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Tierärztliche Hochschule Hannover
Beurteilung von Immunglobulin A und Tau-Protein
im kaninen Liquor cerebrospinalis als diagnostische Hilfsmittel
in der klinischen Neurologie
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Andrea Rörig
Remscheid
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung:
1. PD Dr. med. vet. Veronika Stein, PhD, Klinik für Kleintiere
2. Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Tipold, Klinik für Kleintiere
1. Gutachter: PD Dr. med. vet. Veronika Stein, PhD
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Marion Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 5. November 2012
Meinen ElternMeinen ElternMeinen ElternMeinen Eltern
Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt: Rörig, A., Maiolini, A., Carlson, R., Tipold, A.:
Evaluierung eines „microsphere-based immunfluorescence assay“ zur Bestimmung von IgA im Liquor cerebrospinalis und Serum des Hundes 20. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Laboratoriumsdiagnostik“, Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft, e.V. (DVG), Gießen, 03.02.-04.02.2012
Rörig, A., Carlson, R., Tipold, A., Stein, V.M.:
Cerebrospinal fluid tau protein as a prognostic biomarker for recovery in canine intervertebral disk disease 25th
Annual Symposium of the European Society (ESVN) and European College (ECVN) of Veterinary Neurology, “Epilepsy”
Ghent, Belgien, 14.09.-15.09.2012 Rörig, A., Carlson, R., Tipold, A.:
Evaluation of a microsphere-based immunofluorescence assay for the determination of immunoglobulin A concentrations in cerebrospinal fluid of dogs 25th
Annual Symposium of the European Society (ESVN) and European College (ECVN) of Veterinary Neurology, “Epilepsy”
Ghent, Belgien, 14.09.-15.09.2012
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG UND LITERATURÜBERSICHT.................. .................................. 7
2. MATERIAL UND METHODEN.............................. ............................................ 15
2.1. IgA – Microsphere-based immunofluorescence assay ... ......................... 15
2.1.1. Patientenmaterial ....................................................................................... 15
2.1.2. Material ...................................................................................................... 17
2.1.3. Methode ..................................................................................................... 21
2.1.4. Statistische Auswertung - Methodenvergleich............................................ 28
2.2. Messung von Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis .. ............................ 30
2.2.1. Patientenmaterial und Datenerhebung...................................................... 30
2.2.2. Liquorentnahme ......................................................................................... 33
2.2.3. Material ...................................................................................................... 34
2.2.4. Messung des Tau-Proteins ........................................................................ 36
2.2.5. Statistische Auswertung ............................................................................. 40
3. ERGEBNISSE................................................................................................... 41
3.1. Measurement of IgA in canine CSF using MIA......... ................................. 41
3.2. CSF Tau in dogs with IVDH.......................... ............................................... 43
4. ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ........................... ......................................... 67
5. ZUSAMMENFASSUNG .................................... ................................................ 78
6. SUMMARY........................................................................................................ 81
7. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS.............................. ........................................... 83
8. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS ................ ............................ 85
9. LITERATURVERZEICHNIS ............................... ............................................... 86
10. ANHANG............................................. ............................................................ 106
11. DANKSAGUNG ......................................... ..................................................... 122
Einleitung und Literaturübersicht
7
1. Einleitung und Literaturübersicht
Der Liquor cerebrospinalis (CSF) ist eine klare, farblose, zellarme Flüssigkeit, die das
zentrale Nervensystem (ZNS) umgibt, es schützt und versorgt. Des Weiteren dient
der Liquor dem Transport von neuroendokrinen Substanzen und Neurotransmittern
sowie der Aufrechthaltung eines gleichmäßigen intrakraniellen Drucks. Auch eine
exkretorische Funktion wird der Gehirnrückenmarksflüssigkeit zugesprochen
(TIPOLD 2003; DE LAHUNTA 2009). Der Großteil des Liquors wird von den Plexus
chorioidei in den Ventrikeln als Ultrafiltrat aus dem Blut gebildet. Die Produktionsrate
variiert je nach Spezies und wird für den Hund mit 0,047 ml/min angegeben (DE
LAHUNTA 2009).
Die Rückresorption des CSF in die Blutbahn erfolgt teils über arachnoidale Zotten,
teils über leptomeningeale Gefäße, aber hauptsächlich aus dem Subarachnoidal-
raum. Das gesamte Volumen des Liquor cerebrospinalis wird innerhalb eines Tages
3-5 mal produziert und resorbiert (JAGGY 2005; DE LAHUNTA 2009).
Die Liquorentnahme erfolgt unter Allgemeinanästhesie in der Regel subokzipital und
seltener lumbal, da hier die Gefahr einer iatrogenen Blutkontamination höher ist
(BAILEY u. HIGGINS 1985). Allerdings weisen lumbal gewonnene Proben bei der
Diagnose von kaudal der zerebellomedullären Zisterne gelegenen Läsionen eine
höhere Aussagekraft auf (THOMSON et al. 1989, 1990).
Pathologische Veränderungen im ZNS können die Zusammensetzung des Liquor
cerebrospinalis beeinflussen, so dass die Liquoranalyse ein wichtiger Bestandteil der
neurologischen Diagnostik ist. In der routinemäßigen Untersuchung wird neben
Aussehen (Farbe, Durchsichtigkeit oder Trübung), Protein-, Glukose- und Zellgehalt
auch das Differentialzellbild beurteilt. Die Liquoruntersuchung besitzt eine hohe
Sensitivität aber niedrige Spezifität für die Diagnose einer Erkrankung. Nicht jede
neurologische Erkrankung geht mit Veränderungen im Liquor einher (DI TERLIZZI u.
PLATT 2006). Trotzdem ist diese spezielle Untersuchung hilfreich, denn zusammen
mit Signalement, Anamnese, Blutuntersuchung und Klinik kann sie die Diagnostik
neurologischer Erkrankungen beim Hund effektiv unterstützen (TIPOLD et al. 1995;
ABATE et al. 1998).
Einleitung und Literaturübersicht
8
In den letzten Jahrzehnten wurde das Spektrum der Liquoranalyse deutlich erweitert.
Mittels verschiedener Methoden können unter anderem Antikörper, Krankheits-
erreger, Proteine, Enzyme und Neurotransmitter im Liquor bestimmt und für die
Abklärung von Differentialdiagnosen interpretiert werden (TIPOLD et al. 1994;
OLBY et al. 1999; SCHATZBERG et al. 2003; LEVINE et al. 2006; KWON et al.
2010; LEVINE et al. 2010). So ist zum Beispiel die Messung des so genannten IgG-
Index hilfreich, denn dieser erlaubt die Unterscheidung einer entzündlichen oder
infektiösen Erkrankung des ZNS von anderen zentralnervösen Krankheiten
(TIBBLING et al. 1977).
Die parallele Messung von Immunglobulin A (IgA) in Serum und Liquor
cerebrospinalis ist ein wichtiges Hilfsmittel bei der Diagnose der steril-eitrigen
Meningitis-Arteriitis (SRMA) des Hundes (MAIOLINI et al. 2012). Diese entzündliche
Erkrankung des ZNS ist weit verbreitet und wird besonders bei jungen Hunden
diagnostiziert (TIPOLD 1995; CIZINAUSKAS et al. 2000). Eine exzessive
systemische und intrathekale IgA-Synthese, die sich in der gemeinsamen Erhöhung
von IgA in Serum und Liquor widerspiegelt, ist neben den typischen klinischen
Symptomen wie rezidivierendes Fieber, steife Kopf-Hals-Haltung und Schmerzhaftig-
keit in der Halswirbelsäule, charakteristisch (TIPOLD u. JAGGY 1994;
CIZINAUSKAS et al. 2000).
Immunglobulin A ist das wichtigste Immunglobulin der epithelialen Immunabwehr und
ist deshalb vor allem im Speichel, in der Tränenflüssigkeit sowie in den Sekreten des
Gastrointestinal-, des Respirations- und des Urogenitaltraktes vorzufinden (TIPOLD
et al. 1994; TIZARD 2009). Das kanine Immunglobulin A kann eine monomere oder
dimere Form annehmen (DAY u. PENHALE 1988; TIZARD 2009). Der normale
systemische IgA-Gehalt ist altersabhängig, wobei junge Hunde im Allgemeinen
niedrigere Serumwerte besitzen (GLICKMAN et al. 1988; SCHREIBER et al. 1992;
GINEL et al. 1993). Die in der veterinärmedizinischen Literatur angegebenen
Referenzwerte für den IgA-Gehalt im kaninen Serum sind uneinheitlich und
schwanken zwischen 10,9 µg/ml und 1790 µg/ml (REYNOLDS u. JOHNSON 1970;
HEDDLE u. ROWLEY 1975; FELSBURG et al. 1985; GLICKMAN et al. 1988;
SCHREIBER et al. 1992; TIPOLD et al. 1994; GRIOT-WENK et al. 1999).
Einleitung und Literaturübersicht
9
Physiologischerweise wird im ZNS die humorale Immunantwort durch
Immunglobulin G dominiert (FELGENHAUER u. SCHÄDLICH 1987). Bei
verschiedenen neurologischen Erkrankungen, vor allem bei Entzündungen und
Tumoren, konnte jedoch eine zusätzliche starke Beteiligung von IgA nachgewiesen
werden (BUDKA et al. 1985; FELGENHAUER u. SCHÄDLICH 1987; TIPOLD
et al. 1994). Die genaue Funktion von IgA im ZNS ist bisher nicht bekannt (BUDKA
et al. 1985; TIPOLD et al. 1994). WOO et al. (1993) vermuten, dass intrathekales IgA
zum Schutz des ZNS Antigene neutralisiert und somit dem Erhalt der wichtigen
neuronalen Funktionen dient. Da aber unterschiedliche Erkrankungen des
Nervensystems mit einer Erhöhung der IgA-Konzentration einhergehen, ist zu
vermuten, dass die IgA-Synthese nicht antigenspezifisch erfolgt (BUDKA et al. 1985).
Der erhöhte IgA-Gehalt im ZNS ist auf eine intrathekale IgA-Synthese
zurückzuführen, denn aufgrund der dimeren Form erscheint das Passieren der Blut-
Hirnschranke unwahrscheinlich (WOO et al. 1993; TIPOLD et al. 1994;
TIZARD 2009). Die Messung von IgA im Liquor kann daher auch einen Hinweis auf
einen intrathekalen, primären oder sekundären Entzündungsprozess geben.
Zum Nachweis von Immunglobulin A wurde früher ein radial immunodiffusion assay
(RID) angewendet, welcher auch als Basis für den heute üblichen Enzyme-linked-
immunosorbent-assay (ELISA) diente (HEDDLE u. ROWLEY 1975; TIPOLD
et al. 1994). Da der ELISA einige Nachteile mit sich bringt - so können zum Beispiel
Einzelproben nur mit hohem zeitlichen Aufwand und Materialverbrauch analysiert
werden - bedarf es einer alternativen Messmethode.
Die Durchflusszytometrie ist ein seit langem etabliertes labordiagnostisches
Verfahren, mit dessen Hilfe verschiedene Eigenschaften von Zellen, wie Größe oder
Komplexität, gemessen werden kann. Das Prinzip der Durchflusszytometrie besteht
darin, dass die zu messenden Partikel in einem Flüssigkeitsstrom einzeln einen
Laserstrahl passieren. Die durch diese Teilchen verursachte Lichtstreuung wird
registriert. Zusätzlich können die Zellen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern
markiert werden; dies ermöglicht eine weitere Sortierung der Partikel. Die an den
Detektoren gesammelten Signale werden in elektrische Signale umgewandelt,
Einleitung und Literaturübersicht
10
digitalisiert und mittels geeigneter Softwareprogramme ausgewertet (JAROSZESKI
u. RADCLIFF 1999).
Schon seit längerer Zeit ist diese Methode in ihrer Anwendung jedoch nicht mehr
ausschließlich auf Zellen begrenzt, sondern kann für die Detektion jeglicher Art
von Partikeln, einschließlich Mikrosphären, genutzt werden (JAROSZESKI u.
RADCLIFF 1999). Mikrosphären, auch „Beads“ genannt, sind im Durchmesser 5-20
µm kleine sphärische Gebilde, welche analog zum ELISA als Festphase für
biochemische Nachweisreaktionen dienen können. Da die Stärke der
Fluoreszenzintensität proportional zur Menge des zu messenden Analyten ist,
können die Konzentrationen mittels mitgeführter Standardproben berechnet werden
(WILSON u. WOTHERSPOON 1988).
Verschiedene Autoren konnten eine gute Übereinstimmung zwischen den
Messergebnissen eines ELISA und eines “microsphere-based immunofluorescence
assay“ (MIA) feststellen, insbesondere ein niedriger Intraassay-Variationskoeffizient
und eine gute Linearität wurden beschrieben (MCHUGH et al. 1989; SYRJALA et al.
1991; KWITTKEN et al. 1994).
Humanes Immunglobulin G und E konnte mit Hilfe von Mikrosphären quantitativ
bestimmt werden (LISI et al. 1982; KWITTKEN et al. 1994).
In der Veterinärmedizin hat sich dieses moderne Messverfahren bisher wenig
etabliert. PAUL et al. (2005) nutzten die Technik zur Messung von Anti-Histon-
Antikörpern im Serum von Hunden mit Verdacht auf Systemischen Lupus
erythematodes, während BRESHEARS et al. (2010) die Detektion von
Matrixmetalloproteinasen in kaninen Kreuzband-Zellkulturen mittels multiplexer
Bead-Technologie beschreiben.
Die vorliegende Arbeit schildert die Entwicklung und Evaluierung eines „microsphere-
based immunofluorescence assay“ zur Bestimmung von Immunglobulin A in Serum
und Liquor cerebrospinalis des Hundes. Die beschriebene Entwicklungsarbeit soll die
Grundlage bilden, dieses neue Messverfahren zur Bestimmung verschiedener
Analyten im CSF einzusetzen.
Einleitung und Literaturübersicht
11
In einer zweiten Studie wurde die Liquoranalyse eingesetzt, um die Prognosestellung
bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen zu ergänzen: in Zusammenhang mit einem
Bandscheibenvorfall wird der Liquor cerebrospinalis zur Abklärung von Differential-
diagnosen untersucht. Verschiedene Studien haben sich in den letzten Jahren auch
mit einem möglichen prognostischen Wert der Liquoruntersuchung bei
Bandscheibenvorfällen beschäftigt (THOMSON et al. 1989, 1990; OLBY et al. 1999;
WITSBERGER et al. 2009; SRUGO et al. 2011).
Bandscheibenvorfälle beim Hund sind eine häufig diagnostizierte neurologische
Erkrankung in der Tiermedizin (FLUEHMANN et al. 2006). Die klinischen
Erscheinungsformen sind vielfältig und reichen von Hyperästhesien bis hin zu
Lähmungen der Gliedmaßen (JAGGY 2005). Eine chirurgische Therapie bewirkt in
der Regel eine schnelle Behebung der schmerzhaften Zustände und gibt dem
dekomprimierten Rückenmark die Möglichkeit zur Regeneration (COATES 2000;
DEWEY 2008).
Die Auswirkung eines Bandscheibenvorfalls auf das Rückenmark wird von mehreren
Faktoren beeinflusst. Neben der Menge des vorgefallenen Materials spielen die
Geschwindigkeit des Vorfalls und die Dauer der Kompression eine wichtige Rolle
(KEARNEY et al. 1988; CARLSON et al. 2003).
Die Verletzung des Rückenmarks ist auf primäre und sekundäre Pathomechanismen
zurückzuführen. Die primären Schäden sind Folge der direkten mechanischen
Einwirkung auf das Nervengewebe, die sekundären Schäden entstehen aufgrund
verschiedener pathophysiologischer Reaktionen (ANDERSON u. HALL 1993;
DUMONT et al. 2001). Letztgenannte beinhalten unter anderem Ischämie, Hypoxie,
Elektrolytverschiebungen, das Auftreten freier Radikale, eine übermäßige
Freisetzung des exzitatorischen Neurotransmitters Glutamat und einen anaeroben
Stoffwechsel (ANDERSON u. HALL 1993; OLBY 1999; OLBY et al. 1999; DUMONT
et al. 2001; HAUSMANN 2003).
Das Nervengewebe ist demnach einer Vielzahl schädigender Einflüsse ausgesetzt,
welche schlussendlich zum Zelltod der Neuronen durch Nekrose oder Apoptose
führen (ANDERSON u. HALL 1993; CROWE et al. 1997; LIU et al. 1997; DUMONT
et al. 2001).
Einleitung und Literaturübersicht
12
Die Schwere der Läsionen im Myelon wird mit Hilfe der Befunde der neurologischen
Untersuchung und der bildgebenden Diagnostik wie der Magnetresonanz-
tomographie (MRT) eingeschätzt. Bei plegischen Tieren ist die Frage nach der
Prognose jedoch nicht immer ausreichend zu beantworten. Bei Tieren, die keinen
Tiefenschmerz mehr aufweisen, besteht trotz der schwerwiegenden Schädigung eine
Erholungschance von 43 bis 75% (YOVICH et al. 1994; DUVAL et al. 1996; OLBY et
al. 2003; ITO et al. 2005; RUDDLE et al. 2006). Ein einfach zu bestimmender,
verlässlicher prognostischer Faktor wäre eine große Hilfe für die Bewertung der
Heilungschancen bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen.
In der Humanmedizin sind in den letzten Jahren verschiedene Biomarker zur
Beurteilung der Schwere von Rückenmarksschäden untersucht worden (BRISBY et
al. 1999; GUÉZ et al. 2003; KWON et al. 2010). Als weiterer potentieller
diagnostischer Marker könnte Tau-Protein dienen. Dieses Phosphoprotein ist
hauptsächlich in Nervenzellen und dort vor allem in den Axonen zu finden (BINDER
et al. 1985). Es unterstützt die Polymerisation von einzelnen Tubuli-Monomeren zu
Mikrotubuli, weshalb es in die Gruppe der „microtubule-associated proteins (MAP)“
eingeordnet wurde (WEINGARTEN et al. 1975; BINDER et al. 1985). Mikrotubuli
spielen eine wichtige Rolle in der Stabilisation der Zellform und in axonalen
Transportvorgängen (DRUBIN 1986; BUEE et al. 2000).
Die Kompression und Traumatisierung des Myelon bei Bandscheibenvorfällen
resultiert in Verlust von Neuronen und damit auch in der Freisetzung von
intrazellulären Proteinen in den das Rückenmark umgebenden Liquor
cerebrospinalis. Da Tau kein sekretorisches Protein ist, sind bei gesunden Menschen
und Tieren nur niedrige Tau-Konzentrationen im Liquor cerebrospinalis zu erwarten,
während erhöhte Werte auf eine Schädigung von neuronalem Gewebe hinweisen
(MORI et al. 1995).
Humanes Tau-Protein besteht aus 352 bis 441 Aminosäuren und besitzt ein
Molekulargewicht von 45 bis 65 kDa. Diese Spannweiten in Größe und Gewicht sind
in den sechs verschiedenen Isoformen begründet. Diese Isoformen unterscheiden
sich in der Anzahl der Sequenzwiederholungen am carboxyterminalen Ende des
Einleitung und Literaturübersicht
13
Proteins (drei oder vier) sowie in dem Vorhandsein von Inserts (kein Insert, ein Insert,
mehrere Inserts) am aminoterminalen Ende (GOEDERT et al. 1989a; GOEDERT et
al. 1989b).
Erhöhte Tau-Protein-Konzentrationen im CSF sind beim Menschen zuerst im
Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen, wie der weithin bekannten
Alzheimer Erkrankung beschrieben worden (BLENNOW et al. 1995; ANDREASEN et
al. 1998). Bei dieser sogenannten Tauopathie steht besonders das abnormal
hyperphosphorylierte Tau-Protein im Interesse der Forschung (GRUNDKE-IQBAL et
al. 1986; BUEE et al. 2000).
Auch bei Patienten mit Multipler Sklerose, einer Erkrankung, die mit einer
Demyelinisierung einhergeht, sind hohe Tau-Protein-Werte im CSF zu finden und
diese stehen im Zusammenhang mit der Erkrankungsdauer (TERZI et al. 2007). Es
konnte gezeigt werden, dass auch hier abnormal phosphoryliertes Tau an der
Pathogenese beteiligt sein kann (ANDERSON et al. 2008).
In der tiermedizinischen Literatur ist bisher nur wenig über Tau-Protein berichtet
worden. Lediglich die Expression von Tau-Protein im Gehirn alter Hunde und Katzen,
sowie die Konzentration von Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis bei Hunden mit
Enzephalitis wurden untersucht (HEAD et al. 2005; PUGLIESE et al. 2006; TANAKA
et al. 2011).
ZEMLAN et al. (1999) zeigten, dass erhöhte Tau-Protein-Werte im CSF von
Menschen mit Schädelhirntrauma vorkommen. Des Weiteren konnten KWON
et al. (2010) erhöhte Tau-Protein-Konzentrationen im Liquor cerebrospinalis von
Menschen mit traumatisch bedingten Rückenmarksschäden nachweisen. In dieser
Studie wurde ebenso wie in der Studie von TANAKA et al. (2011) ein ELISA genutzt,
der das sogenannte „Total Tau“ also normales und phosphoryliertes Tau detektiert.
Aufgrund der oben genannten Informationen wurde die Hypothese aufgestellt, dass
die Tau-Protein-Konzentration im CSF mit der Schwere der Schädigung des
Rückenmarks bei Hunden mit Bandscheibenvorfall korreliert und somit eine Aussage
über die Schwere der Läsion sowie über die Prognose des einzelnen Patienten
erlaubt. Da bisher nicht bekannt ist, welche Form des Tau-Proteins bei Hunden mit
Einleitung und Literaturübersicht
14
Bandscheibenvorfällen im CSF vorhanden sein könnte, wurde für die hier angeführte
Studie ebenfalls ein ELISA zur Messung von „Total Tau“ verwendet.
Die vorliegende Arbeit ist in zwei Abschnitte gegliedert: Das Ziel der ersten Studie
(Evaluation of a microsphere-based immunofluorescence assay for the determination
of immunoglobulin A concentrations in cerebrospinal fluid of dogs) war, einen
„microsphere-based immunofluorescence assay“ zu entwickeln, um ein geeignetes
Verfahren für die Untersuchung von CSF-Einzelproben zu erhalten, bei dem nur
geringe Mengen an Probenmaterial benötigt werden. Der entwickelte MIA sollte mit
einem etablierten ELISA verglichen werden.
In der zweiten Studie (Cerebrospinal fluid tau protein as a biomarker for severity of
spinal cord injury in canine intervertebral disk herniation) wurde der Schweregrad der
Schädigungen des Rückenmarks und der mögliche prognostische Wert der
Konzentrationen von Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis bei Hunden mit
Bandscheibenvorfällen untersucht.
Material und Methoden
15
2. Material und Methoden
2.1. IgA – Microsphere-based immunofluorescence ass ay
In der vorliegenden Arbeit wurde in gepaarten Serum- und Liquorproben von Hunden
die IgA-Konzentration mit der im Folgenden beschriebenen Methode („microsphere-
based immunofluorescence assay“) bestimmt. Zusätzlich wurde der intrathekale und
systemische IgA-Gehalt dieser Hunde mit Hilfe eines ELISA nach TIPOLD et al.
(1994) für Serum und Liquor cerebrospinalis sowie mit einem kommerziell
erhältlichem ELISA (Immunology Consultants Laboratory, Inc., Portland, OR, USA)
gemessen und mit den Ergebnissen des MIA verglichen.
2.1.1. Patientenmaterial
Von 44 Hunden, die in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule
in Hannover vorstellig waren, wurden gepaarte Serum- und Liquorproben in
Allgemeinanästhesie entnommen und bis zur Messung bei -20°C aufbewahrt.
Die Patienten wurden entsprechend der im ELISA nach TIPOLD et al. (1994)
gemessenen IgA-Konzentrationen in drei Gruppen eingeteilt:
- Gruppe 1: 17 Hunde mit normalen IgA-Konzentrationen
- Gruppe 2: 14 Hunde mit mittelgradig erhöhten IgA-Konzentrationen
- Gruppe 3: 13 Hunde mit hochgradig erhöhten IgA-Konzentrationen
Eine Übersicht über Signalement und Erkrankungen der Hunde gibt Tabelle 1.
Die genauen klinischen Daten und Messwerte sind im Anhang tabellarisch
dargestellt.
Material und Methoden
16
Rasse (Anzahl der Hunde)
Mischling (8) Boxer (6) Berner Sennenhund (4) Jack Russell Terrier (3) Weimaraner (2) Deutscher Schäferhund (2) Golden Retriever (2) Novia Scotia Duck Tolling Retriever Französischer Bullterrier Zwergpinscher Cocker Spaniel Französischer Griffon Portugiesischer Hirtenhund Rhodesian Ridgeback Labrador Retriever Mops Irish Setter Eurasier Kleiner Münsterländer Border Collie Katalanischer Hirtenhund
Alter Mittelwert Intervall
3,3 0,58 - 12,75
Geschlecht (Anzahl der Hunde)
Weiblich Weiblich kastriert Männlich Männlich kastriert
18 4 20 2
Diagnose SRMA Anfallsgeschehen Neoplasie Meningoenzephalitis Diskopathie sonstige
30 3 3 1 1 6
Tabelle 1: Signalement und Diagnose der Patienten im Überblick
Material und Methoden
17
2.1.2. Material
Geräte
- Reinstwasser-Aufbereitungssystem GenPure,
Fa. TKA Thermo Fisher Scientific, Niederelbert
- Durchflusszytometer FACSCalibur™ mit Apple & Macintosh™ -Computer,
Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Mikrobiologische Sicherheitswerkbank HERAsafeKS,
Fa. Thermo Fisher Scientific, Niederelbert
- Gefrierschrank Premium NoFrost, Fa. Liebherr, Ochsenhausen
- Kühlschrank Comfort, Fa. Liebherr, Ochsenhausen
- Laborwaage LabStyle204, Fa. Mettler Toledo, Giessen
- Magnetrührer mit Heizplatte, Typ MR 3001,
Fa. Heidolph, Schwabach
- Plattenrüttler Promax 1020, Fa. Heidolph, Schwabach
- Reagenzglasschüttler Reax control, Fa. Heidolph, Schwabach
- Tischzentrifuge Rotina 35R, Fa. Hettich, Tuttlingen
- Wasserbad mit Einhängethermostat,
Fa. Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach
- Plattformschüttler Polymax, 1040 Fa. Heidolph, Schwabach
- Ultraschallbad Ultrasound-7-neutral (Art. 5356),
Fa. Roth, Karlsruhe
- Synergy 2 Multi-Detektions-Reader für Mikroplatten,
Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall
Laborbedarf
- Polystyrolröhrchen 3,5 ml und 5 ml (Art.-Nr. 55.1579 bzw. 55.484.001),
Fa. Sarstedt, Nümbrecht
- Immuno Platte Maxisorp F96-well (Best.-Nr. 75-0083),
Fa. VWR, Darmstadt
Material und Methoden
18
- Einmalhandschuhe Novaglove® -Latex (Best.-Nr. 905451),
Fa. NOBA Verbandsmittel, Wetter
- Glas-Pasteurpipetten, 150 ml (Best.-Nr. 612-1798), Fa. VWR, Darmstadt
- Pipettenspitzen: 10 µl (kristall), (Best.-Nr. 702504), Fa. Brand, Wertheim
200 µl (gelb), (Best.-Nr. 613-0240), Fa. VWR, Darmstadt
1000 µl (blau), (Best.-Nr. 2100610), Fa. Ratiolab, Dreieich
- Pipetten Transferpette® einstellbar (0,1-1000 µl), Fa. Brand, Wertheim
- Pipettierhelfer accu-jet® pro, Fa. Brand, Wertheim
- Mehrfachdispenser Handy-step® (Best.-Nr. 705100), Fa. Brand, Wertheim
- Präzisionsdispenserspitzen 5 ml, 25 ml (Best.-Nr. 702376, 702380),
Fa. Brand, Wertheim
- Eppendorf Safelock-Tubes, 1,5 ml (Best.-Nr. 0030121694),
Fa. Eppendorf, Hamburg
- Bio-Spin Tris Columns (Best.-Nr.732-6231), Fa. Bio-Rad Laboratories, USA
- Bechergläser, Fa. VWR, Darmstadt
- Polypropylenröhrchen mit Deckel, 2 ml (Art.-Nr. 72.694), Fa. Sarstedt, Nümbrecht
- Reagenzröhrchen mit Verschluss, Polypropylen 15 ml (Best.-Nr. 62.554.001),
Fa. Sarstedt, Nümbrecht
Reagenzien, Chemikalien
- BSA, bovines Serumalbumin (Best.-Nr. A4503-50G),
Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim
- Dimethylsulfoxid (DMSO) (Best.-Nr. D-5879),
Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim
- Dithiothreitol (DTT) (Best.-Nr. 43815), Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim
- Sulfosuccinimidyl 4-N-maleimidomethyl cyclohexane 1-carboxylate (Sulfo-SMCC)
(Best.-Nr. 22322), Fa. Pierce Thermo Fischer Scientific, Niederelbert
- N-Ethylmaleinimid (NEM) (Best.-Nr. E1271),
Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim
- Natriumazid (NaN3; Best.-Nr. 71289)
Fa. Fluka, Neu-Ulm
Material und Methoden
19
- Tween 20 (Art.-Nr. 8.22184.0500), Fa. Merck, Darmstadt
- o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (OPD) (Best.-Nr. P8287),
Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim
- Perborat-Kapsel (Best.-Nr. P4922), Fa. Sigma- Aldrich-Chemie, Steinheim
- FACSClean (Best.-Nr. 340345), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- FACSRinse (Best.-Nr. 340346), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- FACSFlow (Best.-Nr. 342003), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Functional Bead Conjugation Buffer Set, BD™ Cytometric Bead Array (CBA)
(Best.-Nr. 558556), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Functional Beads A5 (Best.-Nr. 560031), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Coupling Buffer (Best.-Nr. 51-9004756), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Functional Bead Storage Buffer (Best.-Nr. 51-9004758),
Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Wash Buffer CBA (Best.-Nr. 51-9003797), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Canine IgA ELISA Kit (Best.-Nr. E-40),
Fa. ICL Laboratories Inc., Portland, OR, USA
Antikörper
- Ziege-gegen-kanines-IgA (Best.-Nr. A40-104A),
Fa. Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA
- F(ab´)2-Fragment-spezifisches R-Phycoerythrin (RPE)-konjugiertes F(ab´)2-
Fragment Ziege-gegen-murines-IgG (Art.-Nr.115-116-072),
Fa. Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Suffolk, UK
- Esel-gegen-caprines-IgG, R-Phycoerythrin konjugiert (Art.-Nr. 705-116-147),
Fa. Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Suffolk, UK
- Maus-gegen-kanines-IgA (Best.-Nr. MCA631),
Fa. AbD Serotec, Oxford, UK
- Esel-gegen-murines-IgG, Peroxidase konjugiert (Art.-Nr. 715-035-151),
Fa. Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Suffolk, UK
Material und Methoden
20
Puffer, Lösungen und Suspensionen
- Waschpuffer Beads: PBS (steril) 250ml
bovines Serumalbumin (BSA) 2,5 g
Na-Acid (10%ig) 250 µl
- PBS, Phosphatgepufferte Salzlösung (pH 7,4): NaCl 137,0 mM
KCl 2,7 mM
Na2HPO4 8,1 mM
KH2PO4 1,5 mM
Computer-Software
- Cell-Quest™-Software (für Apple & Macintosh™-Computer),
Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Flow Jo Version 7.6, ©Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA
- Gen5™ Reader Control and Data Analysis Software,
Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall
- GraphPad Prism® Version 5.0, Fa. GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)
Material und Methoden
21
2.1.3. Methode
Testprinzip des „Microsphere-based immunofluorescence assays“
Bei dem „Microsphere-based immunofluorescence assay“ (MIA) dienen
mikroskopisch kleine Kügelchen (im Folgenden als Mikrosphären oder Beads
bezeichnet) als Festphase für biochemische Nachweisreaktionen.
In dieser Studie wurden 7,5 µm große Mikrosphären aus Polystyrol der Firma
Becton Dickinson genutzt.
Verschiedene Proteine wie zum Beispiel Antikörper können an die Oberfläche der
Mikrosphären gekoppelt werden. Das Funktionsprinzip entspricht dem eines
SANDWICH-ELISA (siehe Abb.1.).
Die mit dem primären Antikörper beschichteten Mikrosphären binden nach Zugabe
des Patientenserums oder -liquors den darin enthaltenen Analyten (IgA). Es folgt die
Bindung eines zweiten Antikörpers. Dieser kann entweder selbst fluoreszieren oder
er wird mit einem dritten fluoreszierenden Antikörper markiert. Zwischen den
einzelnen Schritten werden überschüssige Antikörper durch Waschvorgänge
entfernt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips eines MIA
Material und Methoden
22
Die Fluoreszenzintensität verhält sich proportional zur Konzentration des Analyten
(IgA) in der Probe. Mit Hilfe einer Standardkurve können die IgA-Konzentrationen in
den Patientenproben berechnet werden. Somit erlaubt der MIA eine quantitative
Bestimmung von IgA.
Kopplung des Antikörpers an die Mikrosphären und Bestätigung der Konjugation
Die Kopplung eines Ziege-gegen-kanines-IgA-Antikörpers mittels kovalenter Sulfo-
SMCC-Bindung an die Oberfläche der Mikrosphären wurde nach Angaben des
Herstellerprotokolls durchgeführt. Der genaue Ablauf ist im Anhang beschrieben.
Die Konjugation wurde als erfolgreich abgeschlossen angesehen, wenn die mittlere
Fluoreszenzintensität (MFI) der Probe mit dem Detektionsantikörper um mindestens
500 größer war als die MFI der Negativkontrolle.
Entwicklung einer Standardkurve
Um aus den gemessenen Fluoreszenzintensitäten die IgA-Konzentration berechnen
zu können, wird eine Standardkurve benötigt. Diese sollte durch die Austestung
verschiedener Verdünnungen des Detektionsantikörpers ermittelt werden. Es wurden
die folgenden sechs Verdünnungsstufen eingesetzt:
• 1:200
• 1:100
• 1: 50
• 1: 10
• 1: 5
• 1: 2,5
Eine IgA-Serumpool-Probe mit einer Konzentration von 162 µg/ml diente der
Erstellung einer Standardreihe mit den folgenden Konzentrationen:
• 162 ng/ml
• 81 ng/ml
• 40,5 ng/ml
Material und Methoden
23
• 20,25 ng/ml
• 10,13 ng/ml
• 5,07 ng/ml
• 2,54 ng/ml
• 1,27 ng/ml
• 0,64 ng/ml
• 0,32 ng/ml
• 0 ng/ml
Die Auswertung der im Durchflusszytometer gemessenen Fluoreszenzintensitäten
erfolgte mit dem Analyseprogramm Flow Jo (Version 7.6, ©Tree Star, Inc., Ashland,
OR, USA). Die Erstellung einer mathematischen Funktion zur Beschreibung des
Kurvenverlaufs erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism® (Version 5.0,
GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) mit der Vorgabe einer
Kalibrierungskurve mit sigmoidalem Verlauf und vier Parametern. Die Bestimmung
der idealen Standardkurve erfolgte zum einen durch die graphische Darstellung und
Beurteilung der Fluoreszenzen bei den verschiedenen Verdünnungsstufen und zum
anderen anhand der berechneten Kalibrierungskurven (vergleiche Abb. 2).
Der optimale Messbereich wurde als der Bereich der Kurve definiert, der den
linearen Anstieg der Kurve umfasst. Nur dieser Bereich wurde später bei der
Probenmessung zur Interpolation der Konzentrationen aus den Fluoreszenz-
intensitäten genutzt.
Material und Methoden
24
0 1 20
500
1000
1500
2000
IgA (ng/ml)
fluor
esce
nce
inte
nsity
Abbildung 2: Standardkurve mit sigmoidalem Verlauf (IgA-Konzentrationen
zwischen 0-162 ng/ml, Werte logarithmiert dargestellt)
Präzision und Reproduzierbarkeit der Methode
Für die Präzision einer Methode sind die Intraassay-Varianz und die Interassay-
Varianz wichtige Kenngrößen, denn sie geben das Maß der analytischen Streuung
wieder. Diese wird als Variationskoeffizient (CV%) angegeben. Die Intraassay-
Varianz beschreibt dabei die Abweichungen innerhalb eines Messdurchlaufs,
wohingegen die Interassay-Varianz die Messabweichung derselben Proben an
mehreren aufeinanderfolgenden Tagen angibt.
Im Intraassay-Vergleich wurden die Variationskoeffizienten der Fluoreszenz-
intensitäten (jede Probe wurde als Duplikat gemessen) der Proben an einem Tag
berechnet und getrennt für Serum und Liquor cerebrospinalis als Median angegeben.
Für den Interassay-Vergleich wurden die IgA-Konzentrationen der gleichen Proben
an sechs Tagen bestimmt und anschließend pro Serum- bzw. Liquorprobe der
Variationskoeffizient errechnet.
Nach denselben Prinzipien erfolgten die Berechnungen für den ELISA nach TIPOLD
et al. (1994). Anstelle der Fluoreszenzintensitäten wurden die Extinktionswerte
entsprechend verwendet.
Material und Methoden
25
Messung der Proben
Für die Messung der Proben mittels des „microsphere-based immunofluorescence
assay“ wurden die Liquorproben in der Verdünnung 1:20 bzw. 1:40 und die
Serumproben in der Verdünnung 1:2000, 1:4000 oder 1:5000 eingesetzt. Zur
Probenverdünnung wurde der Waschpuffer verwendet.
Das detaillierte Versuchsprotokoll ist im Folgenden beschrieben:
1. Erstellen der Standardreihe
Jede der oben genannten Standardkonzentrationen wurde als Triplikat angesetzt,
so dass pro Reihe insgesamt 150 µl der jeweiligen Verdünnungsstufe benötigt
wurden.
Zunächst wurde 1 µl der IgA-Serumpool-Probe mit 499 µl Waschpuffer verdünnt.
Davon wurden 200 µl in weiteren 200 µl Waschpuffer verdünnt und die
Verdünnungsreihe entsprechend in 2er Schritten fortgeführt. Anschließend
wurden jeweils 50 µl der Standard-Verdünnungen in 5-ml Röhrchen pipettiert. Zur
Herstellung des Standards „0“ wurde ausschließlich Waschpuffer verwendet.
2. Herstellung der Kontrollprobe:
Das Kontrollserum hat eine IgA-Konzentration von 100 µg/ml. Es wurde in einer
Konzentration von 100 ng/ml eingesetzt. Dazu wurde 1 µl Kontrollserum in 999 µl
Waschpuffer verdünnt und im Folgenden jeweils 50 µl in die entsprechenden
5 ml-Röhrchen pipettiert.
3. Proben:
Die korrespondierenden Liquor- und Serumproben wurden bei Raumtemperatur
aufgetaut und gemäß den oben genannten Verdünnungsstufen als Duplikate
pipettiert.
Material und Methoden
26
4. Verdünnung der Beads:
Die präparierten Beads wurden 5 sek. mit Hilfe des Reagenzglasschüttlers
gemischt und anschließend mit dem Wachpuffer 1:50 verdünnt.
5. In jedes Standard-, Kontroll- und Probenröhrchen wurden 50 µl der verdünnten
Beads pipettiert. Damit die Beads in Suspension bleiben, wurden die Röhrchen
dabei leicht geschwenkt. Es folgte eine Inkubationszeit von 30 min., wobei die
Röhrchen lichtgeschützt bei Raumtemperatur auf dem Plattformschüttler (Stufe 3)
aufbewahrt wurden.
6. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Beads gewaschen. Dazu wurde in
jedes Röhrchen 1 ml Waschpuffer pipettiert, dieses 5 min. bei 1000 x g
zentrifugiert und der Überstand vorsichtig mittels Pasteurpipette abgenommen.
7. In jedes Röhrchen wurden 50 µl des Detektions-Antikörpers (Maus-gegen-
kanines-IgA; Verdünnung 1:2,5) hinzugefügt und mittels Reagenzglasschüttler gut
vermischt.
8. 30 min. Inkubationszeit und anschließender Waschvorgang (siehe Punkt 5 und 6)
9. In jedes Röhrchen wurden 50 µl des RPE-konjugierten F(ab´)2-Fragments Ziege-
gegen-murines-IgG (Verdünnung 1:100) hinzugefügt und mittels Reagenzglas-
schüttler gut vermischt.
10. 30 min. Inkubationszeit und anschließender Waschvorgang (siehe Punkt 5 & 6)
11. Die Beads wurden in 100 µl Waschpuffer resuspendiert und dann der FACS-
Messung unterzogen.
Material und Methoden
27
FACS-Analyse
Die Durchflusszytometrie im ursprünglichen Sinne dient der Sortierung von Zellen
bzw. Partikeln anhand ihrer Größe und Beschaffenheit. Die sogenannte FACS-
Analyse (Fluorescence activated cell sorting) ermöglicht die Sortierung von Partikeln
anhand der Farbe und Intensität emittierter Fluoreszenzen (JAROSZESKI u.
RADCLIFF 1999).
Aufgrund des verwendeten Fluorochromfarbstoffes PhycoErythrin wurde die
Fluoreszenzintensität im FL2-Kanal des Durchflusszytometers (FACSCalibur™)
gemessen. Des Weiteren wurden das Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) und
das Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) erfasst. Das Vorwärtsstreulicht erlaubt
Rückschlüsse auf die Größe der Partikel, während das Seitwärtsstreulicht
Informationen über die Komplexität der Teilchen liefert (JAROSZESKI u. RADCLIFF
1999). Eine Mindestanzahl von 1000 Ereignissen pro Probe wurde im Vorhinein
festgelegt.
Die Auswertung der gemessenen Fluoreszenzintensitäten erfolgte mit dem
Analyseprogramm Flow Jo (Version 7.6, ©Tree Star, Inc., Ashland, OR USA). Der
geometrische Mittelwert der Fluoreszenzen wurde berechnet und anhand des
mitgeführten Standards wurden die Konzentrationen der gemessenen Liquor- und
Serumproben mit Hilfe des Programms GraphPad Prism® (Version 5.0, GraphPad
Software, Inc., La Jolla, CA, USA) ermittelt.
IgA-ELISA nach Tipold
Der ELISA wurde, wie im Anhang beschrieben, entsprechend dem Protokoll aus der
Studie von TIPOLD et al. (1994), durchgeführt.
Kommerzieller IgA-ELISA
Der ELISA wurde entsprechend der Herstellerangaben durchgeführt. Ein detailliertes
Protokoll ist im Anhang zu finden.
Material und Methoden
28
2.1.4. Statistische Auswertung - Methodenvergleich
Ziel der Studie war neben der Etablierung eines neuen Messverfahrens auch der
Vergleich der neuen (MIA) mit der etablierten Methode (ELISA).
Die statistische Aussagekraft dieses Vergleichs ist unter anderem abhängig von der
Anzahl der verwendeten Proben und dem von den Proben umfassten
Analysebereich. Die vorliegende Studie beinhaltet die Messung von 44
korrespondieren Serum- und Liquorproben und folgt somit der Empfehlung
verschiedener Autoren, eine Mindestanzahl von 40 Proben einzusetzen (LUMSDEN
2000; JENSEN u. KJELGAARD-HANSEN 2006). Die Auswahl und Einteilung der
Proben in die drei oben aufgeführten Gruppen erfolgte in der genannten Art und
Weise, um einerseits den klinisch bedeutsamen Referenzbereich abzudecken und
andererseits, um neben der SRMA als wichtigste Erkrankung auch weitere
neurologische Erkrankungen für die Methodenvalidierung mit einzubeziehen.
Dieser Vergleich der beiden Methoden zur Bestimmung der IgA-Konzentration wurde
auf zwei unterschiedlichen Wegen durchgeführt. Zum einen erfolgte eine Beurteilung
anhand des in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover verwendeten klinischen Referenzbereiches. Diese Referenzwerte
entstammen einer vorhergehenden Studie, bei der IgA bei gesunden Beageln
gemessen wurde (TIPOLD et al. 1994) (siehe Tabelle 2).
IgA-Konzentration in µg/ml Intervall (+ 10%)
CSF < 0,2 (Referenzbereich) < 0,22 µg/ml
> 0,2-0,9 (geringgrad. Erhöhung) > 0,22-0,99 µg/ml
> 0,9 (deutliche Erhöhung) > 0,99 µg/ml
Serum < 100 (erniedrigt od. Referenzbereich) < 110 µg/ml
> 100-200 (geringgrad. Erhöhung) > 110-220 µg/ml
> 200 (deutliche Erhöhung) > 220 µg/ml
Tabelle 2: Klinisch relevante Referenzbereiche für IgA in Serum und Liquor
Material und Methoden
29
Eine Übereinstimmung der Messwerte wurde bejaht, wenn die mit den Beads
gemessenen IgA-Konzentrationen zur Einordnung in denselben Referenzbereich +
ein 10%-Intervall führte wie die mit dem ELISA gemessenen Konzentrationen.
Erfolgte die Einordnung allerdings in unterschiedliche Gruppen, wurde dies als
fehlende Übereinstimmung gewertet.
Zum anderen wurde ein statistischer Methodenvergleich nach dem von BLAND und
ALTMAN (1986) entworfenen Prinzip durchgeführt. Hierbei werden die Differenzen
der Messwerte aus beiden Methoden gegen den Mittelwert der Messwerte beider
Methoden aufgetragen, so dass insbesondere die Streuung und Verzerrung der
Daten mit berücksichtigt werden. Bei einer hinreichend symmetrischen Verteilung der
Differenzen liegen 95% der Messwerte im Bereich der Übereinstimmungsgrenzen
(„limits of agreement“; berechnet aus d ± 2 x s; d = Mittelwert der Messwerte beider
Methoden und s = Standardabweichung der Differenzen). Eine Vorraussetzung für
die Gültigkeit des Verfahrens ist, dass die Differenzen keine systematischen
Veränderungen aufweisen. Sollte dies doch der Fall sein, kann eine gleichförmige
Variabilität der Daten durch eine logarithmische Transformation der Messwerte
erreicht werden (BLAND u. ALTMAN 1986). Ein Bland-Altman-Diagramm erlaubt
eine gute visuelle Beurteilung der Übereinstimmung bzw. Differenzen zweier
Methoden. Eine anschließende Interpretation der Übereinstimmungsintervalle unter
klinischen Gesichtspunkten ermöglicht dann die Einschätzung der Güte der
Übereinstimmung und somit ein abschließendes Urteil über die Vergleichsmethode.
Material und Methoden
30
2.2. Messung von Tau-Protein im Liquor cerebrospina lis
2.2.1. Patientenmaterial und Datenerhebung
In die Studie konnten 51 Hunde, die in den Jahren 2005 bis 2011 in der Klinik für
Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover aufgrund eines
Bandscheibenvorfalls in Hals-, Brust- oder Lendenwirbelsäule vorgestellt wurden,
aufgenommen werden. Einschlusskriterien waren neurologische Symptome mit dem
Schweregraden 2 bis 5 (Einteilung nach SHARP u. WHEELER 2005) sowie eine
stattgefundene Liquorentnahme.
Die Patientendaten wurden hinsichtlich Signalement (Rasse, Geschlecht, Alter),
Dauer der Erkrankung bis zur Erstvorstellung, Vorbehandlung, neurologischem
Status bei der Erstuntersuchung, Lokalisation der Läsion, Befunde aus der
bildgebenden Diagnostik und klinischem Verlauf während des stationären
Aufenthaltes retrospektiv aufgearbeitet.
Entsprechend der Dauer der Symptome bis zur Erstvorstellung wurden die Hunde in
die folgenden Gruppen unterteilt:
• Akut: 1-5 Tage, (n = 15)
• Subakut: 5-14 Tage, (n = 14)
• Chronisch: > 14 Tage, (n = 20)
• Unbekannt, (n = 2).
Abhängig von der Art der Vorbehandlung erfolgte eine Unterteilung der Hunde in:
• Vorbehandlung mit Glukokortikosteroiden, (n = 23)
• Vorbehandlung ohne Glukokortikosteroide, (n = 26)
• Unbekannt, (n = 2).
Material und Methoden
31
Anhand der Befunde der neurologischen Untersuchung am Tag der Erstvorstellung
und des Schweregrades der Symptome wurden die Patienten in folgende Gruppen
unterteilt (nach SHARP u. WHEELER 2005):
• Grad 1: Schmerzhaftigkeit der Wirbelsäule ohne neurologische
Ausfallserscheinungen, (n = 0)
• Grad 2: Gering- bis mittelgradige Parese, Ataxie und
Propriozeptionsdefizite, selbstständig lauffähig, (n = 24)
• Grad 3: Hochgradige Parese; nicht lauffähig, (n = 7)
• Grad 4: Plegie mit erhaltenem Tiefenschmerz, (n = 14)
• Grad 5: Plegie ohne Tiefenschmerz, (n = 6)
Für die spätere statistische Auswertung der Daten wurden die Hunde mit einer
Parese (Grad 2 und Grad 3) und die Hunde mit einer Plegie (Grad 4 und 5) in jeweils
eine Gruppe zusammengefasst.
Bei 50 Hunden wurde eine MRT (bis 2009 mittels Magnetom Impact Plus, 1.0 Tesla,
Siemens AG, Erlangen; ab 2010 mittels Philips Achieva 3.0 Tesla, Philips, Hamburg)
in Allgemeinanästhesie durchgeführt. Neben der genauen Lokalisation des
Bandscheibenvorfalls wurde insbesondere auf intramedulläre hyperintense Läsionen
in der T2-gewichteten SE Sequenz geachtet, da diese einen wichtigen
Beitrag zur Prognosestellung liefern (ITO et al. 2005; LEVINE et al. 2009;
BOEKHOFF et al. 2012).
Dementsprechend wurden die Patienten in die nachstehend genannten
Befundgruppen eingeteilt:
• Hunde mit Bandscheibenvorfall im Bereich der Halswirbelsäule,
(n = 18)
• Hunde mit Bandscheibenvorfall im Bereich der Brust- oder
Lendenwirbelsäule, (n = 33)
o Rückenmark ohne intramedulläre hyperintense Läsion, (n = 26)
o Rückenmark mit intramedullärer hyperintenser Läsion, (n = 24)
Material und Methoden
32
Bei einem Hund erfolgte anstelle eines MRTs ein Myelo-CT, so dass dieser Hund
bezüglich der MRT-Befunde nicht mit in die Auswertung genommen werden konnte.
Die Entwicklung der neurologischen Symptomatik während des stationären
Aufenthaltes wurde durch tägliche Verlaufskontrollen beobachtet. Eine Verbesserung
um einen neurologischen Grad innerhalb einer Woche wurde als positives Ergebnis
gewertet. Diese Entwicklung wurde sowohl für die Gesamtheit der erkrankten Hunde
als auch getrennt für die einzelnen Erkrankungsgrade (Grad 2/3 und Grad 4/5)
betrachtet, um insbesondere die Prognose für die plegischen Hunde beurteilen zu
können. Demnach ergab sich folgende Einteilung:
• Besserung alle Hunde, (n = 23)
• Keine Besserung alle Hunde, (n = 28)
o Besserung Hunde Grad 2/3, (n = 17)
o Keine Besserung Hunde Grad 2/3, (n = 14)
� Besserung Hunde Grad 4/5, (n = 6)
� Keine Besserung Hunde Grad 4/5, (n = 5)
Von den 51 Hunden mussten 13 Hunde aufgrund einer schlechten Prognose
euthanasiert werden, so dass eine weitere Gruppierung in
• Euthanasierte Hunde, (n = 13)
• Weiterhin lebende Hunde, (n = 38)
vorgenommen wurde.
Die detaillierten Angaben zu den Tieren einschließlich Signalement und erhobenen
Befunden sind im Anhang V. und VI. zu finden.
Material und Methoden
33
2.2.2. Liquorentnahme
Die Gewinnung der Gehirnrückenmarksflüssigkeit erfolgte in Allgemeinanästhesie
aus der Cisterna cerebellomedullaris. Unmittelbar nach Entnahme wurden 200 µl des
Liquors der routinemäßigen Laboruntersuchung (Bestimmung von Zellzahl, Gehalt
an Glukose und Protein) zugeführt. Die verbleibende Probenmenge wurde in
Polypropylen-Röhrchen bei -20°C für die spätere Bes timmung der Tau-Protein-
Konzentration aufbewahrt.
Als Negativkontrolle diente der Liquor cerebrospinalis von 12 Hunden, die klinisch
und neurologisch gesund oder an anderen, für diese Studie unbedeutenden
Krankheiten bekannter Genese (z.B. intramuskulärer Abszess, Pankreatitis) erkrankt
waren.
Material und Methoden
34
2.2.3. Material
Geräte
- Reinstwasser-Aufbereitungssystem GenPure,
Fa. TKA Thermo Fisher Scientific, Niederelbert
- Gefrierschrank Premium NoFrost,
Fa. Liebherr, Ochsenhausen
- Kühlschrank Comfort, Fa. Liebherr, Ochsenhausen
- Reagenzglasschüttler Reax control, Fa. Heidolph, Schwabach
- Synergy 2 Multi-Detektions-Reader für Mikroplatten,
Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall
Laborbedarf
- Bechergläser Fa. VWR, Darmstadt
- Pipettenspitzen: 10 µl (kristall; Best.-Nr. 702504), Fa. Brand, Wertheim
200 µl (gelb) (Best.-Nr. 613-0240), Fa. VWR, Darmstadt
1000 µl (blau) (Best.-Nr. 2100610), Fa. Ratiolab, Dreieich
- Pipetten Transferpette® einstellbar (0,1-1000 µl)
Fa. Brand, Wertheim
- Pipettierhelfer accu-jet® pro, Fa. Brand, Wertheim
- Mehrfachdispenser Handy-step® (Best.-Nr. 705100),
Fa. Brand, Wertheim
- Präzisionsdispenserspitzen 5 ml (Best.-Nr. 702376),
Fa. Brand, Wertheim
- Polypropylenröhrchen mit Verschluss 2 ml (Art.-Nr.72.694),
Fa. Sarstedt, Nümbrecht
- Polypropylenröhrchen 4 ml (Best.- Nr. 55.532),
Fa. Sarstedt, Nümbrecht
- Reagenzröhrchen mit Verschluss, Polypropylen, 15 ml (Best.- Nr. 62.554.001),
Fa. Sarstedt, Nümbrecht
Material und Methoden
35
Reagenzien und Chemikalien
- INNOTEST® hTAU Ag, (Artikel-Nr. 80323)
Fa. Innogenetics®, Ghent, Belgien
- 2 N Schwefelsäure (H2SO4) (Stopplösung für den ELISA)
PC Software
- Gen5™ Reader Control and Data Analysis Software,
Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall
- GraphPad Prism®, Version 5.0,
Fa. GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
Material und Methoden
36
2.2.4. Messung des Tau-Proteins
Für die Messung des Tau-Proteins im Liquor cerebrospinalis wurde ein kommerziell
erhältlicher ELISA verwendet (INNOTEST® hTAU Ag, Innogenetics, Ghent, Belgien).
Das Funktionsprinzip eines ELISA beruht auf einer spezifischen Antigen-Antikörper-
Reaktion, die mittels Farbumschlag quantitativ ausgewertet werden kann.
Waschvorgänge zwischen den einzelnen Reaktionsschritten verhindern
unspezifische Bindungen und beseitigen überschüssige Reagenzien.
Der verwendete ELISA erfasst humanes Tau-Protein oder dessen Fragmente mittels
eines ersten monoklonalen (AT120) und zweier sekundärer, biotinylierter Antikörper
(HT7bio und BT2bio). Dieser Antigen-Antikörper-Komplex wird anschließend durch
ein peroxidasemarkiertes Streptavidin (HRP-SV) nachgewiesen (siehe Abbildung 2).
Die eingesetzten Antikörper binden sogenanntes „Total Tau“, das heißt, es wird
sowohl phosphoryliertes als auch nicht-phosphoryliertes Tau gebunden.
Abbildung 3: Prinzip des Tau-ELISA
Aufgrund der Tatsache, dass Tau ein in vielen verschiedenen Spezies
vorkommendes Protein ist und gezeigt werden konnte, dass es konservierte
Proteinregionen besitzt, war die Wahrscheinlichkeit groß, dass auch kanines Tau
von den verwendeten Antikörpern gebunden wird (VIERECK et al. 1988; JANKE
et al. 1999). Außerdem gelang es in einer Studie von TANAKA et al. (2011), kanines
Tau-Protein mit den genannten Antikörpern nachzuweisen.
Material und Methoden
37
Vorangegangene Studien zeigten, dass es zu keiner Beeinträchtigungen des Testes
durch Hämoglobin, Bilirubin, Albumin und Globulin kommt (NISHIMURA et al. 1998).
50 µL (2 x 25 µl) unverdünnter Liquor cerebrospinalis wurden für die Bestimmung der
Konzentration des Tau-Proteins genutzt. Dabei erfolgte die Messung der Proben und
des Standards in Duplikaten. Die errechneten Mittelwerte konnten im Folgenden für
die statistische Auswertung verwendet werden.
Wurde bei den Messungen innerhalb einer Probe ein Variationskoeffizient von 20%
überschritten, so erfolgte eine Wiederholung des Tests für die betroffene Probe.
Die Gesamtheit der Messwerte wurde nur dann als zuverlässig angesehen, wenn die
vom Hersteller empfohlenen Validierungskriterien erfüllt waren. Die Extinktion der
Leerwertvertiefungen sollte bei 450 nm < 0,200 OD und die Extinktion des höchsten
Standards bei 450 nm > 1,600 OD betragen.
Der mitgeführte Standard erlaubte die Erstellung einer sigmoidalen Standardkurve,
anhand derer die Interpolation der unbekannten Tau-Protein-Konzentrationen in den
CSF-Proben (pg/ml) durchgeführt wurde.
Die Nachweisgrenze für humanes Tau lag gemäß Herstellerangaben bei 60 pg/ml.
TANAKA et al. (2011) validierte den ELISA für den Hund, wobei gesunde Hunde eine
Tau-Protein-Konzentration von im Mittel 29,3 pg/ml aufwiesen. Für die folgende
statistische Auswertung der Daten wurden Messwerte zwischen 18,7 und 60,0 pg/ml
als Zahlenwerte belassen, während Messwerte < 18,7 pg/ml als nicht messbar (0)
klassifiziert wurden (TANAKA et al. 2011).
Material und Methoden
38
Versuchsprotokoll des Tau-ELISA
1. Alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen
Liquorproben bei Raumtemperatur auftauen und vor dem Verwenden für 10 sek.
mit Hilfe des Reagenzglasschüttlers mischen.
2. Standard vorbereiten:
Lyophilisiertes, rekombinantes Tau mit 500 µl Probenverdünner rekonstituieren;
15 min. stehen lassen, danach 15 sek. mittels Reagenzglasschüttler mischen.
Ausgehend vom Standard (1200 pg/ml) weitere Verdünnungsstufen (1:2)
herstellen (jeweils 300 µl der vorherigen Verdünnung + 300 µl Probenverdünner)
durchführen.
- Standardkonzentrationen: 1200, 600, 300, 150 und 75 pg/ml
- Die Leerprobe enthält nur Probenverdünner
3. Herstellung der Arbeitslösung 1 (monoklonale Anti-hTAU-Antikörper BT2 und
HT7, markiert mit Biotin):
- 100 µl Arbeitslösung 1 mit 10 ml der zugehörigen Verdünnungsflüssigkeit
mischen
- In jede Kavität 75 µl Arbeitslösung 1 pipettieren
4. 25 µl jeder Standardkonzentration, 25 µl Probenverdünner (Leerprobe) und
25 µl jeder Liquorprobe (unverdünnt) im Doppelansatz in die entsprechenden
Kavitäten pipettieren und durch vorsichtiges Klopfen des Teststreifenhalters
mischen.
5. Inkubation der ELISA-Platte für 14-18 Stunden (über Nacht) bei 25 ± 2°C.
6. Herstellung der Arbeitslösung 2 (Peroxidase-markiertes Streptavidin):
- 120 µl Arbeitslösung 2 mit 12 ml der zugehörigen Verdünnungsflüssigkeit
mischen
7. Herstellen der Waschlösung (Phosphatpuffer):
- 40 ml Waschlösung mit 960 ml Aqua destillata mischen
8. Platte 4x waschen
9. In jede Kavität 100 µl Arbeitslösung 2 pipettieren
10. Platte für 30 ± 3 min. bei 25 ± 2°C inkubieren
Material und Methoden
39
11. Herstellung der Substratlösung (Tetramethylbenzidin gelöst in Dimethylsulfoxid)
- 120 µl Substratlösung mit 12 ml Substratpuffer mischen
12. 4x waschen
13. In jede Kavität 100 µl Substratlösung pipettieren
14. Platte für 30 min. bei Raumtemperatur (18-30°C ) lichtgeschützt inkubieren
15. Stoppen der Reaktion: Zugabe von 100 µl 2N-Schwefelsäure in jede Kavität in
derselben Reihenfolge und in denselben Zeitabständen wie die Zugabe der
Substratlösung
16. Photometrische Auswertung mit Hilfe des ELISA-Readers bei einer Wellenlänge
von 450 nm mit Hilfe des Programms Gen5™ (Referenzwellenlänge 620 nm)
Material und Methoden
40
2.2.5. Statistische Auswertung
Die deskriptive Auswertung der Messwerte, deren graphische Darstellung in Form
von Box-and-Whisker-Plots sowie alle statistischen Berechnungen erfolgten mithilfe
des Statistikprogramms GraphPad Prism®, Version 5.0, (GraphPad Software, Inc., La
Jolla, CA, USA).
Zunächst wurden die Werte einer jeden Gruppe mittels Kolmogorov-Smirnov Test auf
ihre Normalverteilung überprüft. Da die Daten keine Normalverteilung aufwiesen,
wurden nicht-parametrische Tests (Kruskal-Wallis und Mann-Whitney U Test) für die
Beurteilung statistischer Zusammenhänge angewendet. Alle statistischen Methoden
wurden als zweiseitige Tests durchgeführt und als Irrtumswahrscheinlichkeit wurde
p< 0,05 angesetzt.
Eine ROC-(Receiver Operating Characteristic)-Kurvenanalyse einschließlich der
Berechnung der AUC (Area under the curve), der Testsensitivität und –spezifität
wurde durchgeführt, um diejenige Tau-Protein-Konzentration zu ermitteln, die als
Schwellenwert für die Einschätzung der Prognose dienen kann.
Ergebnisse
41
3. Ergebnisse
3.1. Measurement of IgA in canine CSF using MIA
Evaluation of a microsphere-based immunofluorescenc e assay for the
determination of immunoglobulin A concentrations in
cerebrospinal fluid of dogs
A. Roerig, R. Carlson, A. Tipold
Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine
Hannover, Hannover, Germany
Research in Veterinary Sciene
DOI: 10.1016/j.rvsc.2012.07.013
Ergebnisse
42
Abstract
The simultaneous increase of immunoglobulin A (IgA) in serum and cerebrospinal
fluid (CSF) is a characteristic finding in dogs suffering from canine steroid-responsive
meningitis–arteritis (SRMA). The study aimed at developing and evaluating a
microsphere-based immunofluorescence assay (MIA) for the measurement of IgA,
trying to fulfil the need of a quicker method using only small volumes of CSF.
Microsphere beads were coated with goat anti-dog IgA antibodies and bound IgA
was detected by a mouse anti-dog IgA antibody in combination with a PE-labeled
goat anti-mouse IgG. CSF from 44 dogs were tested for IgA and compared with an
in-house utilized ELISA.
Ergebnisse
43
3.2. CSF Tau in dogs with IVDH
Cerebrospinal fluid tau protein as a biomarker for severity of spinal cord injury
in canine intervertebral disk herniation
A. Roerig, R. Carlson, A. Tipold, V.M. Stein*
Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine
Hannover, Hannover, Germany
*Corresponding author: Tel: +49-511-953-6311
Email: veronika.stein@tiho-hannover.de (V.M. Stein)
Ergebnisse
44
Abstract
Intervertebral disk herniation (IVDH) is a common cause of spinal cord injury (SCI) in
dogs. Microtubule-associated protein tau derives predominantly from neurons and
axons, making it a potential marker of neuronal injury.
A retrospective study, including fifty-one dogs with thoracolumbar or cervical IVDH
and 12 clinically normal dogs, was designed to describe associations between
cerebrospinal fluid (CSF) tau concentration, degree of neurological signs and motor
functional recovery in dogs with IVDH. Signalement, degree of neurological
dysfunction and outcome were recorded. Cisternal CSF tau values were determined
by an ELISA. Associations between CSF tau concentration and various clinical
parameters were evaluated.
Tau protein was significantly elevated in dogs showing plegia (median: 79.9 pg/mL;
P = 0.016) compared to healthy dogs and dogs with paresis (median: 30.1 pg/mL;
P = 0.025). Plegic dogs that improved by one neurological grade within one week
had significantly lower tau protein levels compared to plegic dogs that needed more
time for recovery or did not show an improvement (P =0.008). A CSF tau
concentration of > 41.3 pg/mL had a sensitivity of 86% and specificity of 83% to
predict an unsuccessful outcome in plegic dogs based on receiver-operating
characteristics curve analysis (area under the curve = 0.887, P = 0.007, 95%
confidence interval [CI]: 0.717 to 1.057).
In conclusion, CSF protein tau levels are positively associated with the severity of
spinal cord damage and therefore may serve as a prognostic indicator in dogs with
IVDH.
Keywords: spinal cord injury, dog, CSF analysis, protein tau
Ergebnisse
45
Introduction
Tau proteins belong to the microtubule-associated proteins family (Weingarten et al.,
1975). These phosphoproteins specifically localize in neurons where they bind to
microtubules, promoting their assembly and stability (Weingarten et al., 1975; Binder
et al., 1985). Tau is not physiologically secreted; its release into the cerebrospinal
fluid (CSF) is most probably due to neuron damage or death (Mori et al., 1995).
Therefore CSF tau protein concentrations can serve as a biological marker for axonal
damage in the central nervous system (CNS) (Zemlan et al., 1999; Shiiya et al.,
2004).
Elevated levels of CSF tau protein have been described in human neurodegenerative
disorders such as Alzheimer’s disease and in multiple sclerosis (Blennow et al.,
1995; Andreasen et al., 1998; Terzi et al., 2007). At present, information on tau
protein in veterinary medicine is rare. So far tau protein expression in the aging
brains of dogs and cats as well as CSF tau levels in dogs with encephalitis have
been examined (Head et al., 2005; Pugliese et al., 2006; Tanaka et al., 2011)
Intervertebral disk herniation (IVDH) is a common cause of spinal cord injury (SCI) in
dogs, resulting in pain and neurological dysfunction. Severity of neurological signs is
determined by neuroanatomical location, velocity and amount of the compressive
material as well as duration of compression (Brisson, 2010). IVDH leads to SCI via a
combination of primary and secondary events. Primary spinal cord injury refers to the
initial mechanical insult whereas secondary injury is a biochemical cascade following
the primary event and consisting of vascular dysregulation, neurogenic shock,
oxidative stress and excitotoxicity (Dumont et al., 2001).
Several prognostic factors for IVDH were previously studied in CSF samples, such as
the percentage of CSF macrophages (Srugo et al., 2011), CSF levels of myelin basic
protein and creatinine kinase activity (Levine et al., 2010; Witsberger et al., 2012),
concentration of beta-2-microglobulin (Muñana et al., 2007) and CSF glutamate
concentration (Olby et al., 1999). These described studies included dogs with
thoracolumbar IVDH or dogs with acute signs (Levine et al., 2006; Levine et al.,
2010; Srugo et al., 2011). Therefore additional reliable prognostic factors that allow
Ergebnisse
46
differentiating between good and poor functional outcome, are needed. Moreover
clear cut-off points for unfavourable outcome should be stated (Levine et al., 2010;
Witsberger et al., 2012).
CSF tau levels were highly elevated in human head trauma patients and a correlation
was established between clinical improvement and decreased CSF tau levels
(Zemlan et al., 1999). We therefore hypothesized that high levels of protein tau reflect
the severity of spinal cord damage and that determination of CSF tau concentration
has a pivotal value as a prognostic biomarker for motor functional recovery in dogs
with IVDH.
Material and Methods
Study design and animals
Medical records of the Department of Small Animal Medicine and Surgery,
University of Veterinary Medicine, Hannover, Germany, were retrospectively
reviewed (2005 - 2011) for dogs diagnosed with IVDH. The study was performed
according to the ethical rules of the University.
On the basis of the severity of the neurological signs 51 dogs were categorized
according to Sharp and Wheeler (2005) into five grades: paraspinal hyperesthesia
(grade 1), ambulatory paresis, ataxia and proprioceptive deficits (grade 2),
nonambulatory paresis (grade 3), plegia with nociception (grade 4), plegia with no
deep nociception (grade 5) (Sharp and Wheeler, 2005). Inclusion criteria for this
study were dogs suffering from cervical or thoracolumbar IVDH as suggested by
magnetic resonance imaging (MRI) findings and in most cases confirmed by
decompressive surgery, a severity of grade 2 to 5 at presentation and subsequent
analysis of CSF. Dogs were neurologically re-examined seven days after first
presentation.
Ergebnisse
47
The information retrieved from the medical records included signalement (sex, age,
breed), time from onset of clinical signs to presentation, previous drug administration
with emphasis on glucocorticosteroids, localization of the disk protrusion/extrusion,
the occurrence of pathological changes in the myelon detected by MRI and functional
neurological outcome (Levine et al., 2009; Boekhoff et al., 2012). All MR images were
reviewed by certified neurologists. MR images were evaluated for the presence of an
intramedullary hyperintensity over the length of one vertebral body or more (Levine et
al., 2009). The outcome was defined to be successful if the dog improved by at least
one neurological grade within a week after first presentation at the Department of
Small Animal Medicine and Surgery.
Normal research colony dogs (n = 8, Animal Experiment number: 33.42502/05-12.05)
as well as four dogs, which were presented at our clinic because of orthopedic, non-
neurologic diseases, were used as a control population. All control dogs were
required to have normal physical and neurological examinations as well as CSF
analysis.
Cerebrospinal fluid (CSF) collection
Cerebrospinal fluid was collected at the time of presentation/admission under general
anesthesia from the cerebellomedullary cistern. 200 µL of samples without iatrogenic
blood contamination were subsequently used for routine examination (cell count,
glucose and protein concentrations) and remaining CSF samples were frozen and
stored in polypropylene tubes at -20°C (Lachno et a l., 2011).
Biochemical analysis of Tau protein
Tau protein was determined by a commercially available enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) (Innotest hTAU, Innogenetics), which recognizes non-
phosphorylated and phosphorylated tau protein (Vandermeeren et al., 1993). It is a
solid-phase enzyme immunoassay in which tau protein or tau fragments are captured
by a primary monoclonal antibody (AT120) and two biotinylated secondary antibodies
(HT7bio and BT2bio). 50 µL of CSF was used for each measurement, each sample
was measured in duplicates, and the mean was used for further evaluation. Previous
Ergebnisse
48
examinations excluded interferences in the assay format for hemoglobin, bilirubin,
albumin or globulin (Nishimura et al., 1998).
Statistical Analysis
Data obtained were analyzed using a commercially available software package
(GraphPad Prism Version 5.0, GraphPad Software). Variables were controlled for
normal distribution using Kolmogorov-Smirnov normality test. As data were not
consistent with a Gaussian distribution, nonparametric tests (Kruskal-Wallis and
Mann-Whitney U test) were applied. All statistical tests were two-tailed and a P-value
≤ 0.05 was considered to be statistically significant.
For the purpose of analyzing the relation between tau protein levels and severity of
neurological dysfunction, dogs were divided into two groups (A: paresis = grade 2/3,
B: plegia with and without deep pain sensation = grade 4/5). Within these groups
dogs were further categorized based on occurrence of functional improvement by
one grade within 7 days or no functional improvement.
For the purpose of describing duration of clinical signs before admission dogs were
divided into three subcategories (acute: < 5 days, subacute: 5 - 14 days, chronic: >
14 days). For analyzing the effect of administration of corticosteroids (yes vs. no),
location of the spinal cord compression (cervical vs. thoracolumbar) and spinal cord
TW2 hyperintensity (yes vs. no) dogs were divided in two groups, respectively.
Receiver-operating characteristics (ROC) curve analysis was performed to determine
the overall effectiveness of CSF tau concentration to predict an unsuccessful
outcome in dogs showing plegia due to IVDH. Additionally, ROC curve analysis was
used to find out if CSF tau concentrations are able to distinguish between paretic and
plegic dogs. The cut-off that maximized the Youden index (sensitivity + specificity -1)
was selected as optimal.
Ergebnisse
49
Results
Fifty-one dogs with cervical (n = 18) or thoracolumbar (n = 33) IVDH of various
breeds and with a different degree of neurological dysfunction met the inclusion
criteria. Mean age of the dogs was 7.3 years (range 3 - 12.25 years). Breeds
included Dachshund (n = 19), mixed breed (n = 13), Beagle (n = 2), Bernese
Mountain Dog (n = 2), Cocker Spaniel (n = 2), Rottweiler (n = 2), French
Bulldog (n = 2) and 9 other breeds with one dog each. Twenty-three male, 11
castrated male, 7 female and 10 spayed female dogs were examined. The
neurological examination revealed 24 dogs with paresis and/or ataxia with
proprioceptive deficits (grade 2) whereas 7 dogs were nonambulatory paraparetic
(grade 3). Fourteen dogs displayed plegia with nociception (grade 4) whereas in 6
dogs nociception was lost (grade 5). Dogs with paresis (grade2/3, n = 31) and dogs
showing plegia (grade 4/5, n = 20) were combined for further evaluation. Forty-four
dogs (grade 2: n = 18, grade 3: n = 7, grade 4: n = 14, grade 5: n = 5) underwent
decompressive surgery whereas 6 dogs (all classified as grade 2) were treated
conservatively and one dog (grade 5) was euthanized after diagnostic imaging.
Glucocorticosteroids were administered to 23 of the 51 dogs with IVDH (45.1%)
before presentation (Table 1).
The control group consisted of 12 dogs with a mean age of 5.0 years (range 1.8 - 8.8
years). One female, two spayed females, two males and seven castrated males were
examined. Breeds included Beagle (n = 8) and one of each of the following breeds
(mixed breed, Labrador Retriever, Boxer, Chihuahua).
Ergebnisse
50
n Neurologic grade
Grade 2 Grade 3 Grade 4 Grade 5
24 7 14 6
Paretic dogs Neurologic improvement No improvement
31 17 14
Plegic dogs Neurologic improvement No improvement
20 6 14
Clinical signs before admission Acute Subacute Chronic Unknown
15 14 20 2
Location of spinal cord compression Cervical
Grade 2 Grade 3 Grade 4
Thoracolumbar Grade 2 Grade 3 Grade 4 Grade 5
18 11 3 4 33 13 4 10 6
administration of glucocorticosteroids yes no unknown
23 26 2
T2W Hyperintensity of spinal cord (length > one vertebrae)
yes no no MRI (Myelo-CT)
24 26 1
Treatment Decompressive surgery Conservative treatment Euthanasia
44 6 1
Table 1. Clinical signs, treatment and MRI findings of 51 examined dogs with IVDH.
Ergebnisse
51
Tau was measurable in seven of 12 dogs of the control group (58.3%) and in 33 of
51 dogs with IVDH (64.7%). Median tau protein level in the control group was
20.6 pg/mL (range: 0 – 51.2 pg/mL) whereas in dogs with IVDH it was 41.8 pg/mL
(range: 0 – 778.7 pg/mL). Significant differences (P = 0.049) were detected between
CSF tau protein in dogs with IVDH and dogs of the control group. These differences
were even more distinct with evaluation of neurological grade (Fig. 1).
cont
rol
grad
e 2/3
grad
e 4/5
0
100
200
300
400
500500600700800
*
*
Tau
in p
g/m
l
Figure 1. CSF tau protein concentrations show significant (*) differences between
plegic dogs with IVDH (grade 4/5, n = 20) and both, control dogs (n = 12, P = 0.016)
and paretic dogs with IVDH (grade 2/3, n = 31, P = 0.025).
The CSF tau protein concentrations were significantly (P = 0.016) higher in dogs with
plegia (grade 4/5, median: 79.9 pg/mL, range: 0 – 778.7 pg/mL) compared to control
dogs. In dogs with paresis (grade 2/3) CSF tau levels were also higher
Ergebnisse
52
(median: 30.1 pg/mL, range: 0 – 193.1 pg/mL) than in control dogs, however, this
difference did not reach the level of significance (P = 0.175). Moreover, a difference
was noted within the group of dogs with IVDH as plegic dogs showed significantly
higher tau concentrations compared to paretic dogs (P = 0.025).
An association could be assessed for CSF tau concentration and functional outcome.
Dogs with IVDH (n = 51) that improved by one neurologic grade within a week
(n = 23) had significant lower CSF tau levels (P = 0.015) than dogs which needed
more time for neurological improvement or that did not show any improvement
(n = 28; Fig. 2). Considering only plegic dogs, this correlation revealed to be even
more significant (P = 0.008; Fig. 3).
improv
emen
t
no im
prov
emen
t
0
100
200
300
400400500600700800
*
Tau
in p
g/ml
Figure 2. Association of CSF tau levels in dogs with IVDH (n = 51) and outcome.
Twenty-three dogs showed neurologic improvement whereas 28 dogs did not
improve after one week. Low CSF tau concentrations correlate significantly (*) with a
better functional outcome (P = 0.015)
Ergebnisse
53
improv
emen
t
no im
prov
emen
t
0
200
400
600
800*
Tau
in pg
/ml
Figure 3. Comparison of CSF tau protein concentrations within the group of plegic
dogs due to IVDH (grade 4/5, n = 20) with 6 of the dogs showing neurological
improvement defined as amelioration by one neurologic grade within one week and
14 with no improvement. Lower CSF tau levels in plegic dogs with IVDH correlate
significantly (*) with a better functional outcome (P = 0.008)
CSF tau concentrations were evaluated in relation to MRI T2-weighted (T2W)
hyperintensities in the myelon, previous treatment with corticosteroids, duration of
clinical signs before admission and localization of IVDH (cervical vs. thoracolumbar).
Protein tau levels in dogs with thoracolumbar IVDH (median: 48.3 pg/mL, range: 0 –
282.6 pg/mL) were higher compared to dogs with cervical IVDH (median: 24.3
pg/mL, range: 0 – 778.7 pg/mL), even though this difference was not significant.
(P = 0.238)
Ergebnisse
54
No statistical difference (P = 0.319) in tau levels between dogs with or without the
administration of glucocorticosteroids could be detected. Additionally, no correlation
of the CSF tau concentrations was found for T2W spinal cord hyperintensity
(P = 0.087) and duration of clinical signs at admission (P = 0.759)
The ROC curve analysis suggested an optimal CSF tau cut-off value of > 41.3 pg/mL.
At this point the sensitivity and specificity for predicting an unsuccessful functional
outcome in plegic dogs were 86% and 83%, respectively. Area under the ROC curve
(AUC) was estimated at 0.887 (95% CI: 0.717 to 1.057) and the overall ability of CSF
tau concentration to predict unsuccessful functional outcome was significant
(P = 0.07). (Fig. 4)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1 - Specif icity
Sen
sitiv
ity
Figure 4. Receiver-operating characteristic curve (ROC) to predict unsuccessful
outcome for tau protein concentration in the CSF of 20 dogs showing paraplegia due
to IVDH. Sensitivity and specificity of this test at 41.3 pg/ml were 86% and 83%,
respectively and indicated by a circle.
A CSF tau cut-off value of > 59.5 pg/mL with a sensitivity of 60% and specificity of
84% to identify plegic dogs out of all dogs with IVDH was recommended by ROC
curve analysis. AUC was estimated at 0.684 (95% CI: 0.519 to 0.849) and the ability
of CSF tau concentration to classify dogs as grade 4/5 was significant (P = 0.028).
Ergebnisse
55
Discussion
The pathophysiology of intervertebral disk herniation includes primary and secondary
injury of the spinal cord and associated vascular structures. The severity of the injury
and therefore the extent of neuronal damage is thought to be a function of the
amount, speed and duration of cord compression (Kearney et al., 1988; Carlson et
al., 2003). Axons are damaged either because of direct physical disruption or nerve
transmission is negatively influenced by regional hemorrhages or edema (Anderson
and Hall, 1993). Furthermore, secondary injury may lead to neuronal cell death due
to necrosis and apoptosis. This contributes to a loss of neurons which most likely has
a negative impact on outcome (Li et al., 2000). Necrosis typically occurs shortly after
the primary injury, whereas apoptosis can occur weeks following the injury (Crowe
et al., 1997).
Several biomarkers have been examined for their potential to indicate axonal injury.
The study of Brisby et al. (1999) demonstrated that patients with disk herniation have
increased concentrations of neurofilament protein in the CSF, indicating the damage
of axons in the affected nerve root. Additionally, the measurement of glial fibrillary
acidic protein (GFAP) in CSF of humans after trauma to the cervical spine revealed
the possibility to quantify the degree of nerve cell injury (Guéz et al., 2003).
Neuronal cell death is likely to cause a release of intracellular microtubule binding
proteins such as tau into the extracellular space where they are transported by
convective bulk flow to CSF (Segal, 1993). Tau protein was hypothesized to be a
good marker for axonal injury because this protein is localized primarily in neurons
and is enriched in the axonal compartment (Binder et al., 1985).
In humans tau is expressed from a single gene that undergoes alternate splicing
resulting in six tau isoforms which range from 352 to 441 amino acids (Goedert et al.,
1989). Tau proteins can be separated into two groups, the low molecular weight tau
proteins expressed in neurons of the CNS, and the high molecular weight tau
proteins most abundant in the peripheral nervous system (Georgieff et al., 1993). Tau
proteins play an important role in the neuronal microtubules network involved in
axonal transport and neuronal transmission (Drubin, 1986). By regulating microtubule
Ergebnisse
56
assembly, tau proteins participate in modulating axonal morphology and growth
(Buee et al., 2000).
Tau has been the focus of multiple studies over the last years and different authors
have shown that CSF tau levels correlate with the degree of pathological changes in
the CNS. In human patients with head trauma a correlation/positive association
between clinical improvement and decreased CSF tau levels was observed (Zemlan
et al., 1999). Moreover, a severity-dependent elevation of tau in humans with acute
SCI has been demonstrated (Kwon et al., 2010). In contrast, as tau is an
intraneuronal nonreleased protein, CSF tau levels in dogs free of axonal injury are
expected to be low (Mori et al., 1995). This assumption was confirmed in our study by
the low median tau concentration in the control group and was proven in a previous
study where a mean tau level of 29.3 pg/mL was detected in the CSF of healthy dogs
(Tanaka et al., 2011).
A concentration gradient was assessed along the spinal cord for some CSF proteins
(Blennow et al., 1993). However, Sjögren et al., (2001) demonstrated that the volume
of CSF does not influence the tau concentration measured. This enables the
introduction of CSF tau measurements into the clinical routine, where the volume of
CSF collected often differs due to different sizes and bodyweights of the various dog
breeds.
Results of the present study indicate that in dogs with IVDH, CSF tau concentration
was associated with the degree of neurologic dysfunction and the functional
outcome. Although CSF tau has not been investigated previously in dogs with IVDH,
data from human traumatic brain injury as well as SCI are consistent with these
results (Zemlan et al., 1999; Kwon et al., 2010).
Disk herniations with the same dynamic properties and identical volume of extruded
material usually cause more severe damage in the thoracolumbar than in the cervical
spine, due to the smaller epidural space in the thoracolumbar region (Brisson, 2010).
This observation was confirmed in our study by higher protein tau levels in patients
with thoracolumbar IVDH compared to dogs with cervical IVDH, even though this
difference did not reach significance.
Ergebnisse
57
An area of hyperintensity greater than or equal to the length of the L2 vertebral body
in T2W MRI in paraplegic dogs with thoracolumbar IVDH has proven to correlate with
poor functional recovery (Schouman-Claeys et al., 1990; Ito et al., 2005). This
hyperintensity was thought to be caused by hemorrhage, inflammation, edema, and
necrosis (Flanders et al., 1999). As of this multifactorial pathogenesis it is not entirely
surprising that there was no clear association between high protein tau levels and
spinal cord T2W hyperintensity.
In our study no statistical difference in tau levels between dogs with or without the
administration of glucocorticosteroids could be detected. The benefit of this treatment
is controversially discussed, partly because of the risk of harmful side effects (Faden
et al., 1984; Olby, 1999; Davis and Brown, 2002). In dogs with encephalitis tau
protein levels were shown to be significantly lower if they were treated with
glucocorticosteroid (Tanaka et al., 2011).
Using a cut-off value of 41.3 pg/mL CSF tau concentration was a significant and
sensitive predictor of functional outcome in plegic dogs with IVDH. As the AUC
implies a way to measure the accuracy of a diagnostic test, it can be concluded, that
measuring protein tau in the CSF of plegic dogs to determine the functional outcome,
has a test precision of 89% (Hanley and McNeil, 1982). According to Swets (1988)
this is only a moderate accuracy for a diagnostic test. Other studies which
investigated possible prognostic biomarkers in the CSF of dogs with IVDH showed
comparable test accuracy (Levine et al., 2010; Srugo et al., 2011). A combination of
different biomarkers might still result in the most accurate outcome prediction
(Witsberger et al., 2012).
With a sensitivity of 60% and a test accuracy of 68% CSF tau concentrations could
not identify the neurologic grade. This lack of sensitivity is most likely due to the fact
that severity of neurologic signs can not only be explained by the amount of
damaged neuronal tissue but is also substantiated in acute edema, demyelination
and accompanying inflammation of the myelon. Therefore dogs may show severe
neurologic signs even though the loss of neurons and with it the release of protein
tau is minimal.
Ergebnisse
58
A possible limitation of this study is the collection site of CSF samples from the
cerebellomedullary cistern. Lumbar samples are more sensitive for the detection of
abnormalities because of the mainly caudal flow of CSF (Thomson et al., 1989,
1990). Thus, present results might underestimate CSF tau levels in dogs with IVDH,
particularly thoracolumbar IVDH. Lumbar samples were not chosen because of
possible iatrogenic blood contamination.
Previous investigations have shown that the material of test tubes may affect the
results obtained for tau. Even though tau levels did not decrease when samples were
collected in polystyrene tubes it is recommended to use non-absorbent
polypropylene tubes, which definitely have no impact on tau concentrations (Sjögren
et al., 2001). Another study examined the influence of freezing and storage on CSF
tau, revealing that neither a long period of storage nor repetitive freezing and thawing
(up to six cycles) influenced tau concentrations (Schoonenboom et al., 2005). This is
important as the retrospective design of our study implied that some samples had
been stored for a longer time before they were analyzed.
Conclusion
The measurement of protein Tau with an ELISA is reliable and easily performed.
CSF tau concentrations correlate with the degree of damaged neuronal tissue. Thus
CSF tau can be considered as a good biomarker for SCI in dogs with IVDH. A high
protein tau level has a strong potential as a useful prognostic factor in dogs showing
plegia due to IVDH. The biomarker tau protein can be used to support other
assessment tools such as clinical and MRI findings.
Ergebnisse
59
Conflict of interest statement
None of the authors of this paper has a financial or personal relationship with other
people or organisations that could inappropriately influence or bias the content of the
paper.
Acknowledgment
This study was partly funded by the German Research Foundation (FOR 1103). V.M.
Stein was supported by the Frauchiger Stiftung, Berne, Switzerland.
The author wishes to thank Arianna Maiolini for her general assistance and Dr. Rohn
(Department of Epidemiology and Information Processing, University of Veterinary
Medicine Hannover, Germany) for helping with statistical analysis.
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Ergebnisse
60
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Übergreifende Diskussion
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4. Übergreifende Diskussion
Der Liquor cerebrospinalis ist physiologischerweise eine klare, zell-, protein- und
metabolitenarme Flüssigkeit. Die Untersuchung dieser Gehirnrückenmarksflüssigkeit
liefert bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen wertvolle Hinweise für die
Stellung der richtigen Diagnose (ABATE et al. 1998). Dabei ermöglicht die moderne
Labordiagnostik neben der Bestimmung einiger Standardparameter wie Zellzahl,
Glukose- und Proteingehalt auch die Messung von Stoffwechselmetaboliten,
Enzymen und speziellen Antikörpern (DI TERLIZZI u. PLATT 2006).
Im Vergleich zu Serum weist physiologischer Liquor cerebrospinalis eine deutlich
niedrigere Gesamtproteinkonzentration auf. Pathologische Prozesse resultieren in
einer unspezifischen Erhöhung des Proteingehaltes im Liquor. Dieser Anstieg ist
entweder die Folge einer Störung der Blut-Hirn-Schranke und einem damit
verbundenen, verstärkten Proteineinstrom oder das Ergebnis einer lokalen
(intrathekalen) Produktion von Immunglobulinen (FISHMAN 1992).
Der Hauptanteil der Proteine (Albumin, Immunglobuline) des Liquor cerebrospinalis
entstammt dem Blutplasma oder entsteht nach Entzündungsreaktion infolge einer
intrathekalen Produktion. Die übrigen Proteine werden im ZNS selbst gebildet;
trotzdem sind sie selten spezifisch für das Gehirn (THOMPSON 1988). Diese so
genannten „brain-derived proteins“ können entsprechend ihrer unterschiedlichen
Herkunft aus dem Gehirnparenchym in drei Gruppen unterteilt werden (REIBER
2001):
1. Proteine aus Neuronen und Gliazellen wie z.B. Tau-Protein, S-100, NSE
(Neuronen-spezifische Enolase)
2. Proteine aus den Leptomeningen wie z.B. β-trace Protein, Cystatin C
3. Proteine mit einem zusätzlichen Anteil aus der Blutbahn wie z.B.
Transthyretin, ACE (angiotensin converting enzyme).
Die Analyse dieser speziellen Proteinfraktionen stellt in der Humanmedizin eine
wichtige Erweiterung der Liquordiagnostik dar (REIBER 2001). So können erhöhte
Gehalte an Tau-Protein im CSF beim Menschen einen Hinweis auf das Vorliegen
einer Alzheimer Erkrankung geben (BLENNOW et al. 1995; ANDREASEN et al.
Übergreifende Diskussion
68
1998). Die gezielte Messung einzelner Immunglobuline hat auch in der Tiermedizin
bereits an Bedeutung gewonnen, da gezeigt werden konnte, dass eine simultane
Erhöhung von Immunglobulin A in Serum und Liquor ein starkes Indiz für das
Vorliegen einer steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis ist (TIPOLD u. JAGGY 1994).
Die vorliegende Arbeit gibt einen Überblick über die Bedeutung der Analyse des CSF
in der neurologischen Diagnostik mit dem Schwerpunkt der Bestimmung von
Immunglobulin A bei der kaninen steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis sowie der
Messung von Tau-Protein bei Hunden mit Bandscheibenvorfall.
Das Ziel der ersten Studie war die Etablierung und Validierung einer neuen
Messmethode für die zeitnahe Bestimmung von IgA in Serum und Liquor
cerebrospinalis des Hundes.
Die Einführung einer neuen Labormethode kann aus verschiedenen Gründen, wie
zum Bespiel Zeitersparnis oder Kostenreduktion, erfolgen. Für die Bestimmung von
Immunglobulin A in Serum und Liquor cerebrospinalis wurde bisher ein in unserem
Labor entwickelter ELISA genutzt (TIPOLD et al. 1994). Der früher verwendete radial
immunodiffusion assay (RID), welcher als Goldstandard anzusehen ist, steht nicht
mehr zur Verfügung. Kommerziell erhältliche ELISA-Testkits sind nur für die
Messung von IgA im Serum geeignet. Gründe für die Etablierung einer neuen
Messmethode waren demnach:
• Der Bedarf an einer alternativen Messmethode für die Bestimmung
von IgA im CSF
• Die Aussicht auf eine zeitnahe Bestimmung von Einzelproben
• Die Möglichkeit der Messung von IgA in geringen Probenvolumina.
Der „microsphere-based immunofluorescence assay“ (MIA) wurde als potentielle
neue Messmethode ausgewählt, da diesem Verfahren ein dem ELISA ähnliches
Funktionsprinzip zu Grunde liegt und somit die im ELISA etablierten Antikörper
genutzt werden konnten. Zudem war es bereits in anderen Studien gelungen, eine
gute Korrelation zwischen den Ergebnissen beider Messverfahren aufzuzeigen
(MCHUGH et al. 1989; SYRJALA et al. 1991; KWITTKEN et al. 1994).
Übergreifende Diskussion
69
Beide Methoden benötigen eine Festphase für die stattfindende biochemische
Nachweisreaktion, wobei im ELISA die flachen Böden der Mikrotiterplatten und im
MIA die sphärische Oberfläche der „Beads“ diese Vorraussetzung erfüllen. Im
Gegensatz zur kolorimetrischen Bestimmung der Analyten im ELISA, nutzt der
MIA allerdings die Fluoreszenz zur Detektion. Durchflusszytometrische
immunfluoreszenz-basierte Methoden bieten einige Merkmale, die besonders für die
serologische Diagnostik wertvoll sind. Neben der Möglichkeit zur Quantifizierung der
Fluoreszenzintensität und der einzelnen Betrachtung von Zell-/Partikelpopulationen
ist auch die Steigerung der statistischen Genauigkeit durch die hohe Anzahl
gemessener Partikel von Vorteil (MCHUGH et al. 1989).
Die Validierung einer neuen Messmethode ist ein komplexes Unterfangen.
Verschiedene Autoren in der Human- und Veterinärmedizin beschreiben
unterschiedliche Vorgehensweisen bei der Gestaltung einer Methodenvalidierung
und der Interpretation der Ergebnisse. Die OIE (Office International des Epizooties)
hat 1996 einen Leitfaden zur Validierung von Testmethoden für die Diagnose von
Infektionskrankheiten in veterinärmedizinischen Laboren erstellt. Prinzipien der
Standardisierung und Validierung von ELISAs im Speziellen wurden bereits 1993 von
WRIGHT et. al. diskutiert. Da die genannten Autoren sich insbesondere mit
diagnostischen Tests zur Erkennung von Infektionskrankheiten bei Tieren beschäftigt
haben, sind diese Protokolle für die Validierung einer Methode zur Messung von IgA
mit anschließendem Vergleich der Methoden allerdings nur begrenzt geeignet.
LUMSDEN (2000) sowie JENSEN u. KJELGAARD-HANSEN (2006) beschreiben
mögliche Vorgehensweisen für die Beurteilung einer neuen Messmethode und die
statistische Aufarbeitung der Daten für den Methodenvergleich in der
Veterinärmedizin. Neben der Abschätzung der benötigten Probenanzahl, der
Definition des klinisch relevanten Messbereiches, der Bestimmung der Präzision und
Reproduzierbarkeit der neuen Methode ist die Beurteilung der klinischen
Anwendbarkeit von wesentlicher Bedeutung (LUMSDEN 2000; JENSEN u.
KJELGAARD-HANSEN 2006). Des Weiteren gilt es Vor- und Nachteile der neuen
Methode aufzudecken und diese im Zusammenhang mit Merkmalen der
Vergleichsmethode zu bewerten. Die Besonderheit des Methodenvergleichs bei
Übergreifende Diskussion
70
Immunoassays ist die Verwendung möglichst vieler gleicher Komponenten, denn
unterschiedliche Antikörper, Puffer, Substrate und Inkubationszeiten können zu
deutlichen Veränderungen der Ergebnisse führen und so eine vergleichende
Bewertung unmöglich machen (LAPPIN 2000). Wie bereits erwähnt, war es durch
das ähnliche Funktionsprinzip beider Methoden möglich, die gleichen Antikörper
einzusetzen. Um eine optimale Standardkurve zu erhalten, musste allerdings eine
Anpassung der Verdünnung des Sekundärantikörpers (Maus-gegen-kanines-IgA)
erfolgen. Bei einer Verdünnung von 1:2,5 zeigte sich ein sigmoidaler Verlauf der
Standardkurve, anhand derer die IgA-Konzentrationen der insgesamt 44
korrespondieren Serum- und Liquorproben berechnet werden konnten.
Präzision und Reproduzierbarkeit einer Methode werden durch Intra- und Interassay-
Varianz, ausgedrückt als Variationskoeffizient, beschrieben. Die Intraassay-Varianz
für die Bestimmung von IgA im Liquor cerebrospinalis lag bei beiden Methoden in
einem sehr guten Bereich (Beads: 5,5%, ELISA: 4,09%). Im Serum zeigte sich
allerdings ein deutlicher Unterschied zwischen den Methoden (Beads: 11,2%,
ELISA: 4,0%), welcher dann auch bei der Interassay-Varianz für Serum und Liquor
festgestellt wurde (Beads CSF: 41,9% Serum: 42,6%; ELISA CSF: 29,7%
Serum: 16,1%). Diese hohe Variabilität des MIAs könnte einerseits durch
Quervernetzungen zwischen den Beads, die den Anteil freier Antikörperbindungs-
stellen reduzieren und so zu Messschwankungen führen, oder andererseits durch
unspezifische Bindungsreaktionen mit sonstigen im Serum enthaltenen Proteinen
hervorgerufen worden sein.
Der Vergleich der Methoden nach BLAND u. ALTMAN (1986) ergab für die CSF-
Proben zunächst eine gute Übereinstimmung, da 97,3% der Messwerte im Bereich
der „limits of agreement“ lagen. Bei genauer Betrachtung des Bland-Altman-Plots
wurde allerdings die große Spannweite des Übereinstimmungsintervalls deutlich, so
dass letztendlich nur noch eine moderate Konformität bestätigt werden konnte.
Die bei den Serumproben ermittelte große Streuung und Verzerrung der Daten mit
weit auseinander liegenden Grenzen des Übereinstimmungsintervalls waren nicht
akzeptabel und die Hypothese der Gleichheit der Methoden musste abgelehnt
werden.
Übergreifende Diskussion
71
Um zu prüfen, ob der MIA für die Diagnosestellung der SRMA geeignet ist, wurde ein
zusätzlicher Vergleich der Messwerte anhand des klinischen Referenzbereiches
durchgeführt. Bei den Liquorproben stimmten 84,2% der mit den Beads gemessenen
Werte mit der im ELISA ermittelten IgA-Konzentration überein. Somit ist der MIA als
Methode zur Messung von IgA im Liquor gut anwendbar, aber nicht geeignet für die
Konzentrationsbestimmung im Serum, da hier nur 18,2% der Werte übereinstimmten.
Die mit dem kommerziell erhältlichen ELISA gemessenen IgA-Konzentrationen im
Serum waren weder mit den Ergebnissen des ELISAs nach TIPOLD et al. (1994),
noch mit den Messwerten des MIAs vereinbar. Dies bestärkt den Gedanken, dass
jeder Test individuell und in Zusammenhang mit seinen eigenen Referenzbereichen
bewertet werden sollte (JACOBSON u. ROMATOWSKI 1996). Die Tatsache, dass in
der veterinärmedizinischen Literatur uneinheitliche Referenzwerte für die IgA-
Konzentrationen in Serum und Liquor zu finden sind, unterstreicht die Notwendigkeit,
allgemein anerkannte Werte für IgA-Konzentrationen bei Hunden anzugeben bzw. zu
erarbeiten (REYNOLDS u. JOHNSON 1970; HEDDLE u. ROWLEY 1975;
FELSBURG et al. 1985; GLICKMAN et al. 1988; SCHREIBER et al. 1992; TIPOLD et
al. 1994; GRIOT-WENK et al. 1999).
Verschiedene Faktoren hatten einen limitierenden Einfluss auf die Studie. Zum einen
fehlte zum Vergleich ein definitiver Goldstandard, denn der ELISA stellte lediglich
eine Referenzmethode dar. Somit gestaltete sich die Validierung der neuen Methode
schwierig und es war ausschließlich ein Vergleich der Methoden untereinander
möglich. Zum anderen gab es einen Unterschied in den verwendeten Verdünnungs-
stufen des Sekundärantikörpers. Dies führte zu einer nicht komplett gleichartigen,
materiellen Ausgangsbasis und muss somit als mögliche Ursache für die detektierten
Variationen in Erwägung gezogen werden.
Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass der MIA den ELISA nicht ersetzen wird, die
Methode aber durchaus Vorteile mit sich bringt. Es konnte gezeigt werden, dass die
Methode einfach durchzuführen ist und dass trotz der statistisch gesehenen eher
geringen Übereinstimmung eine gute klinische Anwendbarkeit für die Messung von
IgA im Liquor cerebrospinalis vorliegt. Die Evaluierung eigener Referenzwerte für
den MIA kann im Rahmen weiterer Studien empfohlen werden. Zusätzlich bietet der
Übergreifende Diskussion
72
MIA die Möglichkeit, andere Proteine (z.B. Cytokine, Chemokine), gegebenenfalls
auch in Multiplex-Systemen, im Liquor zu bestimmen. Diese simultane Messung
verschiedener Analyten in einer einzelnen Probe ermöglicht nicht nur eine
Erweiterung der diagnostischen Möglichkeiten in der Neurologie, sondern könnte
auch zur Erforschung von bisher noch unbekannten Pathomechanismen beitragen.
In der zweiten Studie wurde der Gehalt an Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis bei
51 Hunden mit zervikalem oder thorakolumbalem Bandscheibenvorfall, sowie bei 12
gesunden Hunden bestimmt.
Bandscheibenvorfälle beim Hund sind eine häufige Ursache einer traumatischen
Schädigung des Rückenmarks. Durch die komplette oder partielle Verlagerung der
Bandscheibe aus ihrer physiologischen Lage zwischen den Wirbelkörpern entsteht
eine mehr oder weniger starke Kompression des Rückenmarks mit Durchblutungs-
störungen und Hypoxie als Konsequenz (JAGGY 2005). Die Weiterleitung von
neuronalen Signalen wird aufgrund der direkten physikalischen Durchtrennung von
Axonen oder durch den negativen Einfluss von Blutungen und Ödemen in der
Umgebung gestört (ANDERSON u. HALL 1993). Zusätzlich kann es im weiteren
Verlauf durch eine Kaskade sekundärer pathophysiologischer Reaktionen zur
Nekrose und Apoptose von Nervenzellen kommen (PLATT u. OLBY 2004).
Der Untergang neuronaler Zellen resultiert in der Freisetzung von intrazellulären
Bestandteilen, darunter auch Tau-Protein, in das umliegende Gewebe, von wo aus
sie in den Liquor cerebrospinalis gelangen (SEGAL 1993). Da Tau-Protein primär in
den Nervenzellen und dort besonders in den Axonen lokalisiert ist, wurde die
Hypothese aufgestellt, dass Tau-Protein als Biomarker für axonale Schäden dienen
könnte (BINDER et al. 1985).
In der Vergangenheit ist eine Vielzahl von Biomarkern auf ihr Potential axonale
Zellschäden zu quantifizieren untersucht worden. So erlauben zum Beispiel die
Konzentrationen an Neurofilament-, sauren Gliafaser- und S-100beta-Proteinen in
der Gehirnrückenmarksflüssigkeit die Abschätzung neuronaler Schäden bei
Menschen mit Rückenmarkstrauma (BRISBY et al. 1999; GUÉZ et al. 2003; KWON
et al. 2010).
Übergreifende Diskussion
73
Studien in der Humanmedizin an Patienten mit Schädel-Hirn-Trauma bzw. mit
Rückenmarksverletzungen konnten zeigen, dass die Konzentration von Tau-Protein
im Liquor cerebrospinalis im Zusammenhang mit der Schwere neurologischer
Defizite der Patienten steht (ZEMLAN et al. 1999; KWON et al. 2010).
Das Ausmaß der Rückenmarksläsionen bei einem Bandscheibenvorfall ist variabel
und dementsprechend variieren auch die resultierenden neurologischen Defizite, die
von Hyperästhesien im Bereich der Wirbelsäule bis zu vollständigen Lähmungen der
Gliedmaßen reichen können (JAGGY 2005). Grundsätzlich gesehen ist der
Bandscheibenvorfall eine gut zu therapierende Erkrankung. Für die Entscheidung,
welches Therapiekonzept zum Einsatz kommt, ist die Einschätzung der Prognose
von großer Bedeutung.
In den letzten Jahren wurden insbesondere die Beurteilung der Tiefensensibilität
sowie die Befunde der Magnetresonanztomographie als Anhaltspunkte für die
Stellung der Prognose verwendet (SCOTT 1997; LEVINE et al. 2009; BOEKHOFF et
al. 2012). Da aber auch Hunde mit Verlust des Tiefenschmerzens eine Erholungs-
chance von 43 bis 75% besitzen, und da das Auffinden von veränderten
Signalintensitäten im betroffenen Rückenmarksabschnitt im MRT nicht zwangsläufig
auf Gewebsnekrosen und -malazien schließen lässt, bedarf es weiterhin eines
verlässlichen prognostischen Faktors (YOVICH et al. 1994; DUVAL et al. 1996;
FLANDERS et al. 1999; OLBY et al. 2003; ITO et al. 2005; RUDDLE et al. 2006).
Aus diesem Grund beschäftigten sich verschiedene, in den letzten Jahren
erschienene Veröffentlichungen, mit Möglichkeiten zur genaueren Stellung der
Prognose von Bandscheibenvorfällen beim Hund, wobei auch Studien mit Analyse
unterschiedlicher Substanzen im Liquor cerebrospinalis durchgeführt wurden.
Ein Zusammenhang zwischen dem Grad der neurologischen Defizite und den
Konzentrationen an Glutamat und Beta-2-Microglobulin im Liquor wurde entdeckt
(OLBY et al. 1999; MUÑANA et al. 2007). Messungen der Kreatinkinase und des
Myelin-basischen Proteins ergaben signifikant höhere Werte bei Hunden, die nach
der Operation keine Spontanbewegungen aufwiesen (LEVINE et al. 2010;
WITSBERGER et al. 2012). SRUGO et al. (2011) zeigten, dass eine Pleozytose mit
der Schwere der Rückenmarksläsion korreliert. Der prozentuale Anteil an
Übergreifende Diskussion
74
Makrophagen, sowie die Aktivität der Kreatinkinase im Liquor sind mögliche
prognostische Indikatoren (SRUGO et al. 2011; WITSBERGER et al. 2012).
In der vorliegenden Studie wurden die Zusammenhänge zwischen der Anamnese
(Dauer der Erkrankung, Vorbehandlung), dem Grad der neurologischen Symptome,
den Befunden der bildgebenden Diagnostik (Magnetresonanztomographie), dem
Verlauf während des stationären Aufenthaltes und der Konzentration des Tau-
Proteins im Liquor cerebrospinalis beurteilt.
Tau-Protein gehört nicht in die Gruppe der sekretorischen Proteine, so dass bei
gesunden Hunden niedrige Messwerte im Liquor erwartet werden. Diese Vermutung
wurde durch die geringen Konzentrationen an Tau-Protein bei den gesunden
Kontrollhunden in dieser, sowie in einer vorhergehenden Studie, bestätigt (TANAKA
et al. 2011).
Aufgrund des schmaleren Epiduralraums im Bereich der thorakolumbalen Wirbel-
säule verursachen Bandscheibenvorfälle mit gleichen dynamischen Eigenschaften
und identischem Volumen an extrudiertem Material in dieser Region in der Regel
schwerere Schäden als im Bereich der Halswirbelsäule (BRISSON 2010). Diese
Beobachtung bestätigte sich in der Studie durch höhere Tau-Protein-Konzentrationen
bei Patienten mit thorakolumbalem Bandscheibenvorfall im Vergleich zu Hunden mit
zervikaler Läsion, auch wenn dieser Unterschied keine Signifikanz erreichte.
Vorhergehende Studien an der Klinik für Kleintiere verdeutlichten die Bedeutung der
Befunde im MRT für die Stellung der Prognose (BULL 2006; BOEKHOFF 2010).
Eine intramedulläre hyperintense Läsion in der T2-gewichteten MRT-Sequenz, die
mindestens der Länge des zweiten Lendenwirbelkörpers entspricht, korreliert
signifikant mit einem schlechteren Genesungserfolg (ITO et al. 2005). Solch eine
Hyperintensität des Myelon kann durch pathologische Prozesse wie Nekrosen,
Myelomalazien, Blutungen oder Ödeme bedingt werden (SANDERS et al. 2002).
Aufgrund dieser multifaktoriellen Genese ist es nicht überraschend, dass kein
signifikanter Zusammenhang zwischen erhöhten Tau-Protein-Gehalten im Liquor
cerebrospinalis und einer Hyperintensität des Rückenmarks in der T2-gewichteten
Sequenz gefunden werden konnte. Es zeigte sich allerdings, dass Hunde mit
Übergreifende Diskussion
75
T2-gewichteten hyperintensen Läsionen im Myelon tendenziell höhere Tau-Protein-
Konzentrationen aufwiesen als Hunde ohne einen derartigen MRT-Befund.
Eine Behandlung mit Glukokortikosteroiden bei Hunden mit Enzephalitiden äußert
sich in signifikant niedrigeren Tau-Protein-Konzentrationen im Liquor (TANAKA et al.
2011). Im Gegensatz dazu konnte in der vorliegenden Studie bei Hunden mit
Bandscheibenvorfällen kein eindeutiger Effekt durch die Gabe von steroidalen
Antiphlogistika auf den Tau-Protein-Gehalt im Liquor nachgewiesen werden. Es gab
eine leichte Tendenz, dass Hunde unter Glukokortikosteroid-Einfluss geringere Tau-
Messwerte aufzeigen, aber diese Beobachtung erreichte keine Signifikanz.
Glukokortikosteroide werden oft mit der Absicht verabreicht, die Kaskade sekundärer
Pathomechanismen zu beeinflussen, um Schäden im Rückenmark zu minimieren
(HALL 1993). Der tatsächliche Nutzen dieser Behandlung ist allerdings umstritten,
unter anderem aufgrund der potentiellen Nebenwirkungen (FADEN et al. 1984;
OLBY 1999; DAVIS u. BROWN 2002).
BOEKHOFF et. al (2012) konnten zeigen, dass das Ausmaß der Rückenmarks-
kompression signifikant mit der Dauer des Krankheitsgeschehens ansteigt. Eine
Assoziation zwischen den Tau-Protein-Messwerten und der Zeitspanne der
Erkrankung ließ sich jedoch nicht nachweisen. Eine mögliche Erklärung dafür ist die
Tatsache, dass eine Kompression des Rückenmarks auch durch Ödeme und
Blutungen hervorgerufen werden kann. Dies sind potentiell reversible Erscheinungen
und müssen daher nicht in einer erhöhten Menge an geschädigtem neuronalem
Gewebe respektive einer gesteigerten Tau-Protein Freisetzung resultieren.
Die Tau-Protein-Konzentration im Liquor cerebrospinalis von Hunden mit Band-
scheibenvorfällen korreliert sowohl mit dem Grad der neurologischen Symptome als
auch mit dem Krankheitsverlauf. Hunde, die eine Besserung des neurologischen
Status innerhalb von einer Woche zeigten, hatten signifikant niedrigere Tau-Protein-
Messwerte als Hunde, bei denen keine Verbesserung der Symptomatik innerhalb
dieses Zeitraums auftrat (p = 0,015). Eine noch deutlichere Signifikanz erreichte der
genannte Zusammenhang bei alleiniger Betrachtung des Krankheitsverlaufes der
plegischen Hunde (p = 0,008). Der mittels der ROC-Kurvenanalyse errechnete
Grenzwert von 41,3 pg/ml lässt schlussfolgern, dass bei höheren CSF-Tau-Protein-
Übergreifende Diskussion
76
Messwerten ein ungünstigerer klinischer Verlauf bei plegischen Hunden
wahrscheinlich ist. Die Beobachtungen dieser Studie decken sich mit Erkenntnissen
aus der Humanmedizin (KWON et al. 2010) und bestätigen die eingangs gestellte
Hypothese, dass die Tau-Protein-Konzentration im Liquor mit der Schwere der
Schädigung des Rückenmarks bei Hunden mit Bandscheibenvorfall korreliert.
Einen limitierenden Einfluss auf die Ergebnisse hatte die Entnahme des Liquor
cerebrospinalis aus der Cisterna cerebellomedullaris. Aufgrund des vorwiegend
caudalen Flusses der Gehirnrückenmarksflüssigkeit bieten lumbal gewonnene
Liquorproben in der Regel eine größere Sensitivität für die Detektion von Pathologien
im Bereich des thorakolumbalen Rückenmarks, bergen aber auch ein höheres Risiko
der iatrogenen Blutkontamination (THOMSON et al. 1989, 1990). Die vorliegenden
Ergebnisse könnten somit den tatsächlichen Gehalt an Tau-Protein im Liquor noch
unterschätzen, insbesondere bei Hunden mit thorakolumbalen Bandscheiben-
vorfällen.
Neben den klinisch bedeutsamen Erkenntnissen ist auch die Probenhandhabung ein
wichtiger Aspekt für die Etablierung der Messung des Tau-Proteins in der
veterinärmedizinischen Liquordiagnostik. Weder eine längere Lagerung noch
wiederholtes Auftauen und Einfrieren (bis zu sechs Zyklen) beeinflussen die Tau-
Protein-Konzentration im CSF (SCHOONENBOOM et al. 2005). Das Material der
Teströhrchen kann jedoch die Messergebnisse von bestimmten Proteinen im Liquor
beeinträchtigen. Auch wenn keine bedeutende Abnahme der Konzentration an Tau-
Protein bei der Verwendung von Polystyrol-Röhrchen bemerkt werden konnten, ist es
trotzdem empfehlenswert, nicht absorbierende Polypropylen-Röhrchen, welche
definitiv keine Auswirkungen auf die Messwerte haben, zu verwenden (SJÖGREN et
al. 2001).
Die Studie konnte zeigen, dass Tau-Protein bei Hunden im Liquor cerebrospinalis mit
einem kommerziell erhältlichen ELISA messbar ist und dass die Konzentration an
Tau-Protein mit dem Schweregrad der Rückenmarksschäden bei Hunden mit
Bandscheibenvorfällen korreliert. Damit eignet sich Tau-Protein als Biomarker für
Rückenmarksläsionen im Allgemeinen und kann im Speziellen bei plegischen
Hunden (Grad 4 bzw. 5 nach SHARP u. WHEELER, 2005) als prognostischer Faktor
Übergreifende Diskussion
77
angesehen werden. Die bestmögliche Einschätzung der Prognose gelingt durch eine
Kombination verschiedener diagnostischer Mittel. Der Gehalt an Tau-Protein im
Liquor ergänzt die Befunde der klinischen Untersuchung und bildgebenden
Diagnostik und schafft damit eine gute Basis für die Stellung der Prognose.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Analyse spezifischer Proteine im
Liquor cerebrospinalis wichtige Hinweise für die Diagnose und Prognose
neurologischer Erkrankungen liefert. Bei der kaninen steril-eitrigen Meningitis-
Arteriitis ist das Ergebnis der parallelen Bestimmung von Immunglobulin A in Serum
und Liquor ein entscheidendes Kriterium für die Stellung der Diagnose. Bei Hunden
mit einem Bandscheibenvorfall kann Tau-Protein als Biomarker das Ausmaß der
Rückenmarksschäden beschreiben und so zur besseren Einschätzung der Prognose
beitragen.
Zusammenfassung
78
5. Zusammenfassung
Andrea Rörig: Beurteilung von Immunglobulin A und T au-Protein im kaninen
Liquor cerebrospinalis als diagnostische Hilfsmitte l in der klinischen
Neurologie
Die Untersuchung spezifischer Proteine im Liquor cerebrospinalis liefert wichtige
Anhaltspunkte für die Diagnose und Prognose von neurologischen Erkrankungen.
Die parallele Erhöhung von Immunglobulin A (IgA) in Serum und Liquor (CSF) ist ein
charakteristischer Befund bei Hunden mit steril-eitriger Meningitis-Arteriitis. Die erste
Studie dieser Arbeit diente der Entwicklung und Evaluierung eines „microsphere-
based immunofluorescence assay“ (MIA) zur Messung von IgA mittels
Durchflusszytometrie. Es sollte eine Methode gefunden werden, die schnell
durchführbar ist, nur geringe Probenvolumina von CSF benötigt, die Messung von
Einzelproben erlaubt und einfach in die klinische Labordiagnostik einzugliedern ist.
Die Mikrosphären wurden mit Ziege-gegen-kanines-IgA-Antikörpern beschichtet und
das gebundene IgA dann mit einem Maus-gegen-kanines-IgA-Antikörper in
Kombination mit einem PE-markierten Ziege-gegen-Maus-IgG-Antikörper detektiert.
Die Messergebnisse von 44 kaninen gepaarten Serum- und Liquorproben wurden mit
einem in der Klinik für Kleintiere etablierten ELISA sowie mit einem kommerziell
erhältlichen ELISA verglichen. Die neue Methode ergab eine gute Übereinstimmung
(84,2%) mit dem ELISA zur Messung von IgA im Liquor, aber nur eine geringe
Korrelation für die Serumproben (18,2%). Die Intraassay-Varianz war zufrieden-
stellend (CSF: 5,5%, Serum: 11,2%), die Interassay-Varianz dagegen erreichte für
die Proben einen sehr hohen (CSF: 41,9%, Serum: 42,6%) und für die
Serumkontrollen einen akzeptablen Wert (25,6%). Der „microsphere-based
immunofluorescence assay“ ist ein wertvolles Verfahren zur Bestimmung und
klinischen Interpretation von IgA im Liquor cerebrospinalis des Hundes, das aber
nicht für die Messung von IgA im Serum anwendbar ist. Der Methodenvergleich
belegte, dass jedes Testverfahren unter Beachtung der eigenen Referenzbereiche
ausgewertet werden muss. Der MIA wird den ELISA nicht ersetzen, eröffnet aber
Zusammenfassung
79
Möglichkeiten für weitere Forschungen mit Mikrosphären-Tests, um verschiedene
Proteine im kaninen CSF zu messen. Die Einführung dieser Art von Immunoassays
bietet eine potentielle Verbesserung der Diagnosemöglichkeiten bei verschiedenen
Spezies.
Bandscheibenvorfälle beim Hund sind eine häufige Ursache für Verletzungen des
Rückenmarks. Ein potentieller Marker für neuronale Schädigung ist das mikrotubuli-
assoziierte Protein Tau, welches überwiegend in Nervenzellen und dort besonders in
den Axonen lokalisiert ist. Um die bestmögliche Therapie bei Bandscheibenvorfällen
zu wählen, ist eine vorherige Einschätzung der Prognose wichtig. Aus diesem Grund
sollte in der zweiten Studie dieser Arbeit die Hypothese bewiesen werden, dass Tau-
Protein im Liquor cerebrospinalis mit dem Schweregrad der neurologischen
Symptome und der Genesung bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen korreliert.
Dazu wurden die Daten von 51 Hunden mit thorakolumbalen oder zervikalen
Bandscheibenvorfällen retrospektiv ausgewertet. Signalement, Grad der
neurologischen Störungen, Zeit vom Auftreten der klinischen Symptome bis zur
Vorstellung in der Klinik, Vorbehandlungen (mit besonderer Beachtung der Gabe von
Glukokortikosteroiden), Lokalisation des Bandscheibenvorfalls, pathologische
Veränderungen des Myelon im MRT und der Verlauf der neurologischen
Symptomatik wurden beurteilt. Der Gehalt an Tau-Protein im CSF wurde mittels
eines ELISA bestimmt. Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen dem
Schweregrad der neurologischen Symptome und der Konzentration an Tau-Protein
im Liquor konnte gefunden werden. Plegische Hunde zeigten höhere CSF Tau-Werte
(Median: 79,9 pg/ml) im Vergleich zu gesunden (Median: 20,6 pg/ml) und
paretischen Hunden (Median: 30,1 pg/ml). Plegische Hunde, welche sich innerhalb
von einer Woche um einen neurologischen Grad verbesserten, hatten signifikant
niedrigere Tau-Protein Werte als plegische Hunde, die mehr Zeit für die Erholung
benötigten oder keine neurologische Verbesserung zeigten. Eine CSF-Tau-
Konzentration größer als 41,3 pg/ml lässt mit einer Sensitivität von 86% und einer
Spezifität von 83% einen ungünstigen klinischen Verlauf bei plegischen Hunde
vorhersagen. Es ließen sich keine eindeutigen Zusammenhänge zwischen der
Konzentration an Tau-Protein im Liquor und den pathologischen Veränderungen des
Zusammenfassung
80
Myelon im MRT, der Vorbehandlung mit Glukokortikosteroiden, der Lokalisation der
Rückenmarkskompression sowie der Dauer der klinischen Symptome bis zur
Erstvorstellung aufzeigen. Abschließend lässt sich sagen, dass der Gehalt an Tau-
Protein im CSF mit der Schwere der Rückenmarkschädigung bei Hunden mit
Bandscheibenvorfällen korreliert und somit als Indikator für neuronale Verletzungen
angesehen werden kann.
Summary
81
6. Summary
Andrea Rörig: Canine cerebrospinal fluid immunoglob ulin A and tau protein as
diagnostic tools in clinical neurology
The analysis of specific proteins in cerebrospinal fluid supports diagnosis and
prognosis of neurological diseases.
The simultaneous increase of immunoglobulin A (IgA) in serum and cerebrospinal
fluid (CSF) is a characteristic finding in dogs suffering from canine steroid-responsive
meningitis–arteritis. The first study aimed at developing and evaluating a
microsphere-based immunofluorescence assay (MIA) for the measurement of IgA,
trying to establish a quick method requiring only small volumes of CSF and
applicable in daily clinical work-up. Microsphere beads can be measured by flow
cytometry, the evaluation of single probes is feasible. Beads were coated with goat-
anti-dog IgA antibodies and bound IgA was detected by a mouse-anti-dog IgA
antibody in combination with a PE-labeled goat-anti-mouse IgG. Sera and CSF from
44 dogs were tested for IgA concentration and compared with an in-house utilized
ELISA as well as a commercially available ELISA. The new method showed a good
agreement (84.2%) with the ELISA concerning the measurement of IgA in CSF but a
low correlation in serum samples (18.2%). The intraassay variance was within a good
range (CSF: 5.5%, serum: 11.2%), the interassay variance appeared to be quite high
for the samples (CSF: 41.9%, serum: 42.6%), but acceptable for the serum control
(25.6%). The microsphere based immunofluorescence assay proved to be a valuable
method for the determination and the clinical interpretation of IgA in canine CSF, but
this method was not applicable for assessment of IgA values in serum. In conclusion,
the two methods cannot be used interchangeably and method comparison showed
that each test needs to be evaluated with its own reference ranges. The MIA will not
replace the ELISA, but it opens the possibility for further research with microsphere-
based assays, measuring different proteins in canine CSF.
Intervertebral disk herniation (IVDH) is a frequent cause of spinal cord injury (SCI) in
dogs. A prior assessment of prognosis is helpful for the selection of the best
Summary
82
therapeutical approach. Microtubule-associated protein tau derives predominantly
from neurons, especially axons, making it a potential marker of neuronal injury.
Therefore, in the second study the hypothesis should be proven that CSF tau
concentration correlates with the severity of neurological signs and functional motor
recovery in dogs with IVDH. Medical records of fifty-one dogs with thoracolumbar or
cervical IVDH were evaluated retrospectively. Signalement, degree of neurological
dysfunction, time from onset of clinical signs to presentation, previous drug
administration (with emphasis on glucocorticosteroids), localization of the disk
protrusion/extrusion, pathological changes of the myelon detected by magnetic
resonance imaging, and functional neurological outcome were recorded. Cisternal
CSF tau levels were determined by an ELISA. Statistically significant correlation was
found between the neurological status and concentration of protein tau in the CSF.
Dogs displaying plegia had higher CSF tau levels (median: 79.9 pg/ml) compared to
healthy dogs (median: 20.6 pg/ml) and dogs with paresis (30.1 pg/ml). Plegic dogs
that improved by one neurological grade within a week had significantly lower tau
protein levels compared to plegic dogs that needed more time for recovery or did not
show an improvement. A CSF tau concentration of >41.3 pg/ml had a sensitivity of
86% and specificity of 83% to predict an unsuccessful outcome in plegic dogs based
on receiver-operating characteristics curve analysis. No correlation of the CSF tau
concentration was found for T2 hyperintensities detected by magnetic resonance
imaging, administration of glucocorticosteroids, localization of spinal cord
compression (cervical vs. thoracolumbar IVDH), and duration of clinical signs at
admission. In conclusion, CSF protein tau levels are positively associated with the
severity of spinal cord damage in dogs with IVDH and can be used as a marker of
axonal injury. High protein tau levels have strong potential as a useful prognostic
factor in dogs showing plegia due to IVDH.
Abkürzungsverzeichnis
83
7. Abkürzungsverzeichnis
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
Abb. Abbildung
AK Antikörper
Art.-Nr. Artikelnummer
AUC Area under the curve
Best.-Nr. Bestellnummer
BSA Bovines Serum Albumin
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
CI Confidence interval, Konfidenzintervall
CNS Central nervous system
CSF Cerebrospinal fluid, Liquor cerebrospinalis,
Gehirnrückenmarksflüssigkeit
CV Coefficient of variation, Variationskoeffizient (%)
DTT Dithiothreitol
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
et al. und andere
Fa. Firma
FACS Fluorescence activated cell sorting
g Erdbeschleunigung, Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sek2)
g Gramm
h Stunde
IVDH Intervertebral disk herniation, Bandscheibenvorfall
Ig Immunglobulin
kDa Kilodalton
log Logarithmus
M molar, Molarität
MAP Microtubule associated protein
Abkürzungsverzeichnis
84
MFI Mittlere Fluoreszenzintensität
mg Milligramm
MIA Microsphere-based immunofluorescence assay
min. Minute
ml Milliliter
MRI Magnetic Resonance Imaging, (siehe auch MRT)
MRT Magnetresonanztomographie
mM millimolar, Millimolarität
N normal, Normalität
NEM N-Ethylmaleinimid
ng Nanogramm
Nr. Nummer
OPD o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid
p Signifikanzwert
PE PhycoErythrin
PBS Phosphate-Buffered Saline, phosphatgepufferte Salzlösung
pg Picogramm
RID Radial Immunodiffusion assay
ROC Receiver-operating characteristics
SCI Spinal cord injury
sek. Sekunde
Std. Standard
SRMA Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis bzw. steril-eitrige Meningitis-
Arteriitis
T2W T2-weighted, T2-gewichtete MRT Sequenz
Tab. Tabelle
u.a. unter anderem
V.a. Verdacht auf
z.B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
85
8. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildungen
Abb. 1: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips des MIA S. 21
Abb. 2: Standardkurve mit sigmoidalem Verlauf (IgA-Konzentrationen S. 24
zwischen 0-162ng/ml, Werte logarithmiert)
Abb. 3: Prinzip des Tau-ELISA S. 36
Tabellen
Tabelle 1: Signalement und Diagnose der Patienten im Überblick S. 16
Tabelle 2: Klinisch relevante Referenzbereiche für IgA in Serum und Liquor S. 28
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Anhang
106
10. Anhang
I. Protokoll IgA-ELISA nach Tipold (1994)
1. Beschichtung der Mikrotiterplatte mit dem Primärantikörper (Ziege-gegen-
kanines-IgA-Antikörper, 1:750 mit 0,1 M Na-Carbonat-Bicarbonat (pH 9,6)
verdünnt); 100 µl/Kavität. Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur in der
feuchten Kammer
2. 3x Waschen der Platte mit Waschpuffer (= 0,9% NaCl-Lösung + 0,5% Tween 20).
3. Auftragen der verdünnten Serum- und Liquorproben, des Standards und der
Leerprobe (jeweils 100 µl/Kavität)
• Verdünnungspuffer (= 0,02 M Tris, pH 8,0 + 0,5 M NaCl + 0,5 %Tween 20)
• Verdünnung des Serums: 1:3000 und 1:6000
• Verdünnung des Liquor cerebrospinalis: 1:10
• Standard: Serumpool (162 µg/ml); acht Verdünnungsstufen, Beginn mit
einer 1:50-Verdünnung, weitere Verdünnungen 1:4
• Leerprobe: nur Verdünnungspuffer
Inkubation für 90 min. bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer auf einem
Plattenrüttler
4. 3x Waschen der Platte mit Waschpuffer
5. Zugabe des Sekundärantikörpers (monoklonaler Maus-gegen-kanines-IgA-
Antikörper, 1:100 Verdünnung mit Verdünnungspuffer); 100 µl/Kavität. Inkubation
für 90 min. bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer auf einem Plattenrüttler.
6. 3x Waschen der Platte mit Waschpuffer
7. Zugabe des Konjugates (Esel-gegen-murines-IgG-Antikörper, Peroxidase-
konjugiert, 1:2 vorverdünnt mit Glycerol, weitere 1:1000 Verdünnung mit
Verdünnungspuffer); 100 µl/Kavität. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur
in der feuchten Kammer
8. 3x Waschen der Platte mit Waschpuffer
Anhang
107
9. Herstellung der Substratlösung: 1 Sodium-Perborat-Kapsel mit Phosphat-Citrat-
Puffer in 100 ml Aqua bidest. lösen. 1 Tablette OPD (o-Phenylendiamin
Dihydrochlorid) in 25 ml des angesetzten Puffers lösen. Zugabe der
Substratlösung (100 µl/Kavität). Inkubation für ca. 3 min. bei Raumtemperatur bis
zur Gelbfärbung
10. Zugabe der Stoplösung (= 3 M Schwefelsäure) (50 µl/Kavität)
11. Photometrische Auswertung mit Hilfe des ELISA-Readers (bei einer Wellenlänge
von 450 nm mit Hilfe des Programms Gen5™)
Anhang
108
II. Protokoll IgA-ELISA der Firma ICL Laboratories Inc., USA
1. Vorbereitung der Reagenzien
• Alle Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmen
• Lösungspuffer 1:5 verdünnen
• Waschlösung 1:20 verdünnen
2. Vorbereitung der Proben und des Standards
• Verdünnung des Serums: 1:4000
• Standard: 5 µl „Dog IgA Kalibrator“ mit 495 µl 1x Puffer verdünnen (� Std. A).
Dann 40 µl von Std. A mit 654 µl 1x Puffer mischen; weiter in 1:2
Verdünnungsschritten
• Leerprobe: nur Lösungspuffer
3. Versuchsablauf
• Auftragen der verdünnten Serumproben, des Standards und der Leerprobe
(jeweils 100 µl/Kavität).
• Platte für 30 min. bei Raumtemperatur inkubieren
• 4x Waschen der Platte mit Waschpuffer
• Jeweils 100 µl des Konjugats in jede Kavität pipettieren
• Für 30 min. bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt inkubieren
• 4x Waschen der Platte mit Waschpuffer
• Jeweils 100 µl des TMB-Substrates in jede Kavität pipettieren
• Für genau 10 min. vor Licht geschützt bei Raumtemperatur inkubieren
• Pro Kavität 100 µl Stopp-Lösung (Schwefelsäure) pipettieren
• Photometrische Auswertung mit Hilfe des ELISA-Readers (bei einer
Wellenlänge von 450 nm mit Hilfe des Programms Gen5™)
Anhang
109
III. Versuchsprotokoll zur Kopplung des Antikörpers an die Beads
Alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen (Beads vor Licht schützen)
(1) Bead-Konjugation
1. Die Beads 30 sek. mittels Reagenzglasschüttler mischen, 75 µl der Bead-
Suspenison in ein Eppendorf-Safelock-Tube pipettieren und anschließend für
1 min. im Ultraschall behandeln
2. 1,9 µl DTT (1 M) zu den Beads pipettieren und für 5 sek. auf dem
Reagenzglasschüttler mischen
3. Vor Licht geschützt für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, dabei Beads-
Suspension alle 15 min. mittels Reagenzglasschüttler mischen
4. Beads nach Ablauf der Inkubationszeit 4x waschen: jeweils 1 ml
Kopplungspuffer zugeben, 3 min. 900x g zentrifugieren, Überstand vorsichtig
abnehmen und verwerfen. Nach dem letzten Waschen die Beads mit 20 µl
Kopplungspuffer resuspendieren
(2) Protein-Modifikation
1. 90 µl von dem Ziege-gegen-kanines-IgA-Antikörper (1 mg/ml) in ein
Eppendorf-Safelock-Cup pipettieren und 2 µl Sulfo-SMCC hinzufügen,
anschließend 5 sek. mittels Reagenzglasschüttler mischen
2. Für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, dabei Suspension alle 15 min. mittels
Reagenzglasschüttler mischen
(3) Puffer-Austausch
1. Vorbereitung der Absorptionssäule: Die Säule mehrfach kräftig schwenken,
um das abgesetzte Gel zu resuspendieren und Luftblasen zu entfernen. Die
Säule dann für 2 min. bei 1000x g zentrifugieren, um den Puffer zu entfernen
2. Die Säule mit Kopplungspuffer füllen und durchlaufen lassen; diesen Vorgang
zweimal wiederholen
Anhang
110
3. Säule in ein 5 ml-Röhrchen stellen, 2 min. bei 1000x g zentrifugieren,
Röhrchen anschließend verwerfen und die Säule in ein neues 5 ml-Röhrchen
geben
4. Komplettes Volumen der Protein-Sulfo-SMCC-Lösung auf die Säule
überführen, 2min. 15 sek. bei 1000x g zentrifugieren. (modifiziertes Protein
befindet sich dann in dem 5-ml-Röhrchen)
(4) Protein-Konjugation
1. Gesamte Proteinlösung zu den vorbereiteten Beads pipettieren und 5 sek.
mittels Reagenzglasschüttler mischen
2. Für 1 h lichtgeschützt bei Raumtemperatur inkubieren, dabei alle 15 min.
mittels Reagenzglasschüttler mischen
3. 2 µl N-Ethylmaleinimid zu dem Beads-Protein-Gemisch pipettieren, 5 sek.
vorsichtig mischen
4. Für 15 min. bei Raumtemperatur inkubieren, zwischendurch mittels
Reagenzglasschüttler mischen
5. 4x waschen: 1 ml Aufbewahrungspuffer zufügen, 3 min. bei 900x g
zentrifugieren, Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen
6. Bead-Pellet in 0,5 ml Aufbewahrungspuffer resuspendieren
Präparierte Beads vor der ersten Anwendung über Nacht ruhen lassen und generell
lichtgeschützt aufbewahren.
(5) Kontrolle der Proteinkonjugation
1. Präparierte Beads für 5 sek. vortexen
2. Zubereiten einer 1:50- und 1:100-Verdünnung des PE-konjugierter Esel-
gegen-caprines-IgG-Antikörpers
3. Vier FACS-Röhrchen wie folgt vorbereiten:
• verdünnte Beads: 245 µl Waschpuffer + 5 µl präparierte Beads
• Negativ-Kontrolle: 50 µl Waschpuffer + 50µl der verdünnten Bead-
Suspension
Anhang
111
• Antikörper 1: 50 µl der 1:50 AK-Verdünnung + 50 µl der verdünnten Bead-
Suspension
• Antikörper 2: 50 µl der 1:100 AK-Verdünnung + 50 µl der verdünnten Bead-
Suspension
4. Röhrchen für 30 min. lichtgeschützt bei Raumtemperatur inkubieren
5. Hinzufügen von 1 ml Waschpuffer, dann Röhrchen bei 1000x g für 5 min.
zentrifugieren, Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen
6. Bead-Pellet in jedem Röhrchen mit 150 µl Waschpuffer resuspendieren
7. Messung und Analyse im Durchflusszytometer
Anhang
112
IV. Signalement, Diagnose und IgA-Messwerte in Seru m und Liquor der 44 Hunde aus der Studie „Evaluatio n of a
microsphere-based immunofluorescence assay for the determination of immunoglobulin A concentration in serum and
cerebrospinal fluid of dogs“
Lfd. Nr. Rasse Alter Geschlecht Diagnose
IgA Beads CSF
(µg/ml)
IgA Beads Serum (µg/ml)
IgA ELISA Tipold CSF
(µg/ml)
IgA ELISA Tipold Serum (µg/ml)
IgA ELISA
kommerziell Serum (µg/ml)
1 Austrian Black and Tan Hound 16 M w SRMA 0,08 164,6 0,06 56,9
2 Jack Russell
Terrier 1,9 J m SRMA 0,16 192,8 0,07 57,3 370,23
3 Jack Russell
Terrier 2,1 J m SRMA 0,116 205 0,08 61 443,82 4 Boxer 13 M w SRMA 0,12 345 0,04 136 1768,60 5 Boxer 15 M w SRMA 0,12 o.P. 0,06 135 98,59
6 Berner
Sennenhund 11,5 M w SRMA 0,08 132 0,04 95,5 602,78 7 Mischling 10,5 M w SRMA 2,27 259 2,2 86,5 658,41 8 Mischling 1,6 J wk SRMA 0,35 94,6 0,29 44,5 431,83 9 Beagle 12,5 M w SRMA 0,26 242 0,13 64,8 471,54
10
Novia Scotia Duck Tolling
Retriever 14 M w SRMA 0,13 114,3 0,08 25,6 317,68 11 Zwergpinscher 1,7 J m SRMA 0,19 290 0,1 72,8 383,90
Anhang
113
Lfd. Nr. Rasse Alter Geschlecht Diagnose
IgA Beads CSF
(µg/ml)
IgA Beads Serum (µg/ml)
IgA ELISA Tipold CSF
(µg/ml)
IgA ELISA Tipold Serum (µg/ml)
IgA ELISA kommerziell
Serum (µg/ml)
12 Cocker Spaniel 15 M m SRMA 1,08 o.P. 0,76 35 281,06 13 Weimaraner 11 M w SRMA 0,22 293,8 0,1 104 767,16
14 Französischer
Griffon 1,7 J m SRMA 1,2 132 0,85 54,7 279,98
15 Portugiesischer
Hirtenhund 3,7 J wk Epilepsie 0,18 144,8 0,07 72,6 511,83
16 Labrador-Mischling 7 M m
V.a. degenerative ZNS-Erkrankung 0,3 69,4 0,02 19,3 192,66
17 Mops 11 M m
Intramedulläre Läsion Th9/10,
Syringohydromyelie, Subarachnoidalzyste 0,02 62,7 0,03 33,7 309,04
18 Berner
Sennenhund 16,5 M m SRMA 1,04 o.P. 0,42 175 1717,58 19 Mischling 15,5 M w SRMA 0,96 256 0,69 146
20 Berner
Sennenhund 1,8 J m SRMA 0,38 o.P. 0,24 168 2068,43 21 Mischling 1,9 J w SRMA 0,37 o.P. 0,28 177 1874,38
22 Berner
Sennenhund 13 M m SRMA 0,22 o.P. 0,2 183,2 2302,22 23 Boxer 10,5 M m SRMA 0,42 492 0,47 148,3 2527,92
24 Labrador Retriever 5,3 J w SRMA 1,12 172,8 0,84 84,6 1331,56
Anhang
114
Lfd. Nr. Rasse Alter Geschlecht Diagnose
IgA Beads CSF
(µg/ml)
IgA Beads Serum (µg/ml)
IgA ELISA Tipold CSF
(µg/ml)
IgA ELISA Tipold Serum (µg/ml)
IgA ELISA kommerziell
Serum (µg/ml)
25 Boxer 1,8 J m SRMA 0,86 149,3 1 108 950,86 26 Irish Setter 15 M w SRMA 0,31 286 0,36 67,8 776,54
27 Eurasier 8,25 J m Meningoenzephalitis 0,6 322 0,52 147,7 1264,36 28 Mischling 3,5 J wk Meningiom 0,54 o.P. 0,41 98,9 1126,82
29 Kleiner
Münsterländer 12,6 J m Diskopathie 0,54 o.P. 0,42 159,9 1720,12
30 Border Collie 3,7 J mk
Aggressions-verhalten unklarer
Genese 0,09 o.P. 0,06 266,3
31 Katalanischer
Hirtenhund 15 M w Anfallsgeschehen 0,26 98 0,2 115,1
32 Jack Russell
Terrier 2,8 J w SRMA 1,45 163,8 1,6 271 1735,2
33 Deutscher
Schäferhund 6,6 J wk Meningiom 2,3 o.P. 1,8 150
34 Beagle 2,85 J m SRMA 2,3 315 2,0 326 1587,99 35 Boxer 11 M w SRMA 2,44 292 2,0 308 4055 36 Weimaraner 1,8 J m SRMA 2,04 348 1,9 204,6 3078
37 Rhodesian Ridgeback 16 M mk SRMA 1,54 254 1,6 229,2 20,41
Anhang
115
Lfd. Nr. Rasse Alter Geschlecht Diagnose
IgA Beads CSF
(µg/ml)
IgA Beads Serum (µg/ml)
IgA ELISA Tipold CSF
(µg/ml)
IgA ELISA Tipold Serum (µg/ml)
IgA ELISA kommerziell
Serum (µg/ml)
38 Mischling 5,25 J w Anfallsgeschehen 2,38 450 2 177,8 39 Golden Retriever 10 M m SRMA 1,4 o.P. 1,65 511,7
40 Mischling 11,9 J w
multifokale Läsionen in Kortex und
Kleinhirn 1,7 546,5 1,53 282,1 3908 41 Boxer 10,5 M m SRMA 0,93 282 1,22 168,3
42 Französische
Bulldogge 10 J m Otitis 2,67 328 3 216,3 2338
43 Golden Retriever 12,3 J m
V.a. demyelinisierende
Polyneuropathie mit sekundärer Myopathie 3,8 o.P. 2,4 330,3
44 Deutscher
Schäferhund 9,7 J w
Zubildung Bulbus olfactorius,
V.a. Metastase eines Schilddrüsen-
karzinoms 1,37 530 1,4 303,8 3569,14 M = Monate, J = Jahre; w = weiblich, wk = weiblich kastriert, m = männlich, mk = männlich kastriert; V.a. = Verdacht auf; o.P. = oberes Plateau (Messwert nicht auswertbar)
Anhang
116
V. Signalement, erhobene Daten und Tau-Potein-Messw erte der 51 Hunde mit Bandscheibenvorfall aus der S tudie
„Cerebrospinal fluid tau protein as a biomarker for severity of spinal cord injury in canine intervert ebral disk herniation“
LfdNr. Rasse
Alter (Jahre) Geschlecht
Grad der neurolog.
Symptome Lokali-sation
Dauer der Symptome
bis zur Erstvor-stellung
Vorbe-hand-lung
Gluko-korti-koide
Besserung der
neurolog. Symptome < 7 Tage
Hyper-intensität MRT (T2-Sequenz)
Eutha-nasie
Tau in pg/ml
1 Kurzhaar-
dackel 5 m 2 TL chronisch ja ja nein nein 48,3
2 Mischling 10 m 2 TL akut nein ja nein nein 50,8
3 Rauhaar-
dackel 10 m 2 TL chronisch nein ja nein nein 55,2
4 Beagle 8,7 wk 2 C chronisch nein nein nein nein 22,3
5 Langhaar-
dackel 10,8 mk 2 C chronisch ja nein ja nein 51,7
6 Mischling 4,4 m 2 C chronisch nein ja ja nein 127,4
7 Mischling 10 m 2 TL chronisch ja nein k.A.
(Myelo-CT) nein 30,1
8 Gordon Setter 9,9 m 2 TL akut ja ja ja nein 41,8
9 Rauhaar-
dackel 6 mk 3 TL subakut ja nein nein nein 24,1
10 Rauhaar-
dackel 8 wk 3 C chronisch ja ja nein nein 26,3
Anhang
117
LfdNr. Rasse
Alter (Jahre) Geschlecht
Grad der neurolog.
Symptome Lokali-sation
Dauer der Symptome
bis zur Erstvor-stellung
Vorbe-hand-lung
Gluko-korti-koide
Besserung der
neurolog. Symptome < 7 Tage
Hyper-intensität MRT (T2-Sequenz)
Eutha-nasie
Tau in pg/ml
11 Mischling 10,3 wk 3 TL chronisch ja nein ja nein 54,8
12 Weißer
Schäferhund 10 w 3 TL chronisch ja nein nein nein 104,8
13 Rauhaar-
dackel 5,8 wk 3 TL subakut ja ja nein nein <18,7
14 Fox Terrier 3,5 mk 2 C subakut nein ja nein nein <18,7
15 Französische
Bulldogge 3,8 mk 2 TL chronisch nein ja ja nein <18,7
16 Dalmatiner 7,8 m 3 C chronisch nein nein ja ja <18,7
17 Berner
Sennenhund 5,5 m 2 TL chronisch nein ja ja nein 75,2
18 Cocker Spaniel 4,8 wk 2 TL subakut ja ja nein nein <18,7
19 Rottweiler 7 m 2 C subakut nein ja nein nein <18,7
20 Cocker Spaniel 5 mk 2 C chronisch ja ja nein nein <18,7
21 Deutsche
Dogge 6,3 m 2 C chronisch ja nein ja nein <18,7
Anhang
118
LfdNr. Rasse
Alter (Jahre) Geschlecht
Grad der neurolog.
Symptome Lokali-sation
Dauer der Symptome
bis zur Erstvor-stellung
Vorbe-hand-lung
Gluko-korti-koide
Besserung der
neurolog. Symptome < 7 Tage
Hyper-intensität MRT (T2-Sequenz)
Eutha-nasie
Tau in pg/ml
22 Rauhaar-
dackel 9 mk 2 C subakut nein nein ja ja 35,4
23
Bayrischer Gebirgs-
schweißhund 8 w 3 C akut nein ja ja nein 180,7
24 Deutscher
Schäferhund 9,5 m 2 TL subakut nein nein nein nein 57,8
25 Französische
Bulldogge 3 m 2 C subakut ja ja nein nein 193,1
26 Mischling 7,8 m 2 TL chronisch nein nein ja nein 30,9
27 Beagle 5 w 2 C akut ja ja ja nein <18,7
28 Rauhaar-
dackel 6,5 w 2 TL chronisch nein ja nein nein <18,7
29 Berner
Sennenhund 6,5 wk 2 TL chronisch nein nein nein ja 46,1
30 Langhaar-
dackel 8 m 2 TL akut nein nein nein nein <18,7
31 Rauhaar-
dackel 5 m 2 C chronisch nein nein nein ja <18,7
Anhang
119
LfdNr. Rasse
Alter (Jahre) Geschlecht
Grad der neurolog.
Symptome Lokali-sation
Dauer der Symptome
bis zur Erstvor-stellung
Vorbe-hand-lung
Gluko-korti-koide
Besserung der
neurolog. Symptome < 7 Tage
Hyper-intensität MRT (T2-Sequenz)
Eutha-nasie
Tau in pg/ml
32 Langhaar-
dackel 7,7 wk 4 C akut nein nein ja ja 61,2
33 Dackel 8,3 m 4 TL akut nein nein ja nein 89,4
34 Dackel 7,4 mk 4 TL akut ja ja ja nein <18,7
35 Langhaar-
dackel 10 w 4 TL subakut ja ja nein nein <18,7
36 Mischling 8 w 4 C akut nein ja nein nein <18,7
37 Mischling 4 mk 4 TL akut ja ja Ja nein <18,7
38 Mischling 12 m 4 TL k.A. k.A. nein Ja ja 778,7
39 Golden
Retriever 5,8 wk 4 TL subakut ja Ja nein nein 135,4
40 Rauhaar-
dackel 5,5 m 4 TL subakut ja ja Ja nein <18,7
41 Rauhaar-
dackel 8 w 4 TL subakut ja nein nein nein 479,4
42 Mischling 4,5 w 5 TL akut nein nein ja nein 70,3
Anhang
120
LfdNr. Rasse
Alter (Jahre) Geschlecht
Grad der neurolog.
Symptome Lokali-sation
Dauer der Symptome
bis zur Erstvor-stellung
Vorbe-hand-lung
Gluko-korti-koide
Besserung der
neurolog. Symptome < 7 Tage
Hyper-intensität MRT (T2-Sequenz)
Eutha-nasie
Tau in pg/ml
43 Schäferhund-
Mischling 7 m 5 TL k.A. k.A. nein ja ja 224,3
44 Langhaar-
dackel 7,8 mk 4 TL subakut nein nein ja nein 266,3
45 Rottweiler 5 mk 5 TL chronisch ja nein nein ja <18,7
46 Yorkshire
Terrier 11,9 m 4 C akut nein nein nein ja 39,5
47 Rauhaar-
dackel 6,8 m 5 TL subakut ja nein ja ja 719,8
48
Kurzhaar-dackel-
Mischling k.A. m 4 TL akut nein nein ja ja 105,1
49 Mischling 10 m 5 TL chronisch nein nein nein ja 162
50 Kurzhaar-
dackel 12,3 m 4 C akut nein nein ja ja 282,6
51 Mischling 7 mk 4 TL akut ja nein nein nein 43 m = männlich, mk = männlich kastriert, w = weiblich, wk = weiblich kastriert; C = zervikal, TL = thorakolumbal; akut = 1-5 Tage, subakut = 5-14 Tage, chronisch = > 14 Tage; k.A. keine Daten vorhanden
Anhang
121
VI. Signalement und Tau-Protein-Messwerte der 12 Ko ntrollhunde aus der Studie „Cerebrospinal fluid tau protein as a
biomarker for severity of spinal cord injury in can ine intervertebral disk herniation“
Lfd. Nr. Rasse Geschlecht Alter (Jahre) Tau in pg/ml
1 Beagle mk 6,3 36,1
2 Beagle mk 5 51,2
3 Beagle mk 6,5 <18,7
4 Beagle mk 4,8 26,2
5 Beagle mk 6,5 29,1
6 Beagle wk 5 19,8
7 Beagle mk 5 <18,7
8 Beagle k.A. k.A. 21,4
9 Labrador m 2,9 <18,7
10 Boxer w 1,75 <18,7
11 Chihuahua m 4,5 25,1
12 Mischling mk 8,8 <18,7 m = männlich, mk = männlich kastriert, w = weiblich, wk = weiblich kastriert; k.A. keine Daten vorhanden
Danksagung
122
11. Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Andrea Tipold und Frau PD Dr. Veronika
Stein, PhD für die Überlassung des interessanten Themas, sowie für ihre
unermüdliche Unterstützung und Motivation bei der Anfertigung dieser Arbeit.
Ein herzlicher Dank gebührt Frau Regina Carlson für ihren wissenschaftlichen
Beistand, ihre stete Hilfsbereitschaft und die freundliche Atmosphäre im Labor.
Des Weiteren danke ich der gesamten Neurologie-Abteilung für die gute
Zusammenarbeit und die tolle Stimmung im Team. Vielen Dank an Arianna, Maren
und Emma für die Hilfe in verschiedensten Situationen und die schöne gemeinsame
Zeit.
Ohne die zahlreichen Serum- und Liquorproben wäre meine Arbeit erst gar nicht
möglich gewesen. Ich danke daher ganz herzlich den Mitarbeiterinnen und
Mitarbeitern der Klinik für Kleintiere für ihre Hilfe beim Sammeln des
Probenmaterials.
Mein Dank gilt ebenso Herrn Dr. K. Rohn aus dem Institut für Biometrie,
Epidemiologie und Informationsverarbeitung für die Unterstützung in statistischen
Fragen.
Ich danke meinen Eltern und Karsten, dass sie immer für mich da waren und mich
unterstützt haben.
Ein großer Dank geht zudem an meinen Bruder für die stete Bereitschaft
computertechnische Probleme zu beheben.
Meinen Freunden, insbesondere Sabine, Lotte, Anne, Verena, Annika und Sonja
danke ich für viele, tolle gemeinsame Unternehmungen zur geistigen Ablenkung.
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