Tuomo Liljenbäck Ohjaajat: Fil.yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko

Homogeeninen multiparametrimääritys vapaalle ja

kokonais-PSA:lle käyttäen terbium(III)-kelaattia donorina

Tuomo LiljenbäckOhjaajat: Fil.yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko

MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA

Nuoret tutkijat 2008 / 11.3.2008 Arcanum

Johdanto

• Työn tarkoitus

• PSA

• FRET

• Määrityksen periaate

Työn tarkoitus

• Tarkoitus on kehittää homogeeninen, multiparametrinen immunomääritys vapaalle ja kokonais-PSA:lle– Hyödynnetään homogeenisille määrityksille hyvin

soveltuvaa fluoresenssiresonanssienergiansiirtoa (FRET)

– Määrityksessä käytetään vasta-aineita, jotka tunnistavat joko vapaan ja/tai kompleksoituneen PSA:n

PSA

• Prostata-spesifinen antigeeni (PSA) on paras ja käytetyin yksittäinen eturauhassyöpämerkkiaine

• Eturauhassyöpä on yleisin länsimaisten miesten syöpä ja toiseksi suurin syöpään liittyvien kuolemien aiheuttaja

• PSA:ta esiintyy verenkierrossa– vapaana

– kompleksoituneena

(yleensä α1-antikymotrypsiinin kanssa)

PSA

• Seerumin korkea kokonais-PSA -pitoisuus voi johtua syövän lisäksi eturauhasen hyvänlaatuisesta liikakasvusta

• PSA:ta käytetään tässä työssä mallianalyyttina– kaksi eri muotoa – soveltuu hyvin multiparametriseen

määritykseen

FRET

• FRET vaatii lähekkäin (<10 nm) olevan luovuttaja- ja vastaanottajavärin, joiden emissio- ja viritysspektrit ovat osittain päällekkäin

• FRET-parin viritysaallonpituus ja emissioaallonpituus ovat kaukana toisistaan, joten määrityksen epäspesifinen tausta jää matalaksi

• Mittausaallonpituudet valittiin siten, että Tb(III)-kelaatin emissio olisi mahdollisimman matala

Määrityksen periaate

Määrityksen periaate

Spektrit

Materiaalit ja menetelmät

• Käytetyt vasta-aineet

• Leimaukset

• Määritykset

Käytetyt vasta-aineet

• Kaikki monoklonaalisia

• 5E4– Sitoutuu vapaaseen ja

kompleksoituneeseen PSA:han

• H50– Sitoutuu vapaaseen ja

kompleksoituneeseen PSA:han

• 5A10– Sitoutuu vain vapaaseen PSA:han

Leimaukset

• Luovuttaja 5E4 Mab leimattiin terbium(III)-kelaatilla

• Vastaanottaja H50 ja 5A10 Mabit leimattiin Alexa Fluor 680:lla

• Myöhemmin H50 leimattiin myös Alexa Fluor 488:lla

Määritykset

• Varsinaiset mittaukset– BSA-pinnoitetuissa kaivoissa 100

µl tilavuudessa• 50 ng kutakin vasta-ainetta

– 2 x 45 min / 1 x 1h inkubointi huoneen lämmössä

– Mittaukset tehtiin Victor 1240 monileimalaskimella (Perkin Elmer MA, USA), johon oli lisätty punaherkkä valomonistinputki (Hamamatsu PMT R4632).

Tulokset

• Leima-asteet

• Standardisuora

• Kinetiikkatarkastelu

• Multiparametrimääritys

Leima-asteet

• Tb – 5E4 Mab (luovuttaja)– leima-aste 12,4

• AF 680 – 5A10 Mab (vastaanottaja)– leima-aste 4,6

• AF 680 – H50 Mab (vastaanottaja)– leima-aste 5,4

• AF 488 – H50 Mab (vastaanottaja)– leima-aste 5

Standardisuora

• AF 680 leimatut 5A10 ja H50 vastaanottaja-Mabit

• Signaalin määrä kasvaa PSA-pitoisuuden noustessa

y = 601,15x0,8378

R2 = 0,9976

y = 266,89x0,8662

R2 = 0,998

Kinetiikka

• Kahden tunnin inkubointi ei muuta signaalin määrää

Multiparametrinen määritys

Päätelmät

• Työssä on todistettu fluoresenssiresonanssienergiansiirron toimivan määrityksessä vapaalla PSA:lla– Vastaanottajavärin signaali kasvaa kummankin vasta-

aineen kohdalla PSA:n määrän noustessa

• Energiaa siirtyy myös, kun molemmat leimatut vasta-aineet ovat läsnä Mittaukset voidaan tehdä multiparametrisesti

• Alun perin määritys oli tarkoitus pystyttää käyttämällä Fabeja

Mab

Fab

Jatkossa

• Optimoidaan vasta-aineiden määriä• Optimoidaan kinetiikkaa• Potilaspaneeli, jos aikaa jää

Kiitokset

• Ohjaajat Ulla ja Tiina• Erikoistyöntekijät ja muu biotekniikan väki• Turun Yliopiston Kemistit TYK ry:n aktiivit