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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DELL’AQUILA
DIPARTIMENTO DI MEDICINA CLINICA, SANITÀ PUBBLICA,
SCIENZE DELLA VITA E DELL’AMBIENTE
LABORATORIO DI MICOLOGIA E SISTEMATICA MOLECOLARE
Identificazione di specie fungine mediante PCR diretta e DNA
barcode e analisi filogenetiche di base
Docenti: Dr. Mirco Iotti
Dr. Marco Leonardi
DNA barcoding
Il codice a barre del DNA (DNA barcoding) e' una sequenza di DNA che identifica in
modo univoco ogni specie vivente, proprio come il codice a barre di un prodotto
identifica ogni oggetto in vendita in un negozio. Il progetto prevede di utilizzare il
codice a barre del DNA di funghi per esplorarne la biodiversità (Fig. 1).
Figura 1 – Processo che porta all’identificazione di una specie fungina tramite DNA barcoding.
Stato dell’arte
La Tassonomia è la scienza che individua e organizza le specie in gruppi sulla base di
caratteristiche comuni. Fino a pochi anni fa la tassonomia classica relativa alle specie
appartenenti al regno dei funghi, si basava esclusivamente sulla valutazione dei
caratteri morfologici che caratterizzano le strutture riproduttive e si avvaleva di
esperti capaci di valutare soggettivamente le poche differenze tra due specie. Inoltre
per questi microrganismi il concetto di specie non è cosi definito come nel regno
degli animali e a volte ci sono incongruenze nella definizione di alcuni gruppi
Banche Dati
ITS1F
ITS4
Amplificazione DNA
Purificazione e
sequenziamento dei frammenti
amplificati
Analisi comparativa
tassonomici fra i diversi esperti. La situazione è radicalmente cambiata con l'avvento
del codice a barre del DNA, che permette di effettuare un’identificazione oggettiva di
una specie, basandosi sulla sequenza di opportuni geni "marcatori"
indipendentemente dalla fase del ciclo biologico in cui si trova la specie fungina e,
quindi, dalla presenza delle strutture riproduttive che sono presenti solo in
determinati periodi e per tempi relativamente brevi. I geni marcatori utilizzati per la
definizione del codice a barre di animali, piante e funghi hanno sequenze molto
conservate all’interno di una specie ma sufficientemente diverse tra specie e specie in
modo che ogni sequenza identificata possa essere univocamente attribuita ad una
unica specie di origine. Dal momento che, in molti geni, si osservano variazioni di
sequenza anche all'interno di una specie, la variazione tra specie diverse (variabilità
interspecifica) deve essere maggiore della variazione all'interno della stessa specie
(variabilità intraspecifica).
Il codice a barre del DNA (DNA barcoding) rapidamente diventato uno strumento
essenziale per gli studi tassonomici, ma trova applicazioni anche in altri campi, come
nel monitoraggio ambientale, nell'analisi della biodiversità di un ecosistema etc.
Il gene barcode selezionato per i funghi
I geni identificati come marcatori e attualmente utilizzati per la definizione del DNA
barcode sono diversi in funzione del gruppo di esseri viventi considerato: il gene
COX1 per gli animali, il gene rbcL per i vegetali, il gene 16S per i batteri e le regioni
ITS per i funghi. Avere identificato questi geni ha consentito di creare un catalogo
generale della diversità, di facile accesso per chiunque voglia rapidamente
identificare un organismo. Una stretta corrispondenza tra la sequenza di basi del
campione e una sequenza già presente nel database identifica un organismo a livello
di specie (se già conosciuto e ben studiato) o a livelli tassonomici superiori (genere,
famiglia, ordine). Codici a barre del tutto nuovi, consentono di immettere nuove
specie non ancora descritte.
Le regioni ITS (spazi di trascrizione interna) si trovano nel DNA ribosomiale fra i
geni 18S (o SSU, small sub-unit) e 28S (o LSU, large sub-unit) (Fig. 2) che sono
parte integrante del complesso ribosomiale dove avviene la sintesi proteica.
Figura 2 – struttura dei ribosomi.
Il DNA ribosomale (rDNA) presenta caratteristiche che lo rendono adatto per scopi di
DNA barcoding e filogenetici, in particolare:
• i geni del rDNA sono presenti in copie multiple (alcune centinaia)
essenzialmente identiche nel genoma;
• è organizzato in unità trascrizionali ripetute in tandem;
• è formato da regioni altamente conservate (trascritte) ed altre variabili per
taglia e sequenza (spaziatori interni e spaziatori intergenici);
• il grado di variabilità delle diverse regioni può essere utilizzato per
differenziare gli organismi secondo livelli tassonomici differenti;
• le banche dati sono estremamente ricche di sequenze di rDNA di diverse
provenienze e specie, utili per le finalità di DNA barcoding;
• in letteratura è disponibile una vasta gamma di coppie di primer PCR per
amplificare frammenti di rDNA in qualsiasi posizione e di qualsiasi taglia
(https://nature.berkeley.edu/brunslab/tour/primers.html);
Le regioni ITS sono due (ITS1 e ITS2) separate dal gene 5.8S (Fig. 3).
Figura 3 – struttura del DNA ribosomale.
Ambiti di utilizzo del DNA barcode
Il DNA barcoding costituisce un valido strumento per l’identificazione del livello di
biodiversità fungina e sua conservazione, nella diagnosi di patogeni fungini di
animali e piante, nel monitoraggio di specie invasive (quelle in grado di colonizzare
nuovi ambienti a scapito delle specie native), per individuare frodi alimentari in
prodotti freschi e conservati a base di funghi altrimenti non identificabili e in molti
altri campi della micologia.
Nonostante tutti i dati che confermano l'utilità del DNA barcode per l’identificazione
delle specie fungine, tale approccio molecolare non è ancora stato introdotto e
approvato per eseguire i test alimentari.
La PCR diretta
La PCR (reazione a catena della polimerasi) è una tecnica di biologia molecolare che
permette di amplificare (riprodurre) uno specifico frammento di DNA in centinaia di
milioni di copie. Solitamente tale tecnica viene preceduta dall’estrazione degli acidi
nucleici dai tessuti viventi tramite protocolli più o meno complessi in funzione della
matrice biologica oggetto d’indagine, della quantità e della purezza del materiale
genetico desiderati. La PCR diretta, al contrario, si basa sull’amplificazione del DNA
bersaglio direttamente da un microscopico frammento della matrice biologica oggetto
d’indagine che viene introdotto direttamente nei tubi di reazione. Questa tecnica
permette un risparmio di tempo e di risorse evitando il procedimento di estrazione del
DNA, oltre a ridurre l’impiego di sostanze tossiche per gli operatori durante il
processo di estrazione e ridurre il rischio di amplificare frammenti di DNA di specie
non bersaglio. Inoltre, la PCR diretta necessita di quantità minime di materiale
oggetto d’indagine, condizione spesso limitante per chi opera con microrganismi in
condizioni naturali. Il principale ostacolo all’amplificazione diretta del DNA
bersaglio da una matrice biologica è la presenza di sostanze cellulari (es. polifenoli)
che inibiscono l’attività enzimatica di polimerizzazione. Comunque, nel caso di
materiale fungino l’efficienza di amplificazione è generalmente paragonabile a quella
del DNA preventivamente estratto. A differenza di un’amplificazione PCR con DNA
estratto è necessario inserire nella miscela di reazione quantità elevate di albumina di
siero bovino (fino a 80 μg in reazioni da 50 μl a seconda del tipo di materiale
impiegato) allo scopo di bloccare l’azione inibente nei confronti della DNA
polimerasi. La PCR diretta è particolarmente indicata per il DNA barcode dei funghi
in cui non serve disporre di una riserva di DNA estratto, e la si può applicare in
diverse fasi del ciclo biologico di una specie (strutture riproduttive, simbiontiche o
vegetative).
Reagenti
Primers (forward and reverse, 10 μM
Taq DNA Polymerase enzima 5U/μl
Taq buffer 10x
dNTPs (10 mM)
Bovine Serum Albumine (25 mg/ml)
Agarosio
Buffer TAE
EuroSafe DNA Stain
Loading dye 6x
H2O distillata
ESTRAZIONE
DEL DNA
Amplificazione
delle regioni ITS
1-2x10-3
mm3
1-2x10-2
mm2
10-20 ife 1-2 mm
di lunghezza
• 100 mg di gleba
• 1-10 apici
micorrizzati
• 100 mg di
micelio da
coltura liquida
(purificazione o
aggiunta di
BSA alla
reazione
successiva)
Reagenti: • acqua ultrapura • buffer PCR • MgCl
2
• dNTP • Primer • DNA polimerasi
Norme di lavoro
•per chi ha i capelli lunghi: legarsi i capelli con un elastico
•prima di cominciare a lavorare, lavarsi le mani
•pulire il banco di lavoro con alcol etilico denaturato
•prima di cominciare l’esperimento, lo studente verrà familiarizzato con la
strumentazione che dovrà utilizzare, in modo particolare con le micropipette e con i
dispositivi di protezione individuale necessari per svolgere in sicurezza tutto il
programma di lavoro.
Reagenti e parametri delle reazione di PCR diretta
Mix PCR per 1 campione fungino Buffer 10x 5 μl
Primer ITS1F (for -10 μM) 2 μl
Primer ITS4 (rev -10 μM) 2 μl
dNTPs (10 mM) 1 μl
H2O 17,2 μl
DNA /
BSA (25 mg/ml) 1,5 μl
Taq polimerasi 5U/μl 0,3 μl
Totale 50 μl
Primer forward ITS1F: 5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’
Primer reverse ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
Parametri termici Den. iniziale 95 °C 10’
30 cicli
Denaturazione 95 °C
Appaiamento
primer
55 °C
Estensione 72 °C
Est. finale 72 °C 10’
Raffreddamento 4 °C
Analisi dei prodotti di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio
Preparazione del gel di agarosio
La concentrazione di agarosio del gel viene scelta dal ricercatore in base alle
dimensioni dei frammenti di DNA da separare e dalla qualità di visualizzazione delle
bande desiderata. Nel nostro caso, dovendo separare frammenti lineari di DNA
compresi tra 500 e 800 bp (base pairs, coppie di basi), si utilizza un gel di agarosio al
1.5%.
preparare la vaschetta per elettroforesi e verificare che il piano su cui si
appoggia la vaschetta per elettroforesi sia orizzontale
misurare 70 ml di tampone TAE 1x in un cilindro e versarli nella beuta di vetro
pirex che contiene già 1 g di agarosio; tapparla con pellicola all’estremità a cui
praticare dei fori di sfiato
sciogliere l’agarosio nel forno a microonde, agitando delicatamente di tanto in
tanto la soluzione
quando la soluzione si è un pò raffreddata (riuscite a tenerla in mano)
aggiungere 2,5 μl di Eurosafe
versare la soluzione di agarosio, evitando di formare bolle, nella vaschetta per
elettroforesi dove e gia stato inserito il pettine.
lasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 15 min. Dopo che il gel si
è solidificato (diventa opaco), togliere il pettine delicatamente e mettere la
vaschetta nella cella elettroforetica contenente 250 ml di TAE 1x
Corsa elettroforetica
aggiungere 2 μl di loading dye (6x) ad un’aliquota di 10 μl di ciascun
campione di DNA
mescolare il colorante delicatamente tramite pipette
caricare lentamente ciascun campione nei singoli pozzetti
in un pozzetto laterale, caricare il marker di DNA a peso molecolare noto
chiudere il coperchio della cella elettroforetica
collegare i morsetti al generatore di corrente, fissare il voltaggio al valore
costante di 80 V e lasciare procedere la corsa elettroforetica per circa 30 min
osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA,
che, essendo incolore, non si puo vedere. Il blu di bromofenolo migra alla
stessa velocita di un frammento di DNA a doppia elica di circa 300 bp, mentre
lo xilene cianolo migra alla stessa velocita di un frammento di circa 4.000 bp
alla fine della corsa elettroforetica, osservare il gel sul transilluminatore
Interpretazione dei risultati della corsa elettroforetica
Figura 4 - gel d’agarosio
Marcatore di peso molecolare (ogni banda nelle corsie laterali
differisce per una taglia di 100 bp)
Nelle corsie 1,2,3,4,7 si possono notare frammenti delle
regioni ITS amplificate con la coppia di primer ITS1F e ITS4
di diverse specie fungine, nella corsia 5 l’amplificazione è
fallita mentre nella corsia 6 è possibile notare una debole
amplificazione di un aspecifico
Purificazione dei frammenti amplificati
Le reazioni PCR che avranno fornito un risultato soddisfacente (presenza di un
amplificato ed assenza di frammenti aspecifici) saranno sottoposti a purificazione con
l’impiego del kit “DNA Cleand & Concentrator” (Aurogene), seguendo il protocollo
della ditta produttrice.
La purificazione si rende necessaria per eliminare tutte le molecole diverse dal
frammento amplificato (enzima, Sali minerali, dNTP non incorporati, ecc.) che
causerebbero il fallimento della reazione di sequenziamento.
I prodotti purificati saranno oggetto di quantificazione al nanodrop, per verificare la
concentrazione del DNA amplificato e la sua purezza.
Attività di Bioinformatica
Analisi delle sequenze di DNA fungine
Agli studenti saranno distribuiti alcuni elettroferogrammi (Fig. 5) di regioni ITS di
specie fungine precedentemente sequenziate, per imparare ad analizzare i dati ottenuti
dal sequenziamento del DNA.
Figura 5 – porzione di elettroferogramma di una sequenza ITS fungina
Le sequenze che saranno analizzate dagli studenti porteranno all’identificazione di
ciascuna specie fungina. Tale identificazione sarà effettuata tramite approccio
comparativo con le sequenze depositate presso GenBank
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizzando il software Blastn (Fig 6) che compara
una sequenza nucleotidica (query) con tutte le altre sequenze nucleotidiche depositate
nella stessa banca dati
Figura 6 – Pagina di caricamento della sequenza nucleotidica per confronto con il programma blastn
Analisi filogenetica
La filogenesi è la scienza che studia l’evoluzione e le relazioni evolutive degli
organismi attraverso l’analisi e il confronto di sequenze proteiche o nucleotidiche.
Dalle analisi filogenetiche si costruiscono alberi in cui si evidenziano le “affinità”
genetiche delle specie identificate.
Con le sequenze a disposizione ed altre scaricate da GenBank saranno costruiti alberi
utilizzando diversi approcci bioinformatici e spiegati nel modo più semplice possibile
i criteri che li supportano.
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