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G Toxicogenomics –
Anwendungen und Perspektive
in der regulatorischen
ToxikologieA. Oberemm1, K. Paal2, K.-E. Appel2
H.-B. Richter-Reichhelm1, U. Gundert-Remy1
1 Sicherheit von Stoffen und Zubereitungen2 Zentrum für Experimentelle Toxikologie
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 2
Toxicogenomics (TXG)
Metabolomics*
* figure from Nicholson et al. 2002
metabolites
transcriptionDNA Genomics/
Transcriptomics
mRNAtranslation
proteins Proteomicsprotein-proteininteractions
R1 R2
� umfassende (globale) Analyse der Expression von Genen und Proteinensowie von Metaboliten nach Exposition mit chemischen Fremdstoffen
Nuwaysir EF, Bittner M, Trent J, et al.Microarrays and toxicology: The advent of toxicogenomicsMOLECULAR CARCINOGENESIS 24 (3): 153-159 MAR 1999
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 3
Toxicogenomics & Co
� OMICS – Methoden; Teildisziplin der Molekularen Toxikologie
� analog: Pharmacogenomics (pharmazeutische Stoffe)
� Toxico - / Pharmaco - genetics:umfassende Analyse genetischer Polymorphismen (SNP‘s):Erfassung individueller Empfindlichkeiten, „personalized medicine“
� Toxicoproteomics: umfassende Analyse der Proteinexpressionnach Fremdstoffexposition
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 4
Toxicogenomics- Methoden (I)
� umfassende quantitative Erfassungen der:
� GenexpressionGenomics/ Transcriptomics
� Genchips/ DNA-Microarrays
� monochrom vs. dual-channel
� “Komplett” - Genom vs.selektive Auswahl relevanter Gene
� ProteinexpressionToxicoproteomics
� nicht-Gel basierte Verfahrenz.B. ICAT-MS 1, SELDI2, Protein-Arrays
� 2-D (Gel)Elektrophorese (2-DE)+ massenspektrometrische
Proteinidentifizierung (MALDI-MS)
770.0 1202.4 1634.8 2067.2 2499.6 2932.0
Mass (m/z)
0
7029.7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sity
Sp e c # 1 = > BC= > NF 0 .7 [BP = 2 2 7 3 .1 , 7 0 3 0 ]
2162.061405.04
2272.12
1705.14
1020.06
2151.131433.08
803.951638.13 2288.10
1475.10 1838.081276.07998.11 1493.06 2184.091993.08 2397.941327.101153.06847.10 1482.26 1716.09 2566.09
1 Isotope-Coded Affinity Tag2 Surface-Enhanced Laser Desorption Inization
+
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 5
Toxicogenomics- Methoden (II)
� umfassende quantitative Erfassungen der:
� Metabolite: Metabolomics/ Metabonomics (weitgehend synonym)
� 1H-NMR-Spektroskopie
� GC-MS
� HPLC-MS
770.0 1202.4 1634.8 2067.2 2499.6 2932.0
Mass (m/z)
0
7029.7
0
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% I
nte
nsi
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Spec #1=>BC=>NF0.7[BP = 2273.1 , 7030]
2162.061405.04
2272.12
1705.14
1020.06
2151.131433.08
803.951638.13 2288.10
1475.10 1838.081276.07998.11 1493.06 2184.091993.08 2397.941327.101153.06847.10 1482.26 1716.09 2566.09
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 6
Toxicogenomics- Methoden (III):Bioinformatik
� Methoden zur Datenanalyse
� Interpretation der Ergebnisse u.a. durch Datenbank-gestützte Analysen:
� Gen-/ Proteinfunktion
� Zuordung zu funktionalen KategorienZellstoffwechsel, Pathwayanalysen, Netzwerke
� Relevanz für Toxikologie
� Biostatistik zur Auswertung von Expressionsrohdaten:- Proben aus unbehandelter Kontrolle vs. Proben aus Behandlungsgruppen -
� Gen- / Proteinlisten von Identitäten,welche expositionsabhängig dereguliert sind
•image from Nature Vol.424, August 2003, p.611
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 7
Endpunkte Toxikologie1
1 “hazard identification”human health- related
chemicals/ biocides
(Sub-) ChronischeToxizität
�oral�dermal�inhalativ
Akute Toxizität�oral�dermal�inhalativ
Reproduktionstoxizität� Fruchtbarkeit� Entwicklungs-
schädigung
Mutagenität /Gen(o)toxizität
in vitro/ in vivo�nicht-Säuger
�Säuger
hoher Bedarf an Tierstudien:� Ethik� Kosten� Zeit
Kanzerogenität�oral�(inhalativ)
ÄtzwirkungHaut- + AugenreizungSensibilisierung
�Atemwege�Haut
Hazard IdentificationHazard Identification
• LD50
• LOAEL• NOAEL• pos. / neg.• Pathologie• Histopathologie• Physiologie
„black box“
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 8
Antworten Toxicogenomics: Zellen/ Gewebe
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 9
Zellstoffwechsel Roche Applied Science "Biochemical Pathways" wall chart:http://www.expasy.ch/cgi-bin/show_thumbnails.pl?2
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 10
Endpunkte Toxicogenomics
� Störung der Homöostase bis hin zur Entstehung irreversibler Veränderungen
� Signaltransduktion: Kaskaden biochemischer Veränderungen
Biochemie der Zelle: Schutz vor durch exogene Faktoren verursachten zelluläre Schäden:
� Reparaturmechanismen (z.B. Reparatur von DNA-Schäden, Proteinstrukturen)
� Rezeptoraktivierung (z.B. Östrogenrezeptor)
� Aktivierung fremdstoffmetabolisierender Enzyme
Analyse/ Aufklärung toxischer Wirkungsmechanismen
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 11
aus dem “Fingerprint”abgeleitete Zuordnung
zu einer toxischen Kategorie/(z.B. hautreizend, lebertoxisch
gentoxisch etc.)„Klassifizierung“
Allgemeine Konzeption
Prüfstrategie-weitere Studien?
in vitro
In vivo
Erfassung der Veränderungen von Mustern
� der GenexpressionGenomics/ Toxicogenomics
� der ProteinexpressionProteomics/ Toxicoproteomics
� der StoffwechselmetaboliteMetabolomics
Kurzzeit-Expositionin vitro - in vivo
Datenbankanalyse
Zuordnung zu einemcharakteristischen
Veränderungsmusteroder toxikologischen
Wirkungsmechanismus
„toxikologischer Fingerabdruck”
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 12
Einsatz von Omics-Methoden in der Toxikologie
� Einsatz in Kurzzeitassays, um schneller (als mit herkömmlichen Verfahren)grundlegende Informationen zu inhärenten toxischen Eigenschaftenvon Stoffen zu bekommen (Screeningverfahren) :
z.B.
Anwendungen
�von Stoffen/ Wirkstoffen bei der Produktentwicklung
�von HPV-Altstoffen, von Stoffen unter REACH („priority setting“ )
� Aufklärung toxikologischer Wirkungsmechanismen
Potentiale
� Erhöhung des Prädiktionswertes von tierexperimentellen Daten:� mittels mechanistischer Daten kann abgeleitet werden, ob Befunde aus Tierversuchen
für den Menschen relevant sind
� Verbesserung der Aussagefähigkeit/ Relevanz von in vitro Methoden
� direkte und indirekte Einsparung von Tierversuchen
� Identifizierung von Biomarkern (Rückschlüsse auf Exposition und Effekte)
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 13
Vision
� komplementärer Einsatz von in silico Methoden (QSAR) und Omics Methodenzur Modellierung/ Prädiktion toxischer Effekte von Stoffen
� öffentlich zugängliche Datenbanken
Voraussetzungen
� zentral koordinierte internationale Aktivitäten (Industrie & wiss. Einrichtungen)
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 14
Fallbeispiel: Perfluoroctansäure (PFOA)
� verwendet zur Herstellung von Polymeren�Teflon� Fluortelomeralkohole (FTOH), zur Beschichtung von Kleidung, Möbeln, Lebensmittelverpackungen
� Exposition des Menschen und der Umwelt (weltweit nachgewiesen)
� Daten aus Tierversuchen:� potentiell reproduktionstoxisch + kanzerogen
� keine eindeutigen Ergebnisse über solche Effekte beim Menschen
� Probleme bei der Risikobewertung:Übertragbarkeit der Tierversuchsdaten auf den Menschen
� Effekte im Tier werden auf einen Wirkungsmechanismus zurückgeführt,der für den Menschen kaum relevant ist:� durch den Rezeptor PPARα - ausgelöste Peroxisomenproliferation
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 15
Perfluoroctansäure (PFOA) (II)
� Humanrelevanz der Tierdaten muss weiter untersucht werden!
� Reprotox Studien an PPARα - knock-out Mäusen undGenexpressionsanalysen mit PFOA- exponierten Maus-Feten (Lungen - + Lebergewebe)
� auch Effekte, die durch andere PPAR-Rezeptoren + andere Faktoren verursacht wurden
Takacs ML, Abbott BDActivation of mouse and human peroxisome proliferator-activated receptors (alpha, beta/delta, gamma)by perfluorooctanoic acid and perfluorooctane sulfonateTOXICOLOGICAL SCIENCES 95 (1): 108-117 JAN 2007
Abbott BD, Wolf CJ, Schmid JE, et al.Perfluorooctanoic acid-induced developmental toxicity in the mouse is dependent on expression ofperoxisome proliferator-activated receptor-alphaTOXICOLOGICAL SCIENCES 98 (2): 571-581 AUG 2007
Rosen MB, Thibodeaux JR, Wood CR, et al.Gene expression profiling in the lung and liver of PFOA-exposed mouse fetusesTOXICOLOGY 239 (1-2): 15-33 SEP 24 2007
aber:
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 16
Toxicogenomics - Aktivitäten
� national/ deutschsprachiger Raum:Industrie, (BfR), (BfARM)
� international/ EU:Industrie/ ECETOC1, NGI/ NTC2, (ECVAM3)
� USA:Industrie/ ILSI4/ HESI, FDA5, NIEHS6, EPA7, NAS8
� Japan: Industrie, METI9/ NEDO10
� international: OECD/ IPCS11: „Toxicogenomics Extended Advisory Group“, ICCA12
1 European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals; 2 Netherlands Genomics Initiative/ Netherlands ToxicogenomicsCentre; 3 European Centre for the Validation of Alternative Methods; 4 International Life Sciences Institute; 5Food And Drug Administration; 6 National Institute of Environmental Health Sciences; 7 Environmental Protection Agency; 8 National Academy of Sciences; 9 Ministry of Economy, Trade and Industry; 10 New Energy and Industrial Technology Development Organization; 11 Int. Programme on Chemical Safety; 12 International Congress and Convention Association
Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 17
Toxicogenomics im BfR
� Identifizierung hepatozellulärer Biomarker zur Früherkennungkanzerogener Eigenschaften von chemischen Stoffen (in vivo - in vitro)1
� Vergleichende Proteomanalyse von Lebertumoren der Mausmit aktivierenden Mutationen in den Onkogenen ß-Catenin, Ha-Ras und B-Rafnach Induktion durch Dioxin- und Phenobarbital- artige PCB (polychlorierte Biphenyle)2
2 Kooperation mit Uni Tübingen, Prof. Schwarz
Zentrum für experimentelle Toxikologie
1 gefördert durch das
� Identifizierung von molekularen proteomischen Biomarkernfür die Risikoabschätzung von Lebensmittelinhaltsstoffen
Abteilung Lebensmittelsicherheit
� Effekte von durch neue technologische Verfahren hergestelltefunktionelle Lebensmittel auf das Proteom von humanen Darmzellen1
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IKO
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UN
G
DANKE FÜR IHRE AUFMERKSAMKEIT
Axel Oberemm
Bundesinstitut für Risikobewertung
Thielallee 88-92 � D-14195 Berlin
Tel. 0 30 - 84 12 - 0 � Fax 0 30 - 84 12 - 47 41
bfr@bfr.bund.de � www.bfr.bund.de
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