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Técnicas de Separação Cromatográficas
Cromatografia de exclusão molecular
Métodos Instrumentais de Análise: 2012-2013
Sumário
• Princípios básicos
• Mecanismo de separação
• Normalização do comportamento de eluição
• Curvas de selectividade
• Propriedades dos géis
• Aplicações
• Cuidados práticos
Tipos de cromatografia: Exclusão Molecular
• moléculas com pequenas dimensões permite distinguir diferenças de
Mr na ordem dos 10%;
• macromoléculas tem de ocorrer uma variação de cerca de 2 x na Mr
para ocorrer separação
• técnica usada para separar
moléculas tendo por base
diferenças nos seus
tamanhos (volumes
hidrodinâmicos)
Tipos de cromatografia: Exclusão Molecular
outras designações: Filtração em Gel; Crivagem molecular
Designação Área Fase
estacionária
Fase
móvel
Compostos a
separar
Exclusão
Molecular
ou Filtração
em Gel
Bioquímica Hidrófila
Aquosa
Biomoléculas
Permeação
em Gel
Química Hidrófoba Solventes
orgânicos
Polímeros
Cromatografia de Exclusão Molecular ou Filtração Gel:
Princípios Básicos
Scanning electron micrograph
of an agarose gel.
Magnification x 50,000.
http://www.chromatography.amershamb
iosciences.com/aptrix/
Difusão
Partícula
de gel
Gel com rede porosa tridimensional preparado sob a
forma de grânulos ou partículas esféricas Fase
estacionária
Fase móvel Eluente que atravessa a coluna
As proteínas apresentam
formas e tamanhos muito
variáveis
Proteína Massa
subunidade
(kDa)
Nº
subunidades
Ribonuclease
(pâncreas bovino)
13 .7 1
Lisozima (clara do
ovo de galinha)
14.3 1
Mioglobina (coração
de cavalo)
16.9 1
Hemoglobina
(eritrócitos de coelho)
16.0 4
Álcool
desidrogenase
(levedura)
35.0 4
Catalase
(fígado de vaca)
57.5 4
-galactosidase
(E. Coli)
130.0 4
Aspartato
transcarbamoílase
(ATCase) (E. Coli)
C - 34 kDa
R - 17kDa
12
(C6R6 )
Mecanismo de separação
• tem por base o tamanho (massa molecular relativa) e a forma das
moléculas (depende do seu raio de Stokes), utilizando as propriedades
de crivo molecular da fase estacionária
Molécula
esférica
raio de
Stokes é o raio da esfera
descrito pela rotação da
molécula ao longo do
seu eixo longo
MW 50 kDa MW 50 kDa MW 50 kDa
o raio de Stokes de uma proteína
aumenta à medida que esta assume uma
forma mais alongada (desviando-se de
uma forma globular), para a mesma MM
e densidade de empacotamento
Cromatografia de Exclusão Molecular ou Filtração Gel:
Princípios Básicos
Voet, B
iochem
istr
y, 3
e
Caracterização das colunas de exclusão molecular
vt – volume total do leito do gel na coluna
vo – volume morto da coluna (~ 35% vt)
volume de eluente exterior ao gel
vi - volume de eluente no interior do gel
vg – volume ocupado pela matriz do gel
vt = vo + vi + vg
h
r
hrv 2t
r – raio da coluna
h – altura de gel na coluna
vt vo vi vt - vo = vg + vi
b c a
Permeação
Fase estacionária
Exclusão
Fase móvel
Mecanismo de separação
Composto Comportamento Volume de eluição
moléculas com dimensões
superiores aos poros do gel (a)
passam todo o tempo na fase móvel:
são as 1as a serem eluídas ve = vo
moléculas com dimensões da
ordem dos poros do gel (b)
penetram apenas numa fracção dos
poros: são fraccionadas pelo gel vo < ve < vo +
vi
moléculas com dimensões
inferiores aos poros do gel (c)
têm acesso livre a todo o eluente
presente no interior dos poros:
são as últimas a serem eluídas
ve = vo + vi
Difusão
O volume de eluição de um componente depende das características da coluna (vt e empacotamento)
Parâmetros de distribuição
Coeficiente de distribuição, Kd - fracção da fase líquida estacionária
acessível a um componente
i
oed
v
vvK
Ve –V0 - volume da fase liquída
estacionária acessível a um componente
Vi - Volume da fase líquida estacionária no
interior dos poros dos grânulos
Ve = V0 + KdVi Expressão clássica do volume de eluição ou retenção
0 ≤ Kd ≤ 1 Ve = V0 (soluto completamente excluído Kd = 0
Ve = V0 + Vi (soluto com retenção máxima) Kd = 1
Constante de distribuição Kav
Vt - vol. total da coluna
• Vi - difícil de determinar
• Substitui-se Vi por Vt - Vo
• Vt - Vo inclui o vol. da matriz do gel (Vm)
• Vt - Vo = Vi + Vm
Vo Vt-Vo Vt
Kav = Ve - Vo
Vt - Vo
• Determinação de Ve e Vo
Perfil de eluição do azul dextrano 2 000 (fracções 4 e 5)
e do azul de bromofenol (fracções 24 a 56) em
Sephadex G 25
Cromatografia de Exclusão Molecular
MM do azul dextrano 2 000 2 000 000
Da
Curvas de Calibração
Cromatografia de Exclusão Molecular
Para cada gel e numa gama de MM de uma série homóloga de solutos
relação linear entre Kav e Ve e o log MM dos solutos
Tempo (horas)
Ab
s.
(206 n
m)
Vo
lum
e
elu
ição
(m
l)
Log MMR
Cada gel é designado pelo limite de exclusão das MM
Ex: Sephadex G200 limite de exclusão de 200 000
A escolha do gel é feita de modo a que os componentes fiquem compreendidos na
zona linear da curva
Massa molecular
Kav
Sephadex do tipo G
Cromatografia de Exclusão Molecular
Propriedades dos géis
Características ideais
disponibilidade sob a forma granular esférica na fase sólida
elevada resistência química e mecânica (não devem colapsar)
porosidade controlada e uniforme
Tipos de gel
Nome Tipo Aplicação
Sephadex gel de dextrano
entrecruzado com epicloro-
hidrina
- não podem ser fabricados com limites de exclusão
superiores a 600 000 pois o estabelecimento de um nº
de ligações cruzadas reduzidas não é suficiente para
evitar o colapso das partículas
Sephacryl gel de dextrano
entrecruzado com N-N’-
metilenobisacrilamida
- matriz semi–rígida e muito estável
- separações rápidas com elevada resolução de
moléculas de grandes dimensões
Sepharose gel de agarose - grande porosidade, ou seja, têm limites de exclusão
muito elevados
- ideal para a separação de substâncias de elevada Mr
Estrutura dos géis
Sepharose gel de agarose (polissacárido natural componente do agar)
Sephadex
gel de dextrano
entrecruzado com
epicloro-hidrina
Sephacryl
gel de dextrano
entrecruzado com
metilenobisacrilamida
Ge
l F
iltra
tio
n –
Prin
cip
les a
nd
Me
tho
ds, A
me
rsh
am
Ph
arm
acia
Bio
tech
Propriedades dos géis
Porosidade e dos grânulos condiciona a aplicação do gel
Sephadex do tipo G
Grau
(m)
Resolução da
separação
Velocidade
de fluxo
Aplicação
Superfino 10 - 40 elevada baixa Escala analítica com
elevada resolução
Fino 20 – 80 intermédia Aplicações
analíticas
Médio 50 – 150 baixa Aplicações
preparativas
Grosseiro 100 - 300 muito baixa elevada Aplicações industriais
e preparativas
Aumento do dos grânulos perda de resolução mas diminuição do tempo
de separação
Gel usado: Sephadex G100, (partículas)= 40 - 120m
Efeito do tamanho das partículas do gel
Perfis de eluição do ácido uridílico em
Sephadex G-25 de várias granulometrias
(fino, médio e grosseiro)
velocidade de fluxo 24 cm3/h
Ge
l F
iltra
tio
n –
Prin
cip
les a
nd
Me
tho
ds, A
me
rsh
am
Ph
arm
acia
Bio
tech
Ab
so
rvê
nc
ia (
28
0 n
m)
Volume de eluente (mL)
fino médio
grosseiro
= 20 -80m
= 50 -150m
= 100 - 300 m
Aplicações
(virus, proteínas, enzimas, hormonas, ac. nucleicos, polissacáridos)
Purificação de substâncias de elevada M.M.
Cromatografia de Exclusão Molecular
• Determinação da M.M. de proteínas (Ve - função linear do log. MM)
Amostra
desconhecida (0,3cm3 de sol.
5mg/cm3)
Ab
s 280n
m
0,500
0,375
0,125
Fluxo: 0,5cm3/min
Registo original: 5mm/min
Registo digitalizado:
1,75mm/min
Tempo
Padrões (0,3cm3): Citocromo c, 12kDa (2,5mg/cm3)
Ovalbumina, 43kDa (5,0mg/cm3)
g-globulina, 150kDa (5,0mg/cm3)
Ab
s 280n
m
0,500
0,375
0,250
0,125
Fluxo: 0,5cm3/min
Registo original: 5mm/min
Registo digitalizado:
1,75mm/min
Tempo
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25
Log (MM)
Kav
r2= 0,997
Citocromo c
12kDa
Ovalbumina
43kDa
-globulina
150kDa
Amostra
28kDa
Cromatografia de Exclusão Molecular MÉTODOS DE SEPARAÇÃO
CROMATOGRAFIA
• Concentração de soluções de substâncias de elevada M.M.
Sephadex G 25 seco
• Dessalificação
coluna de Sephadex G 25
• Mudança de tampão
coluna de Sephadex G 25
Cromatografia de Exclusão Molecular
Equipamento usado
.
Cuidados a observar na aplicação da amostra
• Não perturbar a
superfície do gel
empacotado na
coluna
• Não diluir a amostra
durante a sua
aplicação na coluna
• Não deixar secar a
coluna durante a
aplicação da
amostra
.
Cuidados a observar na eluição da amostra
• o aumento do fluxo utilizado
acelera a separação ...
• mas o fluxo usado na eluição
da coluna tem de dar tempo a
que ocorra a difusão da
amostra para o interior e
exterior das partículas do gel
• quanto maior a altura da
coluna, maior a resolução na
separação
Cromatografia de exclusão molecular: balanço
Cromatografia de exclusão molecular
Vantagens Desvantagens
Técnica simples, barata e rápida Baixa capacidade
(análise de um pequeno volume
de amostra)
Aconselhável para graus de
purificação de 2x a 6x
Baixa resolução
Em geral, é aplicada nas fases
finais de um processo de
purificação, podendo fornecer
informação adicional sobre a MM
da proteína
O fluxo utilizado influencia a
separação
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