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CARACTÉRISATION DE MÉTHODES
D’ANALYSES SUR LES PRODUITS
LAITIERS
LABORATOIRE DÉPARTEMENTAL VÉTÉRINAIRE DU FINISTÈRE
• Création en 1961
• Accrédité COFRAC
• Une centaine d’employés
• Locaux de 4300m2
LES DIFFÉRENTS SECTEURS D’ACTIVITÉ
• Santé Animale
• Microbiologie des aliments et de l’eau
• Chimie Alimentaire, eau, environnement
• Administratif
LE SERVICE CHROMATOGRAPHIEAnalyses pour la qualité des :
• Eaux naturelles et de traitement
• Animaux d’élevage
• Produits laitiers
Les principaux clients :
• DDASS
• DSV
• Industriels privés
ANALYSES SUR LES PRODUITS LAITIERS
• Teneur en eau
• Matière sèche non grasse
• pH
• Acidité oléique
• Indice de peroxyde
• Dosage carotène, acide énantique, sitostérol
LES TRACEURS DANS LES PRODUITS LAITIERS• La CE vend des produits à prix réduits
• Marque de reconnaissance : ajout de traceurs
• Il existe 2 catégories : Chimique : acide énantique (B0)
sitostérol (B1)
Physique : vanilline (A0)
carotène (A2)
LES MÉTHODES D’ANALYSES
ÉTUDIÉES
DOSAGE DU CAROTÈNE
• Détermination de la pureté du carotène
• Gamme d’étalon
• Mesure des échantillons par un spectrophotomètre à 440nm
PRINCIPE DU DOSAGE
• Mesure de l’absorbance
• Loi de Beer Lambert :
A = E l C
Avec E le coefficient d’extinction
DOSAGE DE LA VANILLINE
Principe :• Extraction• Détermination RP-HPLC
Conditions chromato : Pompe : débit 1.0mL/min Injecteur : 20µL Détecteur : UV à 306nm Colonne : RP18 (merck 5µm) Phase mobile : eau(dont 3%acide acétique)
-méthanol (70:30, v/v)
PRINCIPE DE LA HPLC
• Séparation des constituants
d’un mélange
LES DIFFÉRENTS TYPES DE HPLC
1 - chromatographie d'adsorption2 - chromatographie de partage (en phase directe(2A) ou inverse(2B))3 - chromatographie d'échange d'ions (+ chromatographie ionique)4 - chromatographie de paires d'ions5 - chromatographie d'exclusion
6 - chromatographie d'affinité7 - chromatographie adaptée à la séparation d'énantiomères
• En phase inverse l’éluant est plus polaire que la phase stationnaire
• Donc silice greffée dans la colonne
HPLC en phase inversée
PHASE MOBILE
Deux possibilité :
Gradient d’élution : variation de la concentration de l’éluant
(utilisé pour les mélanges complexes)
Mode isocratique : concentration constante
VALIDATION ET CARACTÉRISATION DE MÉTHODES
• Méthode validation basée sur
la Norme XPT 90-210 AFNOR de décembre 1999
« Protocole d’évaluation d’une méthode alternative d’analyse physico-chimique quantitative par rapport à une méthode de référence »
• Trois plans à suivre de type A, B et C
PLAN DE TYPE A
Il permet de caractériser :
La linéarité
La limite de quantification
La limite de détection
LA LINÉARITÉ
• Connaître jusqu’où la mesure est linéaire
• Caractérisation de l’étalonnage
• Réalisation d’un plan à 5 niveaux de concentration et 5 répétitions
• Vérification par des calculs statistiques
LIMITES DE QUANTIFICATION ET DE DÉTECTION• Il existe 3 méthodes :
Issue de l’étude de la linéarité
Issue de l’étude du blanc de matrice
Par vérification d’une limite choisie :
Une concentration choisie
10 prises d’essais identiques
Dans des conditions de répétabilité
Vérification par calculs statistiques
• Limite de détection = LQ/3
PLAN DE TYPE B
• Il permet de contrôler les effets de la matrice sur la mesure
• Réalisation d’ajouts dosés
• Vérification de la présence d’interférences
• C’est la spécificité de la méthode
PLAN DE TYPE C
• Il permet d’estimer la répétabilité et la justesse de la méthode
• Comparaison
méthode de référence/méthode alternative
LA CARACTÉRISATION
• Valider une méthode de référence
• Les étapes à suivre : Linéarité
Limites de détection et de quantification
Répétabilité et reproductibilité
• Les facteurs étudiés dépendent de la manipulation
APPLICATIONS
LE CAROTÈNE
• La linéarité de l’appareil:
Gamme d’essais de 0.55 à 2.75 µg/mL en étalon de carotène
La linéarité est validée
Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par spectroscopie
y = 0,3061x
R2 = 0,9977
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Concentration A2 (µg/mL)
Ab
sorb
ance
• Limites de détection et de quantification :
1) Essais à 0.1µg/mL
Limite non vérifiée
2) Essais à 0.2µg/mL
Limite de quantification à 0.2µg/mL validée
Limite de détection est 0.067µg/mL
• Répétabilité :
10 mesures avec des ajouts de 21µg de carotène dans le beurre non tracé
Rendement de 99%
• Linéarité de la manipulation :
Gamme de 0.55 à 2.75 µg/mL par ajouts
Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par spectroscopie
y = 0,334xR2 = 0,9369
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
1,100
1,200
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Concentration A2 (µg/mL)
Abso
rban
ce
LA VANILLINE
•Linéarité de l’appareil:
Gamme d’étalons de 0.25 à 2 µg/mL
La linéarité est validée
Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par chromatographie
y = 819571x
R2 = 0,9901
0
500000
1000000
1500000
2000000
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentration A0 (µg/mL)
Air
e d
u p
ic
• Limites de détection et de quantification :
1) Essais à 0.2µg/mL
Limite non vérifiée
2) Essais à 0.25µg/mL
Limite de quantification à 0.25µg/mL validée
Limite de détection est 0.083µg/mL
• Répétabilité et reproductibilité :
10 échantillons mesuré avec 2 répétitions pour une concentration de 0.5µg/mL
Rendement de 107%• Linéarité de la
manipulation :
Gamme de 0.25 à 2 µg/mL avec des ajouts dans le beurre
Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par chromatographie
y = 610624x
R2 = 0,9712
0
500000
1000000
1500000
2000000
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentration A0 (µg/mL)
Air
e d
u p
ic
CONCLUSION
Les méthodes d’analyses du carotène et de la vanilline sont caractérisées
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