STUDIO ESPRESSIONE GENICA. Regolazione trascrizionale Regolazione post-trascrizionale Meccanismi...

STUDIO ESPRESSIONE GENICA

•Regolazione trascrizionale

•Regolazione post-trascrizionale

•Meccanismi epigenetici e controllo dell’espressione genica a lunga distanza

I meccanismi di controllo usati per regolare l’espressione dei geni umani devono essere molto più complessi da quelli utilizzati dagli altri organismi.

Cellula umana contiene circa 30000 geni

RNA genes

Geni per proteine

Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale (˜ 5000 geni)

Geni housekeeping Geni tessuto - specifici metabolismobiosintesimembranaistoniribosomali DIFFERENZIAMENTO

CELLULARE

A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA

NUCLEO

controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi risponsivi di geni inducibili

controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessuto-specifico

controllo del trasporto

mRNA

controllo della stabilitàdegradazionetraduzione

PROTEINA

controllo post-traduzionale

PROTEINA attiva o inattiva

DNA Meccanismi epigenetici: controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina

Trascritto primario

(precursore)

mRNA

controllo traduzionale

CITOPLASMA

Esistono molteplici livelli di regolazione dell’espressione genica negli eucarioti

Meccanismi epigenetici

Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA.

•Metilazione del DNA;

Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C. Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio della metilazione la C della doppietta CpG.

•Modificazioni degli istoni;

Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina.

Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA

La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L’estensione delle modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite l’inibizione dell’espressione genica a livello trascrizionale.

•I geni dei vertebrati attivamente trascritti sono “marcati” da “isole CpG” al 5’. In queste regioni la frequenza di CpG è uguale a quella attesa nel DNA totale (40% GC), nella restante parte del genoma è invece più bassa del 20% rispetto all’atteso

•Nel genoma umano il 56% dei geni sono associati a isole CpG: tutti i geni housekeeping ed il 40% dei geni con espressione tessuto-specifica

•I geni tessuto-specifici sono metilati in CpG nei tessuti dove non sono espressi

Quali regioni sono bersaglio della metilazione?

Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni

a livello di specifici geniImportanza della struttura modularee delle interazioni proteina-proteina

I residui amminoacidici all’N-terminale di ciascun istone (20-60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma.Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e metilazione.

Meccanismi epigenetici: Modificazioni degli Istoni

Modificazioni degli istoni H3 e H4

La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina.

Caratteristica Cromatinaattiva

Cromatinainattiva

Conformazionedella cromatina

Estesa, aperta Condensata

Metilazione delDNA

Poco metilataspecialmentenelle regionidel promotore

Metilata

Acetilazionedegli istoni

Is toni acetilati Is toni nonacetilati

CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA

Trascrizione attiva Trascrizione inattiva

Controllo Trascrizionale

Il metodo principale col quale avviene il controllo dell’espressione genica negli eucarioti è una trascrizione selettiva, che si ottiene grazie a specifiche “DNA binding proteins”.

Diversamente dai procarioti, la trascrizione dei geni eucarioti

e’ controllata da numerosi elementi

TATA

Basal tr. machinery

TBPTFIIsPol.II

PROMOTORE

PROSSIMALE CORE~ -200 ~ -50

ENHANCER(~ 1-10 kb)

Perche’? LA CROMATINA

Elementi distali Elementi

prossimali

Promotore basale

• Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al promotore prima che possa farlo la RNA polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potrà iniziare la trascrizione dipenderà anche dal legame di proteine regolatorie, attivatori e repressori.

Il promotore del gene umano dell’insulina

Nero: fattori ubiquitariRossi: fattori specifici delle cellule beta pancreatiche

Il complesso trascrizionale dell’RNA polimerasi II viene assemblato a tappe successive (in vitro)

Lodish

TBP + TAFs=TFIID

Esempio di come i diversi elementi di controllo di un gene possono integrarsi a

livello del promoter “core”

• Zinc finger ( motivo a “dita di zinco”) • Leucine zipper (serratura a leucina)• homodomain (omodomini) assomigliano strutturalmente a

regolatori batterici di tipo helix-turn-helix• Helix-loop-helix (elica-ansa-elica). Le proteine appartenenti a

questa classe, anche nota come HLH possono formare omo o etero-dimeri

• Recettori steroidei

Classi di fattori trascrizionali

Consensus response element (RE) Response to: Protein factor which recognizes RE

(T/G)(T/A)CGTCA cAMP CREB (also called ATF)

CC(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)GG Serum growth factor Serum response factor

TTNCNNNAAA Interferon-gamma Stat-1

TGCGCCCGCC Heavy metals Mep-1

TGAGTCAG Phorbol esters AP1

CTNGAATNTTCTAGA Heat shock HSP70, etc.

Metodi per studiare i fattori trascrizionali

• EMSA

• DNA footprinting

• Trasfezioni transienti

• Geni reporter

Gel Mobility Shift Assay (Electrophoresis Mobility Shift Assay, EMSA)

DNA Footprinting

Saggio per la Beta-galattosidasi

CAT

Mg2+

Luciferasi

N

S N

S

OHCOOH

+ ATP + O2

LUCIFERINA

N

S N

S

-O

+ AMP +PPi + CO2 + LUCE

OXY-LUCIFERINA

O-

Luciferasi