Risa Anita, Krifaton Csilla, Divinyi Dalma Maja, Kukolya ... · NI1 91% 84% NI2 84% 84% Nem...

Risa Anita, Krifaton Csilla, Divinyi Dalma Maja, Kukolya József és Kriszt Balázs

• Aflatoxin B1 (AFB1) az egyik legveszélyesebb mikotoxin

• Termelői: Aspergillus flavus, A. parasiticus

• Genotoxikus, karcinogén (IARC Group 1), teratogén, immunszuppresszív

• Megjelenés: kukorica, gabonák, magvak, fűszerek

• Elterjedés: korábban trópusi területeken, ma már kontinentális éghajlaton is, így hazánkban is (Dobolyi et al., 2013)

http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/topics/Mycotoxins/Article%20Images/Fig04_Asp_peanut.jpg

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/4/40/AflatoxinB1-balls.png/200px-AflatoxinB1-balls.png

• Szennyezés megelőzése: pre-harvest technológiák

• DE!

Manapság egyre több riasztás szennyezett takarmányok, élelmiszerek

Mikotoxin-mentesítési technológiák

• Kémiai technológiák: savak, oxidálószerek (ózonizálás)

• Fizikai megoldások: adszorbensek (bentonit, élesztő sejtfal)

• Biológiai ágensek:

• biodegradáció, biodetoxifikáció élő mikroorganizmusok, enzimek által

• mikrobiológiai készítmények takarmányokhoz keverése

• Két bizonyítottan AFB1-bontó Rhodococcus törzs használata:

• R. erythropolis NI1

• R. rhodochrous NI2

• Sejtmentes extraktumokkal teljes biodetoxifikáció

• Két kísérleti beállítás:

• Extra- és intracelluláris kivonatok

• Konstitutív és indukált termelődésű enzimek vizsgálata

• Enzimatikus folyamatok pH-toleranciájának vizsgálata

http://2013.igem.org/wiki/images/thumb/a/a4/TUM13_biodegradation.png/300px-TUM13_biodegradation.png

Baktériumkultúra felszaporítása

Extracelluláris kivonatok – Inokulum contrifugálása

– felülúszó szűrése (0,2 µm)

Intracelluláris kivonatok – Inokulum centrifugálása –Sejtek átmosása foszfát

pufferben (pH=7) –Ultrahangos sejtroncsolás

cirkon porral (6*1 perc) –Centrifugálás, felülúszó

szűrése (0,2 µm)

Konstitutív / indukált enzimek vizsgálata Indukálás: előinkubáció AFB1 jelenlétében

Inkubáció: 3 nap 28°C

• Biodegradáció

• Extraktumok kontaminálása toxinnal (1 µg/mL AFB1)

• Kémhatás: pH= 7; 7,5 és 8

• Inkubáció: 6 óra, 37°C

• Negatív kontroll vizsgálat

• Bontó enzimek emésztése: Proteináz K + 1% SDS 1 órán keresztül

• Kontaminálás a toxinnal (1 µg/mL AFB1)

• Inkubáció: 6 óra, 37°C

• Genotoxicitás vizsgálata

• SOS-Chromo teszt

• Maradék toxinkoncentráció vizsgálata

• HPLC-FLD (Wessling Hungary Kft.)

SOS-Chromo

teszt

Indukciós faktor (IF)

pH=7 pH=7,5 pH=8

Konstitutív Indukált Konstitutív Indukált Konstitutív Indukált

0h 6h 0h 6h 0h 6h 0h 6h 0h 6h 0h 6h

AFB1 kontroll

2,61 2,38 2,61 2,55 2,29 2,22 2,29 2,22 2,15 2,12 2,15 2,12

NI1 1,49 0,95* 1,19* 1,12* 1,83 1,24* 1,39* 1,14* 1,87 1,26* 1,40* 1,21*

NI2 1,35 1,00* 1,33 0,95* 1,54 1,22* 1,39* 1,31* 1,63 1,14* 1,52 1,28*

HPLC-FLD pH=7; 6h

Degradációs potenciál %

Konstitutív Indukált

AFB1 kontroll - -

NI1 91% 84%

NI2 84% 84%

Nem genotoxikus: IF < 1,5; * p<0,05

1. Extracelluláris kivonatok: genotoxicitás megmaradt 2. Intracelluláris kivonatok:

Szórás kisebb, mint 0,3

Degradációs potenciál %

pH=7; 6h Konstitutív

AFB1 kontroll + Proteináz K -

NI1 + Proteináz K 10%

NI2 + Proteináz K 0%

• NI1 és NI2 törzsek konstitutív és indukált intracelluláris enzimjei felelősek az AFB1 biodetoxifikációjáért

• A proteináz K + SDS-sel történt emésztés igazolta az enzimatikus bontást

• Teljes biodetoxifikáció és 84-91%-os biodegradáció történt

• A detoxifikációs folyamat 6 órán belül lezajlott

• A bontó enzimek stabilan működnek pH=7-8 között

http://healinggourmet.com/wp-content/uploads/2014/02/wheat-300x285.jpg

Enzimalapú takarmány-adalékanyag kifejlesztése

KÖSZÖNÖM A MEGTISZTELŐ FIGYELMET!

Ezt a munkát a 1476-4/2016/FEKUT és a VKSZ-12-1-2013-0078 támogatta