View
32
Download
1
Category
Preview:
Citation preview
PENETAPAN KADAR KURKUMIN PADA SEDIAAN HERBAL YANG
MENGANDUNG Curcuma longa DENGAN METODE ULTRA HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS
SPECTROMETRY (UHPLC-MS/MS)
TUGAS AKHIR
Untuk Memenuhi Persyaratan
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi
Oleh :
Rifky Afrizal Fajar Kurniawan
NIM 155070500111011
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2018
ii
HALAMAN PENGESAHAN
TUGAS AKHIR
Penetapan Kadar Kurkumin Pada Sediaan Herbal yang Mengandung
Curcuma longa dengan Metode Ultra High Performance Liquid
Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS)
Oleh:
Rifky Afrizal Fajar Kurniawan
NIM: 155070500111011
Telah diuji pada: Hari : Rabu Tanggal : 12 Desember 2018
dan dinyatakan lulus oleh :
Penguji-I,
Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm.,Apt. NIP.2011068502181001
Pembimbing-I/Penguji-II, Pembimbing-II/Penguji-III,
Bachtiar Rifai P, M.Farm.,Apt Ika Putri N, S.Farm., M.Sc., Apt.
NIP. 2012058709291001 NIP. 2013048909152001
Mengetahui, Kepala Program Studi Farmasi,
Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm.,Apt. NIP. 2011068502181001
iii
PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN
Saya yang bertandatangan di bawahini:
Nama : Rifky Afrizal Fajar Kurniawan
NIM : 155070500111011
Program Studi : Program StudiFarmasi
FakultasKedokteranUniversitasBrawijaya
MenyatakandengansebenarnyabahwaTugasAkhir yang sayatulisinibenar-
benarkaryasayasendiri, bukanmerupakanpengambilalihantulisanataupikiran
orang lain yang sayaakuisebagaitulisanataupikiransaya. Apabila di
kemudianharidapatdibuktikanbahwaTugasAkhiriniadalahhasiljiplakan,
makasayabersediamenerimasanksiatasperbuatantersebut
Malang, Desember 2018
Yang menyatakanpernyataan,
(Rifky Afrizal Fajar Kurniawan)
NIM.155070500111011
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur kapada Allah SWT atas karunia dan rahmat-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan Tugas Akhir yang berjudul “Penetapan Kadar
Kurkumin Pada Sediaan Herbal yang Mengandung Curcuma longa dengan
Metode Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry
(UHPLC-MS/MS)” dengan lancar untuk memenuhi persyaratan menyelesaikan
studi di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
Ketertarikan penulis terhadap topik yang dibahas didalam penelitian ini
didasarkan pada banyaknya sediaan herbal khususnya yang mengandung kunyit
telah beredar di masyarakat dan tingkat konsumsinya yang meningkat pada.
Oleh karena itu diperlukan pemantauan kualitas dari sediaan tersebut. Salah
satu parameter pemantauan kualitas sediaan herbal secara spesifik yaitu
penetapan kadar senyawa marker yaitu kurkumin dalam sediaan tersebut
dengan metode UHPLC-MS/MS. Sehingga kadar kurkumin yang terkandung
dalam sediaan herbal mengandung Curcuma longa dapat diketahui .
Dengan selesainya Tugas Akhir ini, penulis ingin mengucapkan
terimakasih kepada seluruh pihak yang telah membantu penyelesaiannya, antara
lain:
1. Dr. dr. Sri Andarini, M. Kes, selaku dekan Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya yang telah memberikan kesempatan untuk
menuntut ilmu di Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya
2. Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm., Apt, selaku Ketua Program
Studi Farmasi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya yang telah
memberikan kesempatan untuk menyelesaikan studi dengan baik
3. Bachtiar Rifai Pratita Ihsan, S.Farm., M.Farm.,Apt., selaku dosen
pembimbing pertama yang telah memberikan pengarahan,
bimbingan dan saran-saran yang membangun selama penulisan
Tugas Akhir ini.
4. Ika Putri Nurhayati, S.Farm., M.Sc.,Apt., selaku dosen pembimbing
kedua yang telah memberikan pengarahan, bimbingan dan saran-
saran yang membangun selama penulisan Tugas Akhir ini.
v
5. Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm., Apt. Sebagai penguji yang
telah memberi masukan dan wawasan terhadap penelitian ini
6. Hananditia Rachma Pramestutie.,S.Farm.,M.Farm.Klim.,Apt., selaku
ketua tim Tugas Akhir Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya.
7. Orang tua penulis, bapak Agung Saptono, S.Si, dan ibu Nurul
Hidayati, serta saudara penulis Raditya Afreyzha Ramadhany yang
senantiasa memberikan dukungan dan doa kepada penulis sehingga
Tugas Akhir ini tidak mungkin selesai tanpa bantuan mereka.
8. Teman teristimewa, Winfika Wibisono Putri yang selalu memberikan
dukungan dan bantuan serta doa selama proses penyelesaian Tugas
Akhir ini.
9. Teman-teman penghuni grima, Arip, Birrul, Abu, Panji, Alif, Adit, Dio,
Danil, Bidin, Sandi, Ramen, Wisnu yang selalu menyediakan tawa
ceria di setiap sore hari di kampus.
10. Teman-teman Farmasi UB 2015 yang telah bersama berjuang di
farmasi sejak mahasiswa baru.
11. Kakak-kakak tingkat yang telah memberikan banyak ilmunya kepada
penulis dan adik-adik tingkat yang siap meneruskan perjuangan dan
inovasi penulis.
12. Segenap keluarga organisasi tempat saya menambah ilmu dan
pengalaman yaitu HMF Aecus Prospisio.
13. Semua Pihak yang telah membantu dan tidak dapat disebutkan satu
persatu.
Penulis sadar bahwa tidak ada yang sempurna di dunia ini, demikian
pula dengan penelitian Tugas Akhir yang penulis yakin masih sangat jauh dari
kesempurnaan. Sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang
membangun. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi kita semua.
Malang, 20 Desember 2018
Penulis
vi
ABSTRAK
Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Penetapan Kadar Kurkumin Pada Sediaan Herbal yang Mengandung Curcuma longa dengan Metode Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS).Tugas Akhir, Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Pembimbing: (1) Bachtiar Rifa’i Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri Nurhayati, S.Farm., M.Sc., Apt.
Kunyit banyak dipilih sebagai agen antiinflamasi dan antikanker secara tradisional. Terdapat banyak produk herbal mengandung kunyit untuk mengatasi antiinflamasi atau meredakan nyeri. Senyawa yang paling berperan memberikan efek farmakologis yaitu kurkumin dalam kunyit tersebut. Perlu dilakukan validasi metode analisis kurkumin menggunakan UHPLC-MS/MS karena memiliki hasil pemisahan senyawa dan deteksi senyawa yang sangat baik. Serta perlu dilakukan monitoring kualitas dengan penetapan kadar kurkumin dalam sediaan herbal tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas medote analisis kurkumin yang digunakan dan mengetahui kadar kurkumin dalam beberapa sediaan herbal guna memenuhi monitoring kualitas sediaan tersebut. Sampel dipilih dengan cara metode purposive sampling dengan beberapa kriteria tertentu. Dilakukan validasi metode analisis kurkumin menggunakan UHPLC-MS/MS dengan fase gerak gradien A (0,1% asam format dalam aquabidest) dan B (0,1% asam format dalam acetonitrile) serta fase diam yaitu Kinetex EVO C18 100oA. Metode analisis dinyatakan valid dengan memenuhi parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas (r=0,9997), akurasi (% perolehan kembali = 98,63-101,76%), presisi (%RSD=0,38-5,7%), LOD (0,11µg/ml) dan LOQ (0,34µg/ml). Berikutnya dilakukan penetapan kadar kurkumin dalam 3 sampel sediaan herbal mengandung kunyit. Kadar yang didapatkan sampel serbuk (0,03%), sampel kapsul (4,78%), dan sampel cair (0,03%).
Kata kunci: Kunyit, Kurkumin, UHPLC-MS/MS, Validasi Metode, Sediaan Herbal
vii
ABSTRACT
Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Determination of Curcumin in Herbal
Medicine Containing Curcuma longa Using Ultra High Performance Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS). Final Assignment,
Pharmacy Program, Medical Faculty Brawijaya University. Advisers: (1) Bachtiar
Rifa’i Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri Nurhayati, S.Farm.,
M.Sc., Apt.
Turmeric (Curcuma longa) widely used as the main ingredient of some herbal medicines to relieve pain and inflammation. Curcumin is the main secondary metabolites of Curcuma longa that has also shown some therapeutic activities such as anti-inflammatory and anti-cancer agent. An efficient, sensitive and precise Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS) was developed to determine curcumin content in several herbal medicine contains turmeric. The method was validated for linearity, selectivity, accuracy, precision, LOD and LOQ. Thus, the method can be used to determine curcumin content in herbal medicine to control herbal medicine quality. Objective of this research is to validate the method of curcumin analysis and determine curcumin content in herbal medicine. Validation was done through curcumin analysis using UHPLC-MS/MS with the gradient mobile phase A (0.1% format acid in aquabidest) and B (0.1% format acid in acetinitrile), while the static phase was Kinitex EVO C18 100o A. The method was finally recognized as valid by fulfilling several validation parameters such selectivity showed 3,2 minute as Retention Time (RT) also 285 m/z and 177 m/z as quantifier and qualifier product mass of curcumin , linearity (r=0.9997), accuracy (% recovery = 98,63-101.76%), precision (%RSD=0,38-5,70%), LOD (0,11 µg/ml) and LOQ (0,34 µg/ml). Curcumin level in three samples was determined from the herbal medicines containing turmeric. It showed that each herbal medicines sample contain curcumin 0.03%, 4,78% and liquid 0.03% for powder, capsule and liquid dosage form respectively. This research showed that the proposed method may be useful as an accurate, effective and sensitive for quantitative determination of curcumin content.
Keywords: Turmeric, Curcumin, UHPLC-MS/MS, Method Validation, Dosage Form
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN PENGESAHAN................................................................................. ii
PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN ............................................................... iii
KATA PENGANTAR .......................................................................................... iv
ABSTRAK .......................................................................................................... vi
ABSTRACT ....................................................................................................... vii
DAFTAR ISI ...................................................................................................... vii
DAFTAR TABEL ................................................................................................ ix
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xi
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiiii
DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................... xiii
BAB 1 PENDAHULUAN .......................................... Error! Bookmark not defined.
1.1 Latar belakang .................................... Error! Bookmark not defined.
1.2 Rumusan Masalah .............................. Error! Bookmark not defined.
1.3 Tujuan ................................................ Error! Bookmark not defined.
1.4 Manfaat .............................................. Error! Bookmark not defined.
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .................................. Error! Bookmark not defined.
2.1. Obat Tradisional ................................. Error! Bookmark not defined.
2.2. Kunyit ................................................. Error! Bookmark not defined.
2.3. Kurkumin ............................................ Error! Bookmark not defined.
2.4. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)Error! Bookmark
not defined.
2.5. Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry
(UHPLC-MS/MS) ................................ Error! Bookmark not defined.
2.6. Validasi Metode Analisis ..................... Error! Bookmark not defined.
BAB 3 KERANGKA KONSEP ................................. Error! Bookmark not defined.
3.1. Kerangka Konsep ............................... Error! Bookmark not defined.
ix
BAB 4METODE PENELITIAN .................................. Error! Bookmark not defined.
4.1. Rancangan Penelitian ..................... Error! Bookmark not defined.
4.2. Populasi dan sampel ........................ Error! Bookmark not defined.
4.3. Lokasi dan Waktu Penelitian ............ Error! Bookmark not defined.
4.3.1. Lokasi Penelitian ................... Error! Bookmark not defined.
4.3.2. Waktu Penelitian ................... Error! Bookmark not defined.
4.4. Bahan dan Alat Penelitian ................ Error! Bookmark not defined.
4.4.1. Bahan Penelitian ................... Error! Bookmark not defined.
4.4.2. Alat / Instrumen Penelitian .... Error! Bookmark not defined.
4.5. Prosedur Penelitian .......................... Error! Bookmark not defined.
4.5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MSError! Bookmark not
defined.
4.5.2. Pembuatan larutan baku kurkuminError! Bookmark not
defined.
4.5.3. Preparasi Sampel ................. Error! Bookmark not defined.
4.5.3.1 Sediaan Cair. ......... Error! Bookmark not defined.
4.5.3.2. Sediaan Serbuk........ Error! Bookmark not defined.
4.5.3.3. Sediaan Kapsul ........ Error! Bookmark not defined.
4.5.4. Validasi metode analisis ........ Error! Bookmark not defined.
4.5.5. Analisis data ......................... Error! Bookmark not defined.
BAB 5HASIL DAN ANALISA DATA ........................ Error! Bookmark not defined.
5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MS Error! Bookmark not defined.
5.2. Validasi Metode Analisa ................... Error! Bookmark not defined.
5.3. Penetapan Kadar Kurkumin pada Sediaan HerbalError! Bookmark
not defined.
BAB 6 PEMBAHASAN ............................................ Error! Bookmark not defined.
6.1 Pembahasan .................................... Error! Bookmark not defined.
6.2 Implikasi Penelitian........................... Error! Bookmark not defined.
6.3 Keterbatasan Penelitian ................... Error! Bookmark not defined.
BAB 7 PENUTUP ..................................................... Error! Bookmark not defined.
7.1 Kesimpulan ...................................... Error! Bookmark not defined.
7.2 Saran ............................................... Error! Bookmark not defined.
DAFTAR PUSTAKA ................................................. Error! Bookmark not defined.
x
LAMPIRAN ............................................................... Error! Bookmark not defined.
xi
DAFTAR TABEL
Table 2.1. Kategori Metode Pengujian (United States Pharmacopeial Convention,
2007). ................................................... Error! Bookmark not defined.
Table 2.2. Parameter Analisis yang Dibutuhkan Dalam Validasi Metode Analisis
(United States Pharmacopeial Convention, 2007).Error! Bookmark
not defined.
Tabel 2.3. Kriteria Rentang Recovery yang Dapat Diterima (AOAC, 2002) .. Error!
Bookmark not defined.
Tabel 2.4. Kriteria Akurasi dan Presisi yang Masih Dapat Diterima (AOAC, 2002).
............................................................. Error! Bookmark not defined.
Tabel 4.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak ........... Error! Bookmark not defined.
Tabel 5.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak ........... Error! Bookmark not defined.
Tabel 5.2. Optimasi Parameter Massa untuk CurcuminError! Bookmark not
defined.
Tabel 5.3. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Waktu RetensiError! Bookmark
not defined.
Tabel 5.4. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Detektor MS/MS ............... Error!
Bookmark not defined.
Tabel 5.5. Kriteria Batas Perolehan Kembali yang DapatError! Bookmark not
defined.
Tabel 5.6. Kriteria Batas %RSD yang Dapat Diterima (AOAC, 2002) .......... Error!
Bookmark not defined.
Tabel 5.7. Tabel Hasil Akurasi dan Presisi ............ Error! Bookmark not defined.
Tabel 5.8. Tabel Hasil Penetapan Kadar Kurkumin dalam Sampel .............. Error!
Bookmark not defined.
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1. Logo-logo sediaan jamu (A), Obat Herbal Terstandart (B) dan
Fitofarmaka (C) (BPOM, 2015) ...... Error! Bookmark not defined.
Gambar 2.2. Struktur Kimia Kurkumin (a), Demetoksikurkumin (b), dan
Bisdemetoksikurkumin (c) (Sethi at al, 2009)Error! Bookmark not
defined.
Gambar 2.3. Skema Instrumen HPLC (Ahuja dan Dong, 2005).Error! Bookmark
not defined.
Gambar 2.4.. Skema Injektor (a) posisi pada saat memuat sampel dan (b) posisi
saat menyuntikkan sampel (Ahuja dan Dong, 2005) ............. Error!
Bookmark not defined.
Gambar 2.5 . Skema Pompa Piston Tunggal Pada HPLC (Ahuja dan Dong, 2005)
...................................................... Error! Bookmark not defined.
Gambar 2.6 . Efektifitas kolom dengan perbandingan besar ukuran partikel pada
masing-masing dekakde plot van Deemter (Seelam, 2013). . Error!
Bookmark not defined.
Gambar 2.7. Sistem Kerja MS/MS pada UHPLC-MS/MS (Kang, 2015). ..... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 5.1. Hasil Waktu Retensi antara Standar (a) dan Sampel Serbuk (b)
...................................................... Error! Bookmark not defined.
Gambar 5.2. Hasil Detektor MS/MS antara Standar (a) dan Sampel Serbuk (b)
...................................................... Error! Bookmark not defined.
Gambar 6.1. Residual Silanol Pada Kolom UHPLC (Crawford, 2016) .......... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 6.2. Sistem Kerja ESI-Triple Quadrupole (Kang, 2015)Error! Bookmark
not defined.
Gambar 6.3. Produk Mass Curcumin pada ESI-MS/MS Mode Ion Positif. (A)
spektra kurkumin dalam plasma darah. (A’) spektra kurkumin oleh
SRM ESI-MS/MS (Wang, 2012) ..... Error! Bookmark not defined.
Gambar 6.4. Fragmentasi Kurkumin pada MS a. (Liu, 2016) b.( Albert, 2018)
...................................................... Error! Bookmark not defined.
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Kromatogram Standar Kurkumin ....... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 2. Kromatogram Kurkumin dalam Sampel Sediaan Serbuk
Mengandung Curcuma longa ......... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 3. Kromatogram Kurkumin dalam Sampel Cair Serbuk Mengandung
Curcuma longa............................... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 4. Kromatogram Kurkumin dalam Sampel Kapsul Serbuk Mengandung
Curcuma longa............................... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 5. Kondisi Sistem UHPLC-MS/MS ......... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 6. Tabel data Area Respon Kromatogram dan Waktu Retensi Sampel
Sediaan Herbal dan Standar KurkuminError! Bookmark not
defined.
Lampiran 7. Tabel Perhitungan Kadar Kurkumin dalam Sampel Sediaan Herbal
...................................................... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 8. Tabel Perhitungan Akurasi, Presisi, LOD, dan LOQ Standar
Kurkumin ........................................ Error! Bookmark not defined.
xiv
DAFTAR SINGKATAN
UHPLC-MS/MS = Ultra High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
OHT = Obat Herbal Terstandar
LOD = Limit of Detection
LOQ = Limit of Quantification
ESI =Electrospray Ionization
SRM = Selected Reaction Monitoring
vi
ABSTRAK
Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Penetapan Kadar Kurkumin Pada Sediaan Herbal yang Mengandung Curcuma longa dengan Metode Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS).Tugas Akhir, Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Pembimbing: (1) Bachtiar Rifa’i Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri Nurhayati, S.Farm., M.Sc., Apt.
Kunyit banyak dipilih sebagai agen antiinflamasi dan antikanker secara tradisional. Terdapat banyak produk herbal mengandung kunyit untuk mengatasi antiinflamasi atau meredakan nyeri. Senyawa yang paling berperan memberikan efek farmakologis yaitu kurkumin dalam kunyit tersebut. Perlu dilakukan validasi metode analisis kurkumin menggunakan UHPLC-MS/MS karena memiliki hasil pemisahan senyawa dan deteksi senyawa yang sangat baik. Serta perlu dilakukan monitoring kualitas dengan penetapan kadar kurkumin dalam sediaan herbal tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas medote analisis kurkumin yang digunakan dan mengetahui kadar kurkumin dalam beberapa sediaan herbal guna memenuhi monitoring kualitas sediaan tersebut. Sampel dipilih dengan cara metode purposive sampling dengan beberapa kriteria tertentu. Dilakukan validasi metode analisis kurkumin menggunakan UHPLC-MS/MS dengan fase gerak gradien A (0,1% asam format dalam aquabidest) dan B (0,1% asam format dalam acetonitrile) serta fase diam yaitu Kinetex EVO C18 100oA. Metode analisis dinyatakan valid dengan memenuhi parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas (r=0,9997), akurasi (% perolehan kembali = 98,63-101,76%), presisi (%RSD=0,38-5,7%), LOD (0,11µg/ml) dan LOQ (0,34µg/ml). Berikutnya dilakukan penetapan kadar kurkumin dalam 3 sampel sediaan herbal mengandung kunyit. Kadar yang didapatkan sampel serbuk (0,03%), sampel kapsul (4,78%), dan sampel cair (0,03%).
Kata kunci: Kunyit, Kurkumin, UHPLC-MS/MS, Validasi Metode, Sediaan Herbal
vii
ABSTRACT
Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Determination of Curcumin in Herbal
Medicine Containing Curcuma longa Using Ultra High Performance Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS). Final Assignment,
Pharmacy Program, Medical Faculty Brawijaya University. Advisers: (1) Bachtiar
Rifa’i Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri Nurhayati, S.Farm., M.Sc.,
Apt.
Turmeric (Curcuma longa) widely used as the main ingredient of some herbal medicines to relieve pain and inflammation. Curcumin is the main secondary metabolites of Curcuma longa that has also shown some therapeutic activities such as anti-inflammatory and anti-cancer agent. An efficient, sensitive and precise Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS) was developed to determine curcumin content in several herbal medicine contains turmeric. The method was validated for linearity, selectivity, accuracy, precision, LOD and LOQ. Thus, the method can be used to determine curcumin content in herbal medicine to control herbal medicine quality. Objective of this research is to validate the method of curcumin analysis and determine curcumin content in herbal medicine. Validation was done through curcumin analysis using UHPLC-MS/MS with the gradient mobile phase A (0.1% format acid in aquabidest) and B (0.1% format acid in acetinitrile), while the static phase was Kinitex EVO C18 100o A. The method was finally recognized as valid by fulfilling several validation parameters such selectivity showed 3,2 minute as Retention Time (RT) also 285 m/z and 177 m/z as quantifier and qualifier product mass of curcumin , linearity (r=0.9997), accuracy (% recovery = 98,63-101.76%), precision (%RSD=0,38-5,70%), LOD (0,11 µg/ml) and LOQ (0,34 µg/ml). Curcumin level in three samples was determined from the herbal medicines containing turmeric. It showed that each herbal medicines sample contain curcumin 0.03%, 4,78% and liquid 0.03% for powder, capsule and liquid dosage form respectively. This research showed that the proposed method may be useful as an accurate, effective and sensitive for quantitative determination of curcumin content.
.
Keywords: Turmeric, Curcumin, UHPLC-MS/MS, Method Validation, Dosage
Form
1
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber daya alam dan
dikenal sebagai negara yang mengandung unsur kebudayaan daerah terbanyak
di dunia. Budaya-budaya tersebut masih melekat hingga era modern ini. Salah
satu budaya yang masih dipertahankan yaitu tradisi pengobatan alami, atau
biasa dikenal dengan jamu. Budaya minum jamu ini tidak hanya menonjol pada
bidang kesehatan tapi juga bidang kebudayaan karena sifatnya yang turun
temurun dari generasi ke generasi berikutnya. Antusiasme masyarakat terhadap
jamu masih cukup besar. Berdasarkan Data Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas),
pada tahun 2013 menyebutkan bahwa 30,4% rumah tangga di Indonesia
memanfaatkan pelayanan kesehatan tradisional, dengan rincian 77,8%
menggunakan keterampilan kesehatan tradisional tanpa alat dan 49% rumah
tangga memanfaatkan ramuan (Kemenkes RI, 2013). Menurut Badan Pengawas
Obat dan Makanan (BPOM), obat herbal diklasifikasikan secara umum menjadi 3
bagian besar yaitu jamu yang merupakan ramuan bahan tumbuhan yang
digunakan secara turun-temurun, OHT atau Obat Herbal Terstandar merupakan
sediaan herbal yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah,
dan Fitofarmaka yang telah diujikan secara praklinik dan uji klinik serta bahan
baku dan produk jadinya telah distandarisasi (BPOM, 2005).
Indonesia merupakan negara agraria. Tanahnya yang subur menghasilkan
beragam tanaman yang tentunya memiliki banyak manfaat dalam kehidupan
2
sehari-hari. Hasil-hasil agraria tersebut banyak dimanfaatkan ke berbagai aspek
umum kehidupan seperti, sandang, pangan dan papan, termasuk aspek khusus
yaitu kesehatan. Terdapat sekitar 25% obat modern atau obat konvensional
berasal dari tumbuhan obat (WHO,2013). Berdasarkan Riset Tumbuhan Obat
dan Jamu (RISTOJA) oleh Kementrian Kesehatan pada tahun 2015
menjelaskan bahwa terdapat data informasi tumbuhan obat sebanyak 19.871,
16.218 diantaranya terdiri dari 1.559 spesies meliputi 156 famili. Salah satunya
adalah penggunaan kunyit (Curcuma longa) di bidang medis atau pengobatan
dan sebagai bahan pangan. Kunyit termasuk dalam salah satu ramuan terbanyak
yaitu sejumlah 462 informasi (Kemenkes RI, 2015).
Kunyit merupakan salah satu produk jamu yang banyak dikonsumsi oleh
masyarakat. Terdapat beberapa ramuan kunyit untuk berbagai penyakit. Pada
Etnis Jawa di Yogyakarta terdapat 50 ramuan mengandung kunyit yang
digunakan untuk terapi pasca persalinan. Pada Etnis Jawa daerah Jawa Tengah
terdapat 29 ramuan mengandung kunyit untuk mengatasi penyakit Jaundice atau
gangguan pada organ hati. Pada Etnis Simalungun daerah Sumatera terdapat 1
ramuan untuk pengobatan HIV/AIDS, dan 26 ramuan untuk pengobatan kanker
pada Etnis Suku Hutan Provinsi Riau (Kemenkes RI, 2015). Kunyit memiliki efek
farmakologis antara lain, sebagai antiinflamasi, sebagai agen hipotensi,
pengobatan pada dispepsia antikanker, antikoagulan, antiprotozoa,
antinematoda dan hepatoprotektor (Simanjuntak, 2012). Efektifitas kunyit sebagai
terapi beberapa penyakit sudah banyak dilakukan. Kunyit dosis 200 dan 600
mg/kg akan efektif digunakan sebagai antiinflamasi (Chuang, 2000). 1% dan
0,2% diet kunyit mampu memberikan inhibisi pada expresi gen Rasp21 dan
Fosp62 pada kanker kulit dan menurunkan level dari pailoma (EMA, 2009).
3
Penggunaan secara oral 100 mg/kg dapat mengatasi ulcer pada permukaan
lambung dengan membentuk lapisan protektif (Simanjuntak, 2012).
Penyembuhan sekresi empedu pada saluran empedu yang terhambat dapat
dilakukan dengan pemberian 25 mg/kg natrium
kurkuminat.Kemampuanantiprotozoapadakunyitmemilihiefekhambatyaitusebesar
65% dengandosispemberian 9µg/ml. Senyawa aktif yang terkandung dalam
kunyit adalah kurkuminoid yang terdiri dari kurkumin, dimetoksi kurkumin,
desmetoksi kurkumin, trietil kurkumin dan bisdemetoksi kurkumin (Rukmana,
2005). Senyawa kurkumin terpilih menjadi senyawa marker pada kunyit, karena
merupakan senyawa yang bersifat khas, mempunyai struktur kimia yag jelas,
stabil, tersedia, dapat diisolasi dan memiliki efek farmakologis (Patterson, 2006).
Seiring dengan meningkatnya konsumsi produk herbal terutama jamu
mengandung kunyit, maka monitoring kualitas sediaan tersebut juga menjadi
sangat penting demi menjaga keamanan produk, kualitas produk dan efikasi dari
produk yang terdapat di pasaran. Monitoring kualitas sangat diperlukan guna
menjamin produk dapat tepat indikasi dan memiliki efikasi yang maksimal ketika
dikonsumsi oleh pasien (Oka, 2017). Dosis atau takaran maksimal konsumsi
kunyit pada tubuh manusia berdasarkan WHO monograf menyatakan bahwa
serbuk kunyit maksimal 3 gram/harinya, sedangkan pada sediaan tinktur (1:10)
yaitu 3 ml per harinya (WHO Monographs, 1999).Untuk menghindarkan dan
memberikan tindakan preventif serta edukatif terhadap produksi dan konsumsi
jamu serta menghindarkan pasien dari resiko toksisitas, resiko kurangnya efek
obat atau efikasi yang dibawah nilai ambang, atau efek samping yang tidak
diinginkan akibat inkompatibilitas dari sediaan akibat kualitasnya tidak terjamin.
Berdasarkan pendapat yang telah dijelaskan maka perlu dilakukan validasi
4
metode analisis kurkumin sebagai salah satu dari tahap penjaminan mutu
sediaan kefarmasian baik herbal maupun sediaan oral dan non-oral lainnya.
Analisis suatu sediaan atau senyawa sangat diperlukan dalam proses
produksi, bergantung pada spesifikasi sediaan atau senyawa yang akan diuji.
Efektifitas dalam proses analisis sangatlah diperlukan,salah satu faktor utama
yang berperan dalam efektifitas dan efisien suatu proses analisis adalah metode
dan kromatogram yang digunakan. Banyak pilihan dalam melakukan analisis
suatu senyawa, seperti menggunakan GC-MS, NMR, KLT-Densitometri,
Spektrofotometri UV-Vis. Analisis kurkumin telah banyak dilakukan dengan
menggunakan beragam metode kromatografi, diantaranya adalah analisis
kurkumin menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
dengan optimasi isokratik pada ekstrak kunyit komersial (Wichitnithad, 2009),
validasi metode HPLC analisis kurkumin dalam sediaan sirup (Sumule, 2007)
dan beberapa penelitian penetapan kadar kurkumin pada beberapa bentuk
sediaan yang mengandung kurkumin menggunakan HPLC (Ida, 2010). Dari
beberapa metode analisis yang digunakan tersebut, yang paling efektif adalah
menggunakan HPLC karena memiliki pemisahan puncak yang paling spesifik,
serta memberikan informasi yang lengkap dibandingkan metode kromatogram
lainnya. Berdasarkan penjelasan tersebut, maka pada penelitian ini analisis
dilakukan menggunakan HPLC. Metode HPLC dipilih karena HPLC memiliki
sensitivitas dan selektivitas yang lebih baik terhadap suatu molekul kimia
dibandingkan dengan metode analisis kromatografi yang lainnya. HPLC mampu
memisahkan senyawa dengan sangat baik, teliti dan spesifik. Tidak hanya
berlaku untuk obat saja, HPLC sangat bermanfaat dan efektif untuk analisis
herbal sebgai bentuk identifikasi kandungan senyawa dalam herbal tersebut. Hal
5
ini dibuktikan dengan kemampuan daya pisah molekul yang baik dan mendeteksi
analit dalam jumlah yang kecil (Parwa, 1991). Efektifitas sebuah analisis
senyawa dalam sampel dapat meningkat dengan menggunakan Ultra High
Performance Liquid Chromatography (UHPLC). UHPLC memiliki diameter kolom
6
1.3 Tujuan
1. Untuk mengetahui metode analisis kurkumin dalam kunyit dengan
metode UHPLC-MS/MS dapat memenuhi parameter validasi metode
yaitu selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, LOD dan LOQ.
2. Untuk mengetahui kadar kurkumin pada sediaan herbal mengandung
Curcuma longa di Kota Malang.
1.4 Manfaat
1.4.1 Manfaat Akademik
1. Membantu dan mendukung perkembangan ilmu pengetahuan dan
teknologi di bidang kesehatan khususnya di bidang farmasi dalam
penentuan dosis yang tepat dalam penggunaan jamu kurkumin.
2. Sebagai acuan dalam validasi metode penetapan kadar kurkumin
dalam sediaan jamu di Kota Malang
1.4.2 Manfaat Praktisi
Bagi tenaga kesehatan utamanya apoteker dapat menentukan
dosis yang tepat untuk pasien dalam mengkonsumsi sediaan jamu
kurkumin yang ada di Kota Malang, guna mencapai efektifitas terapi
dan menghindari toksisitas.
7
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Obat Tradisional
Berdasarkan Pasal 1 peraturan Kepala Badan POM No.
HK.00.05.4.1384 Tahun 2005 tentang Kriteria dan Tata Laksana
Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar dan Fitofarmaka,
maka obat tradisional tersebut diklasifikasikan menjadi :
1. Jamu berasal dari kata “jampi”, sebuah kata dalam bahasa
Jawa Krama. Kata jampi tersebut secara bahasa memiliki
makna ramuan ajaib. Sedangkan kata menjampi berarti
menyembuhkan dengan magis/mantera oleh dukun pada era
kuno (Tilaar et al, 2010). Jamu adalah obat tradisional
Indonesia yang dibuat dari tumbuhan, bahan hewan, bahan
mineral, sediaan sarian (galenik) atau campuran dari bahan-
bahan tersebut, yang telah digunakan secara turun-temurun
untuk pengobatan berdasarkan pengalaman.
2. Obat Herbal Terstandar adalah obat tradisional yang disajikan
dari ekstrak atau penyarian bahan alam yang dapat berupa
tanaman obat, binatang maupun mineral yang telah dibukukan
keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan uji praklinik
dan bahan bakunya telah di standarisasi.
3. Fitofarmaka adalah sediaan obat bahan alam yang telah
dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan uji
praklinik dan uji klinik, bahan baku dan produk jadinya telah di
standardisasi.
8
A B C
1.1 Gambar 2.1. Logo-logo sediaan jamu (A), Obat Herbal Terstandart
(B) dan Fitofarmaka (C) (BPOM, 2015)
2.2. Kunyit
Kunyit adalah tanaman tropis yang banyak terdapat di benua Asia.
Mayoritas masyarakat menggunakan kunyit sebagai zat pewarna dan zat
pemberi aroma pada makanan. „Ayurvedic‟ menuliskan bahwa kunyit
berperan sebagai aromatika, stimulan, dan sebagai sumber warna merah
tua. Dan pada era yang baru ini menyebutkan bahwa kunyit berperan
besar dalam penyakit yang berhubungan dengan empedu maupun
hepatobilliary disorders, sinusitis, penyakit hepatik dan diabetes
(Simanjuntak, 2012). Kunyit dapat bertahan hidup sampai lebih dari 2
tahun dan termasuk dalam keluarga Zingiberaceae. Kunyit banyak
tumbuh di wilayah tropis seperti Indonesia, Cina dan India. Kunyit dapat
tumbuh subur di dataran rendah antara 90 meter sampai dengan 2000
meter di atas permukaan laut (Labban, 2014). Menurut Linnaeus,
klasifikasi kunyit adalah :
Kingdom : Plantae
Phylum : Magnoliophyta
Kelas : Liliopsida
Subkelas : Zingiberidae
Ordo : Zingiberales
9
Famili : Zingiberaceae
Genus : Curcuma
Spesies : Curcuma longa Linn.
Kandungan utama dalam rimpang kunyit yaitu kurkuminoid yang
terdiri dari kurkumin, demektosikurkumin dan bisdemetoksikurkumin.
Selain itu, kunyit juga mengandung minyak atsiri, senyawa yang
terkandung dalam minyak atsiri antara lain, Tumerone, Curlone, Curdione,
Turmeronol B, 1,8 cineole, α-zingiberene, β-pinene, β-bisabolene, p-
cynene, Curcumene (Jayaprakasha, 2005).
Kunyit memiliki banyak manfaat di bidang kesehatan, seperti
berperan sebagai anti-inflamasi dengan mekanisme menghambat LOX,
COX fosfolipase, leukotrien, pembentukan prostalglandin, collagenase
dan TNF (Labban, 2014). Peradangan pada hati dapat diberi alternatif
terapi yaitu 200 mg/kg atau 600 mg/kg kurkumin (Agruim, 2012).
Kombinasi antara 480 mg kurkumin dengan 20 mg quercetin dalam 1
kapsul, telah diuji pada 43 pasien transplantasi ginjal, 71% pasien pada
kelompok dosis rendah mengalami penurunan serum kreatinin. Peran
kurkumin besar dalam pengobatan ini yaitu sebagai agen antiinflamasi
dan antioksidan, dengan mekanisme induksi enzim hemeoksigenase dan
sitokin pro-inflmasi yang berbanding lurus dengan tingkat kerusakan pada
sel (Labban, 2014).
Kunyitjugadimanfaatkansebagaiterapialternatifkanker,
atausebagaiagen anti-tumor.Kunyitmenginhibisi 3
tahapdalamcarsinogenesis, yaitufaseinitiasi,
10
fasepromosidanfaseprogresi.Selamafaseinsiasidanfasepromosi,
kurkumindalamkunyitbekerjadenganmengontrol factor transkripsifase I
dan II, menurunkansitokin pro-inflamasi, menurunkan metabolism
asamarachidonatjalurlipoxygenasedanvicyclooxygenase.Efektifitasdarikur
kumin yang diberikansebesar 0,2% dan 1% telahdiujipadaDimetylbenz (α)
Antrasen (DMBA) dan12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetate(TPA)
tumor, ditemukanbahwapapilomapadagrup yang
diberikanterapikukurminmengalamipenurunanataukadarnyalebihrendahda
rikelompoklainnya, serta ditemukanjugaekspresidari gen p21danp62
jugamenurun (EMA, 2009).
Padastudikliniklainmenyebutkanbahwadosisuntuksetiapjeniskankeradalah
berbeda, 100 mg kurkumindiberikanuntukkankerprostatdengankombinasi
40 mg isolavonselama 6 bulan. Pengobatanuntukkankerususdiberikan
360 mg kurkumin 3 kali sehariselama 10-30 hari, untukpasien yang
belummengalamioperasipengangkatankanker. Dosis 8000
mg/haridiberikanuntukpasien yang menderitakanker pancreas,
dalamstudiinijugamenyebutkanbahwacurcuminamandikonsumsihingga
8000mg/harinya (Muthu, 2015). Kunyit juga dapat berperan sebagai
antioxidan dan hepatoprotektor, antidiabetes, anti kanker, dispepsia dan
antimikroba (Labban, 2014).
2.3. Kurkumin
Kurkumin merupakan senyawa aktif yang dominan dalam
Curcuma longa. Kurkumin merupakan salah satu turunan dari
kurkuminoid, turunannya yang lain yaitu demetoksikurkumin dan
bisdemetoksikurkumin.
11
A B C
1.2 Gambar 2.2. Struktur Kimia Kurkumin (a), Demetoksikurkumin (b),
dan Bisdemetoksikurkumin (c) (Sethi at al, 2009)
Kurkumin mempunyai rumus molekul C21H20O6. Kurkumin
termasuk dalam senyawa flavonoid yang tidak larut dalam air tetapi larut
dalam ethanol, dimethilsulfoxid dan aseton. Titik didih kurkumin yaitu
183oC dengan berat molekul 368,37 g/mmol (Sethi at al, 2009). Kurkumin
akan terdegradasi dalam kondisi pH diatas 6,5 dan paparan cahaya
matahari yang berlebih (Tonnesen dan Karlsen, 1985). Kurkumin akan
berwarna kuning hingga jingga pada kondisi asam dan pada kondisi basa
akan berwarna merah. Kurkumin pada kondisi basa dengan pH 8,5-10,0
pada waktu yang relatif lama dapat mengalami proses disosiasi, kurkumin
akan terdegradasi membentuk asam ferulat dan feruloilmetan. Apabila
kurkumin terkena cahaya maka akan juga terjadi reaksi degradasi
fitokimia. Gugus metilen tersebut akan aktif diantara 2 gugus keton pada
senyawa tersebut (Sethi at al, 2009).
2.4. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography merupakan salah satu
alat analisis yang berprinsip pada pemisahan dengan kecepatan dan
efisiensi yang tinggi sampel terhadap fase gerak dan fase diam,
12
dengan optimalisasi kondisi tertentu. Fase gerak dialirkan melalui
kolom dengan tekanan dari pompa, sehingga alirannya cepat,
kemudian sampel akan dideteksi dengan detektor (Hendyana, 2006).
Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak
dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007).
1.3 Gambar 2.3. Skema Instrumen HPLC (Ahuja dan Dong, 2005).
Alat ini didukung dengan sistem pompa tekanan tinggi dan
detektor yang sangat sensitif dan beragam sehingga dapat memunculkan
peak yang sensitif dan beragam senyawa yang spesifik dalam suatu
molekul. Metode HPLC ini telah luas diterima untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel, karena merupakan
metode yang tidak destruktif dan selektif (Gandjar dan Rohman, 2007).
Titik berat dari analisis menggunakan kromatografi adalah pada senyawa
yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak
dapat dianalisis menggunakan kromatografi gas. Kelebihan lainnya dalam
penggunaan HPLC yaitu, kolom dapat digunakan kembali, memiliki
resolusi yang baik, dapat menghindari adanya dekomposisi, mudah
melakukan sample recovery, serta dapat menggunakan berbagai macam
detektor (Effendy, 2004).
13
Banyak tipe dari HPLC berdasarkan prinsip kerjanya, seperti
kromatografi partisi, kromatografi adsorpsi, kromatografi pertukaran ion
dan kromatografi eklusi. Kromatografi partisi terbagi menjadi 2 jenis, yaitu
HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. HPLC fase normal
menggunakan fase diam yang lebih polar dibandingkan dengan fase
geraknya, sedangkan HPLC fase terbalik menggunakan fase diam yang
lebih non-polar dibandingkan dengan fase geraknya (Synder, 2010).
Fase gerak yang digunakan dalam HPLC biasanya terdiri dari
satu pelarut atau campuran beberapa pelarut yang berperan dalam daya
elusi dan resolusi, sedangkan daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh
polaritas pelarut tersebut, polaris fase diam dan sifat sampel yang diuji.
Terdapat 2 tipe elusi pada HPLC yaitu, cara isokratik dan cara gradien.
Cara isokratik berprinsip pada ketetapan fase gerak selama proses elusi
berlangung, sedangkan pada cara gradien berprinsip pada gradien
komposisi fase gerak yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2007).
Kebanyakan fase diam pada HPLC yang dipilih berupa silika yang
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer
stiren dan divinil benzen. Sifat pada permukaan silika bersifat polar dan
sedikit asam akibat adanya residu dari gugus silanol (Si-OH). Salah satu
jenis silika yang dimodifikasi yaitu oktadesil silika (ODS atau C18). ODS
banyak digunakan karena dapat memisahkan senyawa yang memiliki
tingkat kepolaran rendah, sedang dan tinggi (Gandjar dan Rohman,
2007).
HPLC memiliki bagian-bagian terpentingnya, yaitu reservoir
pelarut, pompa, injektor, kolom dan detektor. Reservoir pelarut terbuat
14
dari kaca atau stainless steel yang mampu memuat 200-1000 mL pelarut.
Reservoir dilengkapi dengan degasser yang berfungsi untuk
menghilangkan gas terlarut pada fase gerak yang digunakan, kebanyakan
gas tersebut adalah oksigen dan nitrogen yang berpotensi kuat untuk
mengganggu proses analisis akibat pembentukan gelembung pada kolom
dan sistem detektor. Reservoir juga dilengkapi dengan penyaring milipore
yang mampu menyaring partikel halus yang terdapat pada pelarut.
Penyaring ini berfungsi untuk menghindari kerusakan berupa sumbatan
pada kolom, injektor, dan pompa (Susanti, 2017). Injektor atau alat
penyuntik sampel pada HPLC terbuat dari tembaga tahan karat dan katup
teflon. Sampel akan dimasukkan melewati keluk sampel, katup akan
diputar sehingga fase gerak akan melewati keluk sampel dan membawa
sampel ke dalam kolom (Gandjar dan Rohman, 2007)
1.4 Gambar 2.4.. Skema Injektor (a) posisi pada saat memuat sampel
dan (b) posisi saat menyuntikkan sampel (Ahuja dan Dong, 2005)
Pompa pada HPLC terbuat dari gelas, baja tahan karat, teflon,
dan batu nilam. Sifat pompa ini haruslah inert atau tidak bereaksi
terhadap samel maupun fase gerak yang digunakan. Pompa yang
15
digunakan sebaiknya memiliki kemampuan memberikan tekanan hingga
5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak degnan kecepatan 3
mL/menit. Fungsi adanya pompa adalah menjamin penghantaran fase
gerak dapat berlangsung secara tepat, konstan dan terbebas dari adanya
gangguan (Gandjar dan Rohman, 2007).
1.5 Gambar 2.5 . Skema Pompa Piston Tunggal Pada HPLC (Ahuja dan
Dong, 2005)
Kolom merupakan tempat terjadinya senyawa tersebut terpisah
dari ikatannya akibat interaksi penyerapan molekul antara fase gerak dan
fase diam dengan prinsip kepolaran molekul. Kolom merupakan salah
satu kunci utama dalam proses kromatografi yang baik. Silika merupakan
bahan pengisi kolom yang terdiri dari ikatan siloksan (Si-O-Si). Silanol
pada permukaan dalam kolom memiliki sifat polar. Namun pada sistem
HPLC fase terbalik, fase diam akan bersifat lebih non polar dikarenakan
adanya penambahan hidrokarbon pada permukaan silika (Moffat, 2011).
Kolom yang digunakan pada sistem HPLC pada umumnya memiliki
panjang 5-25 cm dengan diameter bagian dalam sebesar 4,6 mm, ukuran
partikel 5µm dan mengandung 40.000 sampai 70.000 plat/meter (Skoog,
2007).
16
Oven pada sistem HPLC berfungsi untuk menentukan suhu yang
digunakan atau kontrol suhu pada sistem HPLC. Terutama pada sistem
HPLC fase terbalik, suhu akan memengaruhi waktu retensi dan
selektivitas. Kisaran suhu yang digunakan untuk analisis adalah 30o
sampai 50o C (Ahuja dan Dong, 2005). Detektor diperlukan untuk
mendeteksi komponen yang terdapat dalam kolom serta untuk mengukur
jumlah konsentrasi komponen tesebut. Detektor yang baik adalah
detektor yang memenuhi persyaratan sensitivitas yang tinggi dengan
rentang sensitivitas 10-8 -10-15 gram solut per detik, kestabilan dan
reprodusibilitas yang sangat baik, respon yang linear terhadap
konsentrasi solut, dapat bekerja dari temperatur kamar sampai 400oC,
tidak dipengaruhi perubahan temperatur dan kecepatan pelarut
pengembang, mudah didapat, mudah dipakai operator, selektif terhadap
macam-macam linarut dalam pelarut pengembang dan tidak merusak
sampel (Mulja dan Suharman, 1995).
2.5. Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry
(UHPLC-MS/MS)
Prinsip kerja HPLC dengan UHPLC adalah sama, pemisahan
larutan berdasarkan daya ikatnya antara fase diam dan fase gerak dalam
sebuah kolom. Kelebihan UHPLC dibandingkan dengan HPLC adalah
memiliki ukuran partikel yang lebih kecil, efisiensi dan resolusi yang lebih
baik dibandingkan dengan HPLC. UHPLC pada dasarnya menggunakan
ukuran partikel sebesar
17
meningkat. Ketika dikombinasikan dengan kolom yang pendek atau aliran
fase gerak yang cepat. Resolusi yang dihasilkan oleh kolom juga
mengingkat antar puncak. Tingkat resolusi kolom dengan ukuran partikel
sebesar 1,7 µm membaik sebesar 70% dibandingkan dengan ukuran
partikel 5 µm (Seelam, 2013).
1.6 Gambar 2.6 . efektifitas kolom dengan perbandingan besar ukuran partikel
pada masing-masing dekakde plot van Deemter (Seelam, 2013).
Hasil kromatogram pada UHPLC akan lebih baik dibandingkan HPLC
yang memiliki nilai tekanan sebesar 2500-5000 PSI. UHPLC dapat
konsisten menghasilkan pemisahan dengan resolusi yang baik dengan
tekanan yang diberikan yaitu 8.000-15.000 PSI (Seelam, 2013).
Deteksi menggunakan MS akan memiliki efektifitas analisis yang
lebih tinggi dibandingkan deteksi menggunakan UV(Ultraviolet)-visible.
Karena detektsi analit menggunakan instrumen MS akan memberikan
kepastian selektivitas terhadap analit yang ingin di analisis atau diteliti.
Pada prinsipnya MS dapat menyusun molekul gas(ion) berdasarkan
massanya. MS bekerja dengan mengionisasi atom-atom atau molekul-
18
molekul kemudian menyeleksi dan mendeteksi ion berdasarkan
perbandingan massa terhadap muatannya. MS dan sistem UPLC
dihubungkan dengan alat pengionisasi dengan teknik ionisasi
berdasarkan tekanan atmosfer (API, Atmospheric Pressure Ionization).
Salah satu teknik API yang sering digunakan adalah ESI (Electrospray
Ionization) untuk campuran yang bersifat ion atau sangat polar, tidak
stabil terhadap suh tinggi atau yang memiliki berat molekul lebih tinggi
dari 100 (Watson, 2007).
1.7 Gambar 2.7. Sistem Kerja MS/MS pada UHPLC-MS/MS (Kang, 2015).
MS/MS memiliki beberapa tipe instrumen berdasarkan
fungsionalnya dalam analisis tertarget dan analisis tidak tertarget. Analisis
tertarget menggunakan beberapa instrumen seperti QqQ atau biasa
disebut dengan Triple Quadrupoleyang merupakan jenis analisis massa
yang menggunakan osilasi medan listrik yang digunakan digunakan untuk
menyeleksi ion yang stabil atau tidak stabil yang melewati frekuensi radio.
Quadrupole yang pertama bertindak sebagai mass filter, yang bertugas
19
untuk mengirimkan ion masuk ke dalam qudrupole kedua. Tugas dari
quadrupole yang kedua yaitu terjadi tumbukan ion yang mengalami
pemecahan. Sedangkan quadrupole ketiga memiliki tugas sebagai mass
filter yang mengirimkan ion hasil pemecahan ke detektor. Analisis
tertarget bermakna bahwa senyawa kimia lain tidak akan dimunculkan
pada kromatogram karena telah ditarget suatu senyawa yang akan di
analisis. Metode yang biasanya digunakan adalah SRM (Selected
Reaction Monitoring). Sedangkan analisis yang tidak tertarget, akan
banyak keluar senyawa kimia yang lain pada kromatogram, sehingga
tidak spesifik terhadap senyawa yang sedang akan dianalisis. Insrumen
MS yang digunakan pada analisis tidak tertarget yaitu salah satunya TOF
(Time-of-flight) dengan prinsip penembakan laser dengan panjang
gelombang tertentu kepada matriks yang akan menyerap cahaya
tersebut. Tegangan pulsa laser ditembakkan ke pelar target untuk
mempercepat sampel terionisasi menuju analyzer massa time of flight
(Kang, 2015).
2.6. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis adalah proses pembuktian yang
meyakinkan bahwa performa karakteristik suatu metode telah memenuhi
persyaratan untuk aplikasi analisis (United States Pharmacopeial
Convention, 2007). Menurut Harmita (2004), bahwa validasi metode
adalah suatu proses penilaian terhadap metode analisis tertentu
berdasarkan percobaan labolatorium untuk membuktikan bahwa metode
tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan. Validasi metode
analisis ini berfokus pada beberapa parameter tertentu, seperti ketepatan
20
(akurasi), ketelitian (presisi), selektivitas, limit deteksi, limit kuantitasi,
lineartitas dan rentang (United States Pharmacopeial Convention, 2007).
Tujuan dari dilaksanakannya validasi metode ini adalah menjamin
bahwa metode analisis yang dikembangkan dapat memberikan hasil
pengukuran yang cermat, tepat dan sesuai dengan yang diharapkan
secara konsisten. Untuk menghindari penurunan kualitas produk, dalam
upaya menjaga kualitas, keamanan dan efikasi dari produk yang akan
dikonsumsi oleh masyarakat.
Table 2.1. Kategori Metode Pengujian (United States Pharmacopeial Convention,
2007).
Kategori Keterangan
I
Metode untuk penetapan kadar komponen utama bahan baku atau
bahan aktif (termasuk pengawet) dalam produk jadi sediaan
farmasi
II Metode analisis untuk penetapan ketidakmurnian bahan baku atau
hasil degradasi dalam produk jadi sediaan farmasi
III Metode analisis untuk penetapan karakteristik performa (seperti
disolusi, pelepasan obat)
IV Uji identifikasi
21
Table 2.2. Parameter Analisis yang Dibutuhkan Dalam Validasi Metode Analisis
(United States Pharmacopeial Convention, 2007).
Karateristik
Analisis Kategori I Kategori II Kategori III Kategori IV
Akurasi Y Y - - T
Presisi Y Y T Y T
Batas deteksi Y Y Y - Y
Selektivitas T T Y - T
Batas kuantitasi T Y T - T
Linieritas Y Y T - T
Rentang Y Y - - T
a. Selektivitas
Selektivitas merupakan salah satu kemampuan untuk mengukur
analit secara spesifik, cermat dan seksama dengan adanya komponen
yang mungkin ada dalam sampel. Selektivitas dinyatakan dalam derajat
bias dari hasil yang diperoleh dengan membandingkan dengan
impuritas, produk degradasi atau senyawa kimia yang mirip. Selektivitas
ditentukan dengan menginjeksikan sampel pada sistem kromatografi,
puncak yang lain tidak tercampur dengan puncak yang lain, dinyatakan
dalam perhitungan resolusi (Yuwono dan Indrayanto, 2005).
Nilai resolusi (Rs) yang diterima yaitu >1,5 (baseline resolution),
artinya puncak sudah terpisah dan senyawa tersebut telah murni
terdeteksi tanpa adanya kontaminasi dengan bahan lain (Pescok, 1976)
22
b. Linieritas dan rentang
Linieritas adalah kemampuan metode analisis untuk menunjukkan
hasil uji yang secara langsung dengan grafik atau secara perhitungan
matematis proporsional atau sebanding dengan kenaikan konsentrasi
analit dalam sampel pada beberapa sampel atau pada rentang tertentu.
Minimal jumlah konsentrasi atau sampel yang dibutuhkan adalah 4
sampel, untuk menghasilkan nilai resolusi. Linieritas digambarkan dalam
bentuk persamaan regresi linear yaitu y=bx+a. Hasil slope (b), intersep
(a) dan resolusi (r) menggambarkan informasi linieritas. Intersep
menunjukkan tingkat kepekaan analisis instrumen yang digunakan
(Harmita, 2004). Nilai koefisien yang diterima yaitu sebesar 0,999, jika
nilai koefisien kurang dari 0,999 maka perlu dilakukan perhitungan
parameter lain yaitu Vxo ≤5 (Yuwono dan Indrayanto, 2005)
Rentang merupakan jarak antara kadar terendah dengan kadar
tertinggi analit yang sudah ditujukkan dapat diterapkan dengan
ketepatan, ketelitian dan linieritas yang dapat diterima sesuai ketentuan-
ketentuan. Rentang dinyatakan dalam satuan yang sama dengan hasil
yang diperoleh dengan metode analisis (Harmita, 2004).
c. Ketepatan (akurasi)
Ketepatan diartikan dengan kedekatan antara hasil analisis
dengan kadar analit yang sebenarnya. Ketepatan dinyatakan dalam
23
persen perolehan kembali (% recovery). Banyak faktor-faktor yang
mempengaruhi tingkat ketepatan, seperti kalibrasi alat, peraksi dan
pelarut yang tidak menimbulkan residual atau kontaminan, kontrol suhu,
dan pelaksanaan praktikan yang handal (Harmita, 2004). Secara
Internasional, terdapat 3 cara yang digunakan untuk mengevaluasi
ketepatan metode analisis kimia, yaitu dengan bahan rujukan baku
(SRM/Standart Reference Material), menggunakan baku sebagai
pembanding (standart method) dan recovery dengan menempatkan
analit plasebo (Spiked plasebo recovery) (Synder, 1997).
Tabel 2.3. Kriteria Rentang Recovery yang Dapat Diterima (AOAC, 2002)
Konsentrasi analit (%) Akurasi (recovery, %)
100 98-101
10 95-102
1 92-105
0,1 90-108
0,01 85-110
10 µg/g (ppm) 80-115
1 µg/g 75-120
10 µg/kg (ppb) 70-120
d. Kecermatan (presisi)
Ketelitian menunjukkan ukuran kesesuaian antara hasil uji
individual diukur melalui penyebaran hasil individual kemudian di rata-
24
rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel yang diambil
dari campuran yang homogen (Synder, 1997). Ketelitian dinyatakan
sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (Harmita, 2004).
Suatu metode tersebut akan memenuhui syarat apabila nilai
koefisian variasinya (KV) yaitu
25
BAB 3
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1. Kerangka Konsep
Gambar 3.1. Kerangka Konsep
Prevalensi penggunaan obat tradisional mencapai 30,4%
masyarakat Indonesia (Kemenkes RI, 2013)
Ramuan mengandung kunyit mencapai 86
ramuan di berbagai etnis (Kemenkes RI, 2015)
monitoring mutu sediaan obat tradisional
Analisis menggunakan UHPLC-MS/MS
Validasi metode
analisis
Linieritas Selektivitas Akurasi Presisi LOD &
LOQ
Penetapan kadar kurkumin pada sediaan
obat tradisional di Kota Malang
Kurkumin(senyawa marker)
Efek Farmakologi yang tinggi
26
Prevalensi dari penggunaan obat tradisional meningkat pada
dekade ini, terdapat banyak ramuan obat tradisional di berbagai etnis di
Indonesia. Salah satu pemegang jumlah ramuan terbanyak yaitu tanaman
kunyit. Pada penelitian ini, dilakukan validasi metode analisa kurkumin
yang terkandung dalam kunyit, sehingga metode analisa kurkumin pada
kunyit dapat valid untuk dilakukan. Parameter validasi yang
dipertimbangkan adalah selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, LOD dan
LOQ. Kemudian dilakukan penetapan kadar pada sediaan herbal
mengandung kunyit di Kota Malang. Hal ini bertujuan untuk menetapkan
kadar kurkumin pada sediaan tersebut dan menjamin efikasi, keamanan
dan kualitas dari sediaan herbat tersebut ketika dikonsumsi oleh pasien.
Validasi metode ini dilakukan menggunakan HPLC yang telah dioptimasi
kondisinya, fase gerak dan fase diamnya.
27
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1. Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan mengikuti jenis penelitian observasional,
dengan rancangan penelitian deskriptif, karena pada penelitian ini tidak
dilakukan manipulasi pada subjek uji dan hanya mendeskripsikan
keadaan yang ada.
4.2. Populasi dan sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah produk herbal
yang mengandung kunyit (Curcuma longa). Sampel didapatkan atau
diperoleh dari kios-kios jamu yang ada di Kota Malang. Sampel diambil
secara purposive sampling, dapat berupa jamu, OHT atau fitofarmaka.
Sampel yang diambil yaitu sejumlah 3 produk, masing-masing dari merk
atau produk yang berbeda. Kriteria pemilihan sampel yaitu sebagai
berikut :
- Mengandung tanaman Curcuma longa
- Sampel dapat berupa jamu, OHT atau fitofarmaka
- Sampel dapat berupa sediaan serbuk, kapsul atau tablet dan
sediaan cair
4.3. Lokasi dan Waktu Penelitian
4.3.1. Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Labolatorium Bahan Alam,
Program Studi Farmasi Universitas Brawijaya dan di Labolatorium
28
Analisis Instrumen, Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri
Malang.
4.3.2. Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli-Oktober 2018
4.4. Bahan dan Alat Penelitian
4.4.1. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku
standar kurkumin TCI (Tokyo Chemical Industry), sampel produk
herbal yang diambil secara acak sejumlah 3 sampel di Kota
Malang, metanol pro HPLC, asam format 0,1% pro HPLC dalam
aquabidest pro HPLC, asam format 0,1% pro HPLC dalam
asetonitril 0,1% pro HPLC.
4.4.2. Alat / Instrumen Penelitian
Alat yang digunakan adalah UHPLC merk ACCELLA tipe
1250 buatan Thermo Scientific yang terdiri dari degasser vakum,
pompa quartener, autosampler termostatik, MS/MS Triple Q
(quadrupole) spektrometer massa TSQ QUANTUM ACCESS MAX
dari Thermo Finnigan, Personal Computer (PC) dengan perangkat
lunak x-calibur 2.1 dan software TSQ Tune mode ionisasi positif,
kolom Kinetex EVO c18 100oA (50mmx2,1 mm x 1,7 µm.
disposable filter dengan ukuran pori 0,2 mikrometer, neraca
analitik Shimadzu ® AUW 220, pipet volume, labu ukur, gelas
ukur, gelas kimia, mikropipiet, neraca Metler AE® 200),
mikropipet sentrifuge Orcgon® LC-04S, sonikator DAWE®.
29
4.5. Prosedur Penelitian
4.5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MS
Fase gerak yang digunakan yaitu fase gerak A dan fase
gerak B. Fase gerak A terdiri dari 0,1% asam format dalam
aquabidest dan Fase gerak B terdiri dari 0,1% asam format
dalam Acetonitrile. Gradien kecepatan fase gerak yang
dipakai adalah 300 µl/menit dengan pengaturan fase gerak
sebagai berikut :
Tabel 4.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak
No. Time A% B% µl/min 0 0.00 75.0 25.0 300.0 1 0.50 75.0 25.0 300.0 2 3.00 25.0 75.0 300.0 3 4.00 25.0 75.0 300.0 4 4.50 75.0 25.0 300.0 5 6.00 75.0 25.0 300.0
Kromatogram yang digunakan yaitu UHPLC merk
ACCELLA tipe 1250 buatan Thermo Scientific yang terdiri
dari degasser vakum, pompa quartener, autosampler
termostatik dikendalikan Personal computer melalui program
x-calibur 2.1. Kolom yang digunakan dengan spesifikasi
Kinetex EVO C18 100OA (50mm x 2.1mm x 1.7µm). Kolom
dikontrol pada suhu 30oC dan kompartemen sampel ditetapkan
pada suhu 16oC.
Sebagai pendukung data secara kuantifikasi dan kualifikasi,
digunakan MS/MS Triple Q (quadrupole) spektrometer massa
30
TSQ QUANTUM ACCESS MAX dari Thermo Finnigan
dengan sumber ionisasi ESI (Electrospray Ionization)
dikendalikan oleh software TSQ Tune yang dioperasikan
dengan ionisasi mode positive. Penentuan senyawa yang
ditarget dengan metode SRM (Selected Reaction
Monitoring)diatur pada Tabel 1.
Tabel 1. Optimasi parameter massa untuk Curcumin
Komponen Parent mass (m/z) Product mass (m/z)
Qualifier Quantifier
Curcumin 369 177 285
Kondisiionisasi ESIadalah sebagai berikut:
Teganganspray 3kV
Suhupenguapan275◦C
Suhukapiler, 300◦C
Nitrogensebagaisheath gas pressure 40 psi
Aux gas pressure10 psi dengan gas argon.
4.5.2. Pembuatan larutan baku kurkumin
Ditimbang baku kurkumin sebanyak 1,6; 3,3; 7,5; 15; 30 mg
Dilarutkan dengan metanol dalam labu takar 10 ml hingga
tanda sehingga diperoleh konsentrasi 0,16; 0,33; 0,75; 1,5; 3
mg/ml sebagai larutan baku kurkumin
Semua larutan baku tersebut disonikasi selama 10 menit
Larutan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm selama 10
menit
31
Supernatan dipipet, kemudian larutan diencerkan kembali
dengan metanol pro HPLC
Larutan kemudian disaring dengan disposable filter berukuran
0,2 µm
Setiap konsentrasi diinjek pada UHPLC dengan volume 2µl,
dengan replikasi pada masing-masing injeksi yaitu 3 kali
4.5.3. Preparasi Sampel
Terdapat 3 sampel yang digunakan yaitu sampel sediaan cair,
sediaan kapsul dan sediaan serbuk.
4.5.3.1. Sediaan Cair
Ditimbang sampel sediaan cair sebanyak 1,0882 g
Dilarutkan dengan metanol pro HPLC dalam labu
takar 10 ml hingga tanda
Disonikasi selama 10 menit
Larutan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm
selama 10 menit
Supernatan dipipet sebanyak 100 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol. Larutan
tersebut dipipet sebanyak 200 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol sehingga
diperoleh faktor pengenceran sebanyak 660 ml
Larutan kemudian disaring dengan disposable filter
berukuran 0,2 µm
32
Setiap konsentrasi diinjek pada UHPLC dengan
volume 2µl, dengan replikasi pada masing-masing
injeksi yaitu 5 kali
4.5.3.2. Sediaan Serbuk
Ditimbang sampel sediaan serbuk sebanyak 0,1203 g
Dilarutkan dengan metanol pro HPLC dalam labu
takar 10 ml hingga tanda
Disonikasi selama 10 menit
Larutan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm
selama 10 menit
Supernatan dipipet sebanyak 200 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol. Sehingga
diperoleh faktor pengenceran sebanyak 60 ml
Larutan kemudian disaring dengan disposable filter
berukuran 0,2 µm
Setiap konsentrasi diinjek pada UHPLC dengan
volume 2µl, dengan replikasi pada masing-masing
injeksi yaitu 5 kali
4.5.3.3. Sediaan Kapsul
Diambil sejumlah 20 kapsul, serbuk kapsul
dikeluarkan dari cangkang kapsul
Ditimbang serbuk dari 20 kapsul sehingga diperoleh
9,84 g
Ditimbang sampel serbuk kapsul sebanyak 0,1095 g
33
Dilarutkan dengan metanol pro HPLC dalam labu
takar 10 ml hingga tanda
Disonikasi selama 10 menit
Larutan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm
selama 10 menit
Supernatan dipipet sebanyak 100 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol. Larutan
tersebut dipipet sebanyak 100 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol. Larutan
tersebut dipipet kembali sebanyak 100 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol Sehingga
diperoleh faktor pengenceran sebanyak 13.310 ml
Larutan kemudian disaring dengan disposable filter
berukuran 0,2 µm
Setiap konsentrasi diinjek pada UHPLC dengan
volume 2µl, dengan replikasi pada masing-masing
injeksi yaitu 5 kali
4.5.4. Validasi metode analisis
4.5.4.1. Uji Selektivitas
Sebanyak 2 µl larutan sampel cair, sampel kapsul dan
sampel sediaan serbuk serta larutan baku diinjeksikan
ke UHPLC
Dilakukan pengamatan terhadap waktu retensi,
resolusi, dan match factor antara larutan baku dan
masing-masing larutan sampel
34
4.5.4.2. Uji Linieritas
Sebanyak 2 µl larutan baku kurkumin dengan
konsentrasi 0,16; 0,33; 0,75; 1,5; 3 mg/ml diinjeksikan
pada sistem HPLC
Dilakukan 3 kali injeksi pada setiap larutan baku
kurkumin
Diamati luas area pada masing-masing konsentrasi
dan replikasi.
Persamaan kurva baku dari setiap replikasi ditetapkan
dari hasil analisis regresi linear antara konsentrasi
terhadap luas area yang diperoleh.
Kemudian dipilih kurva terbaik dengan nilai koefisien
korelasi (r) >0,999.
4.5.4.3. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin
Sebanyak 2 µl larutan baku kurkumin dengan
konsentrasi 0,16; 0,33; 0,75; 1,5; 3 mg/ml diinjeksikan
pada sistem HPLC
Dilakukan 3 kali injeksi pada setiap larutan baku
kurkumin
Diamati luas area pada masing-masing konsentrasi
dan replikasi.
Luas area yang didapatkan, dimasukkan kembali ke
dalam persamaan linear yang telah dipilih pada uji
linieritas
Hitung perolehan kembali konsentrasi dan %RSD
35
4.5.4.4. Penentuan Limit of Detection (LOD) dan Limit of
Quantification (LOQ)
Sebanyak 2 µl larutan baku konsentrasi 0,16; 0,33;
0,75; 1,5; 3 mg/ml ke sistem HPLC
Dilakukan pengamatan terhadap luas area yang
muncul pada detektor
Dihitung nilai LOD dan LOQ
4.5.5. Analisis data
4.5.5.1. Selektivitas
Selstivitas ditentukan dengan parameter resolusi (Rs)
(Harmita, 2004). Rumus perhitungan resolusi :
𝑟𝑒𝑠𝑜𝑙𝑢𝑠𝑖 𝑅𝑠 = (𝑡𝑅1 − 𝑡𝑅2)
12 (𝑊1 + 𝑊2)
Keterangan : Rs = resolusi
tR1 = waktu retensi puncak analit
pertama
tR2 = waktu retensi puncak
analit kedua
W1 = lebar dasar puncak
pertama
W2 = lebar dasar puncak
kedua
36
4.5.5.2. Linieritas
Linieritas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r) yang
didapatkan dari persamaan regresi y=bx+a. (b)
merupakan nilai slope dari persamaan dan (a)
merupakan nilai intersep dari persamaan. Persamaan
regersi didapatkan dari hasil plot konsentrasi larutan
baku kurkumin terhadap luas area (AUC) pada
kromatogram.
4.5.5.3. Akurasi
Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan kembali
(% recovery). Rumus menghitung % recovery:
%𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 =𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎 𝑥 100%
4.5.5.4. Presisi
Presisi dihitung sebagai simpangan deviasi relatif
(RSD) atau koefisien variasi (KV). Rumus perhitungan
KV:
𝐾𝑉 = 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 (𝑆𝐷)
𝑟𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 (𝑥) 𝑥 100%
4.5.5.5. LOD dan LOQ
Penentuan LOD dan LOQ dapat dilakukan melalui
penghitungan rumus sebagai berikut:
𝐿𝑂𝐷 =3.
𝑆𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢 𝑦 𝑆𝑦
𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 (𝑥)
𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒
𝐿𝑂𝑄 =10.
𝑆𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢 𝑦 𝑆𝑦
𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 (𝑥)
𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒
37
4.5.5.6. Perhitungan Kadar Sampel
Kadar sampel dapat diketahui dengan memasukkan
nilai luas area ke dalam rumus persamaan linier
y=bx+a. Rumus perhitungan kadar sampel yaitu:
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 % =𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 µg/ml 𝑥 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 (𝑚𝑙)
𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑔 𝑥 1000000𝑥100%
38
BAB 5
HASIL DAN ANALISA DATA
5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MS
Validasi metode analisa dilakukan dengan kondisi fase gerak yang
digunakan yaitu fase gerak A dan fase gerak B. Fase gerak A terdiri dari
0,1% asam format dalam aquabidest dan Fase gerak B teridiri dari 0,1%
asam format dalam Acetonitrile. Gradien kecepatan fase gerak yang
dipakai adalah 300 µl/menit dengan pengaturan fase gerak sebagai
berikut :
Tabel 5.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak
Waktu
(menit) A% B% µl/menit
0 75 25 300
0,5 75 25 300
3 25 75 300
4 25 75 300
4,5 75 25 300
6 75 25 300
Kromatogram yang digunakan yaitu UHPLC merk ACCELLA tipe
1250 buatan Thermo Scientific yang terdiri dari degasser vakum, pompa
quartener, autosampler termostatik dikendalikan Personal Computer
melalui program X-Calibur 2.1. Kolom yang digunakan dengan spesifikasi
Kinetex EVO C18 100OA (50mm x 2.1mm x 1.7µm). Kolom dikontrol pada
suhu 30oC dan kompartemen sampel ditetapkan pada suhu 16oC.
39
Sebagai pendukung data secara kuantifikasi dan kualifikasi,
digunakan MS/MS Triple Q (quadrupole) spektrometer massa TSQ
QUANTUM ACCESS MAX dari Thermo Finnigan® dengan sumber
ionisasi ESI (Electrospray Ionization) dikendalikan oleh software TSQ
Tune yang dioperasikan dengan ionisasi mode positive. Penentuan
senyawa yang ditarget dengan metode SRM (Selected Reaction
Monitoring) diatur pada Tabel 1.
Tabel 5.2. Optimasi Parameter Massa untuk Curcumin
Komponen Parent mass (m/z) Product mass (m/z)
Qualifier Quantifier
Curcumin 369 177 285
Kondisi ionisasi ESIadalah sebagai berikut:
Teganganspray 3kV
Suhupenguapan275◦C
Suhukapiler, 300◦CN
Nitrogensebagaisheath gas pressure 40 psi
Aux gas pressure10 psi dengan gas argon.
5.2. Validasi Metode Analisa
5.2.1. Selektivitas
Selektivitas dinyatakan dengan waktu retensi dan match factor
antara baku kurkumin dengan sampel sediaan herbal yang
mengandung kurkumin. Uji selektivitas bertujuan untuk menganalisis
dan memastikan adanya senyawa target pada sampel dibandingkan
dengan standar.
40
Tabel 5.3. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Waktu Retensi
Jenis Sediaan
Waktu Retensi Rata-rata (menit)
Sediaan serbuk
3,19
Sediaan Kapsul
3,32
Sediaan Cair
3,22
Baku Kurkumin
3,20
Gambar 5.1. Hasil Waktu Retensi antara Standar (a) dan Sampel Serbuk (b)
Waktu retensi pada tabel diatas menunjukkan bahwa sampel
mengandung kurkumin ditunjukkan dengan waktu retensi yang sama
yaitu sekitar 3,2-3,3 menit. Dapat diamati pada gambar 5.1 bahwa
(a)
(b)
41
waktu retensi antara standar dan sampel serbuk menunjukkan TR
yang sama yaitu 3,2 dan 3,22 menit. Dari data tabel dan gambar
tersebut bermakna bahwa sampel mengandung kurkumin ditunjukkan
dengan waktu retensi yang sama. Sehingga selektivitas kurkumin
dapat dinyatakan memenuhi syarat berdasarkan kesamaan waktu
retensi.
Tabel 5.4. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Detektor MS/MS
Gambar 5.2. Hasil Detektor MS/MS antara Standar (a) dan Sampel Serbuk (b)
Jenis Sediaan
Product mass (m/z) Sampel
Product mass (m/z) Baku %
Qualifier Quantifier Qualifier Quantifier
Sediaan serbuk
177 285 177 285 100
Sediaan Kapsul
177 285 177 285 100
Sediaan Cair
177 285 177 285 100
(b) (a)
42
Detektor MS akan mendeteksi setiap bagian yang terpecah
menjadi bentuk ion dari senyawa kurkumin. Dari tabel diatas dapat
diamati bahwa sampel sediaan herbal mengandung kurkumin
ditunjukkan dengan berat molekul pecahan senyawa kurkumin yang
sama dengan standar yaitu 285 m/z sebagai berat molekul kuantifier
dan 177 m/z sebagai kualifier, sehingga dapat dinyatakan selektivitas
memenuhi syarat berdasarkan waktu retensi yang sama dan pecahan
ion tertarget yang muncul pada detektor.
5.2.2. Linieritas
Linieritas bertujuan untuk mengetahui korelasi antara
perubahan konsentrasi terhadapat luas area yang muncul pada
sistem UHPLC. Linieritas yang baik ditunjukkan dengan nilai koefisien
korelasi (r2) yaitu lebih dari 0,999 (AOAC, 2002)
Linieritas diperoleh dengan menginjeksi 5 konsentrasi larutan
baku yang berbeda yaitu 0,16; 0,33; 0,75; 1,5 dan 3 mg/mlkemudian
didapatkan persamaan linear yaitu y=59.563,83x+638,72 dengan nilai
koefisien korelasi yaitu 0,9997, yang bermakna perubahan luas area
yang muncul berbanding lurus terhadap perubahan konsentrasi
larutan baku. Nilai Vxo atau relatif standar deviasi yaitu
2,93%dinyatakan memenuhi persyaratan yaitu dibawah 5% (Yuwono
& Indrayanto, 2005). Sehingga dapat dinyatakan uji linieritas
memenuhi persyaratan.
𝑆𝑥𝑜 = 𝑆𝑦
𝑏 𝑉𝑥𝑜 =
𝑆𝑥𝑜
𝑥 𝑥 100%
43
𝑆𝑥𝑜 = 2.005,25
59.563,83= 0,03 𝑉𝑥𝑜 =
0,03
1,15𝑥100% = 2,93%
Gambar 5.3. Grafik Linieritas Larutan Standar Kurkumin dengan Konsentrasi
0,16; 0,33; 0,75; 1,5 dan 3 mg/ml
5.2.3. Akurasi dan Presisi
Akurasi dapat didefinisikan sebagai kedekatan nilai antara nilai
hasil uji terhadap nilai yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan
dengandinyatakan dengan persen perolehan kembali analit. Terdapat
3 konsetrasi larutan yang diinjeksi yaitu 0,75; 1,5 dan 3 mg/ml dengan
3 kali replikasi di setiap konsentrasinya. Merujuk pada tabel 5.7, hasil
perolehan kembali yang didapatkan dari uji parameter akurasi metode
analisis kurkumin yaitu 98,63% pada konsentrasi 0,75 mg/ml,
101,06% pada konsentrasi 1,5 mg/ml dan 101,76% pada konsentrasi
3 mg/ml. Rentang hasil %perolehan kembali yang didapatkan yaitu
98,63%-101,76%. Dari tabel 5.5 dapat diamati bahwa akurasi dari
setiap % perolehan kembali konsentrasi memenuhi persyaratan
merujuk pada tabel 5.5 yaitu di dalam rentang 75-120%.
y = 59.563,83x + 638,72R² = 0,9997
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
- 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50
Lu
as A
rea
Konsentrasi (mg/ml)
Linieritas
44
Tabel 5.5. Kriteria Batas Perolehan Kembali yang Dapat Diterima
(AOAC, 2002)
Konsentrasi Batas Perolehan Kembali
100% 98-101%
10% 95-102%
1% 92-105%
0,1% 90-108%
0,01% 85-110%
10 µg/g (ppm) 80-115%
1 µg/g 75-120%
10 µg/kg (ppb) 70-125%
Presisi merupakan kedekatan antar nilai dalam pengukuran
secara berulang. Presisi dinyatakan dengan simpangan baku (SD)
atau simpangan baku relatif (RSD). Pesisi yang baik dari suatu
analisis ditandai dengan nilai %RSD dibawah persyaratan sesuai
dengan kondisi analisis. Hasil %RSD yang diperoleh dari uji presisi
metode analisis kurkumin yaitu 0,38-5,7%. Dari tabel 5.6 dapat
diamati bahwa %RSD dari setiap konsentrasi larutan baku memenuhi
persyaratan merujuk pada tabel 5.6 yaitu kurang dari 8%.
Tabel 5.6. Kriteria Batas %RSD yang Dapat Diterima (AOAC, 2002)
Konsentrasi Batas %RSD
100% 1%
10% 1,5%
1% 2%
0,1% 3%
0,01% 4%
10 µg/g (ppm) 6%
1 µg/g 8%
10 µg/kg (ppb) 15%
45
Tabel 5.7. Tabel Hasil Akurasi dan Presisi
No Kons.
(mg/mL) Area
KONS. THT
(mg/mL)
%Perolehan kembali
Rata-rata%perolehan
kembali
Deviasi Standart
%Deviasi Standart Relatif
1
0,16 10.483,93 0,165 101,40
99,04 2,15 2,17 0,16 10.203,98 0,161 98,52
0,16 10.076,62 0,158 97,21
2
0,33 23.014,25 0,376 115,59
114,11 2,52 2,21 0,33 22.165,10 0,361 111,20
0,33 23.003,60 0,375 115,53
3
0,75 44.588,03 0,738 98,38
98,63 0,38 0,38 0,75 44.618,92 0,738 98,45
0,75 44.893,26 0,743 99,06
4
1,50 96.862,08 1,615 107,70
101,06 5,76 5,70 1,50 88.294,71 1,472 98,11
1,50 87.627,88 1,460 97,36
5
3,00 183.015,70 3,062 102,06
101,76 1,01 0,99 3,00 180474,04 3,019 100,64
3,00 183.954,39 3,078 102,59
5.2.4. LOD dan LOQ
LOD bertujuan untuk mengetahui jumlah terkecil analit pada
suatu sampel yang memberikan respon yang signifikan
dibandingkan dengan blanko sedangkan LOQ bertujuan untuk
mengetahui nilai analit dalam sampel minimal yang terhitung oleh
sistem kromatogram. LOD dan LOQ didapatkan dengan
menggunakan persamaan:
SD = (𝑦 − 𝑦𝑖)2
𝑁 − 2
SD = 12.063.112,71
3
46
SD = 2005,25
𝐿𝑂𝐷 =3. 𝑆𝐷
𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒𝐿𝑂𝑄 =
10.𝑆𝐷
𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒
𝐿𝑂𝐷 =3.2005,25
59.563,83𝐿𝑂𝑄 =
10.2005,25
59,563,83
𝐿𝑂𝐷 = 0,11 µ𝑔/𝑚𝑙𝐿𝑂𝑄 = 0,34 µ𝑔/𝑚𝑙
Sehingga didapatkan nilai LOD 0,11µg/ml dan LOQ yaitu 0,34 µg/ml.
5.3. Penetapan Kadar Kurkumin pada Sediaan Herbal
Penetapan kadar kurkumin dilakukan untuk mengetahui kadar
kurkumin pada sediaan herbal mengandung kunyit. Sampel serbuk
ditimbang sebanyak 0,1203 gram, sampel kapsul ditimbang sebanyak
0,1095 gram dan sampel cair ditimbang sebanyak 1,088 gram, ketiga
sampel masing-masing dilarutkan dalam 10 ml metanol. Dilakukan
sonikasi selama 10 menit dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan
kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Analisis dilakukan menggunakan
UHPLC-MS/MS sehingga diperoleh kadar kurkumin dari setiap sampel
yaitu 0,03% kurkumin terkandung pada sampel serbuk, 4,78% kurkumin
terkandung dalam sediaan kapsul dan 0,03% sediaan cair.
Tabel 5.8. Tabel Hasil Penetapan Kadar Kurkumin dalam Sampel
No Jenis Sediaan Persamaan
Linear Kadar
Kurkumin(µg/g)
Rata-rata Kadar
Kurkumin (%)
1 Sediaan Serbuk 25 mg
(mengandung 5 gram ekstrak kunyit)
y=58.350,2x-1.080,65
299,71 0,03
2 Sediaan Kapsul 500 mg
(mengandung 500 mg ekstrak y=59563,83x+638,72
47.835,10
4,78
47
kunyit)
3 Sediaan Cair150 ml
(mengandung 30 gram rimpang kunyit)
y=58.350,2x-1.080,65
295,58 0,03
48
BAB 6
PEMBAHASAN
6.1 Pembahasan
Konsumsi sediaan herbal oleh masyarakat semakin meningkat,
terutama sediaan herbal mengandung kunyit. Sediaan herbal itu sendiri
terbagi menjadi 3 kategori yaitu jamu, OHT dan fitofarmaka. Kunyit memiliki
banyak efikasi yang diperlihatkan oleh beberapa ramuan tradisional kunyit di
beberapa daerah di Indonesia. Pada Etnis Jawa di Yogyakarta terdapat 50
ramuan mengandung kunyit yang digunakan untuk terapi pasca persalinan.
Pada Etnis Jawa daerah Jawa Tengah terdapat 29 ramuan mengandung
kunyit untuk mengatasi penyakit jaundiceatau gangguan pada organ hati.
Pada Etnis Simalungun daerah Sumatera terdapat satu ramuan untuk
pengobatan HIV/AIDS, dan 26 ramuan untuk pengobatan kanker pada Etnis
Suku Hutan Provinsi Riau (Kemenkes RI, 2015). Kunyit memiliki efek
farmakologis yang paling populer yaitu sebagai anti-inflamasi. Efek
farmakologi lain dari kunyit yaitu sebagai agen hipotensi, anti kanker, anti
koagulan dan hepatoprotektor (Simanjutak, 2012).
Tujuan dilakukan penelitian ini yaitu mengetahui validitas metode
analisis kurkumin dalam kunyit dengan metode UHPLC-MS/MS dan
mengetahui kadar kurkumin dalam sediaan herbal mengandung kunyit.
Seiring dengan meningkatnya konsumsi produk herbal terutama jamu
mengandung kunyit, maka monitoring kualitas sediaan tersebut juga menjadi
sangat penting demi menjaga keamanan produk, kualitas produk dan efikasi
dari produk yang terdapat di pasaran. Monitoring kualitas sangat diperlukan
49
guna menjamin produk dapat tepat indikasi dan memiliki efikasi yang
maksimal ketika dikonsumsi oleh pasien (Oka, 2017). Monitoring kualitas
sediaan tersebut dilakukan dengan validasi metode analisis kurkumin
dengan parameter uji selektivitas, linieritas, akurasi presisi, LOD dan LOQ.
Kemudian dilakukan penetapan kadar kurkurmin pada beberapa sampel
sediaan herbal mengandung kunyit menggunakan UHPLC-MS/MS. Sampel
diambil dengan metode Purposive Sampling karena terdapat beberapa
kriteria pemilihan sampel yaitu sediaan herbal mengandung Curcuma longa,
sediaan herbal yang digunakan dapat dalam bentuk sediaan serbuk, kapsul
atau tablet dan dapat berupa jamu, OHT dan fitofarmaka, serta memiliki label
lengkap yang berisi kandungan ekstrak atau rimpang kunyit yang digunakan
dan indikasi sediaan herbal tersebut. Sampel yang dipilih adalah jamu
mengandung kunyit dalam sediaan serbuk, jamu mengandung kunyit dalam
sediaan kapsul dan OHT mengandung kunyit dalam sediaan cair.
Optimasi kondisi UHPLC-MS/MS perlu dilakukan untuk menunjang
efektifitas analisis. Sistem kromatografi yang digunakan yaitu fase terbalik,
yang memiliki fase diam yang non polar dan fase gerak yang lebih polar.
Optimasi yang dilakukan pada sistem UHPLC salah satunya yaitu fase
gerak. Beberapa pertimbangan diberikan pada pemilihan fase gerak
berdasarkan polaritas fase gerak. Kepolaran analit, fase gerak dan fase diam
akan mempengaruhi adanya perbedaan kecepatan migrasi masing-masing
senyawa akibat perbedaan distribusi atau afinitas relatif senyawa analit
tersebut pada fase diam dan fase gerak. Sifat senyawa yang polar akan
cenderung terdistribusi pada fase yang polar, sedangkan senyawa analit
yang non polar akan cenderung terdistribusi pada fase yang non-
50
polar.Pelarut A adalah pelarut air dengan 0,1% asam dan pelarut B adalah
pelarut organik seperti asetonitril, metanol dan propanol dengan 0,1% asam
(Jiang, 2012).
Fase gerak A terdiri dari 0,1% asam format dalam aquabidest, fase B
terdiri dari 0,1% asam format dalam Acetonitrile. Terdapat penambahan
asam format pada kedua tipe larutan yang memiliki fungsi untuk
memperjelas bentuk puncak pada kromatogram dan untuk menjadi sumber
proton dalam LC/MS fase terbalik. Asam format akan membuat larutan
memiliki pH yang rendah. Kondisi pH yang rendah ini akan menjaga residu
silanol dalam kondisi yang tidak terpisahkan, sehingga akan menghindarkan
adanya adsorpsi serta tidak terjadinya tailing. Selain itu, asam format
memiliki tingkat kontaminasi yang paling rendah, sehingga tidak menggaggu
proses analisis yang memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi (Ayuchecaria,
2016).
Gambar 6.1. Residual Silanol Pada Kolom UHPLC (Crawford, 2016)
Pada larutan B dipilih Asetonitril karena bersifat polar. Gugus nitrogen
terpolarisasi akibat perbedaan elektronegativitas antara atom karbon dan
nitrogen, sehingga menghasilkan 3 ikatan dari 2 atom tersebut. Oleh karena
itu asetonitril memiliki ikatan dipol yang kuat. Asetonitile juga memiliki jumlah
2 elektron bebas pada atom nitrogen yang dapat mengikat hidrogen atau
51
oksigen sekalipun. Selain kepolaran asetonitril, tingkat viskositas dari
astonitril lebih baik daripada metanol, sehingga dapat memproduksi droplet
yang lebih baik pula ada analisis menggunakan MS.Terdapat proses re-
equilibrasi pada menit akhir yaitu menit 4.5 dan 6. Re-equilibrasi dilakukan
dengan inisiasi komposisi larutan A (0,1% asam format dalam aquabidest)
sebelum analisis berikutnya. Fungsinya yaitu untuk menghasilkan
reprodusibilitas analisis yang tinggi.
Optimasi berikutnya yaitu pada MS/MS. Jenis yang digunakan
adalahTriple Q (quadrupole) Spektrometer Massa TSQ QUANTUM ACCESS
MAX dari Thermo Finnigan® dengan sumber ionisasi ESI (Electrospray
Ionization) yang dioperasikan dengan ionisasi mode positif. TSQ Quantum
secara primer didesain untuk mendapatkan hasil a
Recommended