View
225
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
REKOMBİNANT DNA TEKNİKLERİII
DR. ONUR YILMAZ
2017
RESTRİKSİYON ENZİMLERİ
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN TARİHÇE VE GENEL ÖZELLİKLERİ
1965’de Arber; DNA metilasyonunun bakteriyi restriksiyon ajanlarından koruduğunugöstermiştir.
Bakteri kendi DNA’sını metilleyerek RE enzimlerinden korur
Bakteride bulanan spesifik metilaz enzimleri metil grupları eklerler.
RESTRİKSİYON ENZİMLERİ
Saflaştırılmış ilk RE
E. coli’den EcoRI ve EcoRII
H. influenzae’dan HindII ve HindIII
Laboratuvarda tekrar birleştirilebilen gen parçalarına ayırabilmektedir.
Araştırmacılar RE’lerin;
Gen organizasyonu, Gen fonksiyonu ve Gen ekspresyonu ile ilgili araştırmalarda kullanılabileceğini tanımlamışlar ve böylece
1970’lerin sonlarında moleküler biyologlarca yaygın kullanılmaya başlamıştır.
Günümüzde 300’e yakın farklı DNA dizilimini tanıyan 3000’den fazla RE vardır.
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNDE PALİNDROMİK SEKANS DİZİSİ
Genetik palindromlar sözcüklerdeki palindromlara benzer. DNA içerisindeki birpalindromik sekansta her iki 5’ - 3’ yönündeki baz sekansları aynıdır.
5’
5’
3’
3’
Restriksiyon enzimleri, DNA içerisinde restriksiyonbölgeleri olarak bilinen spesifik palindromiksekanslardan keserler. Bunlar genellikle 4 veya 6bazlık sekanslardır.
RESTRİKSİYON ENZİMLERİ NASIL ÇALIŞIR?
1) DNA iplikçiği ve EcoRI tanıma bölgesi.
2) EcoRI restriksiyon enzimi eklendiğinde
3) Kesilmiş fragmanların ayrılması ile yapışkan uçlu kısımların oluşması.
Yapışkan Uçlar
EĞER ORTAMA DNA LİGAZ EKLENİRSE?
Yapışkan uçlar
DNA ligaz benzer restriksiyon enzimi ile kesilmiş yapışkan uçları birbirine bağlar.
Farklı restriksiyon enzimleri ile kesilmiş yapışkan uçlar birbirleri ile bağlanmaz.
Neden?
Çünkü oluşan yapışkan uçlardaki baz sekansları birbiriyle uyumlu olmayacaktır.
RESTRİKSİYON ENZİMLERİ
Restriksiyon enzimleri DNA sekansını tarar.
Spesifik bir nükleotid setinin olduğu bölgeyi bulur.
Bu dizilimlere yakın bölgelerden ya da bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerdenDNA’yı keserler.
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN KULLANIM ALANLARI
RE ile
Seçilen genin çoğaltılabilmesi
Kodladığı proteinin üretilmesi
Gen dizilerinin belirlenebilmesi yapılabilir olmuştur
RE;
Rekombinant DNA’nın eldesi
DNA haritasının çıkarılması
Polimorfizmlerin belirlenmesi
Probların hazırlanması
DNA modifikasyonlarının belirlenmesinde kullanılır
RESTRİKSİYON ENZİM TİPLERİ ???
Restriksiyon Enzimleri;
Metilaz aktivitelerine
Alt ünite kompozisyonlarına
Kırılma pozisyonlarına
Sekans özgüllüklerine
Kofaktör gereksinimlerine göre geleneksel olarak 4 tip içerisinde sınıflandırılır.
TİP I ENZİMLER
Hem restriksiyon hem de modifikasyon yapabilen iki fonksiyonlu enzimler
Çok yaygın olarak bulunmaktadırlar
Tanıma dizilerine bağlanmalarına rağmen kesimleri dizi dışında tesadüfi olarak gerçekleşir
Aktiviteleri için;
ATP,
S-adenozilmetionin ve
Mg+2 gereklidir
TİP II ENZİMLER
DNA’yı tanımlanmış pozisyona yakın yerden ya da dizi içinden keser
Tam hedef nükleotitten veya çok yakınından kesim yapma özelliğine sahipler
DNA analizi ve gen klonlanmasında laboratuvarlarda kullanılırlar
Aktivite için Mg+2 gerekli iken ATP gereksinimi yok
Tip II enzimler kesim sonucu DNA’da oluşturdukları uçların motiflerine göre iki altgruba ayrılır;
DNA’nın 5’ ucunda yapışkan uç (sticky end) oluşturulması
Bu uçların ligasyon etkinlikleri yüksektir
Klonlama çalışmalarında tercih edilir
TİP II ENZİMLER
Yapışkan uçlar
Küt uç oluşturulması
Ligasyon etkinlikleri düşüktür
Klonlama çalışmalarında daha az tercih edilirler
5’ TGACGGGTTCGAGG CCAG 3’
3’ ACTGCCCAAGGTCC GGTC 5’
Küt uçlar
TİP II ENZİMLER
Restriksiyon ve modifikasyon enzimlerinin büyük bir kombinasyonu
Tip I enzimleri gibi metilasyon modifikasyon fonksiyonuna sahiptirler
Mg+2 ve ATP’ye bağımlı kesim yaparlar
Tam bir kesim yapma özellikleri zayıftır
DNA’ya tanıma bölgelerinden bağlanmalarına rağmen kesimi farklı bir yerden yaparlar
TİP III ENZİMLER
Genel olarak metile DNA’yı tanırlar
E. coli ’nin McrBC sisteminde olduğu gibi
McrBC, tek veya her iki sarmalda methylcytosine içeren DNA’yı kesen bir
endonükleazdır. McrBC, metillenmemiş DNA da işlevsel değildir.
TİP IV ENZİMLER
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN İSİMLENDİRİLMESİ İsimlendirme;
Enzimin elde edildiği bakteri cinsinin ilk harfi
Bakteri türünün ilk iki harfi
Soya ait bir harf
İlk izolasyondan başlayarak Romen rakamı ile enzimin izolasyon sırası
EcoRI;
E= genus Escherichia
co= türünün ilk iki harfi coli
R= suş RY13
I= bu türden izole edilen ilk enzim
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN BAĞLANMA VE KESME MEKANİZMASI
RE;
DNA tanıma bölgeleri ve Katalitik bölge olmak üzere iki alt birimden oluşur
Tanıma bölgesi DNA üzerindeki spesifik bölgeyi tanır ve katalitik bölgenin buraya yerleşmesini sağlar
Katalitik bölge yerleştikten sonra heliksin fosfodiester bağını kırar
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN BAĞLANMA VE KESME MEKANİZMASI
RE;
Çift sarmal DNA’ya tanıma bölgelerinden bağlanabildikleri gibi tanıma bölgelerinin dışından da bağlanabilmektedirler.
Bu durumda çizgisel DNA boyunca kayarlar ve
Bu işlem sırasında DNA ile enzim arasını su molekülleri doldurur
Enzim tanıma bölgeleri bulunduğunda su molekülleri uzaklaştırılır.
Enzim-DNA kompleksi oluşunca hem enzim hem de DNA dizilerinde konformasyonel değişiklikler oluşur
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN BAĞLANMA VE KESME MEKANİZMASI
RE;
Sadece bazlar arasındaki yatay konumda bulunan fosfodiester bağını keserler
Karşılıklı iki baz arasındaki hidrojen bağlarını kesmezler
Hidrojen bağları;
Fosfodiester bağlarının kırılmasıyla ve
Çözelti içindeki termal hareket sonucu oluşan enerjinin etkisiyle kendiliğinden kırılır
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN BAĞLANMA VE KESME MEKANİZMASI
Aynı diziyi tanıyan ve farklı organizmalardan elde edilmiş RE’lerine izoşizomer denir
(SacI ve SstI)
İzoşizomerler, genellikle farklı optimum reaksiyon şartlarına ve stabiliteye
sahiptir
İzoşizomerler aynı diziyi tanımalarına rağmen kesimi dizinin farklı bölgelerinden
de yapabilirler bunlara da neoşizomerler denir (SmaI ve XmaI)
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN TEPKİME ŞARTLARI
RE için;
Hem saklanmaları hem de aktivitelerini gösterirken uygun şartların sağlanması gerekir
Kullanılacakları zaman üretici firmalardan gerekli bilgiler alınmalıdır.
ƛ DNA cut with PstI
RE’lerin;
Star aktivitesi
DNA ve enzim konsantrasyonunun uygunsuzluğu
pH ve iyonik dengenin uygun olmaması
Enzimin başka enzimlerle kontaminasyonu uygun olmayan kesimlere neden olur.
-20°C’de saklanırken saklama tamponunda %50 gliserol bulunur
Gliserol enzimin donmasını engeller
RESTRİKSİYON ENZİMLERİ
STAR AKTİVİTE
RE’lerin en önemli özellikleri;
Optimal şartlarda özgül DNA’yı en yakın dizilimden kesebilirken, optimal olmayan şartlarda bu kesim oldukça değişkendir.
Buna “star aktivite” ya da “relaxed specificity” denir
Bu olay çok önemli olduğundan kullanılacak enzimin star aktivitesinin olup olmadığı bilinmelidir.
STAR AKTİVİTE
Star aktiviteye neden olan durumlar;
Yüksek gliserol konsantrasyonu
Çok yüksek enzim konsantrasyonu
Yüksek pH (>8.0)
Organik maddelerin varlığı (DMSO ve etanol gibi)
Kofaktör olarak Mg+2 yerine diğer divalent katyonların bulunması (Mn+2, Cu+2 vb).
STAR AKTİVİTE
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN KULLANIMI İLE REKOMBİNANT
DNA ELDESİ
Şekil: Varaldo ve arkadaşları tarafından gen bankasına gönderilen FM162351 noluermTR sekansı.
ermTR-F: AACTGCAGATAACCGGCAAGGAGAAGGTTATA (PstI)
ermTR-R: AATCTAGACGTTCTCTTAAAGTTAGAGAACGC (XbaI)
Plazmid
insert
pUC19
PstI
XbaI
Ligasyon
PstI
XbaI
PstI
XbaI
ÖZEL BİR RESTRİKSİYON ENZİMİ İÇİN RESTRİKSİYON KESİM BÖLGELERİ, LİNEAR DNA VE BU ENZİM İÇİN TEK BİR KESİM BÖLGESİ İÇEREN PLAZMİD
Plazmid
Linear DNA
RESTRİKSİYON REAKSİYONUNUN UYGULANMASI
DNA LİGAZIN EKLENMESİ
DNA LİGAZIN EKLENMESİ REKOMBİNANT PLAZMİD DNA’SI
Birden fazla olası rekombinant plazmid eldeedilebilir fakat burda bizim çalışmamız içinistenilen bölgeyi içeren plazmidgösterilmektedir.
DİĞER OLASI REKOMBİNANTLAR
…ve daha pek çoğu!
REKOMBİNANT PLAZMİD DNA’SININ BAKTERİ HÜCRESİNE AKTARILMASI
REKOMBİNANT BAKTERİLERİN ÇOĞALTILMASI
İSTENİLEN GENİ İÇEREN REKOMBİNANT PLAZMİDİ NASIL AYIRABİLİRİZ?
Restriksiyon fragmentleri
rastgele olasılıklarla
plazmidimize ligasyonu yapıldı.
Buna bağlı olarak birçok
rekombinant plazmid formu
oluştu.
Elektroporasyon
yoluyla plazmidlerin
bakteri hücrelerine
aktarılması.
Bakteri hücreleri seçici bir besiyerinde
diğer istenilmeyen DNA parçalarını
almış plazmidleri içeren bakterilerden
ayrılır.
Rekombinant
plazmidler
Recommended