bakterijske celice se DNA pojavi v obliki zankastih vlaken, ki so pritrjena na dele plazmaleme. Velikost zank je ~ 40 kb, pri E. coli jih je okoli sto. Posamezno vlakno je kompleks dsDNA z bazičnimi proteini (histoni).

Do lize evkariontskega jedra pride v interfazi. Premer vlakna je 10 nm (DNA v nukleosomih). Po odstranitvi histonov v metafazi se DNA pojavi v obliki zankastih vlaken, ki so pritrjena na osrednji proteinski podstavek. Povprečna zanka je dolga 560 kb.

Proteinski podstavek je viden pri obeh kromatidah. Seveda so lahko kromosomi vidni

tudi prej. Možno jih je videti kot krtačaste ali politene kromosome v celicah D. melanogaster. Temna območja ustrezajo območjem z intenzivnejšo transkripcijo.

V evkariontskem jedru je kromatin pritrjen na jedrni matriks z MAR-zaporedji - matrix associated region. Te regije verjetno igrajo pomembno vlogo tudi pri replikaciji in transkripciji.

Kromatin je pod mikroskopom viden v dveh oblikah. Prvi, rahlejši, je evkromatin in pri

Slika 69: Politeni kromosomi pri D. melanogaster

človeku zavzema 90% kromosomov, 8% predstavlja heterokromatin. Heterokromatin je lahko konstitutivni ali fakultativni; prvi se nikoli ne prepisuje, drugi se lahko prepisuje občasno. Fakultativni heterokromatin predstavljajo celotni neaktivni kromosomi (v primeru diploidnih genomov).

Ko se v interfazi pojavijo kromosomi, se interfazna DNA skrajša za 5× - 10×. Posamezen kromosom je viden kot par sestrskih kromatid, vsako tvori vlakno s premerom 30 nm. Dejansko se DNA ne skrajša, ampak se samo bolj na tesno pakira.

Slika 70: Če iz kromosoma odstranimo histone, se zanke DNA pakirajo na takšen način. Črna lisa na dnu slike je proteinsko jedro, ki služi kot podstavek, na katerega se veže DNA.

Pri pakiranju kromatina v kromosom velja naslednja hierarhija:

- dsDNA s premerom 2 nm - 10 nm vlakno, 4× krajša - 30 nm vlakno, 40× krajša - tvorba zank, ≥ 1000× krajša - tvorba kromatide, ≤ 10000× krajša

Humani kariotip je vidni prikaz vseh 46 človeških kromosomov v mitozi.

Kromosomi kažejo urejeno strukturo iz temnih-G pasov in svetlih-R pasov. G se nanaša na barvilo Giemsa. Vsak posamezen pas je sestavljen iz okoli 107 bp. Kromosomi so sestavljeni iz dveh krakov: krajšega p in daljšega q.

Osnovni elementi za obstoj kromosoma:

- začetek replikacije - centromere za ločevanje kromatid - telomeri za vzdrževanje koncev; pri

človeku (TTAGGG)n

Slika 72: Sestrski kromatidi s premerom 30 nm. Jasno se vidi centromera, kjer sta obe kromatidi povezani.

Slika 71: Struktura telomeraznega dela kromosomov je sestavljena iz večjega števila zank. Za replikacijo teh koncev je potreben encim telomeraza, ki ob pomoči RNA-primerjev sintetizira konce.

ZZZgggrrraaadddbbbaaa nnnuuukkkllleeeooosssooommmooovvv Nukleosom je osnovna enota evkariontskega kromatina, ki ga sestavlja:

- histonsko oktamerno jedro (H2A+H2B+H3+H4)2 - dsDNA ~ 200 bp, ki naredi dva zavoja okrog histonskega jedra v dolžini 160 bp

Histoni so bazični proteini (velik delež Lys, Arg) z molekulsko maso 11-15 kDa. Za izgradnjo 30 nm vlakna je potreben histon H1, ki je nekoliko večji od ostalih in bolj variabilen. Struktura je verjetno vijačna. Pri nadaljnem pakiranju v kromosom sodelujejo še različni nehistonski proteini iz družine SMC - structural maintenance of chromosomes.

Ko nastane 30 nm vlakno, ki je osnovna komponenta kromosoma, ni več mogoča ekspresija genov. Prepisovanje genov poteka preko nukleosomov, včasih so odstranjeni tudi ti. Področja prepisovanja kažejo povečano občutljivost za cepitev z Dnazo I, kar kaže na spremembe v strukturi nukleosoma, ki jih povzroči acetilacija, metilacija ali fosforilacija histonov, ki delno nevtralizira pozitivni naboj histonov.

Hipersenzitivna mesta za Dnazo I se pojavijo na vsakih 200 bp in so večinoma:

- mesta za regulacijo transkripcije - mesta začetka replikacije - področja centromer

Ta mesta velikokrat prekrivajo drugi proteini, v teh področjih so lahko tudi MAR-zaporedja.

Pri aktivaciji genov se to področje nukleosomske DNA malenkost spremeni:

- nukleosomi postanejo v tem delu bolj občutljivi za delovanje Dnaze I

- zmanjšana metilacija (5-Me-C), predvsem v področju promotorja, kjer so pogosto t.i. CpG otoki. Metilacija C preprečuje transkripcijo.

V sesalskem genomu je približno 30000 CpG otokov, ki imajo zmanjšano vsebnost histonov H1, ostali histoni so močno acetilirani. Pri celični DNA živali je 2-7% citozinov metiliranih, večina metilnih skupin je na CG-dubletih.

Pri spermijih in jajčnih celicah je lahko vzorec metilacije drugačen in specifičen. Gre za t.i. podedovan vzorec (imprinting-vtisnjenje), kar pomeni, da je ekspresija določenega alela v zarodku odvisna od tega, ali je podedovan od matere ali od očeta. Pri nastanku gamet pride do resetiranja vzorca. Pri spermatogenezi se vsi aleli demetilirajo ne glede na to ali so bili prej metilirani ali ne. Pri oogenezi se vsi metilirajo.

Slika 73: Tridimenzionalna struktura histonskega jedra. Obroč na prvi sliki nakazuje navitje DNA, če pogledamo na histonsko jedro do zgoraj. Žičnati model na spodnji sliki je stranski pogled na histonsko jedro z navito DNA.

Molekularna Genetika Skripta by Jernej[1]

Documents

Vol2-4-1992 - KBCSMklinkemija.kbcsm.hr/HDMB/BiochMedARHIVA/Vol_02_4_1992/10_Prijedlog... · Toksikologija (8) Molekularna genetika s osnovama biotch- nologija. (8) Uvod u biotiziku

Molekularna genetika - SSJ Molekularna genetika.pdf · •V dednem materialu vsakega osebka je zapisano, kakšna bo struktura proteinov, celic, tkiv in organov tega osebka •Zapisano

Katja Repnik, Uroš Potočnik...MOLEKULARNA BIOLOGIJA in MOLEKULARNA GENETIKA Navodila za laboratorijske vaje Maribor, 2013/2014 Laboratorijske vaje iz Molekularne biologije in Molekularne

Biokemija - fkit.unizg.hr38].pdf · povezuje opća znanja u znanostima o životu – genetika, biologija stanice, molekularna biologija, fiziologija i imunologija, farmakologija i

Diplomski Molekularna biologija - web.dekanat.pmf.hrweb.dekanat.pmf.hr/redpred/pdf/biologija/diplomski_molekularna... · Medicinska genetika (2+2) 60 6 ... Jasna Ban, Maja Matulić

PRIRUČNIK ZA MOLEKULARNU GENETIKU DOMAĆIH … · Priručnik za studente I. semestra diplomskog studija Genetika i oplemenjivanje životinja za modul Molekularna genetika životinja

GENETIKA NATURALIZIRANIH POPULACIJ ŠARENK · KG molekularna ekologija/populacijska genetika/filogegorafija/ribištvo/akvakultura/ tujerodne vrste/ribe/Salmonidae/šarenka/Oncorhynchus

Jernej kopitar

Jernej Stritih Direktor

Stanična i molekularna biologija godina I. - biotech.uniri.hr 2013/BIL_104_St_i_mol_bio... · molekularna biologija“, studenti ... Medicinska genetika će bit će opisana u kontekstu

KeyframeAnimation - Jernej Barbic

Izvjestaj izbor nastavnik Patologija - unibl.orgunibl.org/uploads/files/strane/izbori_u_zvanje/medicina/Izbor_S...Romac S. (eds.): Molekularna genetika u deejoj neurologiji i psihijatriji

Molekularna genetika · 2018-01-18 · Molekularna genetika Predmetni nastavnik Goran Brajušković brajuskovic@bio.bg.ac.rs Nastavnik doc. dr Tomaž Bratkovič Farmaceutski fakultet

Professor Dragan Primorac. M.D., Ph.D. · (Molekularna genetika nasljednih bolesti, farmakogenetika, genska i stanična terapija) 2009.- Medicinski fakultet, Sveučilišta u Osijeku,

UTVRĐIVANJE RAZINEcore.ac.uk/download/pdf/149969289.pdf · 2018. 2. 12. · Molekularna genetika ABH-antigena ... 8. ŽIVOTOPIS 90 . 1 1. UVOD Klinička važnost svih sustava eritrocitnih

Zavrsetak Kursa Molekularna Genetika

Molekularna genetika v medicini

molekularna dijagnostika final - Specijalna bolnica Sv. Katarina...ISBN 978-953-176-862-7 CIJENA 126,00kn MOLEKULARNA GENETIKA MOLEKULARNA GENETIKA urednici: Jadranka Sertić, Stjepan

AML predstavitev kliničnega primera - hematologija.org P... · Molekularna genetika: FLT3 ITD Negativen, FLT3 D835 Negativen; KM-Mutacija v genu NPM1 Pozitiven; KM-WT1/qPCR Pozitiven;

6. Genetika i Molekularna Biologija