Multi OmicsProfiling of Methionine Restricted MCF7 Cells in 24 … · 2017-09-27 ·...

Multi‐Omics Profiling of Methionine‐Restricted MCF7 Cells in 24 Hours Using a Prototype UPLC‐

Compatible Microfluidic Device

J. Will Thompson 1, Jay Johnson2, Giuseppe Astarita2, XiaohuTang1, Giuseppe Paglia3, Jim Murphy2, Steven Cohen2, Mark Bennett4, Jen‐Tsan Chi1, Jim Langridge4, Geoff Gerhardt2,  

and  M. Arthur Moseley1

1Duke University School of Medicine; 2Waters Corporation, Milford, MA and Manchester, UK; 

3Center for Systems Biology, University of Iceland, 4Nonlinear Dynamics, Durham, NC

High Throughput MS‐Based ‘Omics Methods

Cox, J., and Mann, M. Nat. Biotechnol. 2008, 26, 1367–1372.

Nagaraj, N and Mann, M. et al. Mol. Cell. Proteomics 2012 11, M111.013722.

ProteomicsLipidomicsShevchenko et al. J Mass Spectrom. 2012 Jan;47(1):96‐104.

Reid et al. Anal Chem. 2012 Nov 6;84(21):8917‐26.

Castro‐Perez et al, J Proteome Res. 2010 May 7;9(5):2377‐89.

MetabolomicsKurwin IJ et. al, Ann. N.Y. Acad. Sci.2013 1287, 1–16 C

Want E et. al Nature Prot. 2013 8(1): 17‐32

A Case for 150 um Separations

Assumptions: UPLC conditions of 0.45 cm/sec linear velocityAiming for fast, efficient separation (10‐15 min per sample or fraction)Signal is proportional to analyte concentrationSwept volume (‘delay’) is 3 ul

• It offers a nice blend of:– Sensitivity of capillary scale– Solvent and sample use of 

capillary scale– Throughput of analytical 

(UPLC) scale• But, there have been ‘historical’ 

hangups:– Spray stability and robustness 

at 2‐4 ul/min– Columns that are easy to 

install, with UPLC performance

390 ul/min

90 ul/min (1 mm)

0.5 ul/min (75 um)

0.22 ul/min (50 um)

8 ul/min (300 um)

2 ul/min (150 um)

1.4 ml/min

Tile Design and Flow Diagram

Incoming flow

Analytical Column

Electrical Connections(EEPROM, Heater)

ESI EmitterAssembly

Flexible Configuration of 150 um Tile DeviceConfiguration for Infusion and 1DLC(Polar and Nonpolar Metabolites)

Configuration for High/Low pH 2DLC(Proteins)

Tile options tested:5, 10, 20 cmBEH C18HSS T3 C18CSH C18

BEH C4BEH Amide HILICInfusion Tile

The Beauty of the Tile Interface… seamless column installation for UPLC

Pressure

Solvent AFlow

Solvent BFlow

‐70.0            ‐60.0           ‐50.0           ‐40.0           ‐30.0           ‐20.0           ‐10.0             0   

Injections w 20 cm column Injections with 10 cm columnTILE CHANGE

Target Timeline of a “Comprehensive” MS‐based ‘Omics Profile on a Single System

LIPID INFUSION METHODS: 5 min/sampleMETABOLITE UPLC METHODS: 15 min/samplePROTEIN 2D UPLC METHOD: 3 hr/sample

0         1        2        3        4        5        6        7        8         9       10                 24

Tune and CalibrateLIPID (ESI+)LIPID (ESI‐)

Metabolite (RPLC, ESI+)

Metabolite (HILIC, ESI+)Metabolite (HILIC, ESI‐)

Proteome (3‐fraction RP/RPLC, ESI+)

transition (column change)

transition (column and wash solvent change)

transition (change LC and column)

Data Collection Timeline (Real Time Capture)

Tune and Calibrate+ESI Lipids

‐ESI Lipids

Tile Change

Equilibration+ESI HILIC ‐ESI HILIC

Tile Change

Wash Solvent Exchange

+ESI RPLC

7:00 am                      9:00 am                    11:00 am                          1 pm                             3 pm

Data Collection Timeline, continued…Switch LC System

2DLC Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6

4 pm            7 pm 10pm         1 am          4 am           7 am           10am        1 pm(Will goes to beach)

Bradford Assay(normalize by total lysate)

Cell Disruption(Sonication in AmBic pH8)

Polar Metabolites80/20 MeOH/water

1 hr extraction, N2 dry

Lipids80/20 MTBE/MeOH1 hr extraction, N2 dry

Proteins0.25% w/v RapigestDTT/IAA/trypsin overnight

ResuspendMeOH (HILIC)

OrH20/MeCN (RPLC)(15 min/sample)

Resuspend4/2/1

IPA/MeOH/CHCl3(5 min/sample)

Acidify, Spin, Dry 20 mM Ammon Formate pH 10Inject 8 ug for 2DLC‐MS/MS(3 hr/sample)

Sample Preparation StrategyMCF7 

+/‐Methionine

Bradford Assay(normalize by total lysate)

Cell Disruption(Sonication in AmBic pH8)

Polar Metabolites~48%

80/20 MeOH/water1 hr extraction, N2 dry

Lipids~48%

80/20 MTBE/MeOH1 hr extraction, N2 dry

Proteins~4%0.25% w/v RapigestDTT/IAA/trypsin overnight

ResuspendMeOH (HILIC)

OrH20/MeCN (RPLC)(15 min/sample)

Resuspend4/2/1

IPA/MeOH/CHCl3Inject 4% for FIA(5 min/sample)

Acidify, Spin, Dry 20 mM Ammon Formate pH 10Inject 8 ug for 2DLC‐MS/MS(3 hr/sample)

Sample Preparation StrategyMCF7 

+/‐Methionine

BPI

MP B Co

mpo

s.

m/z

Time (min)

Development of a Versatile RPLC Metabolomics Method

150 um x 10 cm 1.7 um BEH C18 tile, F = 2.0 ul/min at 45°CMobile phase A: 0.1% Formic acid, 0.02% HFBA, in water Mobile Phase B: 0.1% Formic acid in 10/90 IPA/MeCNMass Spectrometry: Synapt G2 HDMS, Resolution mode (25,000 Rs) @ 5Hz

~16,500 total deisotoped features~2,900 ‘high confidence’ features

Polar amino acids

phospholipids

‘native’ peptides

Moderate polarity metabolites

Software for Quantitative Analysis, “Omic” Tools(5’‐methyl thioadenosine (MTA), from RPLC data)

+Met ‐Met

Progenesis COMET/TransOmics(Nonlinear/Waters)

Rosetta Elucidator(Rosetta Biosoftware)

min2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

%

0

100

F1:TOF MS,ES+298.089

-M1 sample +ESI metab

8.740e+003MTA6.22

401.258685

5.784.901.88 3.82

min2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

%

0

100

F1:TOF MS,ES+298.089

pool of +M and -M samples, 2 ul injection, 4x dilution

4.003e+004MTA6.22

1850.2239909

4.89

+Met ‐Met

Software for Quantitative Analysis, “Targeted” Tools(5’‐methyl thioadenosine (MTA), from RPLC data)

Targetlynx(Waters)

Skyline v1.4.1(MacCoss, MacLean)

‘Direct’ HILIC Method Translation from 2.1mm to 0.15 mm

Parameter 2.1 mm UPLC  (Column) 0.15 mm UPLC (Tile)

Column Length 150 mm 100 mm

Mobile phase A/B 0.1% FA in H20/MeCN 0.1% FA in H20/MeCN

Flow Rate (Velocity) 0.4 ml/min (0.45 cm/sec) 0.002 ml/min (0.44 cm/sec)

Loop offline* 0.1 min 2.5 min

Gradient 99% to 30 % B in 5.9 min 99% to 30% B in 7 min

Sample reconstitution* 50/50 MeCN/H2O 99/1 MeCN/H2O

Methionine

Xanthene

Lactose

Arginine

Bradford Assay, 1.8mg/sample(normalize by total lysate)

Cell Disruption(Sonication in AmBic pH8)

Polar Metabolites~48%

80/20 MeOH/water1 hr extraction, N2 dry

Lipids~48%

80/20 MTBE/MeOH1 hr extraction, N2 dry

Proteins~4%0.25% w/v RapigestDTT/IAA/trypsin overnight

Resuspend2/1/0.2 MeCN/

Formic Acid/HFBAInject 1% for LC‐MS/MS

(30 min/sample)

Resuspend4/2/1

IPA/MeOH/CHCl3Inject 4% for FIA(10 min/sample)

Acidify 1/2/97 TFA/MeCN/waterInject 20% for 2DLC‐MS/MS(3 hr/sample)

Summary of Multi‐Omics Sample Preparation Strategy

Lipid Profiling using Flow Injection Analysis and an Infusion Tile

Analysis of the Lipid Isolate from MCF7 cells (prepared using MTBE/MeOH extraction). ‐ Ion‐Mobility Data‐Independent Analysis‐ Synapt G2, 0.6 sec scans (6V then 15‐45V)‐ 3 ul/min flow rate‐ Mobile phase was 10/90 IPA/MeCN with 

0.1% formic acid

Rapid Lipid Profiling and Statistical Analysis (AUC)

TG (57:9)

METLIN Search (10 ppm) (http://metlin.scripps.edu/metabo_batch.php)

+ Met               ‐Met

m/z

Time (min)

6 samples, ESI + and ‐871 Confident, Charge = 1 Features

71 Features Passing ANOVA p<0.05 (Hochberg FDR correction)

Bradford Assay, 1.8mg/sample(normalize by total lysate)

Cell Disruption(Sonication in AmBic pH8)

Polar Metabolites~48%

80/20 MeOH/water1 hr extraction, N2 dry

Lipids~48%

80/20 MTBE/MeOH1 hr extraction, N2 dry

Proteins~4%0.25% w/v RapigestDTT/IAA/trypsin overnight

Resuspend2/1/0.2 MeCN/

Formic Acid/HFBAInject 1% for LC‐MS/MS

(30 min/sample)

Resuspend4/2/1

IPA/MeOH/CHCl3Inject 4% for FIA(10 min/sample)

Acidify 1/2/97 TFA/MeCN/waterInject 20% for 2DLC‐MS/MS(3 hr/sample)

Summary of Multi‐Omics Sample Preparation Strategy

Proteomics Analysis3‐Fraction 2DLC with IMS‐ToF (DIA) 3 hrs/sample

0

100

200

300

400

500

600

5 15 25 35 45 55 65 75 85 95

More

Protein Co

unt p

er Bin

% CV Bin

% CV (n=2207 proteins)

8 ug MCF7 digestHigh/Low pH RPLC

80% of proteins below 25% CV (biological variation)

Technical SummaryMCF7 Multi‐Omics Profile in 24 Hours

Method Time/sample(min)

Total Features

ConfidentFeatures

Median % C.V.(n=6) 

Lipid Infusion, ESI + 5 1750 6621 27

Lipid Infusion, ESI ‐ 5 851 2001 52

Metabolite, HILIC 16.5 6,123 8502 55

Metabolite, RPLC 16.5 16,745 2,9162 25

Protein, 2D RPLC 180 172,569 2,2073 14

1 Filtered based on charge state = 12 Filtered based on charge state = 1, peak width < 0.5 min, peak confidence score > 0.83 Identified and quantified proteins

Cutting Run Time in Half while Maintaining the Separation Efficiency

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

%

0

100

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

%

0

100 BPI1.31e5

22.85995.21

20.31748.48

18.32748.928.94

478.817.62

585.84

13.28622.88

22.91995.21 39.16

795.7930.30706.7528.48

1196.27 32.42964.08

38.46987.5534.83

750.9639.26

1022.2143.99995.54

ID09049_01_UCA195_3252_092712_04 1: TOF MS ES+ BPI

9.02e418.19858.47

12.57549.8410.76;720.95

9.26613.40

7.11617.37

4.43;409.25

15.63724.43

18.34858.47 20.63

983.53 24.96995.54 28.75

774.41 31.62748.42

32.74935.25 39.16

949.15

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

%

0

100

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

%

0

100 BPI1.28e5

13.09995.546.21

730.43

5.50585.84

20.47987.55

16.99706.75

20.56927.15

09156_01_UCA195_3252_092712_04 1: TOF MS ES+ BPI

9.77e410.84858.467.07;720.94

5.90;648.84

4.18550.80

14.09995.53 17.89

935.49

20.51;1118.03

150 um x 100 mm BEH C18 nanoTile7 to 35% MeCN; 3.0 ul/min

Fxn 4

Fxn 5

Fxn 4

Fxn 5

3

912.5

3

9 12.5

150 um Tile Loading Test150 um x 100 mm, 37 min gradient

Loading test performed with E. Coli lysateMethod: 5 to 40% MeCN in 37.1 min, 3 ul/min, 35COnly very minor effects on chromatographic efficiency at 4 ug load

AcknowledgmentsDuke University Proteomics Core Facility

http://www.genome.duke.edu/cores/proteomics/

FundingNIH S10 grantDuke School of MedicineCTSA grant UL1RR024128