Studio delle malattie genetiche Ad eredità mendelianaTalassemia, falcemia, fibrosi cistica Fenotipi...

Malattie genetiche

Ad eredità mendelianaTalassemia, falcemia, fibrosi cistica

Fenotipi complessiNeoplasie, malattie degenerative

Studio delle malattie genetiche

Complex Traits

Complex Traits

Complex Traits

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Il cancro è una malattia genetica.

Differentemente da altre malattie genetiche, a trasmissione

mendeliana oppure ad eziologia multifattoriale,

esso è principalmente causato da mutazioni de novo che avvengono

nel genoma di cellule somatiche.

Mutazioni somatiche e germinali

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Affinché si sviluppi un tumore non è sufficiente la mutazione di un

singolo gene, bensì è necessario che si accumulino all’interno della

stesso genoma differenti mutazioni, il cui numero esatto varia in

dipendenza dello specifico tipo di neoplasia

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9Figure 20-11 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

10Figure 20-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

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Il controllo della proliferazione, del differenziamento

cellulare e dell’apoptosi sono caratteristiche

fenotipiche estremamente complesse, multigeniche e

ridondanti

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15Figure 20-20b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

16Figure 20-22 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

17Figure 20-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

18Table 20-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

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Tumor cells differ from their normal counterparts in many respects:

growth control, morphology, cell-to-cell interactions, membrane properties, cytoskeletal

structure, protein secretion, and gene expression.

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Quali sono i geni le cui mutazioni possono

contribuire all’insorgenza del

fenotipo neoplastico ?

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Fattori di crescita

Recettori per i fattori di crescita

Proteine coinvolte trasduzione del segnale

Fattori di trascrizione

Proteine pro- apoptoticheoppure anti-apoptotiche

Proteine che controllano ilciclo cellulare

Proteine coinvolte nellariparazione del DNA

22Figure 20-37 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

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Geni coinvolti nell’insorgenza e nella progressione della neoplasia

Protooncogeni

Oncosoppressori

Geni codificanti proteine coinvolte nella riparazione del DNA

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Another class of genes that are commonly mutated in cancer

cells are not directly involved in controlling the cell cycle.

Instead, they have a general role as 'caretakers', ensuring the

integrity of the genome.

Loss of function mutations in these genes lead to a general

genetic instability that has long been recognized as a feature of

cancer cells.

Geni Mutatori

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What are the genes responsible for tumorigenic cell growth?

Normal

Cancer

Proto-oncogenesCell growth and proliferation

Tumor suppressor genes

+

-

Mutated or “activated”oncogenes Malignant transformation

Loss or mutation ofTumor suppressor genes

++

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Le mutazioni dei protooncogèni (che diventano oncogèni) alterano la

struttura e le funzioni del gene, e della proteina codificata,

in modo tale da determinare un cambiamento del fenotipo anche in

condizione di eterozigosi (gain of function mutations):

si comportano, quindi, in maniera dominante.

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D’altra parte, le mutazioni dei geni oncosoppressori (cioè, geni che

modulano negativamente la proliferazione cellulare),

causano perdita della funzione del gene e della proteina codificata,

si comportano in modo recessivo (loss of function mutations).

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In alcuni tipi di tumori, gli individui affetti ereditano dai genitori

alcune delle mutazioni,

che possono contribuire all’insorgenza di un determinato fenotipo

neoplastico.

La Predisposizione familiareMutazioni germinali a carico di oncosoppresori

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Sporadic and familial (Mendelian) forms of cancerKnudson’s two-hit hypothesis

Sporadic Normal tumorsuppressorgene

Single tumors,unilateral,later-onset

Somaticmutationin one allele

Somaticmutationin other allele

• two mutations (two hits) are required for loss of tumor suppressor function

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Sporadic and familial (Mendelian) forms of cancerKnudson’s two-hit hypothesis

FamilialTumor suppressor genecontaining a germlinemutation in one allele -heterozygous for themutation

Multiple tumors,bilateral,early-onset

Somaticmutationin other allele

• two mutations (two hits) are required for loss of tumor suppressor function• the first “hit” is inherited and the second “hit” is somatic

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Mutazioni geniche in grado di trasformare un protooncogenein oncogene

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Oncogenes in human tumors

Mechanisms of activation of proto-oncogenes

• point mutations

• chromosomal rearrangements or translocations

• gene amplifications

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1. Point mutations in a proto-oncogene that result in a constitutively acting protein product

2. Localized reduplication (gene amplification) of a DNA segment that includes a proto-oncogene, leading to overexpression of the encoded protein

3. Chromosomal translocation that brings a growth-regulatory gene under the control of a different promoter and that causes inappropriate expression of the gene

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An oncogene formed by the first mechanism encodes an oncoprotein that differs slightly from the normal protein encoded by the

corresponding proto-oncogene.

In contrast, the latter two mechanisms, usually, generate oncogenes whose protein products are identical with the normal proteins;

their oncogenic effect is due to their being expressed at higher-than-normal levels or in cells where they normally are not expressed.

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Il passaggio attraverso il punto di restrizione G0 richiede l’attività del fattore E2F, il quale promuove la trascrizione di geni codificanti

le proteine necessarie per la duplicazione del DNA cellulare. Questo fattore è attivato da Cdk2, Ciclina E e Ciclina A. L’attività di E2F è inibita dal legame con la proteina Rb

ipofosforilata, presente durante la fase M. Le Cdk 4/6, la Ciclina D, e successivamente la Cdk2 e la ciclina E, fosforilano Rb provocando

il rilascio e la conseguente attivazione di E2F

44Figure 20-40 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

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I danni subiti dal DNA nucleare sono identificati da un sistema di controllo, attivo durante G1 e G2, che si basa sulla attivazione dip53, un fattore di trascrizione che stimola l’espressione di p21CIP.

Questo cyclin-kinase inhibitor (CKI) si lega ai complessi Cdk-Ciclina e li inibisce, causando l’arresto del ciclo in G1 oppure in G2 finchè

il danno non sia stato riparato

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Functions of selected proto-oncogenes

Proto-oncogene Biochemical property

1. Secreted growth factorsc-sis Platelet derived growth factor

2. Growth factor receptorsc-erbB Epidermal growth factor receptor

3. Signal transduction proteinsc-abl Protein kinasec-src Protein kinaseH-ras Small G-proteinK-ras Small G-protein

4. Nuclear proteinsc-myc Transcription factorc-fos Transcription factor

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Le mutazioni a carico delle proteine Ras costituiscono un tipico esempio: infatti, una mutazione puntiforme nel gene, che codifica per questa proteina, riduce la sua attività GTPasica rendendola

costitutivamente attiva.

Guadagno di funzione

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Ras family proteins

• the c-ras family contains three genes: H-ras, K-ras, and N-ras

• the Ras proteins encoded by these genes are small G-proteins

• the proteins transmit growth signals from cell surface receptors

• the Ras proteins are activated by binding GTP

• the proteins are inactivated by GTP to GDP hydrolysis

• mutations in the c-ras genes inactivate the Ras GTPase

• mutated Ras proteins are constitutively active

• constitutively active Ras proteins result in uncontrolled cell growth

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amino acid positionRas gene 12 59 61 Tumor

c-ras (H, K, N) Gly Ala Gln normal cells

H-ras Gly Ala Leu lung carcinomaVal Ala Gln bladder carcinoma

K-ras Cys Ala Gln lung carcinomaArg Ala Gln lung carcinomaVal Ala Gln colon carcinoma

N-ras Gly Ala Lys neuroblastomaGly Ala Arg lung carcinoma

Murine sarcoma virus

H-ras Arg Thr Gln Harvey strainK-ras Ser Thr Gln Kirsten strain

Amino acid substitutions in Ras family proteins

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Le ricerche sono state condotte sul cetuximab, un anticorpo monoclonale utilizzato

per il trattamento del cancro del colon-retto metastatico ed è stato individuato un

gene (KRAS) che predice l'efficacia di questa molecola sul paziente.

I risultati mostrano che il cetuximab funziona meglio nei pazienti che non

presentano mutazioni in questo marcatore.

Questa scoperta è un altro decisivo passo avanti verso la messa a punto di terapie

sempre più mirate e su misura per il paziente.

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Una mutazione puntiforme nel gene, che codifica per la proteina Ras, riduce la sua attività GTPasica rendendola

costitutivamente attiva.

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Cetuximab è un anticorpo

monoclonale che blocca il

recettore dell’EGF.

La proteina Ras si trova a valle

di EGFR, quindi anche bloccando

il recettore non si ottiene la

risposta desiderata (blocco della

proliferazione cellulare)

WhenWhen EGFREGFR isis blocked,blocked, KRASKRAS doesdoes notnot transducetransduce proliferationproliferation signalssignals andandduplicationduplication ofof tumourtumour cellscells isis affectedaffected.. However,However, KRASKRAS mutations,mutations, casuallycasuallyoccurringoccurring inin CRCCRC patients,patients, maymay leadlead toto aa KRASKRAS permanentlypermanently turnedturned onon togethertogether withwithitsits downstreamdownstream signallingsignalling:: thisthis maymay causecause tumourtumour cellscells toto proliferateproliferate withoutwithout controlcontrol

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Ricerca delle mutazioni del gene K-Ras

nella biopsia del paziente

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Metodologia

Preparazione del DNA dalla biopsia

Amplificazione (PCR) della regione genomicadi interesse

•Sequenziamento dei frammenti ottenuti

•Saggi di discriminazione allelica medianteReal-Time PCR

Sequenziamento dei frammenti ottenuti

Discriminazione allelica

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Chromosomal rearrangements or translocations

Neoplasm Translocation Proto-oncogene

Burkitt lymphoma t(8;14) 80% of cases c-myc1

t(8;22) 15% of casest(2;8) 5% of cases

Chronic myelogenous t(9;22) 90-95% of cases bcr-abl2leukemia

Acute lymphocytic t(9;22) 10-15% of cases bcr-abl2leukemia

1c-myc is translocated to the IgG locus, which results in its activated expression2bcr-abl fusion protein is produced, which results in a constitutively active abl kinase

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La proteina, codificata da c-myc attiva la trascrizione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare

dalla fase G1 alla fase S.

Normalmente, sia l’ mRNA trascritto dal protooncogene, che la proteina sono molto instabili.

Le cellule il cui genoma contiene le mutazioni sono costitutivamente indotte a proliferare.

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sono tipiche le traslocazioni che interessano il cromosoma 8, dove è

localizzato il gene c-myc, ed uno dei tre cromosomi in cui sono

localizzati i geni che codificano per le catene pesanti e leggere delle

immunoglobuline.

La traslocazione più frequente è la [t (8:14)], che si riscontra nel

90% dei BL:

la traslocazione, spostando cMyc in prossimità dell’enhancer del

gene che codifica per una delle catene delle immunoglobuline, causa

la sua continua espressione e di conseguenza le cellule sono

costitutivamente stimolate a proliferare.

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c-myc is translocated to the IgG locus,which results in its activated expression

bcr-abl fusion protein is produced,which results in a constitutively active abl kinase

bcr-abl

bcr

abl

c-myc IgGIgG enhancerc-myc is activated bythe IgG enhancer in

lymphocytes

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A chromosome translocation that forms Bcr-Abl in a hematopoietic stem cell forms the diagnostic “Philadelphia” chromosome and results in the initial chronic phase of human chronic myelogenous leukemia (CML), characterized by an expansion in the number of well-differentiated granulocytes, a type of white blood cell. A second mutation in one such cell (e.g., in p53) leads to acute leukemia.

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The chromosomal translocation results in fusion of a portion of the bcr gene (whose function is unknown but whose N-terminal segment

forms a coiled-coil domain that links several bcr polypeptides together) with part of the c-abl gene, which encodes a protein-

tyrosine kinase whose normal substrates are not known.

The chimeric polypeptides expressed from the resulting Bcr-Abl oncogene form a tetramer that exhibits constitutive Abl kinase

activity. Although Abl is normally localized to the nucleus, addition of the Bcr segment causes the Bcr-Abl oncoprotein to be localized to the

cytosol.

Bcr-Abl binds to many intracellular signal-transduction proteins and then phosporylates them, proteins that Abl would not normally

activate.As a consequence, these signaling proteins become activated in the

absence of growth factors.

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microRNAs CAN FUNCTION AS TS AND OG

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80Figure 20-16 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

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