Proteome & Proteomics

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分子生物学 第一章 绪论分子生物学 第三章 人类基因组计划

Proteome & Proteomics

分子生物学 第二章 染色体与基因

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分子生物学 第三章 人类基因组计划

Proteome & Proteomics 定义 Proteome ：

1994 年，由澳大利亚 Macguarie 大学的 Wilkins等首先提出：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的全部蛋白质” (proteome indicates the proteins expressed by a genome)

“proteome” 是由蛋白质一词的前几个字母“ prote” 和基因组一词的后几个字母“ ome” 拼接而成

蛋白质组 (Proteome) : 细胞内的全部蛋白质

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Proteomics 定义 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究

细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学 最早是在 1995 年提出的，它在本质上指的是

在大规模水平上研究蛋白质特征： 表达水平 （量） 翻译后的修饰（成熟与调控） 蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等 由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代

谢等过程的整体而全面的认识

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Proteome 与 Genome 关系 互补的角度 / 空间来研究细胞的分子架

构 相辅相成 Genome --- 导演

RNome --- 编剧

Proteome--- 演员

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Proteome 与 Genome 区别 稳定性

Proteome --- 静态 Genome --- 动态

修饰化程度 Proteome --- 高 Genome --- 底

复杂程度 Proteome --- 高 （ 20aa + 高度多样性修饰） Genome --- 底 （ 4nt ）

特异性 Proteome --- 组织和细胞特异性 Genome --- 无组织和细胞特异性

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功能蛋白质组 (functional proteome) 1997 年，由 Cordwell 和 Humphery-Smith

提出的，它指的是在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。

功能蛋白质组只是总蛋白质组的一部分，通过对功能蛋白质组的研究，既能阐明某一群体蛋白质的功能，亦能丰富总蛋白质数据库，是从生物大分子 ( 蛋白质、基因 ) 水平到细胞水平研究的重要桥梁环节。

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功能蛋白质组

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蛋白质组学研究思路与方法

策略、技术、工具

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蛋白质组研究相关网站 蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术

http://www.proteomeworks.bio-rad.com 蛋白质组研究技术、信息等 http://www.proteinpathways.com 发现新蛋白及新作用 ( 新药开发 ) http://www.proteome.med.umich.edu 蛋白质组研究相关企业、各 种

仪器来源、新闻等 http://www.proteome.co.uk 各种蛋白质组研究相关信息 http://www.micromass.co.uk 介绍蛋白质鉴定的先进仪器 http://www.expasy.ch 蛋白质鉴定专家系统， Swiss Institute of Bioi

nformatics http://expasy.proteome.org.au 蛋白质鉴定专家系统， Australian Pr

oteome Analysis Facility http://expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统， Canadian Bioinfor

matics Resours

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主要专业术语及其英文对照和缩写 IPG-IEF：固相 pH 梯度等电聚焦（ immobilized p

H gradients isoelectric focusing） SDS- PAGE ：十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电

泳（ Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis ） 2-DE ：双向电泳 (Two Dimensional Electrophoresis)

HPLC ：高效液相色谱（ High performance Liquid Chromatography ）

MALDI-TOF MS ：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)

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研究策略与技术两条互补的实验流程

基于凝胶的工作流程

（ Gel-based workflow ） 基于液相色谱的工作流程

（ LC-based workflow ）

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蛋白质组学实验室所需的条件

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双向凝胶电泳（ 2DE ） 是等电聚焦电泳和 SDS-PAGE的组合

即先进行等电聚焦电泳（按照 pI 分离）然后再进行 SDS-PAGE （按照分子大小） 凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图

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蛋白质组研究的基本技术 2D-SDS-PAGE ：

样品制备 第一向 IPG-IEF 电泳 IPG 平衡 第二向 SDS-PAGE 电泳 染色（银染）及 图谱分析目标蛋白获取及其鉴定（ MC 分析）

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2DE结果图谱

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蛋白质组研究的基本技术 --- 样品预分离 样品的制备（预处理）：

组织 细胞 细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）

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蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取 重要性：

在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补 把蛋白质看作具有独特而奇妙性质的实体

原则： 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修

饰（如酶性或化学性降解等） 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白

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蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取步骤：

破碎沉淀蛋白去除杂质

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蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取 样品制备流程 --- 破碎

尽可能减少蛋白水解 / 其它形式蛋白降解原则机械法（超声波法、高压法 、机械匀浆法

） 化学法（去污剂法、酶裂解法 ） 物理法（液氮研磨法、循环冻融法、渗透

法 、玻璃珠破碎法 ）

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蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取 样品制备流程 --- 沉淀蛋白

去杂浓缩后蛋白可溶性是关键 TCA- 丙酮沉淀法 三氯醋酸（ TCA ）沉淀法 – 引起降解 / 修

饰 丙酮沉淀法 硫酸铵沉淀法 – 影响 IEF

醋酸铵沉淀法 – 步骤繁琐

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2D 电泳结果影响因素分析

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蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取 样品制备流程 ---- 去除杂质

关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰 核酸的清除 （ DNase/Rnase ） 多糖的清除 （超离心 、 TCA沉淀等）去污剂的清除 （丙酮沉淀法等）盐离子和外源带电小分子的清除（透析、

TCA- 丙酮沉淀法）

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2D 电泳结果影响因素分析

可能原因：样品含高丰度 Pr

可能原因： TCA残留致使 Pr丢失

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2D 电泳结果影响因素分析

可能原因： Tris 质量不好 可能原因： Urea 不纯

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蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取 样品制备注意事项：

蛋白质水解 ---- 蛋白酶抑制剂 (PMSF 等 )

特殊样品的制备 (低丰度 、强碱性蛋白质 （核糖体）、极端分子量 )

样品定量 重复性

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2D-SDS-PAGE 重复性

The same protocol and sample, however not the same resultsRec: similar; cir: different

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2-DE 第一向 IPG-IEF 电泳

IEF 是一种根据样品的等电点不同而使它们在 pH 梯度中相互分离的一种电泳技术

将等电点不同的蛋白质混合物加入有 pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的 pH位置上，形成分离的蛋白质区带

从而得知其等电点信息

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分子生物学 第三章 人类基因组计划IEF 的基本条件

step 1step 2step 3total

voltage Time Volt-Hours Ramp

250 20min －－－ Linear4000

40002hr －－－－－－ 10,000V-hr

Linear

Rapid5 hr 14,000V-hr

7 cm

step 1step 2step 3

total

total

step 1step 2step 3

11 cm

17 cm

250

2508000

1000010000

8000

20min

20min2.5hr

2.5hr

－－－

－－－

－－－－－－

－－－－－－

20,000V-hr

40,000V-hr

～ 30,000V-hr

～ 50,000V-hr

5.3 hr

7 hr

LinearLinear

LinearLinear

Rapid

Rapid

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IPG-IEF 电泳

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2-DE 第二向垂直 SDS-PAGE 电泳

聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应 。 SDS 与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关

从而得知其分子量信息

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第二向垂直 SDS-PAGE 电泳 凝胶浓度与其对应的分离范围

胶浓度 分离范围 (KD) 5% 36-200 7.5% 24-200 10% 14-200 12.5% 14-100 15% 14-60

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第二向垂直 SDS-PAGE 电泳步骤：

溶液配置 (Buffer 、 Bis-Acr 、 AP 、 TEMED)

灌胶 电泳

Ettan Dalt twelve 电泳系统

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第二向垂直 SDS-PAGE 电泳

Ettan Dalt six 电泳系统

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2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测 染色： 1 ）考马斯亮兰染色法；

2 ）银染法；

3 ）负染法；

4 ）荧光染色法；

5 ）放射性同位素标记法等

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2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测图像扫描和分析—— Image Scanner II

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2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测 全自动斑点切取系统（ Ettan Spot Picker ）

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2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测 质谱或MALDI-TOF MS

质谱分析基本原理是使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散——离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。

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2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测 MALDI-TOF MS

样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测，常用来测蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子

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2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测 通过质谱分析，可以获得分析样品的分子量、

分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息

SARS 病毒 N 蛋白整体分子量

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蛋白质功能研究技术

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蛋白质功能研究技术酵母双杂交

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蛋白质功能研究技术 Co-IP 技术

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蛋白质功能研究技术 Co-IP&Pull down

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蛋白质组在医学研究中的现状和前景

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蛋白质组在医学研究中的现状和前景 人类疾病的蛋白质组研究

直肠癌：Sanchez 等对 15例结肠癌和 13

例正常人的结肠上皮进行 2-DE 。建立了包括 882 和 861 个斑点的结肠癌及正常人结肠粘膜的标准胶图。结果发现在分子量为 13kD 和 pI值为 5.6处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。经鉴定为：钙粒蛋白 B（ calgranulin B ）及钙卫蛋白（ calprotectin ）

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蛋白质组在医学研究中的现状和前景 人类疾病的蛋白质组研究

肝癌 --- 醛糖还原酶 膀胱癌 ---醛糖还原酶 、 Trp-tRNA合成酶、 IFN-γ诱导的 r3 ， SOD 及 35.8kD 和11.2kD两未知蛋白

扩张型心肌病 --- 8 种蛋白质

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蛋白质组在医学研究中的现状和前景 致病微生物的蛋白质组研究

检测博氏疏螺旋体与免疫有关的蛋白质 弓形体抗原的检测 白色念珠菌 ---- 对真菌细胞壁蛋白分析筛选抗药真菌药物

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蛋白质组学研究趋势

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蛋白质组学研究趋势 在应用研究方面

蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一

在技术发展方面 研究方法将更强调各种方法间的整合和互

补，以适应不同蛋白质的不同特征 蛋白质组学与其它学科的交叉互动