Seminari di approfondimento sulla Biochimica per docen di ...Alessio Scarafoni DeFENS Università...

SeminaridiapprofondimentosullaBiochimicaperdocen4discienze

organizza4daCusMiBio

nell’ambitodelproge;oILinceiperunanuovadida?canellaScuola

30novembre2016–AulaV10viaVenezian15ore15.00

Titolo:GlienzimiediloroinibitorinaturaliDo;.AlessioScarafoniDipar'mentodiScienzepergliAlimen',laNutrizioneel’Ambiente,SezioneScienzeChimicheeBiomolecolari,UniversitàdegliStudidiMilanoTitolo:Cibo,prevenzioneesaluteDo;.MauroCortelliniDipar'mentodiMedicinaPreven'vaePrediBva,FondazioneIRCCSIs'tutoNazionaledeiTumoriMilano

E’previstalaconsegnadelcer'ficatodipartecipazionevalidoperl’aggiornamentodocen'

Obie?vi• Promuovereunaggiornamentocon'nuosuitemipiùaJualidellebioscienze.• CoinvolgereaBvamentegliinsegnan'nellacostruzionedinuoveunitàdidaBcheteorico-pra'chesutema'cheaJualielegateainuoviobieBvidiapprendimento.Programma• Seminaridiapprofondimento,tenutidadocen'universitari,sutema'chechehannocomenucleoprincipalelabiochimica.• Cos'tuzionedigruppidilavorocoordina'dacollaboratoridelCusMiBio,chesvolgerannounaaBvitàdiformazionecon'nuaconlarealizzazionedipercorsididaBcidiapprofondimentosullabiochimica.

Alessio Scarafoni

DeFENS Università degli Studi di Milano

Via Celoria 2 20133 Milano

Tel. 02 50316820

alessio.scarafoni@unimi.it

Le reazioni enzimatiche

Una reazione chimica è un processo che porta alla formazione di nuove sostanze (prodott i ) trasformando le molecole di partenza (reagenti)

S P

Keq = P S

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Le reazioni enzimatiche

Gli enzimi

Sono macromolecole biologiche (proteine) con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze - CATALIZZATORI

Gli enzimi sono catalizzatori biologici

Gli enzimi aumentano la velocità con cui l’equilibrio di una reazione viene raggiunto

Presentano alta specificità di substrato e prodotto

Catalizzano reazioni in condizioni blande (fisiologiche) rendono più moderate le condizioni di reazione

Gli enzimi

Gli enzimi

Gli enzimi

Gli enzimi

Cinetica enzimatica Equazione di Michaelis Menten

Fasi di una reazione enzimatica

Gli enzimi

Cinetica enzimatica Equazione di Michaelis Menten

Gli enzimi

Cinetica enzimatica Equazione di Michaelis Menten

Il valore della Km è importante perché:

a) è una costante specifica per ogni enzima

b) è una stima della affinità per il substrato

c) lo studio dell' effetto di diversi composti sulla Km permette di identificare eventuali inibitori.

Gli enzimi

Gli enzimi

Gli enzimi

Solo una parte della molecola è coinvolta nella catalisi MA Tutta la molecola è importante. Alterazioni a siti distanti dal sito catalitico possono variare (ridurre) l’attività enzimatica

Modello chiave nella serratura

Gli enzimi

Gli enzimi

Esochinasi

Gli enzimi

Gli enzimi

T Temp

Atti

vità

Atti

vità

0

pH

Denaturazione

Gli enzimi

Gli inibitori

Una sostanza che diminuisce o annulla la velocità di una reazione biochimica è detta inibitore

Inibitori irreversibili (inattivazione) Inibitori reversibili:

Incompetitiva Non competitiva

Competitiva

L’inibizione

L’inibizione

Inibizione non competitiva

L’inibizione

L’inibizione

Inibitori competitivi

Inibizione competitiva

Inibitori competitivi

Inibitori competitivi

Gli inibitori competitivi sono inibitori reversibili che si legano al sito attivo, alterando la Km ma non la Vmax

L’inibizione

L’inibizione da feedback è resa possibile da una proprietà detta ALLOSTERIA Possiede due siti: uno per il substrato (s.a.) ed uno allosterico dove si lega l’inibitore Quando l’inibitore si lega, conformazione dell’enzima varia ed il substrato non più legarsi

CLASSIFICAZIONEENZIMI

classe 4podireazionecatalizzata

1ossidoredu;asi reazionidiossido-riduzione

2transferasi trasferimen'digruppidiatomidaun donatoreadunacceJore

3idrolasi idrolisidilegami

4liasi roJuralegamiC-C,C-O,C-N,comprese reazionicheeliminanoacqua

5isomerasi interconversionediisomeri

6ligasi unionediduemolecoleconaccoppiata idrolisidiATP

Gli enzimi

Gli inibitori naturali

Cosa sono gli inibitori naturali? Quale ruolo hanno?

Gli inibitori naturali

Ruolo di difesa contro: - Predatori - Patogeni

“Inibiscono enzimi chiave per la vita dell’aggressore”

Ruolo di regolazione cellulare: germinazione

Gli inibitori naturali

Gli inibitori naturali

Inibitori di proteasi Inibitori di amilasi Inibitori di glucanasi

Quindi agiscono su enzimi digestivi

Sono conosciuti anche con il nome di fattori antinutrizionali

Hanno natura proteica

Protein family

Examples Type of protein Source Adverse activity Beneficial activity

Proteinase inhibitors

BBI Small, compact Many seeds Inhibition of endogenous

proteolytic enzymes

Anticarcinogenic, anti-inflammatory

Amylase inhibitors

2S albumin Small Many seeds Inhibition of endogenous

amylolytic enzymes

Anti-obesity, diabetes, metabolic

syndrome

Storage proteins

Conglycinin α’ subunit

Large chain Soybean Not applicable Hypolipidemic

Gamma conglutin

Large chain Lupin Not applicable

Hypoglycemic

Vicilin Fragment Lupin Not applicable Lectin

Lectins PHA Medium size Many legume seeds

Hemagglutination Immuno-modulation

Peptides ACEIn Small Few seeds Not known Hypotensive

Thiamine BP PA2 Small Many seed Not applicable Vitamin vehiculation

Gli inibitori naturali

Gli inibitori naturali

Presenti in tutte le piante

Possono trovarsi accumulati in certi organi (es: semi)

Oppure Venire sintetizzati al bisogno (in seguito ad un attacco)

La proteolisi

Le proteasi

• Tripsina: estremità –COOH di K e R (n-1 diverso da P)

• Chimoripsina: estremità –COOH di F, Y, W

• Lys-C: estremità –COOH di R

• Clostripaina: estremità –COOH di R

• Carbossipeptidasi A: rilascia tutti tranne P, R e K

• Carbossipeptidasi B: rilascia tutti tranne P

Gli inibitori naturali

Inibitori competitivi

Gli inibitori naturali

Inibitore di Kunitz

Gli inibitori naturali

Inibitore di Bowman-Birk

L’attività di un enzima si misura in U.I.

Le unità enzimatiche si definiscono per ogni enzima

Misurare l’attività di un enzima

Misurare l’attività di un enzima

1/2

L’attivitàdegliinibitoridellatripsinavienevalutataattraversoil

TrypsinInhibitorActivity(TIA),unparametrochecorrelailrapportotralamassadell’enzimainibitoelamassadelcampioneanalizzatoincuisipresumepossaessercil’inibitore

proteico.

SeguendolaNormaISO14902:2001,

l’attivitàinibitorianeiconfrontidellatripsinavienemisurataaggiungendo

adaliquotedeicampioniilbenzoil-L-arginina-para-nitroanilide

(L-BAPA).

TIA=

i=[(Ar-Abr)-(As-Abs)]\(Ar-Abr)mi=massadellatripsinainmilligrammidi=diluizionedelcampionemo=massadelcampioneingrammi

Misurare l’attività di un enzima

SEMEDISOIA

Minerali

Vitamine Proteine

Lipidi Carboidrati

Un esempio

PRO–  B u o n a f o n t e

nutrizionale–  Proteine–  Isoflavonoidi–  Omega3eOmega6–  Fitoestrogeni

CONTRO–  Inibitoriproteici–  Lectine–  Ureasi–  Acidifitici–  Lipossigenasi

Un esempio

BowmanBirkInhibitor KunitzInhibitor

PM:8kDa

Termostabile

PM:20kDa

Termolabile

(pdb:1K9B) (pdb:1AVU)

Un esempio

Un esempio

Gli inibitori naturali

Inibitori di amilasi

Amilasi

Gli inibitori naturali

Inibitore non competitivo

Le attività criptiche

Many kinds of bioactive peptides which might prevent

lifestyle-related diseases are released from food

proteins after enzymatic digestion.

Le attività criptiche

Proteolysis

Gastrointestinal digestion

Germination

Fermentation

Food processing

Le attività criptiche

Source Protein Produced by Activity

Soybean Storage Enz. digestion Immunostimulation

Soybean Storage Fermentation Antihypertensive ACE inhibition

Soybean 7S globulin Enz. digestion Hypocholesterolemic

Soybean Storage Germination Lipases inhibition

Lupin 7S globulin Germination Antitumoral

Le attività criptiche

Le attività criptiche

Porzione della proteina esposta al solvente = regione

superficiale

Le attività criptiche

Le attività criptiche

Le attività criptiche

L’enzima umano Angiotensin Converting Enzyme (ACE) rappresenta una tappa fondamentale nel meccanismo del controllo della pressione sanguigna

Gli inibitori naturali

Gli inibitori naturali

Peptidi con attività ACE-inibitoria da proteine di legumi e patata

ACE inibitori

Peptidi con attività ACE-inibitoria da proteine del muscolo