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2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
POLÍTICA EDITORIAL FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA
La revista FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA es una publicación de la Asociación Colombiana de Fitopatología y Ciencias Afines
“ASCOLFI” con circulación semestral a nivel Nacional e Internacional. Está dirigida a todos los profesionales interesados en el estudio de las
enfermedades de las plantas, su control y manejo (Ingenieros agrónomos, investigadores, fitopatólogos, profesores, técnicos, extensionistas, etc) . También, se incluye a otros profesionales de ciencias afines, tales como biólogos, microbiólogos, botánicos, fitomejoradores, etc, y a
entidades representativas del sector agropecuario, centros educativos y a los centros de investigación nacionales e internacionales.
Está orientada hacia la publicación de artículos originales de carácter científico y técnico de interés fitopatológico. Incluye también notas
científicas de alta calidad, revisiones bibliográficas de naturaleza crítica, cartas al editor sobre información publicada, opiniones e ideas, recomendaciones y resúmenes de congresos.
Los trabajos deben ser inéditos. Aquellos presentados en congresos, simposios, conferencias o reuniones científicas pueden ser aceptados
para su publicación.
Las tesis de pregrado y postgrado, lo mismo que resultados de trabajos divulgados en forma preliminar de manera sucinta, en informes o avances técnicos también pueden ser objeto de publicación.
Todas las opiniones, editoriales y artículos publicados en Fitopatología Colombiana son responsabilidad del autor o autores y no
reflejan necesariamente los puntos de vista de ASCOLFI o la de las instituciones a las cuales están afiliados quienes los escriben, en
otras palabras el autor es el único responsable por los conceptos, ideas u opiniones emitidas en el trabajo. El Comité Editorial se reserva el derecho directo de aceptar o no las cartas, los artículos, notas y revisiones o de hacerlo indirectamente
mediante su cuerpo de asesores científicos. Los trabajos deben ser remitidos en original y dos copias, además del disquete o disco compacto
con el archivo en un procesador de texto (preferiblemente Word) al editor de la revista, Apartado Aéreo 5004 de Cali y deberán ceñirse a las
Normas para la elaboración de artículos instituidas por la Asociación. En el caso de correcciones y modificaciones el editor devolverá al autor el trabajo acompañado de las sugerencias y comentarios
realizados por el grupo de asesores científicos. El artículo corregido deberá enviarse nuevamente en un plazo máximo de 30 días. Una fe de
erratas podrá eventualmente ser incluida en el siguiente número, para efectuar las rectificaciones necesarias.
Los trabajos no aceptados para la publicación serán devueltos a los autores a los siguientes 30 días contados a partir de la fecha de recepción.
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Teniendo en cuenta los altos costos que implica las publicaciones se ha considerado conveniente solicitar a los autores una contribución razonable para llevar a feliz término el propósito de divulgar los resultados de la investigación fitopatológica en Colombia... Se ha estimado
para socios activos que el valor por página impresa será el equivalente en pesos de: U.S $25, 30, 35 según contenga solamente texto, texto
con ilustraciones en blanco y negro o texto con ilustraciones de color, respectivamente. El valor de los cargos estará sujeto a ajustes y no se
definirá hasta cuando el autor reciba para su revisión la prueba de impresión y su pago deberá hacerse efectivo después de la impresión del artículo en la revista. La tarifa tendrá un descuento de U.S. $ 5 por página para aquellos autores que remitan el escrito según las normas de
publicación de ASCOLFI y satisfactoriamente preparado para proceso electrónico del texto. Para no socios la contribución será de U.S $ 40,
45 y 50 según se trate solamente de texto, texto con ilustraciones en blanco y negro o texto con ilustraciones de color, respectivamente.
Para anticipar la estimación de costos se debe tener en cuenta que por cada tres páginas tamaño carta escritas a doble espacio, a razón de 12 caracteres por pulgada (12cpi), se obtienen tres páginas impresas en FITOPATOLOGIA COLOMBIANA.
Los autores deberán enviar con su artículo una carta personal o de la institución, compañía o benefactor del proyecto para el cual trabajan
responsabilizándose por el pago de la publicación. La factura correspondiente se enviará a cada autor, institución, compañía o benefactor del
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No se suministrarán copias gratuitas. Se podrán preparar separatas al costo a petición de los autores, según un formato que debe diligenciarse
al momento de regresar las prueba de impresión.
Autorización para reproducción de artículos. La autorización para la reproducción, total o parcial, de los artículos publicados en la revista
Fitopatología Colombiana, se debe solicitar por escrito al editor.
Portada
Síntomas del Dasheen mosaic virus en hojas de Zantedeschia aethiopica (Ver más información pag. 64 )
.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
CONTENIDO
FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA
ISSN 0120-0143
VOLUMEN 35 NÚMERO 2 DICIEMBRE 2011
JUNTA DIRECTIVA ASCOLFI 2011-2013
Principales Suplentes
Presidencia
Mónica Betancourt V. Bertha Lucia Castro
Vicepresidencia
Cristian Olaya Benjamín Pineda L.
Secretaría
Nancy Arciniegas Gustavo Adolfo Prado
Tesorería
Diego Fernando Chávez Rodrigo O. Campo A.
Vocales
Omar Guerrero G. Cristian Noreña
.
Revisoría Fiscal
José Albeiro Arias
Representantes Internacionales
Francisco J. Morales Fernando Correa V.
Gabriel Cadena
Revista
“FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA”
ÓRGANO DE DIFUSIÓN DE LA ASOCIACIÓN
COLOMBIANA DE FITOPATOLOGÍA Y CIENCIAS
AFINES- ASCOLFI
ISSN 01120-0143
Licencia de Min. Gobierno No 001808, Cali, Apartado Aéreo
5004, Nit. : 891 –301.725-6
Sociedad sin ánimo de lucro, Personería Jurídica 1097 de abril
1º de 1977
Editor
Benjamín Pineda L, Ing. Agr. M Sc.
b.pinedalopez@gmail.com
COMITÉ EDITORIAL
Benjamín Pineda López Ing .Agr. – M Sc Fitopatología
Elizabeth Álvarez C. Ing. Agr. – Ph D Fitopatología
Francisco J. Morales G. Ing. Agr. – Ph D Virología
Jorge I. Victoria K. Ing. Agr. – Ph D Bacteriología
Rodrigo O. Campo A. Ing. Agr. – Ph D Fitopatología
Representante de publicidad
Gabriel Robayo V., Ing Agr, M.Art
Contacto Revista: Oficina Ascolfi, Km 1 Vía al Penal Granja
Corpoica C.I. Palmira, cel. +57- 3164303079
Palmira - Valle del Cauca – Colombia
Apartado Aéreo 5004- Cali- Valle del Cauca -Colombia
Correos electrónicos: ascolfi.colombia@gmail.com
contacto@ascolficolombia.org
Página web: http://www.ascolfi.org/
Suscripciones y Canje: publicaciones@ascolficolombia.org
ascolfi.colombia@gmail.com
Diseño y Diagramación: Benjamín Pineda L
Impresión: COMPUIMAGEN, Tel 2716528
Fecha de impresión: Diciembre de 2011
Tiraje 300 ejemplares
Publicación Indexada por COLCIENCIAS en la Categoría “C”
del Índice Nacional de Publicaciones Seriadas Científicas y
Tecnológicas de Colombia (Publindex). Referenciada interna-
cionalmente por el Índice Latinoamericano de Publicaciones
Científicas y Tecnológicas (Latindex).
Política Editorial .............................................................................. i
Evaluación in vitro de germoplasma de lulo
(Solanum spp.) bajo la presión de toxinas de
Colletotrichum acutatum Pedro Pablo Parra Giraldo, Rodrigo A. Hoyos, Elizabeth
Álvarez y Alonso González…………………………………….. 37
Identificación de microorganismos asociados
a la pudrición basal del estípite en palma de
aceite en la zona central palmera colombiana
Yuri Adriana Mestizo Garzón y Gerardo Martinez-L ………… 43
Selección de levaduras filosféricas con
potencial para el control biológico de
Botrytis cinerea
Alba Marina Cotes, Jimmy Zapata, Andrés Diaz, Magda García, Claudia Medina, Diana Cristancho,
Sonia Rodríguez, Fernando Rodríguez y Daniel Uribe ……..… 51
Proceso infectivo de la mancha de aceite
causada por Xanthomonas axonopodis en
gulupa (Passiflora edulis Sims) Solange Benítez, Wadith de León, Lina Farfán,
Sandra Castillo y Lilliana Hoyos ………………………..…….. 57
Identificación y caracterización del
Dasheen mosaic virus en Cala (Zantedeschia
aethiopica) en Córdoba, Argentina Eva E. Cafrune, Florencia Asinari, Claudia F. Nome,
María C. Perotto, Mariana Quiroga y Vilma C. Conci ……… 63
Identificación de arvenses como hospederos
naturales de Begomovirus en el Valle del
Cauca, Colombia Juan Carlos Vaca-Vaca, Dorian Otavo Fiscal y Karina
López-López ………………………………………………… 69
Fitopatología Colombiana, normas para la
elaboración de artículos…………....…………..……….…… 73
Editorial
A propósito de la elección de la nueva Junta Directiva de la Asociación Colombiana de Fitopatología y Ciencias Afines efectuada
durante el xxx Congreso Colombiano y xvi Latinoamaericano de fitopatología vale la pena revivir una leyenda que por mucho
tiempo fue la inspiradora del trabajo en equipo, efectuado para sostener el propósito de mantener vigente a Ascolfi y su revista
Fitopatología Colombiana, a través del tiempo. Algo se ha logrado, no obstante ahora más que nunca, considero que es
importante evocar de nuevo la leyenda y tomarla con todo el fervor y la dedicación necesaria.
Para quienes no la conocen se la comparto y para quienes ya la conocen, les transfiero algunas de las deducciones que han
extraído otras personas que la han leído y analizado en la poderosísima “Web” que hoy hace que nuestro mundo sea realmente
una aldea global, con todas sus consecuencias.
Se trata de La leyenda: El vuelo de los gansos
“La ciencia ha descubierto que los gansos vuelan formando una “V” porque cuando cada ave bate sus alas, produce un
movimiento en el aire que ayuda al ganso que va detrás de ella. Volando en “V”, toda la bandada aumenta por lo menos en
71% más su poder de vuelo, que si cada ave lo hiciera sola. Cada vez que un ganso se sale de la formación y siente la resistencia
del aire, se da cuenta de la dificultad de volar solo y de inmediato se incorpora de nuevo a la fila para beneficiarse del poder del
compañero que va adelante. Los gansos que van detrás, producen un el graznido propio de ellos, y hacen esto con frecuencia, para
estimular a los que van adelante a mantener la velocidad. Cuando el líder de los gansos se cansa, se pasa a uno de los puestos de
atrás y otro ganso toma su lugar. Finalmente, cuando un ganso enferma o cae herido por un disparo, dos de sus compañeros se
salen de la formación y lo siguen para ayudarlo y protegerlo. Se quedan con él hasta que esté nuevamente en condiciones de volar
o hasta que muere, solo entonces los dos acompañantes vuelven a la bandada o se unen a otro grupo”
Deducciones
1ª Cuando compartimos una dirección común y tenemos sentido de comunidad, podemos llegar a donde deseamos, más fácil y más
rápido. Este es el beneficio de apoyo mutuo pues Debemos considerar que la unión hace la fuerza.
2ª Si tuviéramos la lógica de un ganso, nos mantendríamos con aquellos que se dirigen en nuestra misma dirección.
3ª Una palabra de aliento incrementa las fuerzas y produce grandes resultados.
4ª Todos debemos estar dispuestos a asumir responsabilidades. Obtenemos resultados óptimos cuando hacemos turnos para realizar
los trabajos difíciles.
5 ª Si tuviéramos la inteligencia de un ganso, nos mantendríamos siempre uno al lado del otro, ayudándonos y acompañándonos
Esto se llama: trabajo en equipo Unidos vencemos, divididos caemos.
Benjamín Pineda López
Editor Revista Fitopatología Colombiana
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
37
EVALUACIÓN in vitro DE GERMOPLASMA DE LULO (Solanum spp.) BAJO LA PRESIÓN DE
TOXINAS DE Colletotrichum acutatum*
Pedro Pablo Parra Giraldo1,2, Rodrigo A. Hoyos1, Elizabeth Álvarez2 y Alonso González2.
1Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, 2Programa Frutas Tropicales Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT)
Autor para correspondencia: ppparra@unal.edu.co
*Artículo científico, recibido para publicación el 30/05/2011, aceptado el 17/08/2011; galardonado con “Mención de honor al Premio Nacional de Fitopatología Gonzalo Ochoa,
Categoría estudiante”, otorgada durante el XXX Congreso Colombiano y XVI Latinoamericano de Fitopatología Bogotá (Colombia) Agosto 19 de 2011.
RESUMEN
La antracnosis causada por el hongo (Colletotrichum acutatum) afecta
el fruto tanto en su desarrollo como en su fase de post-cosecha. Hasta
la fecha no se han encontrado fuentes de resistencia genética en la
especie S. quitoense, por lo que el uso de híbridos interespecíficos se
sugiere como una solución. Este estudio tuvo como objetivo desarro-
llar una metodología que permita la evaluación in vitro de germoplas-
ma de lulo para buscar resistencia a C. acutatum basado en la aplica-ción de toxinas obtenidas del hongo. Los experimentos se realizaron
utilizando genotipos de lulo evaluados previamente por resistencia a la
enfermedad en condiciones de campo y laboratorio. El extracto crudo
de C. acutatum se obtuvo incubando discos de 0,5 cm de diámetro de micelio en medio líquido durante una, dos y tres semanas. El extracto
crudo del hongo se esterilizó por filtración y se aplicó al medio de
cultivo en diferentes proporciones (50, 25, 12.5, 8, 5, 3% v/v), sobre el
cual se sembraron ápices de 1,5 cm de longitud. El desarrollo de área foliar y de raíces de materiales con diferentes grados de resistencia se
evaluó cuatro y seis semanas después de siembra. Hubo corresponden-
cia entre el desempeño de los materiales en campo y las evaluaciones
realizadas en laboratorio; los materiales PL-35, PL-24, PL-19, PL-11 y PL-8 (Híbridos producidos por CORPOICA) considerados resistentes
presentaron los menores porcentajes de inhibición del desarrollo foliar,
2,6%, 20,5%, 20,1%, 21,2 y 8,7% respectivamente y los clones castilla
EC-28 y EC-39, susceptibles, expresaron una inhibición del 53,4% y 44,7%. Además el efecto del extracto crudo sobre los explantes estuvo
en función de la concentración y el tiempo de incubación. La metodo-
logía es reproducible y representa una alternativa para la evaluación de
germoplasma bajo condiciones in vitro.
Palabras clave: Extracto crudo, lulo, naranjilla, híbridos interespecífi-
cos, antracnosis, frutales
SUMMARY
In vitro evaluation of Lulo (Solanum sp) germplasm under Colleto-
trichum acutatum toxins pressure
Lulo, S. quitoense is affected by anthracnose (Colletotrichum acuta-
tum), resulting in high production costs and excessive use of pesti-
cides. Anthracnose, reduce crop productivity and increase post harvest losses. To date, no genetic resistance in the S. quitoense species has
been found, so the use of interspecific hybrids appears as a solu-
tion. This study aimed to develop an in vitro methodology to evaluate
lulo germplasm to find resistance against C. acutatum. The method was based on the application of culture extracts to the growing media
containing explants of lulo accessions previously evaluated for resis-
tance in field and laboratory conditions. The crude extracts of C.
acutatum were obtained by incubation of mycelia discs of 0.5 cm in diameter in liquid media for one, two and three weeks. The crude
extracts were sterilized by filtration and applied in several concentra-
tions (50, 25, 12.5, 8, 5, 3% v / v) to the culture media containing
apices of 1.5 cm in length. The development of leaf area and roots in accessions with different degrees of resistance was evaluated four or
six weeks after sowing. A good correspondence between the perfor-
mance of accessions in field and laboratory evaluations was shown,
the materials PL-35, PL-24, PL-19, PL-11 and PL-8 (Hybrids pro-duced by Corpoica) considered resistant had the lowest inhibition
percentages of leaf development, 2.6%, 20.5%, 20.1%, 21.2 and 8.7%
respectively, and the EC-28 and EC-39 “Castilla” accessions, suffered
inhibition of 53, 4% and 44.7%, respectively. Besides, the effect of the culture filtrate on the explants performance was a function of concen-
tration and incubation time, and resistance of the evaluated
germplasm. The methodology is reproducible and represents an alter-
native for evaluating germplasm under in vitro conditions.
Keywords: Crude extracts, interspecific hybrids, antracnose , fruits
INTRODUCCIÓN
El lulo (Solanum quitoense) Lam. es una
especie vegetal que en los últimos años ha cobrado importancia como cultivo y es utili-
zado como materia prima en la agroindustria
para la elaboración de mermeladas, dulces y
bebidas. En los últimos años el área de producción del cultivo se ha incrementado en
nuestro país (Ministerio de agricultura, 2006),
y la presencia de enfermedades y plagas ha
generado un excesivo uso de insumos agro-químicos que aumentan los costos de produc-
ción y adicionalmente generan residualidad
química con posibles efectos deletéreos sobre la salud humana.
La antracnosis representa un riesgo cre-
ciente y puede llegar a ocasionar grandes
pérdidas tanto a nivel de cultivo como de pos
cosecha (Tamayo, 2002), según el MADR, (2007) las pérdidas en pos cosecha en el
departamento del Huila, que es el mayor
productor de lulo en el país, oscilan entre el
18% y 25%. El costo del manejo sanitario de la an-
tracnosis puede variar entre un 2% y 16% de
los costos de producción, disminuyendo así la
rentabilidad del cultivo. Con el objetivo de encontrar una solución
genética, los mejoradores han buscado genes
de resistencia a estos problemas fitosanitarios en especies cercanas a S. quitoense; adicio-
nalmente, la biotecnología ofrece nuevas
herramientas para que los investigadores y
mejoradores seleccionen materiales resisten-
tes para avanzar en la generación de varieda-des que le permitan al agricultor garantizar la
sostenibilidad de la producción de lulo.
Este trabajo tuvo como objetivo dar un
primer paso en la selección de material vege-tal en condiciones in vitro con posible resis-
tencia a la antracnosis. La metodología repre-
senta una herramienta de ayuda para el mejo-
ramiento tradicional facilitando la obtención de materiales con estas características con las
características esperadas ahorrando tiempo y
recursos.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 38
MATERIALES Y MÉTODOS
Siembra de material vegetal
Se sembraron individualmente ápices de 1,5
cm de longitud de los materiales susceptibles EC-39, EC-28 y del material resistente PL-
35, PL-24, PL-19, PL-11 y PL-8, en frascos
de 135 mL, con 20 mL de medio de cultivo A
de Lulo, que consta de sales Murashige y Skoog (MS), Tiamina HCL 0,5 mg/L, Panto-
tenato de calcio 2,5 mg/L, Pyridoxina HCL 1
mg/L, Ácido Nicotínico 5 mg/L, Azúcar 30
gr/L, Gel Rite 2,5 gr/L y pH 5,9 (Segovia, 2002; CIAT Annual report, 2003 y 2004).
Los materiales utilizados se evaluaron pre-
viamente en condiciones de campo y labora-
torio para determinar su resistencia a enfer-medades.
Para la siembra del material vegetal en
medio de cultivo con las diferentes concen-
traciones del extracto crudo se utilizaron ápices de aproximadamente 1,5 cm de longi-
tud a los cuales se le eliminaron las hojas. Se
sembró un solo ápice por frasco, el cual
constituyó una unidad experimental; esto se realizó con el fin de no generar competencia
entre las vitro plantas. Las unidades experi-
mentales se mantuvieron en cuarto de creci-
miento bajo condiciones controladas de tem-
peratura (28±2oC), con fotoperiodo 12-
horas/día, iluminación (1000 lux), proporcio-
nada por tubos fluorescentes.
Obtención del extracto crudo
Para la obtención del extracto crudo, inicial-
mente se reactivó el patógeno utilizando trocitos de micelio obtenidos a partir de
cultivos monospóricos de C. acutatum de los
aislamientos LM-41C y LM-44B de alta y
baja patogenicidad, respectivamente, conser-vados en tubos eppendorf con agua doble-
mente desionizada estéril. Los fragmentos
seleccionados se sembraron en medio de
cultivo PDA (39 gr/L con acido láctico 10 ml/L). Después de quince días de crecimiento
se tomaron cuatro discos de micelio de 0,5
cm de diámetro del aislamiento seleccionado
para inocular 250 mL del medio líquido MS (Nyange, 1997) contenido en erlenmeyeres.
Los recipientes se sellaron con película
plástica vinilpel® y se incubaron a tempera-
tura ambiente (23±2ºC), en condiciones de reposo y oscuridad durante una, dos y tres
semanas.
Durante la incubación de los cultivos en
el medio MS, se realizaron las observaciones requeridas para determinar los cambios ocu-
rridos.
Esterilización del extracto crudo
Para la esterilización del extracto crudo se
realizaron tres filtraciones con papel filtro
Whatman No. 1, seguidamente, se filtró dos veces con un filtro Whatman de 2,5 µm y
posteriormente con una unidad de filtración
desechable NALGENE® (50 mm de diáme-tro y membrana de nitrocelulosa de 0,22 µm),
para garantizar su completa esterilización. El
pH del extracto se ajustó a 5,9 con KOH 1M
antes de realizar la esterilización final con membrana de 0,22 µm, para no alterar el pH
del medio de cultivo MS al momento de
preparar diferentes concentraciones.
Adición del extracto sobre vitro-plantas
A vitro-plantas de cuatro semanas de edad,
obtenidas en cuarto de crecimiento, se adi-
cionó un mL del extracto del aislamiento
LM-41C obtenido después de una semana de incubación en medio líquido, procurando
aplicarlo directamente sobre la superficie del
medio de cultivo, evitando el contacto directo
con el tejido foliar. Los controles consis-tieron en plantas en medio de cultivo que no
recibieron el extracto.
Cuatro semanas después del tratamiento
se realizaron las observaciones pertinentes para determinar el efecto sobre las plántulas;
teniendo en cuenta la sintomatología expre-
sada y su localización, además del efecto en
el crecimiento
Siembra de materiales de lulo con diferen-
tes concentraciones del extracto crudo
Los extractos crudos obtenidos a partir de dos aislamientos de patogenicidad contrastante,
después de una semana de incubación, se
aplicaron al medio del cultivo en diversas
diluciones (V: V). El volumen total de medio de cultivo A de lulo utilizado se preparó en
un solo recipiente, para disminuir la variación
en la preparación de éste de un tratamiento a
otro; el volumen de medio para cada trata-miento se esterilizó en el autoclave por sepa-
rado y se le adicionó el volumen de extracto
crudo correspondiente a cada concentración,
se homogenizó antes de ser servido en frascos de 135 mL. Cada frasco recibió 20 mL de
medio con filtrado, se dejó enfriar y solidifi-
car por 20 minutos y se selló con Vinilpel
hasta su utilización. Los frascos se mantuvie-ron en observación por tres días para detectar
posible contaminación antes de sembrar el
material vegetal.
Las concentraciones del extracto crudo se establecieron a partir de una serie de experi-
mentos. La evaluación de cada experimento
permitió ir definiendo el efecto del tiempo de
incubación, la concentración del filtrado y las variables de crecimiento de los explantes que
mejor permitieron demostrar el efecto de la
toxina, y las diferencias entre los materiales
de lulo. En un primer experimento, ápices de 1,5
cm de longitud de los materiales PL-19 (re-
sistente), EC-28 y EC-39 (susceptible) se sembraron en el medio de cultivo A con una
concentración del 12,5% v/v de extracto
crudo de una semana de incubación de los
aislamientos LM-41C y LM-44B de alta y
baja patogenicidad, respectivamente (CIAT, 2009).
Los tratamientos control consistieron en
ápices sembrados en medio de cultivo A sin
adición de extracto crudo. El experimento se estableció en un dise-
ño completo al azar y arreglo factorial con
cuatro repeticiones por tratamiento. Las
evaluaciones se realizaron seis semanas después de siembra, teniendo en cuenta las
variables desarrollo de área foliar y peso seco
de raíces.
En experimentos posteriores se sembra-ron ápices de 1,5 cm de longitud sin hojas de
los materiales híbridos interespecíficos PL-
35, PL-24, PL-19, PL-11, PL-8 considerados
resistentes, y de los materiales castilla EC-28, EC-39 susceptibles; adicionalmente se inclu-
yeron materiales de la variedad comercial la
Selva P32, HO+G y HOF+G (híbridos inter-
específicos). Los materiales se expusieron a concentra-
ciones de 50%, 25%, 12,5%, 8%, 5% y 3% de
filtrado obtenido por la incubación en medio
líquido durante una semana del aislamiento LM-41C. Los frascos se mantuvieron en
cuarto de crecimiento en las condiciones ya
descritas.
Cuatro semanas después de siembra se realizó la evaluación basada en la medición
del desarrollo de raíces y tejido foliar, y se
calculó el porcentaje de inhibición del desa-
rrollo de los órganos, comparando el desarro-llo de las unidades experimentales sembradas
en medio con diferentes concentraciones en
relación al desarrollo de los explantes en el
tratamiento control sin adición de extracto crudo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cambios ocurridos durante la producción
del extracto crudo
Durante la incubación del aislamiento LM-
41C de alta patogenicidad, el pH del medio
líquido varió desde 6,0 hasta 2,68, 2,98 y
2,86 después de una, dos y tres semanas de
incubación respectivamente.
Plusky et al. (2001), y Yakoby et al.
(2000) sugieren como factor de virulencia
para Colletotrichum spp. la secreción de amonio al medio, con el consecuente incre-
mento en el pH, y está demostrado para el
caso de C. gloeosporioides una relación
directa entre este fenómeno y la activación de enzimas relacionadas con la degradación de
pectinas y en general en otros patosistemas
para la activación de enzimas degradadoras de la pared celular (Yakoby et al. 2000). Así
mismo Fernández et al. (2000) reportó que
dos razas de C. lindemuthianum crecidas en
medio de cultivo papa dextrosa alcanzaron el pico de producción de toxinas cuando el pH
del extracto crudo alcanzó la neutralidad pH
6,8 y 7,0 a los 20 días de incubación.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
39
Según Shih et al. (2000) citado por Cerón et al. (2006), el crecimiento micelial in vitro
de Colletotrichum spp. presenta algunas
similitudes con el desarrollo necrótrofo, en lo
que se refiere a la expresión enzimática; así mismo Jayasinghe et al. (2001) reporta que
tanto en el cultivo in vitro como en el proceso
infectivo de C. acutatum in vivo se producen
enzimas con actividad poligalacturonasa, pectin liasa, enzimas celulolíticas (beta glu-
cosidasa y celobiasa) que degradan la pared
celular.
En contraste los resultados antes mencio-nados difieren de los obtenidos en el presente
trabajo donde se observó un descenso en el
pH del medio de cultivo después de una, dos
y tres semanas de incubación. Concuerdan con los resultados obtenidos por Patiño
(2009), quien reporta que 14 días después de
la incubación en medio líquido Murashige -
Skoog, el pH fue 2,86. Igualmente, este autor reporta que para la especie C. acutatum, las
enzimas se expresan y secretan a valores de
pH bajos alrededor de tres, donde se favorece
la producción de poligalacturonasas y liasas teniendo un efecto adverso sobre la estabili-
dad de las membranas y haciendo más sus-
ceptible la planta al ataque del hongo. El pH
inicial del medio líquido fue 5,9 y una sema-na después el pH para el aislamiento LM-41C
fue 2,5, y para el aislamiento LM-44B fue
2,8.
Efecto de la aplicación del extracto crudo
sobre vitro
Cuatro semanas después de la adición del
extracto crudo en los materiales castilla EC-28 y EC-39 se presentó inhibición en el cre-
cimiento, clorosis y necrosis en las hojas más
jóvenes y en el meristemo apical. El material
PL-19 considerado resistente, no presentó este tipo de síntomas a nivel foliar aunque se
presentó necrosis en las raíces en menor
proporción, la cantidad y longitud de raíces
disminuyó respecto al control (Figura 1). Las vitro plantas a las que no se les adicionó
extracto crudo, no presentaron síntomas.
García-Pajón et al. (2003) reporta que ensa-
yos realizados con filtrados crudos y solucio-nes de toxinas extraídos de Colletotrichum
capsici inhiben el crecimiento de raíces y
causan marchitez en plántulas de pimiento.
Estos resultados coinciden con los resultados obtenidos en el presente trabajo donde se
puede observar que la necrosis y clorosis en
los materiales castilla EC-28 y EC-39 son
diferentes a las observadas en el materia
hibrido PL-19.
Seis semanas después de siembra, se ob-
servó inhibición en el desarrollo de raíces y área foliar de ápices de los materiales PL-19,
EC-28 y EC-39 (Figura 2)
El número de hojas, área foliar y desarro-
llo de raíces fueron afectados significativa-mente por efecto del extracto crudo de ambos
aislamientos cuyo efecto sobre los explantes
fue estadísticamente iguales. Se encontraron diferencias significativas
en cuanto al desarrollo de área foliar entre los
materiales. El área foliar desarrolladas bajo la
influencia del filtrado de los dos aislamientos no varió en el material PL-19 pero si en los
dos materiales castilla, EC-28 y EC-39.
Se observó una reducción superior al
90% en el área foliar de los materiales casti-lla, y 40% en PL-19.
En el desarrollo de raíces se observó in-
hibición de aproximadamente 95% en los
materiales castilla, mientras que el material hibrido presentó inhibición del 4% con el
aislamiento LM-41C y 41% con el LM-44B.
Estos resultados coinciden con las evaluacio-
nes realizadas en campo y laboratorio, donde el material PL-19 es considerado resistente a
la antracnosis (CIAT, 2009). No solo se
presenta un grado de resistencia a nivel de
planta y fruto sino de los explantes en condi-ciones in vitro bajo la presión de toxinas.
Fernández et al. (2000) reporta que el
crecimiento de callos de los cultivares de
frijol susceptibles a Colletotrichum lindemut-hianum, ¨Collacia¨, ¨Andecha¨ y ¨Seronda¨ se
inhibió cuando se trataron con solución de
extracto al 12,5% obtenido a partir de una
raza de este hongo, mientras que para otra raza se requirió la adición del 25% de la
solución para inhibir por completo el creci-
miento de los callos. Estos resultados con-
Figura 1. Efecto del extracto crudo del aislamiento de alta patogenicidad LM-41C a vitro plantas de cuatro
semanas de desarrollo de los materiales A. PL-19, B. EC-28 y C. EC-39. Nótese el efecto sobre el desarrollo
de las plántulas, sistema de raíces y síntomas en el follaje.
Tratamiento - Aislamiento
Ctrl LM-41C LM-44B
Pes
o se
co r
aice
s (g
r)
0,000
0,001
0,0020,003
0,006
0,009
0,012
0,015
0,018
Ctrl LM-41C LM-44B
Are
a fo
liar
(cm
2 )
0
2
4
8
12
16
20
Ctrl LM-41C LM-44B
Num
ero
de H
ojas
0
2
4
6
8
10
PL-19
EC-28
EC-39
A B
C
Figura 2. Evaluación seis semanas después de siembra de los materiales PL-19, EC-28 y EC-39 sembrados en medio A con una dilución de 12,5% de extracto crudo obtenido a partir de la incubación durante una
semana en medio líquido de dos aislamientos LM-41C y LM-44B de patogenicidad contrastante de Colleto-
trichum acutatum A. Numero de hojas B. Área foliar C. Peso seco de raíces.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 40
cuerdan con los obtenidos por Anderson, (1980) citado por Fernández et al. (2000)
quien menciona que hay diferencias fisiológi-
cas y bioquímicas en las propiedades de los
extractos de diferentes razas de la especie de este hongo.
Para el caso de C. acutatum en este estu-
dio no se observó una diferencia en cuanto a
la respuesta de los explantes al extracto crudo obtenido de dos aislamientos del hongo aun
cuando se observó una inhibición superior del
aislamiento LM-44B comparado LM-41C en
el material PL-19, al parecer el contenido de toxinas segregadas al medio del cultivo por el
hongo es similar.
Los diez materiales que se sembraron en
medio de cultivo con diferentes concentra-ciones del extracto crudo presentaron una
amplia variación en síntomas a concentracio-
nes de 3%, 5%, 8%, 12,5% y 25%, los mate-
riales castilla EC-28 y EC-39 considerados susceptibles, mostraron mayores porcentajes
de inhibición en el número de hojas que los
híbridos interespecíficos PL-11, PL-19 y PL-
24. A concentraciones de 3% y 5% no hubo
diferencias estadísticamente significativas
entre los híbridos interespecíficos, respecto a
sus correspondientes controles ni para el número de hojas ni para el área foliar.
El área foliar de PL-19 y PL-24 fue es-
tadísticamente diferente de los respectivos
controles a concentraciones de 8%, 12,5% y 25%.
Los clones que conforman el cultivar la
Selva, P-32, HOF+G y HO+G no presentaron
diferencias estadísticamente significativas de los controles a concentraciones 3% y 5% en
cuanto al área foliar; en general todos los
materiales presentaron alta variabilidad. En el
material P-32 se observó que las muestras tratadas con 3% y 5% de extracto crudo
tuvieron un área superior al control equiva-
lente al 26,8% y 6,4%, respectivamente (no
hubo diferencias estadísticamente significati-vas).
El material HOF+G a 3% de extracto
crudo, también presentó crecimiento 3,8%
superior al tratamiento control, mientras que a concentración 5%, se presentó inhibición
igual a 26,5%. Por último el material HO+G,
presentó inhibición a concentraciones 3% y
5% de 16,9% y 32,84%, respectivamente, en comparación al tratamiento control.
Los porcentajes de inhibición de los ma-
teriales la Selva y en general de los híbridos
interespecíficos fueron menores, comparados con los porcentajes de inhibición presentados
por los materiales castilla EC-39 y EC-28 en
las diferentes concentraciones (Tabla 1). Todos los materiales analizados en la pre-
sente investigación se evaluaron previamente
en condiciones de invernadero, campo y en la
susceptibilidad de los frutos a la antracnosis (CIAT, 2009). La incidencia de la antracnosis
en condiciones de campo de los materiales
híbridos PL-8, PL-11, PL-19 y PL-24 fue de
0% en las dos localidades donde se realizó la evaluación, excepto el material PL-35 con
solo 2,1% de incidencia (Muñoz, 2009; Qui-
ñonez, 2009). Sobre fruto, se presentaron
también los menores valores de área bajo la curva del progreso de la enfermedad en los
materiales híbridos (Tabla 2).
Aunque se presenta una gran variabilidad en la respuesta al interior de cada grupo de
materiales, como es el caso de los híbridos
inespecíficos que según las evaluaciones de
campo han sido declarados como resistentes, fue posible bajo esta metodología separarlos
de los materiales “Castilla” que han sido
declarados en condiciones de campo y labora-
torio como susceptibles.
La metodología implementada arrojó re-sultados que concuerdan con los obtenidos en
otras evaluaciones con el hongo in vivo y por
lo tanto, puede ser un apoyo para la identifi-
cación previa de materiales con característi-cas de tolerancia a la antracnosis para ser
incluidos dentro de programas de mejora-
miento.
CONCLUSIONES
La metodología implementada para la purifi-
cación, inoculación e incubación del hongo
en medio líquido permitió obtener filtrados crudos de buena calidad y sin contaminación.
El pH del medio líquido después de una, dos
y tres semanas de incubación con aislamien-
tos de diferente patogenicidad disminuyó respecto al pH en el tiempo cero de incuba-
ción.
La metodología de adición de filtrado so-
bre vitro plantas de cuatro semanas de desa-rrollo tuvo efectos sobre el desarrollo de
raíces, clorosis y necrosis del tejido foliar y
del meristemo apical en los explantes de los
materiales castilla EC-28 y EC-39, mientras que el material PL-19 no presentó este tipo de
afectaciones y en general este comportamien-
to se mantuvo en los materiales híbridos.
Los materiales tipo castilla EC-39 y EC-
28 presentaron la mayor inhibición en el
desarrollo de área foliar que los materiales
híbridos y los conocidos como la selva. Se
hace necesario continuar con experimentos posteriores para identificar las concentracio-
nes del extracto crudo que permitan separar
los híbridos interespecíficos y así diferenciar
su respuesta a la presión del hongo.
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biochemical compositions and toxic ac-tivity of extracellular components produ-
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Tabla 1. Porcentaje de inhibición en el desarrollo del área foliar de diez materiales de lulo bajo la presión
de diferentes concentraciones de extracto crudo del aislamiento LM-41C de alta patogenicidad de Colle-
totrichum acutatum
Material Concentración del extracto crudo
3%
5%
8%
12,50%
25%
EC-28
53 a 57 a 65,43 a 88,77 b 96,04 b
EC-39
45 c 51,25 c 52,84 c 85,68 d 97,85 d
PL-8
8,8 g 5,33 g
PL-11
21 h 6,99 h 8,84 h 14,62 h
PL-19
20 i 21,99 i 45,55 j 58,41 j 98,44 k
PL-24
21 l 4,77 l 20,88 l 45,43 m
PL-35
2,6 n 20,4 n
P-32
-27 o -6,42 o
HOF+G
-3,8 p 26,54 p
HO+G 17 q 32,84 q
Prueba de comparación de Duncan, basado en el desarrollo de área foliar de las unidades experimentales
en las diferentes concentraciones de todos los ensayos (p = 0,05). Letras diferentes indican diferencias
estadísticas significativas de los promedios observados dentro de un mismo material.
Tabla 2. Evaluación de los materiales de lulo en
diferentes condiciones, por su tolerancia a an-
tracnosis causada por Colletotrichum acutatum.
Mate
ria
les
In
vitro
Campo (fruto)
Lab
orato
rio
(fru
to)
(Área
Foli
ar)
% I
nh
ibic
ión
1
Pop
ay
án
a
Sta
. R
osa
b
ABCPE
(%)3c
Incidencia (%)2
EC-28 53 22,7 12 3,79
EC-39 44 14,4 11 4,68
PL-8 8,75 0 1,1 0,317
PL-11 21,2 0 4 0
PL-19 20,15 0 0 0,0181
PL-24 20,5 0 0 0,346
PL-35 2,63 0 2,1 1,67
P-32 -26,86 - - -
HOF+G -3,84 - - -
HO+G 16,93 - - -
1 % desarrollo de área foliar sobre frutos en dos
calidades, 3 Área bajo la curva del progreso de la
enfermedad, porcentaje de área total del fruto
afectada por el hongo. (Fuente: a: Muñoz, 2010,
b: Quiñonez, c: CIAT, 2009)
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ronmental microbiology 66: 26-1030.
42
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE FITOPATOLOGIA
Y CIENCIAS AFINES, ASCOLFI
Misión
Contribuir a la creación y utilización del conocimiento científico en la fitosanidad para
facilitar soluciones a los problemas de la producción de cultivos sanos con rentabilidad
social y económica, protegiendo el medio ambiente
Visión
Ser una entidad líder, reconocida nacional e internacionalmente por su excelente labor
en beneficio de la promoción, divulgación y consolidación del conocimiento científico
de personas e instituciones allegadas a la fitosanidad y sus ciencias afines como
elemento esencial de la producción de cultivos de alta calidad
Objetivos
Contribuir a la creación de una conciencia nacional sobre la importancia de la
ciencia y tecnología en la sanidad vegetal como aporte al desarrollo agropecuario
y económico del país
Promover el interés en todos los aspectos de la fitopatología y ciencias afines
Contribuir a la creación y difusión del conocimiento científico de la fitopatología
y ciencias afines
Promover y estimular la publicación de los resultados de los estudios y/o
investigaciones sobre fitopatología y ciencias afines
Promover la cooperación entre entidades del sector público y privado tanto
nacional como internacional que tengan interés en estas disciplinas
Promover el mejoramiento del nivel académico de sus asociados y de quienes
manifiesten interés en las áreas de la fitopatología y ciencias afines
Estrechar los vínculos de solidaridad y compañerismo entre sus afiliados
Informar y motivar a la opinión pública y sus representantes sobre la
problemática de las enfermedades de las plantas y su control
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
43
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS ASOCIADOS A LA PUDRICIÓN BASAL DEL
ESTÍPITE EN PALMA DE ACEITE EN LA ZONA CENTRAL PALMERA COLOMBIANA*
Yuri Adriana Mestizo Garzón1 y Gerardo Martinez-L2
1Universidad de Cundinamarca, sede Fusagasugá, 2Programa de plagas y enfermedades Cenipalma
Correo electrónico de contacto: gerardo.martinez@cenipalma.org
*Artículo científico, recibido para publicación el 27/05/2011, aceptado el 17/08/2011; galardonado con el “Premio Nacional de Fitopatología Gonzalo Ochoa,
Categoría estudiante”, otorgada durante el XXX Congreso Colombiano y XVI Latinoamericano de Fitopatología Bogotá (Colombia) Agosto 19 de 2011
RESUMEN
La pudrición basal del estípite es una de las enfermedades más impor-
tantes de la palma de aceite en todas las zonas productoras. En Colom-
bia la incidencia de la enfermedad ha aumentado lenta pero progresi-vamente sobre todo en las zonas Centro y Norte del país, incrementan-
do costos y control y desafiando con difundirse en toda la región. Los
síntomas más comunes son acumulación de flechas, clorosis, dobla-
miento de las hojas bajeras, acumulación de raíces adventicias y de inflorescencias masculinas. En la base del estípite es posible observar
lesiones características de pudrición seca, a medida que la enfermedad
avanza se presenta enruanamiento y doblamiento de la punta de las
hojas. El propósito de esta investigación fue identificar morfológica y molecularmente los microorganismos asociados a la pudrición basal
del estípite, para ello se realizaron aislamientos a partir de tejido del
área de avance de la enfermedad, los cuales se sembraron en diferen-
tes medios de cultivo, purificados e identificados, comparando las características macroscópicas y microscópicas de cada uno con claves
taxonómicas y mediante métodos moleculares. De los 24 aislamientos
obtenidos se identificaron seis hasta especie (Cladosporium cladospo-
rioides, Curvularia affinis, Curvularia lunata Neonothopanus nambi, Thielaviopsis paradoxa y Coprinopsis cinerea); siete hasta género
(Fusarium, Pythium, Phlebia, Nodulisporium y Penicillium); uno
hasta división (Basidiomycota) y 10 no pudieron ser identificados.
Para hacer observaciones preliminares de patogenicidad se realizaron inoculaciones en pecíolos de palma y se encontró que los hongos
involucrados en las lesiones de mayor tamaño fueron Neonothopanus
nambi, Curvularia affinis, Coprinopsis cinerea, Phlebia sp. Thiela-
viopsis paradoxa, Penicillium sp. y tres de los no identificados. No obstante estos resultados, se requiere profundizar más en la aplicación
de metodologías que conduzcan a la verificación de la patogenicidad
de los microorganismos asociados con la pudrición basal de estípite de
la palma de aceite, observada en la plantación Indupalma Ltda., en el Sur del Cesar.
Palabras Claves: Elaeis guineensis, Ganoderma spp., hongos, aisla-
mientos
SUMMARY
Identification of microorganism associated with basal stem rot in
oil palm at the central region of Colombia
Basal stem rot is one of the most important diseases in oil palm in all
the production areas. In Colombia there are evidences of the slow but
constant increase in incidence in the Central and North regions, with
the effect on the identification costs and the risk to spread to the entire region. The most common initial symptoms are the accumulation of
spear leaves, yellowing, bending of the lower leaves, accumulation of
adventitious roots as well as of male inflorescences. As the disease
advance, there is accumulation of many hanging leaves and bending of the tips of them. The purpose of this research was to identify morpho-
logical and by molecular biology, the microorganisms associated with
the disease. For this, tissue from the front of advance of the lesion was
used for isolation, purification and identification of the microorgan-isms present, using different culture media. The macroscopic and
microscopic characteristics of the colonies were compared with tax-
onomic keys and further identification was done with molecular biolo-
gy protocols. From the 24 isolates obtained, six were identified to species: Cladosporium cladosporioides, Curvularia affinis, Curvularia
lunatus, Neonothopanus nambi, Thielaviopsis paradoxa and Copri-
nopsis cinerea); seven to genera: Fusarium, Pythium, Phlebia, Nodu-
lisporium and Penicillium; one to division: Basidiomycota and ten were not identified. For preliminary pathogenicity observations, oil
palm petioles were inoculated. It was found that fungi microorganisms
involved with the greater sizes lesions were: Neonothopanus nambi,
Curvularia affinis, Coprinopsis cinerea, Phlebia sp. Thielaviopsis paradoxa, Penicillium sp and tree unidentified fungi as well. It is quite
important to investigate and standardize the methodology of pathoge-
nicity tests that has not been completed at the moment. This will help
to identify the microorganisms responsible in the developing of basal stem rot oil palm in Indupalma Ltd. plantation state in the South of
Cesar.
Key Words: Elaeis guineensis, Ganoderma spp., Fungi, Isolates
INTRODUCCIÓN
La pudrición basal del estípite (PBE) es una
de las enfermedades más importantes de la
palma de aceite. La PBE ha causado graves
pérdidas económicas a través del tiempo en países cultivadores comportándose como un
enemigo silencioso pero fatal (Meón, 2005).
Por muchos años se consideró como una enfermedad de las palmas viejas y de poca
importancia económica, debido a que tales
palmas se reemplazaban pronto; sin embargo,
a mediados de la década de 1950 la enferme-dad comenzó a presentarse en palmas mucho
más jóvenes en el Sureste Asiático, particu-
larmente en áreas sembradas después de
cocoteros o en resiembras de palma de aceite (Turner, 1981).
En Malasia e Indonesia, la PBE se consi-
dera como la enfermedad más limitante en
el cultivo de la palma de aceite tanto que algunos autores registran la muerte del 50-
80% de las palmas, en la mitad de su vida
productiva. También se presenta en África y Centroamérica (Chinchilla y Richardson,
1987; Turner y Gillbanks 2003; Franqueville
et al., 2009).
En Colombia los casos de la PBE se han vuelto frecuentes y han alcanzado importan-
cia económica en las zonas Norte y Centro y
aunque existen diferentes tipos de pudricio-
nes de estípite, la PBE es una de las más problemáticas (Sarria, G.A., 2008 datos no
publicados).
En Malasia e Indonesia, la PBE es causa-
da por el hongo Ganoderma boninense Pat., según los resultados de las pruebas de pato-
genicidad, aunque existen otras especies
como G. lucidum, G applanatum, G chal-ceum, G miniatocinctum entre otros que
tienen relación con la palma de aceite (Tur-
ner, 1981; Ho y Nawawi, 1985; Khairudin,
1991; Idris, 1999; Idris et al., 2000). Debido a que la enfermedad ha sido atri-
buida a un Basidiomiceto (parásito facultati-
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 44
vo), capaz de vivir como saprofito en tocones o raíces en descomposición que quedan en el
suelo en espera de un huésped adecuado
(Khairudin, 1993, citado por Rodríguez,
2001; Franqueville, 2009), se considera que la presencia de raíces muertas, colonizadas
por el patógeno, y las heridas juegan un papel
clave en la penetración del hongo en el hos-
pedero. Como lo informa Turner (1981), la edad a
la cual se infecta la palma depende del ritmo
de colonización de los tejidos de la población
anterior, de la proximidad de los tejidos colonizados a la palma de aceite, del tiempo
que requieren las raíces para entrar en contac-
to con los tejidos e infectarse, y del desarrollo
del hongo a lo largo de las raíces y su esta-blecimiento dentro de los tejidos del estípite
La infección en las palmas más jóvenes,
comienza en el centro del estípite en creci-
miento y las palmas mueren rápidamente después de contraer la enfermedad.
En palmas adultas, en las cuales el estípi-
te ha alcanzado su máximo desarrollo, las
raíces externas son las responsables de portar el inóculo y generalmente, la infección se
inicia desde afuera y avanza hacia adentro.
Cuando los tejidos de la base del estípite
están completamente endurecidos, el avance de la enfermedad suele ser lento y la muerte
puede tardar algunos años.
La dispersión de la enfermedad en una
plantación, se presenta por el contacto entre las raíces de las plantas sanas y enfermas, las
palmas afectadas normalmente aparecen
agrupadas y el tamaño de estas áreas aumenta
a medida que se vayan contagiando más plantas; en consecuencia una palma infectada
actúa como foco que puede transmitir la
enfermedad a las palmas vecinas (Gurmit,
1990). Además se especula con menor credi-bilidad que la enfermedad se disemina am-
pliamente a través de las basidiosporas
transportadas por el viento o por vectores
(Sanderson et al., 2000). En la descripción de la sintomatología
que causa el patógeno en palmas se mencio-
nan: amarillamiento seguido por secamiento
y necrosis; las hojas nuevas emergentes son mas cortas y cloróticas y a medida que la
palma avanza adquiere una apariencia pálida,
produce flechas sin abrir , el crecimiento se
retrasa y la descomposición de la parte inter-na del estípite se hace evidente mediante la
aparición de un cráter u orificio en la base;
las raíces presentan color pardo con porciones
negras y fáciles de desmenuzar; hojas secas y muertas; presencia de cuerpos fructíferos
entre otros.
En las palmas más viejas, los síntomas típicos son el doblamiento de las hojas baje-
ras, simulando una falda (enruanamiento), la
producción de muchas flechas sin abrir y una
decoloración generalizada del follaje (Fran-queville et al., 2009). Dichos síntomas refle-
jan el deterioro en la absorción de agua y
deficiencia de nutrientes en el follaje de las
palmas afectadas (Gurmit, 1990; Khairudin, 1993; Sánchez 1986; Turner, 1981; Nieto,
1994).
En Colombia la presencia de PBE en las
plantaciones de Palma de aceite es cada vez más frecuente y la información sobre las
causas de la enfermedad no está suficiente-
mente documentada, requiriéndose, por lo
tanto, establecer con exactitud cuál es el agente causante. Hasta el momento, a pesar
que algunos palmicultores la han asociado
con Ganoderma spp., por la presencia de
cuerpos fructíferos visibles en palmas (carac-terísticas más sobresaliente de la enfermedad
en Malasia e Indonesia), no existen estudios
que confirmen que alguna o algunas de las
especies de éste género sean las responsables de la enfermedad en el país.
El propósito de esta investigación fue
identificar morfológica y molecularmente los
microorganismos asociados a la pudrición basal del estípite en la zona de estudio
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación
El estudio se realizó durante el periodo comprendido entre marzo y noviembre de
2009, en la plantación Indupalma Ltda.,
localizada al sur del departamento del Cesar
en la Jurisdicción del municipio de San Al-berto. Altitud de 125 m.s.n.m., temperatura
máxima promedio 34 °C y mínima promedio
22 °C, humedad relativa media de 72,3%,
precipitación anual de 2.497 mm, evapora-ción anual 1.208 mm y 2.130 horas de brillo
solar al año, condiciones agroecológicas
correspondientes a la zona de vida Bosque
Húmedo Tropical.
Seguimiento de síntomas en campo
Se seleccionaron 30 palmas en la parcela F04BP de la subdivisión La Ilusión, con 8,94
hectáreas en las cuales estaban establecidas
1279 palmas y el 12,4% de ellas presentaban
la enfermedad. Los síntomas se seleccionaron de acuerdo a los registros durante los estudios
de la enfermedad y se describieron de acuer-
do al comportamiento presentado en el cam-
po. Una vez seleccionadas las palmas del es-
tudio se realizó la caracterización de los
síntomas durante nueve meses, teniendo en
cuenta la apariencia externa de las palmas con respecto a la descripciones hechas en la
literatura (Nieto, 1994; Darus, 1995; Meon,
2005, Franqueville et al. 2009). Cada diez días se efectuaron las diferentes evaluaciones
comparando el avance de la enfermedad y la
identificación de nuevos casos de la PBE.
Para el estudio de la sintomatología in-terna, se erradicaron 10 palmas que en el
momento de su evaluación, permitieron
caracterizar el daño interno y asociarlo con la
sintomatología externa observada en el mo-
mento de realizar la inspección interna de los tejidos de la palma.
Toma y procesamiento de muestras.
Se tomaron muestras de tejidos, directamente
en campo de plantas que presentaban sínto-
mas de PBE, especialmente en estados inícia-
les e intermedios de daño, usando trozos pequeños de tejido enfermo que contenían
tejido adyacente sano, los cuales se colocaron
inmersos en tubos de vidrio con Tween 20 y
se refrigeraron con el fin de conservarlos hasta ser llevados al laboratorio. El trabajo
posterior se realizó principalmente en la
plantación y en los casos en los que se requi-
rió, se llevaron muestras al laboratorio de fitopatología de Cenipalma en el Campo
Experimental El Palmar de la Vizcaína.
Aislamiento y purificación de microorga-
nismos
Se tomaron trozos de 0,5 cm de longitud,
aproximadamente, los cuales se pusieron en vasos de precipitado con Tween 20 de tal
manera que cubriera todo el tejido; se taparon
con una gasa sostenida por una banda de
caucho y se lavaron con el agua del chorro del grifo durante dos horas como mínimo.
Posteriormente en la cámara de flujo laminar
se lavaron nuevamente con hipoclorito al
1,0% durante un minuto, luego se lavaron con alcohol al 70% durante 30 segundos y, final-
mente con agua destilada estéril dos veces.
Este tejido se colocó a secar sobre papel
toalla estéril durante cinco a 10 minutos y se procedió a sembrar cinco trozos por caja de
Petri en diferentes medios de cultivo: papa-
dextrosa-agar (PDA), agar-agua (Agar), GSM
(Medio selectivo para Ganoderma), BAM (Medio selectivo para Basidiomicetos), agar
extracto de Malta y en el caso de bacterias
todos los aislamientos iníciales se realizaron
en agar-nutritivo. De igual manera se toma-ron carpóforos en campo y se realizaron
siembras directas a partir de muestras de los
tejidos de la fructificación con el fin de obte-
ner el microorganismo en condiciones in vitro.
Después de cinco a siete días se verificó
la aparición de hongos y se realizaron los
subcultivos necesarios, con el fin de iniciar el proceso de purificación de colonias de mane-
ra temprana y evitar posibles contaminacio-
nes, hasta obtener finalmente aislamientos
puros.
Identificación de microorganismos
A partir de los aislamientos puros se realizó
la identificación a nivel de género por carac-
terísticas morfológicas mediante la utilización
de claves específicas para cada uno (Paul et al., 1927, Barnett, 1960; Domsch, 1980).
Las características morfológicas se eva-
luaron mediante comparación y medición de
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
45
estructuras por toma directa del microorga-nismo, improntas y microcultivos. De igual
manera se tomaron signos de la enfermedad
en palmas afectadas con el fin de hacer mon-
tajes directos que permitieran por morfología realizar la identificación de la especie.
El trabajo de identificación molecular se
realizó en el laboratorio de Biología Molecu-
lar de Cenipalma, en el Campo Experimental Palmar de la Vizcaína, donde se realizó la
amplificación del ADN ribosomal y el pro-
ducto obtenido se envió a secuenciación a
Macrogen Inc. (Seúl Corea). Las secuencias se editaron con el programa SequencherTM
4,8 (Codes Corporation, USA) y se determinó
la homología de la secuenciación de estudio
con las bases de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information), usado
en algoritmo Mega Blast.
Pruebas de patogenicidad in-vitro
Se realizaron inoculaciones de todos los
microorganismos aislados, sobre trozos de
pecíolos con el fin de verificar la patogenici-dad de los mismos.
En campo se seleccionaron dichos pecío-
los provenientes de palmas en condiciones
fitosanitarias adecuadas (libres de enferme-dades), y se llevaron al laboratorio, dónde, se
les retiró los foliolos, se limpiaron con hipo-
clorito de sodio al 5,0%, se cortaron en trozos
de 25 cm y se sellaron con parafina los ex-tremos expuestos, posteriormente se llevaron
a la cámara de flujo laminar donde se les
realizó dos perforaciones con broca calibre
3/8 de 2,0 a 2,5cm de profundidad, en sentido vertical y horizontal respectivamente, cada
una fue ubicada a 8,0cm del borde.
Con un sacabocados se tomó parte del
microorganismo, hongo o bacteria, adherido al medio en el que estaba sembrado y se
depositó en cada una de las perforaciones, se
selló con algodón estéril, y se cubrió todo el
pecíolo con vinipel. Luego los peciolos ino-culados se almacenaron en bandejas a tempe-
ratura ambiente en el laboratorio (26-28°C
aproximadamente).
Diseño Metodológico
Se realizaron observaciones sistemáticas y
organizadas dentro de un diseño de tratamien-tos correspondientes a cada tipo de microor-
ganismo. Como unidad experimental se tomo
un trozo de peciolo de 25cm con dos perfora-
ciones; los microorganismos se asignaron a las unidades experimentales en forma aleato-
ria y sin restricción alguna, bajo el esquema
de un diseño completamente al azar; las unidades experimentales provenían del mis-
mo material, de la misma edad, del mismo
lote y de similar manejo agronómico; cada
tratamiento se repitió tres veces y se hicieron evaluaciones a los 10, 20 y 30 días después
de la inoculación.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Seguimiento de síntomas en campo Síntomas externos. En las observaciones de
las 30 palmas seleccionadas se encontró que ocho presentaban estado de cráter avanzado
(orificio que se observa a simple vista sobre
la base del estípite), 11 en estado leve (orifi-
cio determinado por prueba de varilla o chu-so) y 11 sin cráter, de esta manera el sínto-
ma más claro de la presencia de la enferme-
dad fue el cráter en la base de estípite (Figura
1a, b), el cual corresponde a un estado avan-zado, de la enfermedad siendo hasta ahora la
máxima expresión para diagnosticar plantas
afectadas por la pudrición basal de estípite.
De acuerdo con los resultados obtenidos, el cráter leve es un estado previo al estado de
cráter avanzado. Durante los nueve meses de
evaluación, el porcentaje de palmas que
presentó algún tipo de cráter aumentó en un 20% y esto se debió a la aparición de nuevas
palmas en estado de cráter leve. Acompañado
al incremento de nuevos casos se observó un
aumento de palmas en estado de cráter avan-zado como consecuencia de la evolución de
las palmas reportadas previamente como
casos de cráter leve.
El promedio mensual de palmas que se afectaron fue del 2,2% mientras que la evolu-
ción entre el estado de cráter leve hacia avan-
zado fue del 3,6% (Figura 2).
Síntomas como la presencia de raíces adventicias (Figura 1 c), acumulación de
flechas (Figura 1f), el amarillamiento de
hojas jóvenes (Figura 1j), entre otros, son
síntomas secundarios que reflejan lo que está ocurriendo internamente en la palma afecta-
da por PBE, pero que también pueden ser
ocasionados por otras causas.
En cuanto a síntomas externos asociados a la enfermedad, la acumulación de flechas
(AF), las raíces adventicias (RA) y las hojas
bajeras dobladas (Figura 1k), fueron las que
alcanzaron incidencias superiores al 40%, en los primeros estados de desarrollo de la en-
fermedad (Figura 3).
La acumulación de inflorescencias mas-
culinas (Figura 1h) fue uno de los síntomas observados en los estados iniciales pero a
medida que avanzó la enfermedad se hizo
menos evidente.
En el transcurso de las evaluaciones, síntomas como el enrruanamiento (Figura
1g), y doblamiento de la punta de las hojas
(Figura 1i) se hicieron más evidentes (Figu-
ra 3). El amarillamiento de hojas jóvenes estuvo afectado por las condiciones de preci-
pitación
Síntomas internos. Las 10 palmas utilizadas
en el estudio de la sintomatología interna, al
erradicarlas y evaluarlas cuatro presentaban
cráter leve, cuatro cráter avanzado y dos sin cráter. En los cortes se observaron lesiones
que comenzaban desde el centro del estípite
y avanzaban hacia afuera, aunque en algunos
casos las lesiones iniciaban más cerca a los laterales de la base del estípite, situación
similar a la registrada por Franqueville
(2009).
El tejido del estípite afectado se descom-puso y muchas veces alcanzó un estado de
degradación avanzada hasta formar un mate-
rial semejante a la turba. En la zona de avan-
ce de la enfermedad el tejido del estípite tomó un color café oscuro a negro y en la parte
externa de ésta se observó un área de color
café más claro e inmediatamente contiguo se
observó una zona de color amarillo que sepa-ra el tejido enfermo del sano, que se diferen-
ció por su consistencia corchosa (Figura 4a).
Al realizar un corte transversal en
búsqueda de tejido sano se observaron lesio-nes necróticas aisladas (Figura 4b) indicando
el avance de la pudrición en el estípite y, en
algunas lesiones se observó el crecimiento de
micelio blanco sobre el tejido en descomposi-ción. (Figura 4c)
Las raíces infectadas presentaron consis-
tencia frágil, corteza parda en descomposi-
ción y el cilindro central mostró coloración negra.
Al relacionar la sintomatología con res-
pecto al estado interno se observó que tanto
para cráter leve como para el avanzado, el 90 por ciento de las palmas erradicadas presentó
síntomas de acumulación de flechas (AF), el
100 por ciento raíces adventicias (RA) y en el
80 por ciento hojas bajeras dobladas (HBD). Las cuatro palmas que se encontraron en
estado de cráter avanzado (CA) registraron
síntomas de doblamiento de la punta de las
hojas (DPH) y tres de ellas enruanamiento. En las dos palmas que no registraron cráter se
observó que una mostró pudrición en la parte
interna del estípite.
Identificación de microorganismos asocia-
dos a la pudrición basal de estípite
En las muestras de tejido obtenido en la parte interna y externa de la base del estípite, raíces
y cuerpos fructíferos se aislaron 24 microor-
ganismos entre los que se encontraron hongos
del género Cladosporium, Fusarium, Curvu-laria, Coprinopsis, Phlebia, Thielaviopsis y
Penicillium y algunas especies de Basidio-
mycete (Figura 5).
De las siembras de tejido en Agar-
nutritivo, se aislaron bacterias del género
Pseudomonas y Erwinia, pero no se tuvieron
en cuenta por considerarse saprofitas y con-taminantes. Mediante procedimientos de
biología molecular se identificaron hasta
especie seis microorganismos, ocho hasta género por las características de las estructu-
ras microscópicas que presentaron y 10 no se
pudieron identificar por presentar solo creci-
miento micelial y no ser amplificados correc-tamente en el proceso de PCR con el ADN
obtenido.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 46
Figura 1. Síntomas externos asociados a la pudrición basal del estípite:
a. Cráter leve (CL)
b. Cráter avanzado (CA) c. Raíces adventicias (RA)
d. Basidiocarpos o cuerpos fructíferos (CF)
e. Fruto opaco (FO)
f. Acumulación de flechas (AF) g. Enrruanamiento (E)
h. Acumulación de inflorescencias
masculinas (IM)
i. Doblamiento de la punta de las hojas (DPH)
j. Amarillamiento de hojas jóvenes (A)
k Hojas bajeras dobladas
a b c
d e
k j
i h g
f
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
47
Lesiones producidas en observaciones
preliminares de patogenicidad
Las inoculaciones fueron realizadas en dos
etapas, la primera desde el código H001 hasta
el H027 con un testigo con solo medio de
cultivo y un testigo absoluto no inoculado y, la segunda desde el código H028 hasta el
H038 con sus respectivos testigos.
En la primera etapa de inoculaciones, el
hongo Thielaviopsis paradoxa generó conta-minación entre los peciolos inoculados con
los otros microorganismos, debido a la cer-
canía entre un tratamiento y otro y la fácil
proliferación del hongo, lo que provocó que
el área total de daño fuese más amplia. En
algunos peciolos fue posible la identificación
del daño producido por el microorganismo inoculado mientras en otras la contaminación
con Thielaviopsis paradoxa creó confusión
en los síntomas producidos por el microorga-
nismo inoculado. Después de realizar el análisis de los
datos se encontró una alta variabilidad intrín-
seca que no permitió realizar análisis estadís-
ticos relacionados con pruebas de patogenici-dad, pero sin embargo se observó que los
hongos involucrados en las lesiones de mayor
tamaño fueron: Neonothopanus nambi
(5304,25 mm2), Curvularia affinis (9960
mm2), Coprinopsis cinérea (4992,5 mm2), Phlebia sp. (4778,5 mm2), Thielaviopsis
paradoxa (9187,5 mm2), Penicillium sp.
(492,5 mm2), y tres de los no identificados
(5135,3, 1038,5 y 4313 mm2) (Figura 6).
CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
Se logró avanzar en el reconocimiento de los diferentes microorganismos asociados con la
pudrición basal del estípite, generando nuevas
oportunidades para continuar con el proceso
de investigación. Es necesario profundizar más en la meto-
dología para la realización de pruebas de
patogenicidad las cuales hasta el momento no
han sido completadas, con el fin de buscar otras alternativas que permitan llegar a la
producción de los órganos de reproducción
del (los) patógeno(s) involucrados en este
disturbio, eliminando los riesgos de contami-nación con Thielaviopsis paradoxa.
Algunos de los síntomas internos y exter-
nos, característicos de la pudrición basal de
estípite, que fueron observados en este estu-dio, coinciden con los descritos en la literatu-
ra para aquellos casos en los cuales la enfer-
Figura 2. Comportamiento del síntoma primario de la PBE en las 30 palmas seleccionadas para evalua-
ción.
Figura 3. Comportamiento de los síntomas secundarios de la PBE. A (Amarillamiento); DPH (Doblamien-to de la punta de las hojas); E (Enruanamiento); FF (Foliolos frágiles); AF (Acumulación de flechas); FO
(Fruto opaco); HBD (Hojas bajeras dobladas); RA (Raíces adventicias); IM (Acumulación de inflorescen-
cias masculinas).
Figura 4. Progreso de la lesión de la pudrición
basal en el interior del estípite. a. avance longitu-
dinal. b. avance circular c.crecimiento micelial
sobre lesiones y aspecto turboso, granular de los
tejidos
a
b
c
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 48
medad se ha asociado con Ganoderma boni-
nenses, una de las más importantes en la
palma de aceite y especialmente en el Sureste Asiático.
A pesar de que no se ha confirmado sin
lugar a dudas, la presencia de Ganoderma
boninenses, en Colombia, estos resultados
indican que es necesario la implementación
de prácticas de manejo de esta clase de en-
fermedades, en todos los programas de reno-
vación de cultivos de palma de aceite en las diferentes áreas productoras en Colombia,
con el fin de evitar que estas se conviertan en
el futuro, en un nuevo limitante de la produc-
ción. Es muy importante para próximas inves-
tigaciones dedicar más esfuerzos a la identifi-
cación e inoculación de aquellos microorga-
nismos aislados de estructuras fructíferas conocidas como Basidiocarpos o carpóforos,
al igual que de los micelios que crecen sobre
lesiones propias de la enfermedad. Es por
esto que los microorganismos que no han
sido identificados en este estudio deben
generar la mayor atención.
Considerando que aún no se ha logrado
identificar todos los microorganismos asocia-dos con la pudrición basal del estípite en la
plantación Indupalma Ltda., en San Alberto,
Cesar, es necesario que se continúen estas
investigaciones.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen de manera especial a
las personas del Área de Fitopatología de
Cenipalma que contribuyeron para la realiza-ción de este trabajo y, a la Plantación Indu-
palma Ltda., al Fondo de Fomento Palmero y
al Centro de Investigación en Palma de Acei-
te, Cenipalma, por su apoyo en el desarrollo de esta investigación.
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i
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h
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g
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c
. b
.
Figura 6. Lesiones producidas en peciolos de palma. a. Neonothopanus nambi; b. Curvularia affinis; c.
Phlebia sp.; d. Thielaviosis paradoxa; e. Coprinopsis cinerea; f. Penicillium sp.; g. Nodulisporium sp.; h.
no identificado; i. Fusarium sp.
50
“FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA”
Órgano de difusión de la Asociación Colombiana de Fitopatología y Ciencias
Afines- ASCOLFI
ISSN 01120-0143
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2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
51
SELECCIÓN DE LEVADURAS FILOSFÉRICAS CON POTENCIAL
PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE Botrytis cinerea*
Alba Marina Cotes1, Jimmy Zapata1, Andrés Diaz1, Magda García1, Claudia Medina2,
Diana Cristancho2, Sonia Rodríguez3, Fernando Rodríguez3 y Daniel Uribe2
1Laboratorio de Control Biológico, Centro de Biotecnología y Bioindustria (CBB), CORPOICA. 2Laboratorio de Microbiología Agrícola,
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN). Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. 3 Laboratorio
de Microbiología Molecular, Centro de Biotecnología y Bioindustria (CBB), CORPOICA. *Autor para correspondencia: amcotes@corpoica.org.co
*Artículo científico, recibido para publicación el 08/04/2011; Aceptado el 18/08/2011, Galardonado con Mención de Honor del Premio Nacional de Fitopatología Rafael Obregón,
categoría profesional, Auspiciado por Bayer Crop Science, Colombia y otorgado durante el XXX Congreso Colombiano y
XVI Latinoamericano de Fitopatología Bogotá (Colombia) 19 de agosto de 2011
RESUMEN
Las levaduras epífitas actúan como colonizadores primarios en las superficies de las plantas constituyendo una barrera natural para las
infecciones producidas por patógenos foliares como Botrytis cinerea,
por lo que la capacidad de adherencia de éstas podría jugar un papel
determinante en su actividad biocontroladora. En el presente trabajo se evaluó en pétalos de rosa variedad Vendela la actividad biocontrolado-
ra contra B. cinerea de 124 aislamientos de levaduras obtenidas de de
hojas de mora. A los aislamientos seleccionados por presentar alta
actividad biocontroladora se les evaluó su adherencia en pétalos estan-darizando una técnica basada en el uso de microgotas. En el tratamien-
to patógeno se obtuvo una incidencia del 100% y un índice de severi-
dad (IS) de cuatro, si se tiene en cuenta que los pétalos se vieron afec-
tados en más de 95% de su área, mientras que en presencia de las levaduras se generaron cuatro grupos de respuesta, seleccionando
preliminarmente 48 aislamientos por presentar los más bajos IS (entre
0 y 0,87); al realizar nuevamente la evaluación con estos aislamientos,
se encontró que 37 de ellos mostraron consistencia de los resultados en el tiempo con un IS similar al obtenido anteriormente. De acuerdo con
los resultados obtenidos, se seleccionaron los aislamientos codificados
como Co3, F11, F14, Gr1, Gr2, Gr3, Gr20 Sb25, Sb27, Si6 y Si29, por
presentar la mayor inhibición del moho gris en los pétalos con un IS de 0 a 0,4. En relación con la adherencia de las levaduras, se generaron
tres grupos de respuesta, permitiendo seleccionar 13 aislamientos por
presentar porcentajes de adherencia superiores al 88%. Considerando
los criterios de actividad biocontroladora, adherencia e identidad molecular, más parámetros de interés generados en la literatura, tales
como su facilidad de producción y su baja o nula patogenicidad, se
seleccionaron los aislamientos Gr1 y Si6, identificados como Rhodoto-
rula glutinis como los más promisorios para futuros desarrollos.
Palabras claves: biocontrol, adherencia, moho gris, enfermedades,
postcosecha
SUMMARY
Selection of phyllosphere yeasts isolates as biocontrol agents
against Botrytis cinerea
Epiphyte yeasts act as primary colonizers on the surface of plants
forming a natural barrier for infections produced by foliar pathogens such as Botrytis cinerea. The adhesive capacity of these yeasts could
play an important role in their biocontrol activity. In this study the
biocontrol activity of 124 yeast strains, previously collected from
blackberry leaves, was evaluated on rose petals (Vendela variety). The isolates which presented a high effectiveness against B. cinerea were
evaluated using a technique based on micro-drops to determine their
adhesion to petals. In the pathogen treatment (without yeasts) an inci-
dence of 100% and a severity index (SI) of four were observed, taken into account that the petals were affected in more than 95% of their
area. Yeast isolates generated four response groups which lead to a
preliminary selection of 48 which showed the lowest SI (between 0
and 0,87) and upon a second evaluation 37 of these showed a consis-tent result in field trials with a SI similar to the one previously deter-
mined. From these results Co3, F11, F14, Gr1, Gr2, Gr3, Gr20 Sb25,
Sb27, Si6 and Si29 isolates were selected for showing the highest
inhibition of grey mold on the petals with a SI between 0 and 0,4. With regards to the adhesion of the yeasts, three response groups were
generated which allowed the selection of 13 isolates which showed
adhesion percentages above 88%. Based on the criteria of bio-
controlling activity, adhesion and molecular identity and additional parameters obtained from literature, such as easy production and their
low or null pathogenicity, isolates Gr1 and Si6, identified as Rhodoto-
rula glutinis were selected as the most promising for future develop-
ments.
Key Words: biological control, adhesion, plant diseases, gray mold,
postharvest
INTRODUCCIÓN
Botrytis cinerea, agente causal del moho gris
es uno de los patógenos foliares más impor-
tante a nivel mundial (Elad et al., 2004). El
control de este patógeno se ha basado en el uso de fungicidas; sin embargo, bajo ciertas
condiciones de presión de inoculo esta medi-
da no ha sido eficaz, sumado a problemas ambientales debido a su uso excesivo.
El uso de levaduras epifíticas ha demos-
trado resultados promisorios de control de
diferentes patógenos en postcosecha, incluido B. cinerea (Arras, 1996, Cheah et al., 1996;
Droby et al., 2009; Friedman et al., 2010;
Lima et al., 1997). Sin embargo, teniendo en cuenta que B. cinerea, también afecta de
forma significativa los cultivos a nivel de
campo y que bajo estas condiciones el efecto
del viento y de la lluvia pueden actuar negati-vamente en la persistencia de dichas levadu-
ras, es importante considerar la colonización
como un factor determinante sobre la capaci-dad de adhesión de las levaduras sobre la
superficie de las plantas, mediada por la
producción de cápsulas de polisacáridos
extracelulares (di Menna, 1959), proteínas glicosiladas con restos de manosa o manopro-
teínas (Buck y Andrews, 1999) y proteínas
denominadas floculinas que promueven la adhesión de la levadura entre las células y la
superficie en la cual se encuentran. Estos
polisacáridos se localizan en los sitios de
gemación y le ayudan a la levadura a tolerar plaguicidas y a metabolizar variedad de
nutrientes (Buck y Andrews, 1999; di Menna,
1959), característica que podría contribuir potencialmente a mejorar la eficacia en el
control biológico.
El presente trabajo tuvo como objetivo
seleccionar aislamientos de levaduras que, además de presentar alta actividad biocontro-
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 52
ladora contra B. cinerea, se adhieran eficien-temente a la superficie vegetal, lo que permi-
tirá en un futuro el desarrollo de productos
biológicos a base de las mismas, que permi-
tan su aplicación en condiciones de campo y de postcosecha.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos y medios de cultivo
Se seleccionaron 124 aislamientos de una
colección de levaduras del Laboratorio de
Control Biológico de la Corporación
Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica), aisladas en trabajos previos a
partir de hojas mora de castilla. Las levaduras
se cultivaron en agar extracto malta y
levadura (AEM) y se incubaron a 25°C durante 48 horas. El B. cinerea Bo-004,
suministrado por el Laboratorio de Control
Biológico de Corpoica, se cultivó en agar
papa dextrosa (PDA) y se incubó a 23°C durante 14 días.
Evaluación de la actividad biocontroladora
de los aislamientos seleccionados
Este ensayo se llevó a cabo utilizando pétalos
de rosa (Rosa centifolia) de la variedad
Vendela, la cual es susceptible al ataque de B.
cinerea. Las rosas se obtuvieron de un cultivo comercial de la Corporación Unidad
de Desarrollo, Investigación y Tecnología
(DIT) Flores La Conchita (Bogotá-
Colombia). Se trabajó con pétalos jóvenes tomados del interior de la cabeza de la flor,
evitando el uso de pétalos externos, ya que
estos podrían tener residuos superficiales de
fungicidas. Se preparó un inóculo mixto a una
concentración de 1x10 7 células.mL-1 para las
levaduras y de 1x104conidios.mL-1 para B.
cinerea. Posteriormente, los pétalos se inocularon aplicando una gota de 10 µL de la
suspensión de células de levaduras y conidios
del patógeno, colocándose a continuación
sobre una malla plástica en cámaras húmedas, dejándolas en incubación a temperatura
ambiente durante siete días.
Al final del período de incubación se eva-
luó la incidencia y la severidad de la enfer-medad. Para estimar esta última variable se
estandarizó una escala de la lesión producida
por el patógeno descrita en grados con un
rango de 0 a 4, siendo el grado 1 en donde se produjo hasta el 25% de área afectada, en el
grado 2 hasta el 50% , el grado 3 hasta 75% y
el grado 4 hasta el 100%. El índice de severi-
dad (IS) se calculó promediando el nivel obtenido en la escala de severidad para cada
uno de los 15 pétalos por tratamiento, tam-
bién se determinó la incidencia. En este ensayo se evaluaron individual-
mente todas las levaduras y se contó con un
testigo relativo inoculado con agua destilada
estéril y un testigo absoluto. El experimento
se estableció en un diseño experimental completamente al azar por triplicado; la
unidad experimental consistió de una cámara
húmeda con cinco pétalos. Con los resultados
obtenidos en la prueba se seleccionaron aquellos aislamientos que presentaron la
mayor actividad biocontroladora; siguiendo la
metodología descrita anteriormente, se repitió
una vez más la evaluación con el fin de de-terminar la consistencia en el control de B.
cinérea. Los análisis estadísticos consistieron
de una ANOVA y una comparación de me-
dias utilizando la prueba de Tukey (P<0,05).
Determinación de la adherencia de las
levaduras seleccionadas
Esta determinación se realizó con 48 aisla-mientos seleccionados en la etapa anterior por
presentar alta actividad biocontroladora
contra B. cinerea en pétalos de rosa.
Para realizar el análisis se tomaron cinco secciones circulares de pétalo de rosa de 0,75
cm de diámetro por tratamiento, las cuales se
inocularon aplicando una gota de 10 µL de la
suspensión de cada una de las levaduras ajustada a una concentración de 1x107 célu-
las.mL-1. Se colocaron sobre una servilleta
estéril y se sometieron a la corriente de aire
estéril de una cabina de flujo laminar durante 45 minutos.
Los pétalos secos se colocaron en un tubo
de ensayo con nueve mL de agua destilada
estéril. En seguida se agitaron por tres veces en un agitador Vortex a máxima velocidad
durante nueve segundos. Luego se tomaron
10 µL de cada uno de los tubos y se sembra-
ron en una caja con AEM, formando cuatro cuadrantes, y empleando tres microgotas
separadas por cuadrante.
El crecimiento de las levaduras, en uni-
dades formadoras de colonia finales (UFCf), se calculó mediante la siguiente ecuación:
UFCf = P x D x 100
En donde: P es el promedio de UFC por
microgota, D es el inverso de la dilución
realizada, 100 el factor de corrección relacio-
nado con la siembra de 10 µL por microgota. Para el cálculo del porcentaje de adheren-
cia se utilizó la siguiente fórmula:
% Adherencia = {[(UFCsm) – (UFCf)]/
(UFCsm)} x 100
UFCsm corresponde al número de unidades
formadoras de colonia en la suspensión origi-
nal. Con los resultados obtenidos se realizó un
análisis de agrupamiento (análisis de clusters)
utilizando el Programa SAS, versión 9.0. Se utilizó la técnica del vecino más cercano con
distancia métrica Euclidiana limitando los
resultados a tres agrupamientos, en función
de la magnitud de la adherencia presentada experimentalmente para las 48 accesiones de
levaduras. El número óptimo de agrupamien-
tos se determinó previo análisis de la gráfica
de Distancia de Aglomeración. Los agrupa-mientos se conformaron con las accesiones
que presentaban características de adherencia
similares.
Identificación molecular de los aislamien-
tos seleccionados
Se realizó la identificación de 11 aislamientos de levaduras filósféricas seleccionadas en
etapas previas. Éstas se sometieron a creci-
miento, extracción de ADN, y la amplifica-
ción y secuenciación de parte de la Subuni-dad Larga (LSU) del 26S de ADNr, siguiendo
los protocolos previamente estandarizados
por Butinar et al., 2005.
Matriz de decisión para la selección de las
levaduras con potencial para futuros desa-
rrollos
Para determinar las accesiones más promiso-
rias se aplicaron tres tipos de criterios discri-
minados así:
Criterio ecofisiológico, relacionado con la
adherencia. Los resultados experimentales se normalizaron para generar un índice de selec-
ción para el criterio.
Criterios de actividad biocontroladora, se
tuvieron en cuenta los resultados obtenidos
tanto en incidencia como en el índice de severidad; de acuerdo con un análisis previo,
a cada uno de estos dos factores se le asignó
un valor igual. Los resultados experimentales
se normalizaron para generar un índice de selección para este criterio.
Criterio tecnológico, expresado como la
probada capacidad a nivel de laboratorio para
la obtención de biomasa de cada una de las
accesiones identificadas, lo que facilitaría llevar a cabo su producción masiva con base
a la información generada en la literatura.
Para la determinación cuantitativa se realizó
un análisis de la información disponible en la base de datos Science Direct (www.scienc
edirect.com), que posee reconocimiento
mundial y que contiene numerosas publica-ciones en el área de microbiología, ingeniería
y bioprocesos. Las referencias obtenidas se
normalizaron para las especies de levaduras
identificadas hasta especie para generar un índice de selección para este criterio.
Criterio de patogenicidad, dadas las
características patogénicas para mamíferos de
algunos géneros de levaduras, que limitarían
su aplicación para el desarrollo de un biopla-guicida, se realizó un análisis de la informa-
ción disponible en la base de datos Springer
Link (www.springerlink.com) y MedLine
(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/), que pose-en los registros de infecciones o riesgos para
la salud causados por microorganismos. Por
tanto, en función de la patogenicidad se
generó la siguiente escala para cuantificar el índice de selección asociado: 1 para accesio-
nes no patogénicas, 0,5 para accesiones con
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
53
carácter de parásito facultativo y 0 para acce-siones patogénicas o de alto riesgo para
mamíferos.
Paralelamente, un grupo de expertos en
los temas relacionados con los criterios en mención, llegó a un consenso acerca de la
importancia relativa de cada uno de estos
factores y generó, mediante una técnica de
comparación por pares, un índice de peso o importancia para cada uno (Tabla 1).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación de la actividad biocontroladora
de los aislamientos seleccionados
Se generó una escala de severidad de la
infección causada por B. cinerea en pétalos
de rosa (Figuras 1 y 2). B. cinerea en ausencia de las levaduras, infectó los pétalos
produciendo los primeros síntomas de la
enfermedad (lesiones necróticas) después de
24 h, lo cual es concordante con lo reportado por Salinas et al., 1989 (Figura 1A), a medida
que trascurrió el período de incubación,
aumentó el tamaño de la lesión, alcanzando
entre el quinto y sexto día un tamaño superior al 95% del área del pétalo, además de
presentarse esporulación (Figuras 1b a 1d).
De los 124 aislamientos evaluados, 121
presentaron algún nivel de control del moho gris en los pétalos comparado con el testigo
B. cinerea (a excepción de los aislamientos
F8, Sb9 y Co11 que presentaron una inciden-
cia de 100% y un IS igual o similar al testigo B. cinerea (resultados no mostrados). Consi-
derando que las levaduras son el mayor com-
ponente de la microflora epifítica en las
superficies vegetales, que crecen de forma saprofítica en una gran variedad de sustratos
y que están adaptadas a las condiciones am-
bientales presentes en la filósfera (Andrews y
Back, 2004), podría asumirse que éstas pue-dan establecerse rápidamente sobre los péta-
los, desarrollándose y multiplicándose al
consumir los nutrientes presentes en la super-
ficie de estos, fenómeno que por competencia limitaría la germinación de los conidios de B.
cinerea (Elad, 1996, Elmer y Reglinski,
2006).
Con los resultados obtenidos se generaron cuatro grupos de respuesta de acuerdo con el
nivel en la escala de severidad, correspon-
diendo el grupo 1 a los aislamientos que
presentaron un IS de 0 a 0,99, el grupo 2 a
aislamientos con un IS de 1 a 1,99, el grupo 3 a los aislamientos con un IS de 2 a 2,99 y el
grupo 4 a los aislamientos con un IS de 3 a 4
(Figura 3).
Las levaduras ubicadas en el grupo uno (48 aislamientos) fueron aquellas que presen-
taron mayor actividad biocontroladora, repre-
sentada por un IS de 0 a 0,87. De estos se
destacaron los aislamientos Gr10 y Sb27 que inhibieron al patógeno en un 100%, puesto
que no se presentaron lesiones en los pétalos,
para el resto de los aislamientos de este gru-
po, la incidencia obtenida estuvo entre 0 y
87%. Aunque este rango incluyó cifras altas de incidencia, dado que el IS fue bajo, lo que
significa que el tamaño de la lesión provoca-
da por el patógeno en la mayoría de los péta-
los se ubicó en el grado 1 de la escala de severidad (nunca superó el 25% del área del
pétalo), se mantienen estos aislamientos
como promisorios, si se tiene en cuenta
además que se observaron diferencias signifi-cativas tanto para la incidencia como para la
severidad (Tabla 2).
Tabla 1. Índice de peso relativo por criterio de
selección
Criterio
Índice de
peso
relativo
Ecofisiológico (Adherencia) 0,2
Actividad biocon-
troladora
Incidencia
0,4 Índice de
severidad
Potencial Tecnológico 0,25
Toxicología (Patogenicidad en
mamíferos) 0,15
Total 1
a b
d
Figura 2. Escala de severidad
del moho gris en pétalos de
rosa.
a. Grado 0
b. Grado 1
c. Grado 2
d. Grado 3
e. Grado 4
c
e
Figura 1. Desarrollo del moho gris en pétalos de rosa, B. cinerea se inoculó en una concentración de
1x104conidios.mL-1. a. Primeros síntomas del moho gris después de 24 h de incubación; b. Aumento de la
lesión después de tres días de incubación; c. Lesión después de cinco días; d. Pétalo completamente
necrosado, además se observa esporulación de B. cinerea en la parte superior del pétalo después de seis
días de inoculación.
a b
c d
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 54
Al realizar segunda evaluación de la acti-
vidad biocontroladora contra B. cinerea, de
los 48 aislamientos del grupo uno selecciona-dos en la etapa anterior, se observó que sola-
mente 37 de ellos mostraron un efecto repeti-
ble de control del patógeno. Estos presenta-
ron las menores incidencias y severidad, expresados con IS entre 0 y 0,7. En relación
con los aislamientos restantes, con 16 se
observó un IS entre 1 y 1,9 y con 2 se obtuvo
un IS entre 2 y 3. Teniendo en cuenta estos resultados, se seleccionaron los aislamientos
F11, F14, Sb25, Sb27, Co3, Si6, Si 29, Gr1,
Gr2, Gr3 y Gr20 por presentar las menores
diferencias en el tiempo (0,2), y los menores
IS (entre 0 y 0,37) (Tabla 3). La incidencia
presentó un comportamiento similar al obte-nido en el primer bioensayo con porcentajes
de 3% para el aislamiento Gr20 y del 36%
para el aislamiento F14.
Las levaduras evaluadas en este estudio controlaron efectivamente a B. cinerea, indi-
cando que podrían ser utilizadas en campo,
evitando de esta manera la infección quies-
cente y el posterior desarrollo del patógeno en postcosecha. Otros autores encontraron
resultados de control similares en diferentes
especies vegetales, Peng y Sutton (1991)
reportaron la reducción del moho gris en un 53-79% en frutos de fresa, mediante aplica-
ciones de Rhodotorula glutinis, levadura
aislada de foliolos de fresa. En otro estudio
R. glutinis y Cryptococcus sp., aisladas de hojas de trigo también mostraron ser efectivas
en el control de patógenos foliares como
Septoria tritici y Bipolaris sorokiniana, ya
que redujeron la esporulación de estos pató-
genos en 69% y la severidad hasta en un 85%
(Parrello et al., 2002).
Adherencia de las levaduras seleccionadas
a los pétalos de rosa
En el primer agrupamiento, en el que se
ubicaron las levaduras que presentaron alta adherencia a la superficie de los pétalos de
rosa, se ubicaron 13 accesiones de levadura
con magnitudes entre el 88,57% y el 99,47.
(Tabla 4) En el segundo agrupamiento (ad-herencia intermedia) se ubicaron 34 accesio-
nes de levadura con magnitudes entre el
50,40% y el 82,80%, equivalentes a un 70,8%
del total de las accesiones evaluadas, mien-tras que en el tercer agrupamiento se ubicó la
accesión codificada como Gr21 con adheren-
cia de 46,40%.
Los resultados obtenidos se graficaron en forma de dendograma (Figura 4) para ilustrar
la distancia relativa entre las levaduras y la
constitución de cada uno de los agrupamien-
tos. Considerando que la rápida y eficiente
adhesión de los microorganismos a la super-
ficie foliar es el primer paso requerido para la
colonización de ésta (Buck y Andrews, 1999) y que para ejercer un control biológico efec-
tivo se requiere de la persistencia del agente
de biocontrol en el sitio de acción del patóge-
no (Droby et al., 2009), de los resultados obtenidos para el factor adherencia se puede
concluir que las accesiones de levadura ubi-
cadas en el grupo de respuesta alta son las más promisorias para el desarrollo de un
bioplaguicida, teniendo en cuenta la forma de
aplicación y las características del cultivo en
Tabla 2. Eficacia en el control de B. cinerea en pétalos de rosa de los aislamientos de levadura selecciona-
dos
Accesión (%)
Incidencia
Índice de
severidad Accesión
(%)
Incidencia
Índice de
severidad
B. cinerea 100a 3,93a Gr21 33h 0,53b
Co3 13k 0,13b Gr22 13k 0,33b
Co7 40g 0,67b Gr26 20j 0,20b
F11 27i 0,33b Sb11 33h 0,33b
F13 67c 0,93b Sb12 13k 0,21b
F14 33h 0,33b Sb16 20j 0,47b
F16 67c 0,87b Sb25 20j 0,20b
F18 73b 0,87b Sb27 0m 0c
F20 67c 0,80b Sb28 13k 0,13b
F22 60d 0,87b Sb29 67c 0,73b
F32 53e 0,80b Sb30 60d 0,60b
F34 53e 0,53b Sb32 7l 0,07b
F43 33h 0,33b Sb33 33h 0,53b
F44 60d 0,73b Sb34 13k 0,27b
Gr1 20j 0,20b Sb35 13k 0,27b
Gr2 7l 0,07b Si1 40g 0,40b
Gr3 13k 0,27b Si4 67c 0,87b
Gr4 73b 0,93b Si6 27i 0,27b
Gr7 67c 0,87b Si8 67c 0,67b
Gr8 73b 0,93b Si12 60d 0,60b
Gr10 0m 0c Si15 67c 0,73b
Gr11 7l 0,07b Si21 67c 0,87b
Gr15 40g 0,60b Si26 47f 0,80b
Gr17 73b 0,93b Si29 13k 0,33b
Gr20 7l 0,07b
Los valores promedio de incidencia y de severidad seguidos por diferentes letras son significativamente
diferentes de acuerdo con el análisis de comparación de medias aplicando la prueba de Tukey (P < 0,05)
Tabla 3. Levaduras seleccionadas por su consis-
tencia en los bioensayos realizados
Accesión (%)
Incidencia
Índice de
severidad
B. cinerea 100a 3,93a
Co3 16bc 0,17b
F11 36b 0,37b
F14 36b 0,37b
Gr1 16bc 0,17b
Gr2 26bc 0,27b
Gr3 29bc 0,30b
Gr20 3c 0,03b
Sb25 30bc 0,30b
Sb27 13bc 0,13b
Si 6 29bc 0,30b
Si 29 33bc 0,33b
Los valores promedio de incidencia y de severi-
dad seguidos por diferentes letras son significati-
vamente diferentes de acuerdo con el análisis de
comparación de medias aplicando la prueba de
Tukey (P < 0,05).
0
10
20
30
40
50
60
Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4
Nivel
Nú
me
ro d
e a
isla
mie
nto
s
Figura 3. Grupos de respuesta de actividad biocontroladora de las levaduras de acuerdo con el nivel de
severidad del moho gris observado en pétalos de rosa después de siete días de incubación.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
55
el que se presente el moho gris.
Identificación molecular de levaduras
seleccionadas
El ADN de todos los aislamientos se pudo
amplificar y secuenciar usando la pareja de
primers NL1-LR6, obteniendo amplicones
secuenciados de aproximadamente 800pb. Comparando con bases de datos del NCBI y
CBS, se lograron identificar hasta especie 10
accesiones de levadura y una accesión hasta
género (Tabla 5).
Matriz de decisión para la selección de las
levaduras con potencial para futuros desa-
rrollos
En las etapas previas se seleccionaron 13
aislamientos por su alta adherencia a los
pétalos de rosa y 11 aislamientos de levadura por su alta actividad biocontroladora, corres-
pondientes a Rhodotorula spp., Cryptococcus
sp., Pseudozyma tsukubaensis, Pichia ony-
chis, Debaryomyces hansenii y Occultifur externus (Tabla 6). Teniendo en cuenta la
adherencia, la actividad biocontroladora y
los parámetros tecnológicos y de patogenici-
dad mencionados anteriormente, la matriz de decisión utilizada permitió determinar que las
accesiones codificadas como Gr1 y Si6
(Rhodotorula glutinis) fueron las más promi-
sorias para el desarrollo futuro de un biopla-guicida; esto se sustenta en la magnitud del
índice de selección estandarizado que pre-
sentó una diferencia de menos de 3% entre
estas dos accesiones. De otra parte, el resto de accesiones presentó un índice de selección
estandarizado que estuvo entre el 34,04% y
51,39% por debajo del obtenido con la mejor
accesión (Tabla 6). Sin embargo para el desarrollo de un bio-
plaguicida a base de alguna de las levaduras
que presentó altos rendimientos para las
variables evaluadas, es necesario desarrollar estudios de producción masiva, formulación y
evaluación de la eficacia de los prototipos
desarrollados en el control de B. cinerea bajo
condiciones controladas y cultivos comercia-les como flores y mora.
CONCLUSIONES
Once de los trece aislamientos de levadura
seleccionados por presentar alta adherencia a los pétalos de rosa, presentaron alta actividad
biocontroladora.
Teniendo en cuenta los parámetros de ac-tividad biocontroladora, adherencia e identi-
ficación molecular hasta especie, así como
los reportados en la literatura como facilidad
de producción y su baja o nula patogenicidad en mamíferos, se seleccionaron los aislamien-
tos Gr1 y Si6, identificados como R. glutinis
como los más promisorios para futuros desa-
rrollos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a COLCIENCIAS por
el apoyo financiero otorgado en el marco del
proyecto “Estudio de la diversidad funcional
de levaduras habitantes de la superficies foliar en mora y su relación con el control
biológico de Botrytis cinerea”. Contrato
número 204-2005. También expresan sus
agradecimientos a la Corporación Unidad de Desarrollo, Investigación y Tecnología (DIT)
Flores La Conchita, por suministrar las rosas
con las cuales se desarrolló este trabajo.
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Tabla 4. Adherencia de los aislamientos de levadura seleccionados a pétalos de rosa
Accesión Grupo Adherencia (%) Accesión Grupo Adherencia (%)
F11 Alto 91,35 Gr8 Medio 79,38
F13 Alto 95,61 Gr10 Medio 68
F14 Alto 99,2 Gr11 Medio 72,6
F18 Alto 98,39 Gr15 Medio 64,3
F20 Alto 95,75 Gr17 Medio 57,9
F32 Alto 99,47 Gr20 Medio 77,8
Gr1 Alto 94,2 Gr22 Medio 68,9
Sb11 Alto 99,34 Gr26 Medio 64,6
Sb12 Alto 95,84 Sb16 Medio 82,8
Si1 Alto 94,64 Sb25 Medio 51,14
Si4 Alto 88,57 Sb27 Medio 60,6
Si12 Alto 93,85 Sb28 Medio 64
Si15 Alto 89,67 Sb29 Medio 54,6
Co3 Medio 55,88 Sb30 Medio 69,8
Co7 Medio 55,88 Sb32 Medio 76,5
F16 Medio 78,02 Sb33 Medio 71,3
F22 Medio 55,88 Sb34 Medio 63,11
F34 Medio 52,7 Sb35 Medio 77
F43 Medio 50,4 Si6 Medio 55,88
F44 Medio 74,7 Si8 Medio 54,54
Gr2 Medio 78,4 Si21 Medio 73,36
Gr3 Medio 78,25 Si26 Medio 69,58
Gr4 Medio 68,4 Si29 Medio 66
Gr7 Medio 71,2 Gr21 Bajo 46,4
Distancia
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Co
3
Co
7
Sb11
Sb12
Sb16
Sb25
Sb27
Sb28
Sb29
Sb30
Sb32
Sb33
Sb34
Sb35
F11
F13
F14
F16
F18
F20
F22
F32
F34
F43
F44
Si1
Si4
Si6
Si8
Si12
Si15
Si21
Si26
Si29
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr7
Gr8
Gr10
Gr11
Gr15
Gr17
Gr20
Gr21
Gr22
Gr26
Figura 4. Análisis de agrupamiento de las levaduras seleccionadas por su adherencia a los pétalos de rosa.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 56
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Tabla 5. Comparación e identificación de los aislados de levaduras, por medio de BLAST comparados con las bases de datos NCBI y CBS.
Accesión Identificación más
cercana / Cepa
GenBank NCBI CBS Database
Designación de especie,
No. de accesión (%) E
Designación de espe-
cie, No. de accesión (%) E
Co3 Rhodotorula mucilaginosa
CRUB 1027
Rhodotorula mucilaginosa
AY158651.1 100 0,0 Rhodotorula mucilaginosa 100 0,0
F11 Pichia onychis
NRRL Y-7123
Pichia onychis
U75421.1 98 0,0 Pichia onychis 98,26 0,0
F14 Pichia onychis
NRRL Y-7123 Pichia onychis U75421.1 98 0,0 Pichia onychis 99,15 e-155
Gr1 Rhodotorula glutinis Rhodotorula glutinis AF335985 100 0,0 Rhodotorula glutinis 100 0,0
Gr2 Pseudozyma tsukubaensis
Pseudozyma tsukubaensis AJ235297.1 99 0,0
Pseudozyma tsukubaensis
CBS 6389 99,56 0,0
Gr3 Cryptococcus sp.
Cryptococcus sp. AF444699.1 100 0,0 Cryptococcus sp. CBS 8363 100 0,0
Gr20 Rhodotorula mucilaginosa
UWFP-373 Rhodotorula mucilaginosa AF335987
97
0,0 Rhodotorula mucilaginosa 97,16 0,0
Sb25 Rhodotorula mucilaginosa
UWFP-373
Rhodotorula mucilaginosa
AF335987.1
100
0,0 Rhodotorula mucilaginosa 99,6 0,0
Sb27 Occultifur externus Occultifur externus AY745723
100
0,0
Occultifur externus
CBS8732 100 0,0
Si6 Rhodotorula glutinis
ATCC 32765 Rhodotorula glutinis AF335985.1
100
0,0 Rhodotorula glutinis 100 0,0
Si29
Debaryomyces hansenii var.
fabryi
CECT 11957
Debaryomyces hansenii AY167604.1
100
0,0 Debaryomyces hansenii 100 0,0
NI, No Identificado % de similaridad: porcentajes < 97 no se tienen en cuenta Valor E: los valores > 0.0 no se tienen en cuenta (Ej: e-170) ; NRRL – Agricultural Research Service Culture Collection, USA; UWFP – University of Washington Fungal Project; CECT – Colección Española de Cultivos Tipo; CBS – Centraalbure-
au voor Schimmelcultures, Databases.; CRUB – Centro Regional Universitario Bariloche
Tabla 6. Índice de selección obtenido para 11 accesiones de levadura con potencial biocontrolador
Código
cepa Identificación
Índice de
selección
final
Índice de selección
final estandarizado
(%)*
Gr1 Rhodotorula glutinis 0,14189 100
Si6 Rhodotorula glutinis 0,13847 97,59
Gr3 Cryptococcus sp. 0,09359 65,96
Sb25 Rhodotorula mucilaginosa 0,08744 61,62
Co3 Rhodotorula mucilaginosa 0,08248 58,13
Gr2 Pseudozyma tsukubaensis 0,08126 57,27
Gr20 Rhodotorula mucilaginosa 0,0808 56,95
F14 Pichia onychis 0,07897 55,66
F11 Pichia onychis 0,07703 54,29
Si 29 Debaryomyces hansenii var. fabryi 0,06909 48,69
Sb27 Occultifur externus 0,06897 48,61
*La estandarización se realizó con respecto al mejor índice de selección final obtenido
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
57
PROCESO INFECTIVO DE LA MANCHA DE ACEITE CAUSADA POR
Xanthomonas axonopodis EN GULUPA (Passiflora edulis Sims)*
Solange Benítez, Wadith de León, Lina Farfán, Sandra Castillo y Lilliana Hoyos Carvajal1
1Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá. Laboratorio de fitopatología. Facultad de Agronomía.
Autor para correspondencia: limhoyosca@unal.edu.co
*Artículo científico, recibido para publicación el 08/04/2011; Aceptado el 18/08/2011, Galardonado con el Premio Nacional de Fitopatología Rafael Obregón, categoría profesional,
Auspiciado por Bayer Crop Science, Colombia y otorgado durante el XXX Congreso Colombiano y XVI Latinoamericano de Fitopatología Bogotá (Colombia) 19 de agosto de 2011.
RESUMEN La gulupa (Passiflora edulis), así como muchas otras pasifloras, es
atacada por diferentes grupos de microorganismos, entre los que se
incluyen hongos, bacterias, virus y nematodos, que le ocasionan en-
fermedades; reduciendo, la calidad y volumen de los frutos para expor-
tación; además de afectar su ciclo productivo y en consecuencia au-
mentar los costos de la inversión en manejo y control. Uno de estos
microorganismos es la bacteria Xanthomonas axonopodis, agente
causal de la mancha de aceite o bacteriosis. Para determinar el avance de la bacteria en el tejido de gulupa, se desarrolló una escala visual de
progresión de síntomas, para determinar el periodo de incubación y
dinámica del inóculo, ubicación en tejidos y distribución en órganos.
Se observó que el periodo de incubación es de aproximadamente cinco días (humedad relativa del 80% y temperatura de 20-25°C), pre-
sentándose clorosis en el área de inoculación. En cuanto a dinámica
del microorganismo en el tejido, a los cinco días, la población en el
punto de inoculación es de 2x104 UFC/4cm2 posteriormente, se incre-menta a 1x108 UFC/4cm2, presentándose una clorosis pronunciada. A
los 17 días pos-inoculación el tejido llega a su máximo de células
bacterianas 2x109 UFC/4cm2, y a continuación la bacteria se dispersa
a otros tejidos, observándose síntomas en hojas adyacentes al tejido inoculado, también en tallos y zarcillos, indicando el movimiento del
patógeno a través de los haces vasculares. Esto fue corroborado por
análisis histológicos y tinción de Gram in situ. Por lo anterior, se
considera que la enfermedad es de carácter sistémico y de rápido avance en la planta.
Palabras claves: frutales, bacteriosis, infección
SUMMARY The purple passion fruit (Passiflora edulis), and many other Passiflora,
is attacked by different groups of microorganisms, among which are
including fungi, bacteria, viruses and nematodes which will cause
diseases, reducing the quality and volume of fruit for export , as well
can affect the productive cycle and therefore increase costs in man-
agement and control. One of these organisms is the bacteria Xantho-
monas axonopodis, causal agent of bacterial oil spot. To determine the
advance of the bacterium in gulupa tissue, was developed a visual scale of the progression of symptoms, to determinate the period of
incubation and inoculum dynamics, location and distribution in tissue
organs. Was noted that the incubation period is approximately five
days (relative humidity 80% and temperature of 20-25 ° C), chlorosis appear in the inoculation area. With regard to dynamics of the organ-
ism in tissue, after five days, the population in the inoculation is 2x104
UFC/4cm2 then is increased 1x108 UFC/4cm2, showing a pronounced
chlorosis. At 17 days post-inoculation the tissue reaches its maximum of bacterial cells 2x109UFC/4cm2, and then, the bacteria spreads to
other tissues, noting symptoms in inoculated tissue adjacent leaves,
also stems and tendrils indicating movement pathogen through the
vascular vessels. This was confirmed by histological analysis and Gram stain in situ. Therefore, is considered that the disease is systemic
and rapid progress in the plant.
Keywords: fruits, bacterial disease, infection
INTRODUCCIÓN
La gulupa (Passiflora edulis Sims), en Co-
lombia, se ha ubicado entre las principales
frutas de exportación después del banano y la
uchuva (Jiménez et al., 2009). Se exporta hacia Alemania, España, Bélgica, Francia y
Suiza entre otros y en América a Canadá y
Estados Unidos principalmente (Rubio y
Gómez, 2008, Miranda et al., 2009). La fruta posee características organolép-
ticas y contenido nutricional de interés en el
sector agroindustrial y apta para el consumo
fresco (Pinzón, 2007).
Debido a la expansión del cultivo se ha
incrementado la incidencia de varias enfer-
medades, entre las cuales se encuentra la
mancha de aceite; esta ha disminuido el volumen de producción limitando la oferta de
la fruta para su exportación, pero principal-
mente, demeritando su calidad. El agente
causal, Xanthomonas axonopodis, fue identi-ficado por primera vez por Pereira (1969) en
Brasil; en Colombia se registró en cultivos de
maracuyá en 1995 (Castillo y Granada,1995). La sintomatología característica de la enfer-
medad se observó en el sur de Sumapaz
(Cundinamarca), una de las zonas de alta
producción en donde los niveles de inci-dencia en lotes afectados pueden llegar hasta
el 95% (Mora et al., 2009), reduciendo con-
siderablemente las áreas productivas (Miran-
da et al., 2009). Benítez (2010), confirmó la identidad del agente causal en Colombia
mediante pruebas biológicas, bioquímicas y
moleculares concluyendo que se trata de X.
axonopodis, pero descartando temporalmente que se trate del patovar passiflorae de X.
axonopodis, debido a que en las pruebas
experimentales con marcadores moleculares
específicos diseñados por Munhoz (2009) no se observó el mismo patrón de amplificación
reflejado en tal investigación, tampoco así en
las pruebas biológicas preliminares.
La sintomatología observada en campo de la enfermedad es bastante diversa e incluye
lesiones foliares pequeñas, cloróticas, aceito-
sas, translúcidas y con halos visibles, siendo más prevalentes las manchas foliares de color
amarillo con exudado aceitoso (Benítez y
Hoyos-Carvajal, 2009). Cuando evolucionan,
estas lesiones se tornan necróticas y con bordes difusos en toda la lámina foliar, des-
prendimiento del peciolo y presencia de otras
lesiones en diferentes órganos de la planta
tales como tallos o frutos (Benítez y Hoyos-Carvajal, 2009; Monteiro de Campos, 2001;
Pinto et al., 2003). Benítez, (2010) determinó
el avance de la enfermedad, encontrando que
a partir el día 45 pos-inoculación los órganos afectados presentaban una severidad mayor
del 80% de acuerdo a la escala de Castillo et
al., (2009).
De acuerdo a las observaciones en campo y análisis preliminares de la enfermedad, se
ha considerado que esta podría ser de carácter
sistémico y de rápido avance en la unidad
productiva, lo cual indica que las medidas de control deben ser inmediatas una vez se
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 58
observen los síntomas iniciales para evitar la dispersión de la bacteria a otras plantas. El
modo de infección de este agente bacteriano
podría ser similar al de otras especies de
Xanthomonas en aspectos como la dispersión hacia diferentes órganos de la planta; sin
embargo, no se dispone de información al
respecto. Por tanto, el propósito del presente
trabajo fue determinar el proceso infectivo de la enfermedad con pruebas de patogenicidad
y análisis histopatológicos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Determinación de avance de síntomas en
plantas de gulupa
Las pruebas para determinar el avance de los síntomas de de la enfermedad se realizaron
en plantas de gulupa de dos a cuatro meses de
edad utilizando ocho aislamientos de
Xanthomonas axonopodis (FAB-145,FAB-146,FAB-147, FAB-148,FAB-149, FAB-150,
FAB-151, FAB-152). Cada aislamiento se
inoculó en tres plantas, para el control abso-
luto se inyectó agua destilada estéril. Las plantas se ubicaron en el invernadero de la
Facultad de Agronomía de la Universidad
Nacional de Colombia, sede Bogotá. Para las
inoculaciones se emplearon los métodos de inyección con émbolo y corte de tijeras ino-
culando suspensiones bacterianas de
D.O600nm: 0,2 (1,0 x 108 a 3,8 x 10 8
UFC/mL), realizando el procedimiento en las hojas siguientes a las yemas o puntos de
crecimiento. Las plantas se mantuvieron a
una humedad relativa del 80% y temperatura
de 20-25°C por cinco semanas.
Las evaluaciones de progresión de sínto-
mas se realizaron a partir del día de inocula-
ción y luego cada dos días hasta completar
tres semanas mediante una escala visual diseñada para este propósito (Figura 1).
Evaluación de la dinámica poblacional del
inóculo bacteriano
Para la evaluación de la dinámica poblacional
de la bacteria se usaron dos cepas de X. axo-
nopodis, FAB-147 y FAB-151, seleccionadas por obtener en pruebas anteriores un avance
rápido de síntomas en el hospedero. Se rea-
lizó una inoculación en el envés de la hoja
con suspensiones bacterianas de 1 X 108 UFC/mL cubriendo una zona de 0,5 mm de
diámetro. Para el análisis se tomaron discos
de tejido con un sacabocados de 22 mm de
diámetro cada dos días a partir del día uno hasta 15 días pos-inoculación (Castañeda
2005, Robinson et al., 2006 y Zuleta et al.,
2002). Después de desinfectar los tejidos se maceraron en una caja de Petri estéril con un
mL de agua destilada estéril, tomándose 100
µL para realizar diluciones seriadas hasta
llegar a 10-10, estas soluciones se sembraron en Agar nutritivo y se realizó la lectura de
concentración bacteriana por conteo de uni-dades formadoras de colonias UFC, con esto
luego se efectuaron los cálculos matemáticos
para determinar la concentración de bacterias
en el tejido.
Análisis de cortes histopatológicos
Con lesiones obtenidas de las pruebas de patogenicidad, se realizaron análisis histoló-
gicos mediante la técnica de cortes en parafi-
na de Smith y Dickey (1981) en hojas y
tallos infectados con los aislamientos de X. axonopodis FAB-145, FAB-146 y FAB-149.
Para tal fin, se tomaron fragmentos de cinco mm de cada lesión y se sometieron a un
proceso de fijación (Smith y Dickey, 1981)
en una solución de Formalina- Alcohol-
Acetona (FAA) por 24 h. Luego, se llevó a cabo un proceso de deshidratación con cinco
cambios de alcohol a concentraciones ascen-
dentes cada una por 24 h.
Posteriormente, se realizó una imbibición con cuatro cambios distintos de vol/vol de
tert-butanol: alcohol 96% y una inclusión con
parafina, de la cual se tomaron bloques con el
fin de realizar los cortes a seis micrones en un micrótomo de rotación tipo Minot, Modelo
Figura 1. Escala de evaluación visual utilizada en las pruebas de patogenicidad para el seguimiento de
progresión de síntomas.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
59
Spencer 820 en el laboratorio de Fitopatolog-ía de la Facultad de Agronomía de la Univer-
sidad Nacional de Colombia.
Después de la fijación en láminas porta-
objetos de los cortes, se realizó la coloración de Brown-Hopps, la cual es una modificación
de la tinción de Gram en donde se fijan las
bacterias a las superficies con una solución
1:1 ácido pícrico-acetona (Prophet et al., 1995).
RESULTADOS Y DISCUSION
Determinación de avance de síntomas en
plantas de gulupa
De acuerdo con las pruebas de patogenicidad
desarrolladas con X. axonopodis en este
estudio, los métodos de inoculación de infil-
tración y corte de tijeras permitieron una penetración eficiente en los tejidos de las
bacterias utilizadas (Tabla 1).
El método de infiltración asemeja a la pe-
netración que hacen las fitobacterias, que ocurre frecuentemente por la vía estomática o
por los hidátodos (Ploetz, 2003), y que les
facilita entrar en los espacios intracelulares
del mesófilo (Ruz et al., 2008); una vez en el apoplasto pueden iniciar su multiplicación y
expresar factores de patogenicidad. Entre las
estrategias de ataque al hospedero por parte
de Xanthomonas está la secreción de poli-
sacáridos extracelulares (PE) que desempe-
ñan un papel importante en la colonización
del tejido. Estos PE al interactuar con las
células del hospedante, pueden formar un gel
favoreciendo la adhesión a ellas y poder así secretar efectores respectivos de virulencia
(Goodman y Novacky, 1994).
En contraste, la inoculación con corte de
tijeras, permite la entrada fácilmente al tejido y a las nervaduras por el daño invasivo gene-
rado. Las heridas ocasionadas en los tejidos
ayudan a los fitopatógenos a establecer la
enfermedad severa y aún más si la concentra-
ción bacteriana es mayor (Agrios, 2005),
pudiéndose observar síntomas cercanos a las
nervaduras, pudriciones del peciolo y sínto-
mas en tallos adyacentes más rápidamente, en comparación con el anterior método de inocu-
lación, lo que lo hace un método eficiente
para este tipo de evaluaciones (Zuleta et al.,
2002). No obstante, con el método de infil-tración (Figura 2) se inocula una concentra-
ción conocida de bacterias y garantiza la
entrada a las células del mesófilo en una área
de tejido específica y muy pequeña, por ello este método es ideal para evaluaciones de
dinámica poblacional y estudios de dosis
respuesta (Figura 3 y 4).
Las evaluaciones de progresión de sínto-mas, permitieron hacer un registro fotográfi-
co del avance del daño (Figura 2), encontrán-
dose que el periodo de incubación de la en-
fermedad fue aproximadamente entre las 72 y las 96 horas luego de la inoculación, donde se
empezó a observar la aparición de síntomas
tales como halos aceitosos y manchas necró-
ticas (Figura 2) y el aumento en la concentra-ción de bacterias UFC en 4 cm2 de tejido,
correspondiente a un porcentaje de severidad
de 4,75% al 14,3% según la evaluación de
severidad elaborada, consistente con la escala de severidad diseñada por Castillo et al.
(2010), y similar a lo encontrado en otras
investigaciones realizadas en el género de
Xanthomonas en lechuga (Robinson et al., 2006), en plantas perennes como Nepetia
cataria (Koike et al., 2001) y en plantas de
maracuyá (Botero et al., 2006).
Evaluación de la dinámica poblacional del
inóculo bacteriano
Después del periodo de incubación aproxi-
madamente de cinco días, la población en el
punto de inoculación fue de 2X104 UFC/4cm2
posteriormente, se incrementa a 1X108
UFC/4cm2, presentándose una clorosis pro-
nunciada (Figura 4). A los 17 días pos-
inoculación (d.p.i.) el tejido llega a su máxi-mo de carga bacteriana 2X109 UFC/4cm2, y
Tabla 1. Análisis estadístico mediante programa SAS. Análisis de varianza (ANOVA) de Índices de
severidad obtenidos
Fuente gl Suma de Cuadrados Cuadrado de
la media F valor Pr > F
Métodos de
Inoculación 1 2.441.961,158 2.441.961,158 4,31 0,0392
Cepas Bacterianas
8 1.402.624,357 200.374,908 0,35 0,9276
Figura 2. Estados visuales síntomas causados por aislamiento X. axonopodis FAB145 por inocu-
laciones con infiltración del envés.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 60
empieza la dispersión del microorganismo a otros tejidos, observándose síntomas en hojas
adyacentes al tejido inoculado; también en
tallos y zarcillos, indicando el movimiento
del patógeno a través de los haces vasculares. De acuerdo a la evaluación de la progre-
sión de síntomas y al análisis de la progresión
de la enfermedad, se alcanzaron porcentajes
de severidad de hasta el 85% luego de 20 d.p.i. A partir de los 30 d.p.i se presentaron
lesiones aceitosas en tallos, estos síntomas se
extienden hasta las hojas sanas de la misma
planta; 45 d.p.i. aumenta la presencia de síntomas en hojas nuevas. Lo anterior
también ha sido propuesto y caracterizado por
Goncalves (2000), quien desarrolló una in-
vestigación en esta enfermedad en zonas productoras de maracuyá en Brasil.
Análisis de cortes histopatológicos
De acuerdo a las observaciones de los cortes
histológicos (Benítez et al.,2010), X. axono-
podis inicia su penetración a través de la
epidermis por medio de los estomas o hidáto-dos. La posterior colonización está asociada a
tejidos como el parénquima lagunar y luego a
través de todo el mesófilo en el tejido foliar
causando disrupción y en algunos casos invasión de las células del parénquima lagu-
nar. Cuando este agente comienza a movili-
zarse localmente en el tejido, se observa
invasión de los vasos conductores y así puede alcanzar la nervadura central de la hoja
(Kaku et al., 2004: Smith y Dickey, 1981).
En enfermedades como X. malvacearum
en algodón, luego de 30 d.p.i. se empieza a observar lesiones aceitosas en tallo y la colo-
nización de estas bacterias se asocia con el
parénquima cortical, permitiendo que se
movilicen hasta los haces vasculares vía xilema, ya que estas células mantiene una alta
concentración de fuentes de carbono (Kaku et
al., 2004). En un estudio de Wallis et al.,
(1973) se observó en evaluaciones histológi-cos de tejidos foliares de lechuga infectados
con X. campestris, que el movimiento de
masas bacteriales se favorece por la disolu-
ción de la pared de las células, pudiendo estas al final, atravesar los vasos conductores
adyacentes. Esto puede indicar que esta en-
fermedad tiene naturaleza sistémica, origi-
nando sintomatología varios órganos en la planta y causar el colapso de la misma (Cason
et al., 1977).
Con respecto a los cortes histopatológi-
cos, la presencia de halos aceitosos como los
observados en el estado 3, según Kaku et al.
(2004) se relacionan con la degradación de
cloroplastos a consecuencia de la acción de efectores como citotoxinas; los síntomas
prosiguen a manchas pardas y necróticas,
asociadas a la plasmólisis celular presente en
el parénquima en empalizada y lagunar y además, la presencia de esas masas celulares
en el xilema de las nervaduras principales
desembocan a los conductos del peciolo pudiendo causar así desprendimiento de la
hoja. (Benítez et al., 2010). También se ob-
servó en lesiones de tallo principal, necrosis avanzada con contaminación con hongos
oportunistas en la superficie de estas lesiones
(Benítez et al., 2010).
CONCLUSIONES
Mediante los análisis histológicos y evalua-ción de la manifestación de síntomas a través
del tiempo, puede concluirse que la bacterio-
sis en gulupa causada por X. axonopodis es
una enfermedad de carácter sistémico y de rápido avance en la unidad productiva (Figura
5), tomando 45 días en dispersarse a órganos
no inoculados, pero que por la velocidad de
dispersión en la planta y su tasa de multipli-cación, obliga a que las medidas de control
sean rápidas para evitar la dispersión de la
bacteria a plantas sanas, y sobre todo plante-
ando que se deben emplear medidas de carác-ter preventivo principalmente.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Universidad Na-
cional de Colombia, sede Bogotá, Asohofru-
col y Ministerio de Agricultura y Desarrollo
Rural por la financiación de la presente inves-tigación (Contrato 2007L4348_49-837/07).
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Figura 4. Dinámica poblacional de los aislamientos X. axonopodis FAB147 y X. axonopodis FAB151 en relación a la concentración celular a través de los días 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15 pos-inoculación.
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2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 1
63
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL Dasheen mosaic virus
EN CALA (Zantedeschia aethiopica) EN CÓRDOBA, ARGENTINA*
Eva E. Cafrune1, Florencia Asinari2, Claudia F. Nome1, María C. Perotto1, 3, Mariana Quiroga4 y Vilma C. Conci1, 3
1Instituto de Patología Vegetal (IPAVE), Centro de Investigaciones Agropecuarias (CIAP), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria
INTA) . 2 Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Univ. Nacional de Córdoba en el IPAVE-CIAP INTA. 3 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). 4Agencia Nacional de Promociones
Científicas y Técnicas. Córdoba, Argentina.
Correos electrónicos de contacto ecafrune@ciap.inta.gob.ar, vconci@ciap.inta.gob.ar
*Artículo científico, recibido para publicación el 27/05/2011; aceptado el 18/08/2011 Galardonado con el Premio Andinesa, otorgado durante el XXX Congreso
Colombiano y XVI Latinoamericano de Fitopatología Bogotá (Colombia) 19 de agosto de 2011.
RESUMEN
En jardines de la ciudad de Córdoba, Argentina, en donde la cala
común (Zantedeschia aethiopica) se utiliza como ornamental, se de-tectaron plantas cuyas hojas mostraban un marcado mosaico de etio-
logía desconocida. El objetivo de este trabajo fue identificar el agente
causal de los síntomas observados. Inicialmente se realizaron observa-
ciones al microscopio electrónico mediante la técnica “leaf dip” utili-zando extractos de plantas de cala afectadas por el mosaico, que per-
mitieron detectar partículas virales filamentosas y flexuosas. Poste-
riormente, en cortes ultrafinos de lámina foliar se visualizaron inclu-
siones tipo molinete, típicas del género Potyvirus. Los resultados obtenidos se confirmaron mediante la técnica inmuno enzimática
indirecta (PTA-ELISA) utilizando un antisuero (Potyvirus group
complete kit-BIOREBA) específico para este género viral. La clona-
ción y secuenciado de un fragmento genómico de 664 nt correspon-diente a la porción final del gen de la NIb y la primera parte de la
cápside protéica (CP); mostró un 70,2% a 87,3% de identidad de
amino ácidos con secuencias de Dasheen mosaic virus (DsMV). La
comparación de la secuencia completa de la CP con otras secuencias de DsMV publicada en el GenBank, mostró entre 83,6 y 95,2% de
identidad, detectándose los mayores porcentajes con aislamientos
provenientes de Zantedeschia sp. (entre 94,3 y 95,2%). Los resultados
obtenidos confirman la identidad del virus según los criterios de de-marcación de especies del 8vo Reporte del ICTV para Potyvirus (iden-
tidad mayor al 80% de aminoácidos de la CP).
Palabras clave: Araceae, Potyvirus, caracterización molecular,
DsMV.
SUMMARY
In gardens of the city of Cordoba, Argentina, where the Araceae,
(Zantedeschia aethiopica) is used as an ornamental plant is was o served some affected plants with a typical mosaic disease of unknown
ethiology. In order to stablish the causal agent of that disease it was
planned to realize the present investigation. Initially, observations
through the TEM, using leaf dip methodology with disease leaf tissues, some filamentous, flexuous virus particles were observed.
Also, using ultrafine sections the presence of cylindrical inclusions
were observed by transmission electron microscopy. An indirect
enzyme immunoassay (PTA-ELISA) using the Potyvirus group com-plete kit-BIOREBA, confirmed the presence of a potyvirus. A
genomic fragment of 664 nt corresponding to the final portion of the
NIb gene and the first portion of the capsid protein (CP) was cloned
and sequenced, resulting in 70.2% to 87.3% amino acid identities with corresponding sequences of Dasheen mosaic virus (DSMV). Specific
primers for DSMV’s CP were used to produce a fragment of 1000 bp,
showing 83.6 and 95.2% homologies with selected CP sequences of
DSMV. The highest identity was obtained with DSMV in Zantedeschia sp. (94.3 to 95.2%). This confirms the identity of the
virus studied here, according to the ICTV species demarcation criteria
for potyviruses (greater than 80% homology of amino acids in the
CP)..
Keywords: Araceae, Potyvirus, molecular characterization, DsMV.
INTRODUCCIÓN
La Araceae es una familia de plantas mono-
cotiledóneas que incluye especies alimenti-
cias y ornamentales ampliamente utilizadas. Esta familia de plantas incluye 2.950 especies
distribuidas en 106 géneros (Mabberley,
1989;Grayum, 1990), que incluyen Zante-
deschia. La propagación agámica (asexual) de las
especies de aráceas facilita la transmisión de
patógenos sistémicos como los virus. Debido
a esto, es de fundamental importancia realizar un examen de las plantas madres para produ-
cir material propagativo libre de virus. La Z.
aethiopica (cala común) es una planta orna-mental de amplia distribución mundial, y las
virosis son uno de los factores más importan-
tes que limitan la producción (Chen et al.,
2003). Se han citados numerosos virus en
cala, entre los cuales se destacan especies de Tospovirus, como el Tomato spotted wilt
virus y el Watermelon silver mottle virus
(Chen, 2005; Zettler y Hartman, 1995); Poty-
virus, como el Turnip mosaic virus (TuMV), Konjac mosaic virus (KMV) y Dasheen
mosaic virus (DsMV)(Barg et al., 1994; Chen
et al., 2000; Chen et al., 2003; Pham et al.,
2002; Shimoyama et al., 1992a; Shimoyama et al., 1992b; Zettler et al., 1987); Carmovi-
rus como el Carnation mottle virus (Chen et
al., 2002); y Cucumovirus como el Cucumber
mosaic virus (Shimoyama et al., 1990). Los virus encontrados en cala inducen síntomas
de mosaico y distorsión de las hojas en la
mayoría de los cultivares comerciales, pu-diéndose observar además manchas amarillas
y estriados (Chen et al., 2003).
El DsMV es considerado el virus de ma-
yor importancia y prevalencia en el género
Zantedeschia (Zettler & Hartman, 1987). Es un miembro del género Potyvirus, con partí-
culas filamentosas, flexuosas de aproxima-
damente 750 nm de largo, cuyo ácido nuclei-
co es ARN de cadena simple y sentido positi-vo (Abo El-Nil et al., 1977; Shukla et al.,
1994; Zettler et al., 1978a; Zettler et al.,
1978b). Este virus fue reportado por primera
vez en Colocasia esculenta (L) Schott (Zettler et al., 1970) y es el patógeno viral
más importante de las aráceas cultivadas en
todo el mundo (Zettler & Hartman, 1987). El
patógeno está ampliamente distribuido debido a la propagación vegetativa de sus hospedan-
tes y por sus vectores naturales, los áfidos,
entre los que se incluye Myzus persicae y Aphis gossypii que lo transmiten en forma no
persistente (Babu et al., 2011; Zettler et al.,
1978b).
En jardines de la ciudad de Córdoba, Ar-
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 1 64
gentina, en donde la cala común (Zantedes-chia aethiopica) se utiliza como ornamental
se detectaron plantas cuyas hojas mostraban
un marcado mosaico en forma de estrías de
diferentes tonos de verde, ampollas suaves y notables deformaciones foliares que hacían
poco atractivas. En razón de que se desconoc-
ía la causa del disturbio se planteó la presen-
te investigación cuyo objetivo fue identificar y caracterizar el patógeno asociado a los
síntomas observados.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y análisis serológico
En jardines de la ciudad de Córdoba se recogieron hojas de cala común con síntomas
característicos de mosaico y deformaciones
(Figura 1).
Las muestras colectadas de los tejidos se conservaron a 4º C para su estudio. Se toma-
ron porciones de tejido con síntomas y se
analizaron mediante la técnica indirecta PTA-
ELISA (“Plate Trapped Antibody-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”, por sus
siglas en idioma Inglés), utilizando un anti-
suero monoclonal comercial para la detección
de potyvirus, según las instrucciones del fabricante (Potyvirus group complete kit-
BIOREBA). Se usaron los controles positivos
y negativos del paquete y los valores de
absorbencia a A405 nm se determinaron me-diante un espectrofotómetro Dynatech MR
4000, considerando como positivos muestras
cuyos valores de absorbencia superaron dos
veces a la media de los testigos sanos.
Microscopía electrónica
Con el objeto de verificar si las muestras del tejido afectado contenían partículas virales,
éstas se procesaron mediante la técnica de
preparación rápida con tinción negativa co-
nocida como “leaf dip”. Para el efecto se maceraron muestras de hojas de cala con
síntomas en proporción 1/5 (p/v) en tampón
borato 0,05 M pH 8,1 y teñidas negativamen-
te con acetato de uranilo al 2% (pH 4,2) (Kitajima, 1965). Las preparaciones se obser-
varon al microscopio electrónico de transmi-
sión (MET, JEOL JEM 1200 EX II).
Para evaluar las alteraciones citológicas, se realizaron cortes ultrafinos a partir de la
lámina foliar con mosaico. Las muestras se
fijaron con glutaraldehido 2,5%-
paraformaldehido 2,5% y contrastaron con tetroxido de osmio 1% en tampón cacodilato
0,05M, pH 7.
Los procesos de deshidratación se efec-tuaron usando un gradiente de acetona (50-
100%).
Las muestras se embebieron en resina
“Spur low viscosity” (embedding media kit ®. Data sheet #217 Polysciences, INC.), a
temperatura ambiente, siguiendo la metodo-
logía descrita por Kitajima (1997).
Los cortes ultrafinos se realizaron con cuchilla de diamante y se contrastaron con
acetato de uranilo 2% (Reynolds, 1963).
Posteriormente las preparaciones se observa-
ron al MET.
Detección molecular
Para la detección molecular de los virus
presentes en las muestras de cala con sínto-mas de mosaico, se realizó la extracción de
RNA total de planta con el paquete Qiagen p
(RNeasy Plant Mini Kit)
Las muestras se analizaron mediante
transcripción reversa seguida de reacción en
cadena de polimerasa (RT-PCR), usando
iniciadores degenerados para Potyvirus
(Lunello et al., 2005) que hibridan en la porción final de la NIb y la primera parte de
la cápside proteica, que amplifican un frag-
mento de aproximadamente 630 pb. El tejido
vegetal también se analizó con iniciadores específicos para DsMV (Reyes et al., 2009)
que amplifican un fragmento de 1000 pb;
desarrollados a partir de regiones conservadas
del genoma de DsMV y que amplifican la CP y la región 3´no codificante.
Los RT-PCR se realizaron con el paquete
Access RT PCR System (Promega) de acuer-
do a las instrucciones del fabricante. Los pasos del RT-PCR para los iniciadores que
detectan Potyvirus fueron: transcripción
reversa 48ºC por 45 minutos; programa de
ciclado de 94ºC por dos minutos, desnatura-lización con cinco ciclos de 94ºC por 30
segundos, 40ºC por 30 segundos, 68ºC por un
minuto para la desnaturalización, hibridación
de los iniciadores y extensión del fragmento
respectivamente. Se continuó con 40 ciclos a
94ºC por 30 segundos, 50ºC por 30 segundos,
68ºC por 2,5 minutos para la desnaturaliza-ción, hibridación de los iniciadores y exten-
sión del fragmento respectivamente., comple-
tando con una etapa de extensión final a 68ºC
por siete minutos. Para los iniciadores específicos de DsMV
la transcripción reversa se realizó a 48ºC por
una hora, seguida de un programa de ciclado
de 15 min a 95ºC para la desnaturalización; 40 ciclos de 94ºC por un minuto, 41ºC por un
minuto, 68ºC por un minuto para la desnatu-
ralización, hibridación de los iniciadores y
extensión del fragmento respectivamente, completando con una etapa de extensión final
de 10 min a 68ºC.
Caracterización molecular
Los fragmentos amplificados por RT-PCR se
clonaron en el vector pGEM®- T Easy Vec-
tor (PROMEGA). Las células competentes de Escherichia coli provistas por el paquete, se
transformaron por el método de choque
térmico (incubado a 42ºC por 30 segundos)
de acuerdo a las especificaciones del fabri-cante y se sembraron en medio LB + ampici-
lina (100 µg/ml). Se seleccionaron las colo-
nias recombinantes mediante la técnica de
PCR de colonia. El DNA plasmídico de los clones obteni-
dos se purificó mediante el paquete “Plasmad
Mini Kits for purification of ultrapure, trans-
fection grade plasmid DNA QUIAGEN®.” Los clones se secuenciaron con un secuencia-
dor automático (Unidad de Genómica, Insti-
tuto de Biotecnología, Centro Nacional de
Investigaciones Agropecuarias, INTA Caste-lar, Buenos Aires, Argentina). Las secuencias
de nucleótidos generadas se analizaron con el
A B
Figura 1. Síntoma en hojas de Zantedeschia aethiopica, A, mosaico y ampollas suaves en la lámina foliar ,
B, deformaciones y distorsión de la hoja.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 1
65
paquete de programas LASERGENE (DNASTAR Inc. vers. 5. 2001, Madison, WI,
USA). La comparación de las secuencias
consenso obtenidas con las existentes en el
GeneBank se realizó aplicando el programa BLAST. Se generó un árbol filogenético
utilizando el método “Neighbor-Joining”. La
significancia estadística del orden de las
ramas se estimó realizando 1000 repeticiones del alineamiento múltiple original (boots-
trap).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En las hojas de cala común con mosaico
marcado, se observaron partículas virales
filamentosas y flexuosas. En los cortes ultra-
finos de lámina foliar se detectaron agregados laminares, rollos e inclusiones tipo molinete,
típicas de la subdivisión III (Edwardson &
Christie, 1996) del género Potyvirus (Figura
2).
La presencia de virus perteneciente a este género fue confirmada con suero específico
para el género Potyvirus mediante PTA-
ELISA. En las muestras provenientes de cala
infectadas se detectaron valores de absorban-
cia 14 veces superiores a los de los testigos
sanos.
Aquellas muestras que resultaron positi-vas en la prueba serológica, se usaron para la
extracción de RNA y se logró amplificar un
fragmento del tamaño esperado del genoma
viral mediante la técnica de RT-PCR con los iniciadores degenerados para potyvirus.
La secuencia de 664 nucleótidos del
fragmento obtenido se comparó con secuen-
cias publicadas de los virus mencionados como patógenos de cala, TuMV (GenBank Nº
HQ446217; NC_002509), KMV (GenBank
Nº AB219545; NC_007913) y DsMV (Gen-
Bank Nº AF048981; AJ298034; AY994104; DMU00122; DQ925466; EF199550;
HQ207542; NC-003537). Los mayores por-
centajes de identidad se detectaron con las
secuencias del DsMV, desde un 70,2 a un 87,3%, siendo los porcentajes de identidades
con las del TuMV de 51,5 y 52,7% y con las
del KMV 53%.
Posteriormente las muestras se probaron mediante RT-PCR con iniciadores específicos
para DsMV y se logró amplificar fragmentos
del tamaño esperado (1000 pb) a partir de dos
aislamientos diferentes de cala, los cuales se clonaron y secuenciaron. Para corroborar la
identidad del virus, conforme a lo establecido
por el “International Committee on Taxono-
my of Virus” (Adams et al., 2005; Fauquet et al., 2005), se comparó la secuencia de ami-
noácidos (aa) del gen de la cápside proteica
(CP) de los aislamientos de cala de Argentina
con 22 secuencias de aa de diferentes aisla-mientos de DsMV provenientes de distintas
especies de Araceae publicados en el Gen-
Bank, nueve obtenidas de Xanthosoma spp.
de Nicaragua publicadas por Reyes et al. (2009), tres secuencias de Zantedeschia
aethiopica de China CAC83049, AAM
46863, NP_734112), tres de Amorphophallus paeoniifolius de India (ADN88390,
ACI05261, ADN88389), cuatro de Coloca-
sia sp. de diferentes orígenes (AAA18257,
AAA21392, ABL09440, ADN88400), una de
Caladium sp. (AAC05494) y dos secuencias
provenientes de otras Araceae no identifica-
das (AAD51951, ABM97418). Además se comparó una secuencia de-
nominada “Spathiphyllum potyvirus” de
India (ADK88942); tres secuencias
(CAD23064, CAE83572, CAE83571) de un potyvirus conocido tentativamente como
“Vanilla mosaic virus” (VanMV) obtenida de
vainilla de Tahití (Vanilla tahitensis). Como
extragrupo fue usada una secuencia de Bean common mosaic virus cepa peanut stripe
(BCMV, CAA72439).
Del análisis de la comparación de se-
cuencias de aa de la CP mediante Clustal W, con el paquete de programas LASERGENE
(DNASTAR Inc. vers. 5. 2001, Madison, WI,
USA), se obtuvieron identidades que variaron
entre un 83,6 y un 95,2% con las 22 secuen-cias de DsMV, siendo los mayores porcenta-
jes de identidades con las secuencias de
DsMV obtenidas de Zantedeschia sp. (94,3 al
95,2 %). Esto confirma la identidad del poty-virus investigado según los criterios de de-
marcación de especies del 8vo Reporte del
ICTV para especies del género Potyvirus
(homología mayor al 80% de aminoácidos de la CP) (Adams et al., 2005; Fauquet et al.,
2005). También se observó alta identidad con
tres secuencias publicadas como VanMV
(81,4 al 94,5%) y una como Spathiphyllum potyvirus (81,1%), especies citadas como
tentativas dentro del género Potyvirus.
Estos resultados podrían estar indicando
que las secuencias publicadas como VanMV y Spathiphyllum potyvirus tienen la misma
identidad que lo reportado como DsMV, y
por consiguiente podría tratarse del mismo
virus. Esta identidad también fue reportada por Reyes et al. (2009) y Farreyrol et al.
(2006).
Del análisis filogenético de las secuencias se observan dos grandes grupos (Figura 3), o
clúster, que se separan con un alto valor de
“boostrap” (98,1%). En el clúster I se agru-
pan las secuencias de DsMV provenientes de
especies de diversos géneros de aráceas,
como Colocasia, Amorphophallus, Caladium
y Zantedeschia con una identidad variable entre 87,2 y 95,5%. En este clúster se separan
del resto las secuencias provenientes de
Zantedeschia sp., (dos de Argentina y tres de
China) en lo que podría ser un subgrupo, dentro del mismo.
El clúster II, incluye 11 de las secuencias
comparadas, con una identidad variable entre
83,3 y 88,5%, y comprende DsMV secuen-ciado a partir de todas las Xanthosoma spp.,
una secuencia proveniente de Colocasia sp., y
una de otra arácea no identificada. Separados
de estos grupos quedan las secuencias obteni-das desde orquídea (VanMV) con porcentajes
de identidades que van del 81,1 al 94,5 y de
Spathithyllium sp. con porcentajes de iden-
Figura 2. Cortes ultrafinos de tejido foliar de Zantedeschia aethiopica vistos al microscopio electrónico de transmisión. a: inclusiones tipo molinetes (“pinwheel”),
b: inclusiones tubulares, o rollos (“scroll”) y c: agregados laminares (“laminated agregate”).
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 1 66
tidades que van del 81,1 al 81,5. Los agrupa-
mientos parecieran estar más relacionados al
género del hospedante de donde proviene el virus que al origen geográfico, pero esto
necesita ser confirmado. Los agrupamientos
observados revelan diferencias dentro del
DsMV que probablemente permitan separar razas, o variantes del virus que deberían ser
estudiadas en el futuro.
CONCLUSIONES
Las inclusiones virales observadas en los
cortes ultrafinos de tejido infectado y las pruebas serológicas permitieron concluir que
el virus detectado en cala en Córdoba, Argen-
tina pertenece al género Potyvirus. Las com-
paraciones de secuencias genómicas del gen que codifica para la CP viral del virus detec-
tado reveló alta identidad con el DMV detec-
tado en otros países (entre 83,6 y 95,2%),
corroborando la presencia de este virus según los criterios de demarcación establecidos por
el ICTV para este género viral. El análisis
filogenético de las secuencias publicadas y
las obtenidas en este trabajo sugieren la exis-tencia de 2 razas, o variantes virales.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio fue realizado en el IPAVE-
CIAP-INTA y financiado por fondos de
INTA y CONICET.
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NP_734112 DsMV Zantedeschia China
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Zantedeschia ARGENTINA 1
Zantedeschia ARGENTINA 3
100.0
55.5
AAM46863 DsMV Zantedeschia
59.4
AAA21392 DsMV Colocasia
AAD51951 DsMV aroid plants Taiwan
82.0
44.6
ABL09440 DsMV Colocasia Vietnam
34.0
AAC05494 DsMV Caladium
23.9
ACI05261 DsMV Amorphophallus India
ADN88400 DsMV Colocasia India
82.6
ADN88390 DsMV Amorphophallus India
40.2
ADN88389 DsMV Amorphophallus India
NA
25.0
AM910405 DsMV Xanthosoma Masaya-Nicarag
AM910407 DsMV Xanthosoma Masaya-Nicarag
83.9
AM910406 DsMV Xanthosoma Masaya-Nicarag
46.3
AM910403 DsMV Xanthosoma Masaya-Nicarag
77.2
AM910404 DsMV Xanthosoma Masaya-Nicarag
99.4
ABM97418 DsMV Araceae rivieri Durieu Ch
86.5
AM910398 DsMV Xanthosoma N Guinea-Nicar
AM910400 DsMV Xanthosoma N Guinea-Nicar
71.6
AM910401 DsMV Xanthosoma N Guinea-Nicar
79.9
AAA18257 DsMV Colocasia
76.6
96.6
AM910402 DsMV Xanthosoma N Guinea-Nicar
98.9
98.1
CAE83572 VanMV
64.0
CAE83571 VanMV
77.5
ADK88942 Spathiphyllum India
58.7
CAD23064 VanMV
76.0
CAA72439 BCMV
Gru
po I
Gru
po II
Figura 3. Árbol filogenético obtenido por Neighbor-Joining de la CP deducida de la secuencia de nucleótidos del aislamiento argentino del DsMV y las CP de 22 secuencias de DsMV, 1 de Spathiphyllum potyvirus y 3 de VanMV, publicadas en GeneBank. El análisis filogenético se llevó a cabo con CLUSTAL W, las rela-
ciones de las ramas fueron calculadas con un bootstrap de 1000 repeticiones. Se tomó al Bean common mosaic virus como miembro extragrupo.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 1
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68
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE FITOPATOLOGIA
Y CIENCIAS AFINES, ASCOLFI
XXXI Congreso Colombiano de Fitopatología Pereira Septiembre 18 al 20 de 2013.
Informes
Sede ASCOLFI
www.ascolficolombia.org
ascolfi.colombia@gmail.com
Congresoascolfi2013@gmail.com
Teléfono celular 316-4303079
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
69
IDENTIFICACIÓN DE ARVENSES COMO HOSPEDEROS NATURALES
DE Begomovirus EN EL VALLE DEL CAUCA, COLOMBIA*
Juan Carlos Vaca-Vaca, Doryan Otavo Fiscal y Karina López-López
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia sede Palmira.
Carrera 32 vía Candelaria, Palmira, Valle del Cauca, Colombia.
Correo electrónico de contacto: jcvacava@unal.edu.co, klopezl@unal.edu.co.
*Artículo científico, recibido para publicación el 27/05/2011; aceptado el 18/08/201
RESUMEN En la última década, la mayoría de las pérdidas fitosanitarias asociadas
al cultivo del tomate en el Valle del Cauca han sido atribuidas a la
infección por Begomovirus, un virus transmitido por mosca blanca
Bemisia tabaci. Las arvenses son importantes reservorios para los virus que afectan a las plantas y se ha conjeturado que pueden servir
como hospederos temporales para Begomovirus. Por lo anterior, el
objetivo de la presente investigación fue identificar arvenses asociadas
al cultivo de tomate Solanum lycopersicum presentes en el Valle del Cauca (Colombia) que actúen como hospederos naturales de Begomo-
virus. Se colectaron arvenses en cultivos de tomate de Palmira y Can-
delaria, y mediante la metodología de Reacción en Cadena de la Poli-
merasa se detectó la presencia de Begomovirus. Las arvenses identifi-cadas como Desmodium sp, Amaranthus dubius, Laportea aestuans,
Rivina humilis y Lantana camara fueron positivas, siendo este el
primer reporte en Colombia de la presencia de Begomovirus en estas
arvenses. De acuerdo a la literatura reportada a la fecha, este es el primer reporte de la presencia de Begomovirus en Rivina humilis y
Lantana camara, a nivel mundial. Estos resultados indican que es
esencial que se reconozcan estas arvenses en campo con el fin de
realizar un control cultural eficiente y reducir las virosis en tomate.
Palabras claves: Solanum lycopersicum L., Desmodium sp, Amarant-
hus dubius, Lantana camara, Rivina humilis, Geminivirus
SUMMARY
Identification of weeds as natural host of Begomovirus in Valle del
Cauca, Colombia
In the last decade, most of the phytosanitary yield losses associated
with tomato crops in Valle of Cauca has been attributed to the Bego-
movirus infection, a virus transmitted by whitefly Bemisia tabaci.
Weeds are important reservoirs for the virus that affect plants and has been hypothesized that may serve as temporary hosts Begomovirus.
Therefore, the objective of this research was to determine the presence
of Begomovirus in weeds associated with tomato crops at the Valle of
Cauca. Weeds were collected from tomato crops in Palmira and Can-delaria, and using the methodology of the Polymerase Chain Reaction
(PCR) was detected the presence of Begomovirus. Weeds identified as
Desmodium sp, Amaranthus dubius, Laportea aestuans, Rivina humilis
and Lantana camara were positive, and this is the first report on Colombia for the presence of Begomovirus in these weeds. According
to the literature reported to date, this is the first report of the presence
of Begomovirus in Rivina humilis and Lantana camara, of worldwide.
These results indicate that it is essential to recognize these weeds in the field to conduct an effective cultural management of them and
reduce the severity of viral diseases in tomato.
Key words: Solanum lycopersicum L., Desmodium sp, Amaranthus
dubius, Lantana camara, Rivina humilis, Geminivirus
INTRODUCCIÓN
El tomate (Solanum lycopersicum) es la
hortaliza de mayor importancia en el mundo.
Este cultivo es afectado por varios patóge-
nos (hongos, bacterias y virus) que disminu-
yen su producción, lo que ha hecho necesario
desarrollar métodos de control químico,
biológico y genético para reducir y/o eliminar
las pérdidas económicas provocadas por algunas de ellos.
En el caso de las enfermedades virales su
control constituye un caso especial, ya que
éstas no se pueden combatir por medio de estrategias convencionales usualmente em-
pleadas para erradicar otros tipos de patóge-
nos de plantas (Jones et al., 1991). En tomate, las enfermedades causadas por
los virus se encuentran entre las de mayor
importancia económica por los daños que
generan, en especial aquellas causadas por la Familia Geminiviridae. De esta familia, los
pertenecientes al género Begomovirus han
surgido como una amenaza seria para la
producción de los principales cultivos de importancia económica a nivel mundial en
zonas tropicales y subtropicales del planeta
(Mansoor et al., 2003; Morales y Anderson, 2001; Varma y Malathi, 2003, Seal et al.,
2006). Los Begomovirus son transmitidos de
manera circulativa no propagativa por la
mosca blanca (Bemisia tabaci Genn.), insec-to polífago con una amplia gama de plantas
hospedantes (Lazarowitz, 1992; Czoneck et
al., 2002; Varma y Malathi, 2003, Strange, y
Scott, 2005). En la última década, la mayoría de las
pérdidas fitosanitarias asociadas al cultivo del
tomate en el Valle del Cauca se han atribui-
das a la infección por Begomovirus, patóge-nos transmitidos por la mosca blanca Bemisia
tabaci (Vaca-Vaca et al., 2011; Morales et
al., 2002). Las arvenses son reservorios importantes
para los virus que afectan a las plantas y se ha
conjeturado que pueden servir como hospede-
ros temporales para Begomovirus. Esto debi-do a que las arvenses figuran entre aquellas
plantas de las cuáles las moscas blancas se
alimentan, convirtiéndose eventualmente en
reservorio de Begomovirus. Desde este punto de vista las arvenses pueden cumplir tres
roles no excluyentes en la epidemiología de
las enfermedades virales al servir como re-servorio del virus, ser reservorio de los vecto-
res o de ambos a la vez (Duffus, 1971; Rist y
Lorbeer, 1989; Ochoa et al., 1999).
Desde las arvenses, su vector natural, B. tabaci, puede adquirir y transmitir los Bego-
movirus a los cultivos de tomate, en donde se
pueden adaptar rápidamente y eventualmente
dar lugar a nuevas variantes virales, justifi-cando la realización de estudios que permitan
identificar las arvenses potencialmente peli-
grosas para el cultivo de tomate. Por lo ante-
rior, el objetivo de la presente investigación fue identificar arvenses asociadas al cultivo
de tomate Solanum lycopersicum presentes en
el Valle del Cauca (Colombia) que actúen como hospederos naturales de Begomovirus.
Los resultados de la investigación pueden
ser empleados en la formulación de medidas
culturales de control eficaces que conduzcan a la reducción de la incidencia de la enferme-
dad geminiviral en los cultivos de tomate
localizados en este departamento.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 70
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta de las muestras
Los muestreos se realizaron durante el año
2010-2011 en cultivos de tomate localizados
en los municipios de Palmira y Candelaria, en
el Valle del Cauca, Colombia. Las muestras vegetales consistentes en hojas y brotes
jóvenes con sintomatología viral típica se
colectaron en el campo y posteriormente se
transportaron para su análisis al Laboratorio de Fitopatología y Biología Molecular de la
Universidad Nacional de Colombia sede
Palmira. El criterio de selección de las arven-
ses en campo se fundamentó en la presencia de sintomatología geminiviral típica caracte-
rizada por clorosis, mosaico, arrugamiento,
deformación de hojas y enanismo; así como a
la presencia del insecto vector B. tabaci.
Clasificación taxonómica de las arvenses
recolectadas
Las muestras recolectadas en campo se iden-
tificaron y clasificaron en el Herbario "Josep
Cuatrecasas Arumí" de la Universidad Na-
cional de Colombia sede Palmira. La identifi-cación se realizó por medio de comparación
de los especímenes colectados en campo con
otros presentes en la colección del Herbario.
Extracción del ADN
La extracción del ADN genómico de cada
una de las muestras vegetales colectadas en campo se realizó utilizando el método modi-
ficado de extracción con bromuro de cetil-
trimetil-amonio, CTAB, por sus siglas en
idioma Inglés, (Doyle y Doyle, 1987). El ADN total obtenido se almaceno a -20°C
para su análisis posterior.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Para detectar la presencia de cada componen-
te viral en el ADN genómico previamente
extraído a cada una de las arvenses recolecta-das en campo, se uso la técnica de Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus
siglas en idioma Inglés). En razón de que un
Begomovirus bipartita está compuesto por dos componentes genéticos: un ADN- A, que
porta los genes involucrados en replicación y
encapsidación; y un ADN-B, que porta los
genes involucrados en el movimiento del virus (Seal, 2006); se utilizaron los cebadores
degenerados PAR1c496/ PAL1v1978 y
PBL1v2040/ PCRc1 (Rojas et al., 1993) que amplifican un fragmento de ~ 1200pb y 600
pb correspondientes a los componentes ADN-
A y ADN-B, respectivamente, de un Bego-
movirus bipartita típico. Las condiciones de la PCR para de am-
bos pares de cebadores se realizó siguiendo
los protocolos descritos según Rojas et al.
(1993).
Los productos de PCR obtenidos se ana-lizaron por electroforesis en geles de agarosa
al 1,0%, en cámaras de electroforesis “Hori-
zon 58” (Invitrogen®) y utilizando una fuente
de poder Thermo EC135-90. Para obtener una buena separación de los productos de
PCR se corrieron durante una hora a 65
voltios.
Para la visualización de los productos de la PCR los geles se colorearon con bromuro
de etidio al 1% y luego se fotografiaron con
un Fotodocumentador (Molecular Imager Gel
DocXR+ Systems BIORAD ®).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Identificación taxonómica de las arvenses
Se colectaron en campo 27 muestras de especies de arvenses, 15 de las cuales se
obtuvieron en el Municipio de Candelaria
Tabla 1) y 12 en el de Palmira (Tabla 2)
Taxonómicamente, se identificaron 19
especies y no fue posible hacerlo con ocho,
mencionadas como NN (Tablas 1 y 2).
De otra parte, en 21 muestras de las es-pecies colectadas se observaron los síntomas
típicos de la enfermedad geminiviral, consis-tentes en clorosis, mosaico, arrugamiento y
deformación de las hojas, además del ena-
nismo o achaparramiento de las plantas (Ta-
blas 1 y 2). En las especies Lagacea mollis, Ipomoea
congesta, Emilia sonchifolia, Poligonum
persicaria, Portulaca oleracea y Commelina
diffusa no se observaron síntomas (Tablas 1 y 2).
En las especies Amaranthus dubius,
Desmodium sp. y Lantana camara se ob-
servó la presencia de moscas blancas (Tablas 1 y 2) .
Obtención del DNA genómico total de las
arvenses recolectadas en cultivos de tomate
A las muestras de las arvenses recolectadas se
les realizo la extracción de ADN genómico
total. El método de CTAB modificado per-mitió obtener ADN de buena calidad a partir
de la mayoría de las muestras recolectadas en
campo. Sin embargo, hubo algunas arvenses
como Corchorus orinocensis, Parthenium
hysterophorus, Ipomoea congesta, Poligonum persicaria, Portulaca oleracea y Momordica
Tabla 1. Arvenses recolectadas en un cultivo de tomate ubicado en el Municipio de Candelaria, Valle del
Cauca.
Nombre común Nombre Científico Ab* Síntomas observados
Espadita Corchorus orinocensis Ct Hojas jóvenes cloróticas
Pimpinela Euphorbis hirta Eh clorosis en hojas jóvenes, y
deformación de hojas
Marihuana macho Parthenium hysterophorus Ph Hojas jóvenes cloróticas, enanismo,
mosaico y deformaciones
Barquito Lagacea mollis Lm Asintomática
Desconocido Cand1 N.N Clorosis y rugosidades en hojas jóvenes
Batatilla Ipomoea congesta Ic-a Asintomática
Bledo Amaranthus dubius1 Ad Clorosis en hojas, y enanismo
Pincel Emilia sonchifolia Em Asintomática
Pega- Pega Desmodium sp1 Dm Mosaico, enanismo
Batatilla Ipomoea congesta Ic-b Clorosis
Desconocido Cand 2 Poligonum persicaria Pp Asintomática
Verdolaga Portulaca oleracea Pt Asintomática
Falso racimo Laportea aestuan Lp Hojas cloróticas
Llantén Plantago meajor Pm Hojas jóvenes cloróticas y rugosas
Deconocido Cand 3 N.N Clorosis hojas, rugosidad en hojas jóvenes
Tomate (Control positivo) Solanum lycopersicum L. Sl Clorosis y mosaicos
* Abreviatura. N.N, maleza no identificada 1Además de síntomas de Geminivirus se observo en las plantas
La presencia de “moscas blancas”
Tabla 2. Arvenses recolectadas en un cultivo de tomate ubicado en el Municipio de Palmira, Valle del
Cauca
Nombre común Nombre Científico Ab* Síntomas observados
Desconocido Palm 1 N.N - Rugosidad en hojas jóvenes
Siempre viva Commelina diffusa Cd Asintomática
Marihuana macho Parthenium hysterophorus Ph Enanismo, deformaciones y clorosis en
hojas
Desconocido Palm 2 N.N - Enanismo , clorosis
Pepa de culebra Momordica charantia Mc Clorosis
Coralillo Rivina humilis Rh Clorosis en toda la plata
Desconocido Palm 3 N.N Deformación, clorosis
Falso ramio Laportea aestuans La Clorosis y embombamientos (deformación)
Venturosa Lantana cámara1 Lc Clorosis, deformación en hojas jóvenes.
Desconocido Palm 4 N.N - Clorosis
Desconocido Palm 5 N.N - Clorosis
Desconocido Palm 6 N.N - Clorosis
Tomate (Control positivo) Solanum lycopersicum L. Sl Clorosis y mosaicos
* Abreviatura. N.N, maleza no identificada. 1Además de síntomas de Geminivirus se observo en las plan-
tas la presencia de “moscas blancas”
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2
71
charantia en donde el ADN extraído fue de baja calidad, puesto que no se disolvía ade-
cuadamente y estuvo acompañada de precipi-
tados de color oscuro, indicio de la presencia
de metabolitos secundarios tales como poli-fenoles. Se ha reportado que estos productos
pueden interferir la aplicación de técnicas
moleculares como el PCR (Echevarría-
Machado et al. 2005), por lo que estas mues-tras se descartaron y no se utilizaron en análi-
sis posteriores.
Detección de Begomovirus bipartitas en las
arvenses
En las muestras colectadas en el Municipio
de Candelaria se obtuvieron resultados posi-tivos para Begomovirus bipartitas en las
arvenses Amaranthus dubius y Desmodium
sp, las cuales amplificaron un fragmento
aproximadamente de 1200 pb que correspon-de al componente ADN-A (Figura 1A), indi-
cador de la presencia del patógeno.
En el municipio de Palmira, se detectó la
presencia de Begomovirus bipartitas en Rivi-na humilis, Laportea aestuans y Lantana
cámara (Figura 1B),
Como control positivo en el ensayo de
PCR se utilizó una muestra de ADN de toma-te Solanum lycopersicum infectada por bioba-
listica con el Begomovirus Potato yellow
mosaic virus (PYMV), el cuál amplifico
ambos componentes ADN-A y ADN-B, (Figuras 1A y 1B). No se detectó por la PCR
el componente ADN- B en las arvenses co-
lectadas que dieron positivo para el compo-
nente ADN-A. La no detección del componente ADN-B
por PCR puede estar relacionado con la baja
concentración de este componente en la
muestra analizada a tal punto que el método de PCR tradicional no pudo detectarlo o a la
ausencia del mismo en la maleza hospedera.
Arvenses identificadas como reservorio de
Begomovirus bipartitas
Los resultados de este trabajo muestran que
las arvenses Amaranthus dubius (Figura 2A), Laportea aestuans (Figura 2B), Desmodium
sp (Figura 3C), Lantana camara (Figura 2D
y 2E) y Rivina humilis (Figura 2F) son reser-
vorios de Begomovirus bipartitas. Estos resultados coinciden con trabajos previos
reportados en otros países, donde también se
estudiaron arvenses como posibles reservo-
rios de Begomovirus: Garzón-Tiznado et al. (2001) reportaron en Mexico a Amaranthus
dubius, como reservorio de Begomovirus en
estudios realizados en arvenses asociadas al cultivo de tomate; Lima et al. (2010) reporta-
ron en Brasil que una maleza relacionada
taxonómicamente con Desmodium sp. era
reservorio del Begomovirus Desmodium yellow spot virus (DesYSV) y Fauquet et al.
(2003) identificaron en Tanzania a la maleza
Laportea como hospedera del Begomovirus
African cassava mosaic virus (ACMV), un
begomovirus bipartita, considerado como la
principal enfermedad viral en el cultivo de la
yuca en el África.
Figura 2. Arvenses identificadas como hospederas de Begomovirus bipartitas. A, Amaranthus dubius presenta poca clorosis y es hospedera de mosca blanca; B, Laportea aestuans presenta poca clorosis hojas
jóvenes y protuberancias en hojas jóvenes; C, Desmodium sp presenta mosaico en hojas; D, Lantana cama-
ra presenta clorosis y protuberancias en hojas jóvenes; E, Lantana camara mostrando mosca blanca; F,
Rivina humilis presenta clorosis en toda las hojas.
Figura 1. Detección por PCR de Begomovirus bipartitas en arvenses recolectas en cultivos de tomate en el
Valle del Cauca. (A) Arvenses recolectadas en el Municipio de Candelaria. Gel de agarosa al 1%. M,
marcador de peso molecular hyperLadder II; 1, Euphorbis hirta; 2, Lagacea mollis; 4, Amaranthus dubius;
5, Emilia sonchifolia; 6, Desmodium sp; 7, Laportea aestum; 8, Plantago mejor; +, Solanum lycopersicum
control positivo; -, control negativo. Las muestras 3 y 9, corresponden a arvenses que no se logró identificar
taxonómicamente. (B) Arvenses recolectadas en el Municipio de Palmira. Gel de agarosa al 1%. M, marca-
dor de peso molecular hyperLadder II; 2, Commelina diffussa; 3, Parthenium hysterophorus; 4, Rivina
humilis; 6, Laportea aestuans; 7, Lantana camara. Las muestras 1, 5, 8, 9 y 10 corresponden a arvenses
que no se lograron identificar taxonómicamente.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 72
Los resultados de este estudio constituyen el primer reporte en Colombia de las arvenses
Amaranthus dubius, Desmodium sp., Rivina
humilis y Laportea aestuans, como reservo-
rios de Begomovirus bipartitas. Así mismo, este es el primer reporte en el ámbito mundial
de Lantana cámara y R. humilis como
reservorios del mismo tipo de virus.
Al analizar los resultados de detección de Begomovirus con la presencia de síntomas, se
puede observar una correlación positiva entre
ambos. Es decir, la observación visual de
algunos síntomas virales permite establecer la relación entre la presencia del virus y los
daños detectados en las arvenses. Por ejem-
plo: Amaranthus dubius presentaba clorosis
en hojas jóvenes y enanismo (Figura 2A), mientras que Desmodium sp presentó mosai-
cos y enanismo (Figura 2C).
Es importante resaltar que ambas arven-
ses fueron colectadas en sitios cercanos entre si y en ambos casos al momento de la colecta
se evidenció alta presencia de poblaciones de
mosca blanca, hecho que fundamenta aún
más el papel del hospedante alterno de Be-gomovirus que en un momento determinado
puede ser desempeñado por estas.
Una situación de relación síntoma y pre-
sencia de Begomovirus se evidenció para el caso de Rivina humilis la cual presento cloro-
sis en toda la planta mientras que Laportea
aestuans y Lantana camara presentaron
moderada clorosis, epinastia y pequeñas deformaciones en las hojas jóvenes (Figura
2B, 2D y 2F). Es importante mencionar que
Lantana camara presentó alta población de
mosca blanca en la planta (Figura 2E). Todas las observaciones y descripciones
de esta investigación constituyen un aporte
importante para el reconocimiento de los
virus en las arvenses aquí descritas; aunque siempre es recomendable para determinar la
presencia de los Begomovirus el uso del
diagnóstico molecular
CONCLUSIONES
Los resultados de este trabajo muestran que las arvenses Amaranthus dubius, Desmodium
sp., Lantana camara, Rivina humilis y La-
portea aestuans resultaron positivas para
Begomovirus bipartitas, por lo tanto, podrían servir como fuente de inoculo de Begomovi-
rus en el cultivo de tomate.
Este es el primer reporte en Colombia de
Amaranthus dubius, Desmodium sp. y Lapor-tea aestuans como reservorios de Begomovi-
rus bipartitas y a la fecha consideramos que
este es el primer reporte de Lantana camara y Rivina humilis como reservorio de Bego-
movirus bipartitas a nivel mundial.
Finalmente, la identificación y control de estas arvenses pretende contribuir al manejo
cultural del cultivo de tomate, que sin duda
permitirá reducir la diseminación de las
enfermedades causadas por Begomovirus en campo.
AGRADECIMIENTOS
Este proyecto fue financiado por el Ministerio
de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR) y por la Dirección de Investigación de la Uni-
versidad Nacional de Colombia sede Palmira
(DIPAL), a quienes los autores expresan sus
agradecimientos.
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2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 (2) 73
RREEVVIISSTTAA FFIITTOOPPAATTOOLLOOGGÍÍAA CCOOLLOOMMBBIIAANNAA
Normas para la elaboración de artículos
Presentación del Trabajo
Para enviar el trabajo a la revista (original y tres copias), se deberá aplicar el siguiente orden, comenzando cada ítem en páginas independientes, según
lo detallado a continuación:
Carátula: Una página con el título del artículo, el autor, su dirección y el tipo de publicación y la entidad. (1 página).
Resumen y palabras claves (1 página)
“Summary “ y palabras claves en inglés (1 página).
Cuerpo del trabajo (Texto). (Las necesarias sin sobrepasar los límites de este reglamento).
Agradecimientos (si lo considera necesario).
Referencias Bibliográficas.
Tablas (1 por página). (Con su respectivo título ).
Figuras (una por página, debidamente numeradas).
"Leyendas" o pies de las figuras.
Estructura general, secciones
El artículo científico incluirá las secciones que se indican más adelante; en la nota científica se podrán unir algunas de las secciones y la revisión
bibliográfica es de estructura libre. Los tres tipos de colaboraciones deben incluir siempre el resumen y el “summary”.
La estructura del artículo científico debe contener lo siguiente:
1. Título
Deberá reflejar adecuadamente el contenido de la publicación con el menor número posible de palabras; estas no deben ser más de veinte. El
título no debe incluir abreviaturas ni fórmulas químicas (salvo para los isótopos).
2. Autor(es)
Se describirán su nombre y apellidos debajo del título, seguidos del nombre de la entidad donde se generó la investigación y la dirección y la del
autor. Enseguida se coloca, si es el caso, toda la información correspondiente al personal técnico que haya colaborado en la investigación.
3. Resumen y “Summary”
El resumen debe hablar de la naturaleza e importancia del trabajo, la metodología usada y los resultados sobresalientes. Debe tener un máximo de una
página (200 a 300 palabras) si corresponde a un artículo científico, o de media página si corresponde a una nota técnica o científica.
4. El “summary”
Es la traducción al portugués o al inglés del resumen, incluido el título. Si se desea, se pueden adicionar resúmenes en Portugués, Francés, o Alemán.
5. Palabras claves
Deberá seleccionarse la palabra o palabras claves más importantes, preferiblemente no contenidas en el título, y colocarlas en un listado lo más
breve posible.
6. Introducción
Deberá destacar la necesidad e importancia de la investigación, mencionar las limitaciones del trabajo, y los resultados de otros trabajos similares o
relacionados (revisión de literatura breve referida a la información más relevante).
7. Materiales y métodos
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 (2) 74
Se deben escribir en forma ordenada, clara y precisa, con detalles suficientes para que el lector pueda, si lo desea, repetir el experimento.
8. Resultados y discusión:
Ambos temas se pueden incluir preferiblemente en una sola sección. Los resultados se deben escribir en forma precisa y ordenada. En la discusión se
explican los hechos y se relacionan con los resultados de otras investigaciones, debidamente sustentados con citas bibliográficas entre paréntesis,
utilizando el Sistema Autor, Año.
9. Conclusiones
Deben ser breves y claras y basarse estrictamente en los resultados (no en conjeturas).
10. Agradecimientos
(Si se desea).
11. Referencias Bibliográficas
Se debe limitar a la estrictamente necesaria y en relación directa con la investigación realizada. Todas las referencias citadas en esta sección
deben ser citadas en el texto. Las referencias se deben colocar en la lista en orden alfabético por los apellidos de los autores.
Cuando hay varias referencias encabezadas por un mismo autor, se escriben primero aquellas en las cuales éste aparece sólo, y luego aquellas
en las que está seguido por coautores; dentro de cada grupo se sigue en orden cronológico. No use la palabra ¨Anónimo¨ para asignar autores
desconocidos; en su lugar, escriba el nombre del editor (seguido de un paréntesis con la abreviatura ed. o eds.) o el de la editorial o, si no hay
ninguno comience con el título de la obra.
No incluya en la bibliografía las referencias de informaciones personales, ni de trabajos sin publicar aunque estén aceptados. Estas fuentes se
pueden citar en el texto, entre paréntesis. La referencia de una publicación periódica se hará en el siguiente orden: autor, año, título del artículo,
nombre abreviado de la revista, volumen, número (entre paréntesis) y páginas.
Ejemplo:
Bowman, J.M., Delwiche, P.A., Brabiebson, R.L. y Williams, P.H. 1980. Lepthosphaeria maculans on cabbage in Wisconsin. Plant. Dis. 64(3):326-
328.
En los libros y folletos el orden general es: autor, año, título, número de la edición, casa editora, lugar de la publicación y número de páginas.
En caso de incluir referencias consultadas electrónicamente en Internet estas se pueden presentar en el siguiente orden:
Autor(es). Año de publicación. Título del documento. Subtítulo. El medio, en línea [entre corchetes]. Número de la edición (sólo a partir de la
segunda). Editorial o entidad que publica en web. Lugar de publicación. Fecha en que se consultó el material, para los documentos en línea [entre
corchetes].Serie, si la tiene (entre paréntesis). Disponible en:
Ejemplos:
Dollar, D. y Kraay, A. 2000. Growth is good for the poor [en línea]. World Bank. Washington, DC. [consultado 15 Septiembre 2001]. Disponible
en : http://www.worldbank.org/research/growth/pdfiles/growthgoodforpoor.pdf
Jiménez, C. (s.f.). Intervención del hombre en los ecosistemas naturales [en línea]. [citado 16 octubre 2001]. Disponible en:
http://www.monografias.com/trabajos7/ecna/ecna.shtml
Gottret, M.V. y Raymond, M. 1999. An analysis of a cassava integrated research and development approach: Has it really contributed to poverty
alleviation? [on line]. In: International Workshop Assessing the Impact of Agricultural Research on Poverty Alleviation (1999, San José,
Costa Rica). Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Cali, CO. [consultado 21 Septiembre 2001]. Disponible en : http://ciat-
library.ciat.cgiar.org/paper_pobreza/038.pdf
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 (2) 75
Myers, M.P., Yang, J. y Stampe, P. 1999. Visualization and functional analysis of a maxi-K-channel (mSlo) fused to green fluorescent protein
(GFP). Electronic Journal of Biotechnology 2(3) [en línea ]. [consultado 21 Marzo 2000]. Disponible en :
http://www.ejb.org/content/vol2/issue3/full/3/index/html
Dávila, M. y Coyne, D. 2000. Detección de genes de letalidad en caraota mediante el uso de la técnica de análisis de segregantes en grupos.
Agronomía Tropical 50(3):323-335 [en línea]. [citado 12 octubre 2001]. Disponible en: http://www.redpav-fpolar.info.ve/agrotrop/index.html
Extensión y formato para los trabajos
La extensión máxima del artículo completo (Resumen, “summary” cuerpo, agradecimientos, referencias, tablas y figuras ) escrito con un tipo de letra de
12 cpi (caracteres por 2,5 cm o una pulgada) será de 16 páginas a doble espacio si se trata de un "artículo científico" o una "revisión bibliográfica"; 6
páginas si es una "nota científica" y una página si es una "carta al editor”
Cualquier colaboración para la revista debe estar mecanografiada o mecanotipiada en papel tamaño carta, por una sola cara, a doble espacio y con
letra grande (no más de 12 caracteres por pulgada). Los márgenes superior, inferior, izquierdo y derecho tendrán 2,5 cm. Cada página se numerará en la
esquina inferior derecha.
Se prefieren los trabajos elaborados en computador utilizando el procesador de palabra "Word". A la copias del escrito impresas en texto de alta
calidad se anexará el disquete o el Disco compacto respectivo conteniendo exactamente lo presentado en el escrito..
Los títulos de primer orden deben ser en mayúsculas; los títulos de segundo orden deben ir en minúsculas; los títulos de tercer orden son en
minúscula, dos puntos y seguido de texto, así:
TITULO DE PRIMER ORDEN
Título de segundo orden
Título de tercer orden: Seguido de texto como en este ejemplo.
Redacción general y estilo
El trabajo se debe redactar en pasado impersonal y debe ser claro, conciso, coherente y exacto. Los nombres científicos se deben escribir en itálicas y
completos la primera vez que se nombren; después se pueden abreviar, escribiendo sólo la inicial del género, pero dejando la especie completa.
Las referencias deben ser citadas en el texto utilizando el Sistema Autor, Año, colocados en paréntesis, por ejemplo (Arbeláez, 1988). Cuando son
varios (más de dos) los autores de la publicación citada, debe colocarse el primer autor seguido del latín et al. y luego el año respectivo, pero en el
listado de Referencias Bibliográficas deben figurar todos los autores.
Al referirse a productos se deben preferir los nombres comunes a los comerciales. En el caso de nombres de marcas registradas, se deben escribir
seguidos de la letra R (mayúscula) y de la dirección del fabricante.
Para las unidades de medida se debe usar el Sistema Internacional de Unidades (SI).
Tanto las tablas como las figuras se deben numerar en forma consecutiva con números arábigos. Todos ellos, al igual que todas las referencias
bibliográficas se deben citar en el texto.
En la medida de lo posible se deben evitar las notas de pie de página. Es preferible reemplazarlas por paréntesis dentro del texto.
Elaboración de tablas
Cada tabla o figura se debe presentar en una hoja aparte, al final del texto, pero debe estar nombrada dentro de éste.
2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 (2) 76
Las tablas deben ser sencillas y contener sólo la información
indispensable para claridad del trabajo. Su formato puede o no llevar
líneas verticales; se recomienda dejar solamente las horizontales
necesarias para destacar el encabezamiento (títulos y subtítulos de las
columnas) y para cerrar los datos, al final de la misma. La tabla debe estar
identificada por un número y por un título, el cual debe ser claro y auto-
explicativo. Los datos no deben ser una repetición de los del texto o de
alguna figura y deberán limitarse a aquellos indispensables para claridad
del artículo científico.
Ejemplo:
Los valores contenidos en las tablas deben usar el punto (.) para
separar los miles y la coma (,) para los decimales, ejemplo 1.545,20.
La tabla puede incluir abreviaturas y llamadas, las cuales se identificarán con letras minúsculas (usadas a manera de exponentes para que no se
confundan con los correspondientes a diferencias estadísticas). Las llamadas se aclararán en las notas de pie. Cuando hay niveles de significación
estadística, se indican con asteriscos (uno a tres) y se explican en las notas del pie de la tabla.
El número de tablas a incluir en el artículo deben ser las estrictamente necesarias
Figuras
Por figuras se entienden diferentes ilustraciones como fotografías, gráficas, mapas, dibujos, etc. Al igual que las tablas, deben tener un título claro, y
estar numeradas en el orden en que se citan en el texto. Deben ser muy nítidas y de buen tamaño, teniendo en cuenta que su calidad disminuye en el
proceso de impresión, y que en dicho proceso ellas no se ampliarán sino que muy probablemente se reducirán.
Las fotografías deben ser en papel brillante y con buen contraste, y estar bien enfocadas sin elementos distractores (etiquetas elaboradas a mano
con letras más grandes que el sujeto a destacar); también se aceptan transparencias a color de buena calidad o imágenes electrónicas en formato JPG
entre 500 y 1000KB en su respectivo diskette o CD.
En cuanto al número de fotografías a incluir deben ser las estrictamente necesarias y preferiblemente en una composición.
Las gráficas deben ser sencillas en la medida que lo permita el trabajo y todos sus elementos deben estar identificados claramente. Cuando se
elaboren mediante el uso de computador debe incluirse los archivos en el disquete o un disco compacto, indicado en la etiqueta el programa y la
versión del mismo. Utilizar tramas y tonos de gris contrastantes. Se prefiere que las gráficas no sean a color.
Las l̈eyendas ̈de las figuras y las convenciones, si las hay, deben quedar dentro del área del gráfico colocadas en una posición conveniente de
manera que faciliten la interpretación.
Los pies de figuras o títulos de estas deben elaborarse en una página aparte y no dentro del área de la gráfica del archivo electrónico, el texto debe
ser lo suficientemente descriptivo como para que se pueda entender sin recurrir al texto.
Cada figura debe estar identificada al respaldo con su número correspondiente y con el nombre del autor del artículo. Figuras desalineadas, con
líneas borrosas o fotocopias no serán aceptadas.
Solamente incluir las estrictamente necesarias (los costos de separación de color e impresión son muy altos). Nota: Para mayor ilustración respecto a
estas normas se pueden consultar las guías para preparación de artículos de “Plant Disease”, “Phytopathology” y especialmente las instrucciones para
los autores de la Revista Corpoica 2(1): 64-70, 1997
Tabla 5. Incidencia y severidad de la Antracnosis en mango cultivar Haden-
ICA, bajo diferentes medidas de manejo de la enfermedad, durante 1993.
Tratamientos Incidencia
(%)
Severidad
(%)
1 Aspersión floración 81,7 AB 50 A
2 Aspersión frutos alfileres 80,33 AB 50 A
3 Aspersión frutos con 50% de
maduración
73,33 B 40 AB
4 Aspersiones floración y frutos
alfileres
74,33 B 40 AB
5 Aspersiones floración y frutos con
50% maduración
72,66 B 38 AB
6 Aspersiones floración a cosecha (8
aspersiones)
50,50 C 20 C
9 Podas floración a cosecha 66,67 B 45 A
12 Aspersiones floración a cosecha y
podas
25,34 D 10 D
13 Testigo absoluto 90,0 A 55 A
ARBITROS
Ana Cecilia Velasco Fernández Bacterióloga
Bernardo Villegas Estrada Ing. Agr. – M Sc Fitopatología
Bertha Lucia Castro C Ing. Agr. M Sc.Fitopatología
Diana Marcela Vanegas Villa Adm. C Agr. – M Sc. Biotecnología
José Maria Hernández Murillo Ing. Agr. – Espec. En Fitopatología
Maria Luisa Guzmán Bacterióloga y Laboratorista Clínica
Mauricio Castaño Jaramillo Ing. Agr.
Nelson Bravo Otero Ing. Agr. – M Sc Sistemas de Semilla
Octavio Montoya Estrada Ing. Agr.
COMITÉ CIENTIFICO
Alberto Páez Redondo Ing. Agr. – M Sc Fitopatología
Benjamín Pineda López Ing. Agr. – M Sc Fitopatología
Bernardo Villegas Estrada Ing. Agr. – M Sc Fitopatología
Carlos Germán Muñoz Perea Ing. Agr. – Ph D in Plant Sciences
Diana Marcela Vanegas Villa Adm.CAgr. M Sc. Biotecnología
Edwinson Alberto Rojas Triviño Microbiólogo – M Sc Fitopatología
Elizabeth Álvarez Cabrera Ing. Agr. – Ph D Fitopatología
Francia Varón de Agudelo Ing. Agr. – M Sc Fitopatología
Francisco José Morales Garzón Ing. Agr. – Ph D Virología
Gerardo Martínez López Ing. Agr. – Ph D Virología
Gloria María Mosquera Cifuentes Bacterióloga – Ph D Fitopatología
Gustavo Adolfo Prado Ing. Agr. – M Sc Ciencias Agrícolas
Iván Lozano Potes Biólogo Genetista – M Sc Ciencias
Jairo Castaño Zapata Ing. Agr. – Ph D Fitopatología
Jesús Eliecer Larrahondo Aguilar Químico – Ph D Fitoquímica
Jesús Humberto Gil Gonzales Quimico- Ph D Ciencias Químicas
Jhon Jairo Méndez Arteaga Lic. Bio-Química, - Ph D Ciencias Químicas
Jorge Enrique Gómez Hurtado Ing. Agr. – M Sc. Fitopatología
Jorge Ignacio Victoria Kafure Ing. Agr. – Ph D Bacteriología
José María Hernández Murillo Ing. Agr. – Espec. Fitopatología
Juan Carlos Ángel Sánchez Ing. Agr. – M Sc Fitopatología
Juan Gonzalo Morales Osorio Ing. Agr, - Ph D
Liliana María Hoyos Carvajal Ing. Agr. – Ph D Biología
Marina Sánchez de Prager Ing. Agr. – Ph D Suelos y Aguas
Maritza Cuervo Ibañez Ing. Agr. - M Sc Rec. Fitogenéticos
Mónica Betancourth Vásquez Ing. Agr. – Ph D Biotecnología
Oscar Adrián Guzmán Piedrahita Ing. Agr.– M Sc Fitopatología
Pedro Alfonso Alarcón Gómez Ing. Agr. – M Sc Fitopatología
Rodrigo Orlando Campo Arana Ing. Agr. – Ph D Fitopatología
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