Tratamiento de la muestra: Extracciones

Tratamiento de la muestra

Extracciones

I.Q. Manuel Arturo Caballero Rdz. Campus Monterrey Norte

Universidad del Valle de MéxicoEscuela de Ciencias de la SaludQuímico Farmaco Biotecnólogo

Desarrollo Analítico

Tratamiento de la muestra

• Objetivos generales:– Eliminar componentes que causan interferencias.– Concentrar los analitos de interés para su mejor

detección.

• Método: Extracciones

Extracción

• Técnica general más utilizada para el aislamiento y purificación de un compuesto orgánico de una mezcla de reacción o de sus fuentes naturales.

• Se aplica en todo tipo de mezclas ya sean sólidas, líquidas o gaseosas.

• Está fundamentada en la diferencia de solubilidad de los compuestos.

Extracción líquido-líquido

• Se fundamenta en la ley de distribución o de reparto, la cual gobierna la distribución de un soluto entre dos disolventes inmiscibles.

• Para un soluto A distribuido libremente entre dos fases se cumple:

K = [Ao]/[Aw]

• Ao es concentración de A en fase orgánica

• Aw es concentración de A en fase acuosa

Extracción líquido-líquido

Fase orgánica

Fase acuosa

Extracción líquido-líquido

• El soluto A se distribuye entre las dos fases en función de su solubilidad en ambas originando un equilibrio de partición dinámico.

• Este equilibrio viene definido por su constante de equilibrio, constante de distribución o coeficiente de reparto K.

• Esa relación de concentraciones entre la fase orgánica y la fase acuosa es independiente de la cantidad total de A.

Extracción líquido-líquido

• Consiste en tratar la mezcla con un disolvente no miscible de tal forma que el analito se disuelva en dicho disolvente y el resto de las sustancias no lo haga.

• Se aplica agitación. Se dejan reposar las fases para que se separen por densidad.

• La eliminación del disolvente extractor suele realizarse con un rotoevaporador (destilación a presión reducida).

Extracción líquido-líquido

• La eficiencia de la extracción se puede aumentar al hacer el proceso en etapas.

• No es lo mismo usar 30 mL de solvente de extracción en un proceso, que hacer la extracción por triplicado con 10 mL en cada una.

• Ver video Extracción simple / múltiple. https://youtu.be/Q3QxStCFDUo

Extracción líquido-líquido

• La ELL se aplica en control de dopaje para aislar los compuestos de interés o analitos de la matriz urinaria.

Extracción sólido-líquido

• Se emplea un equipo Soxhlet, el cual permite una operación de extracción-destilación continua.

• La muestra sólida se coloca ya finamente dividida en un cartucho de extracción para introducirlo al Soxhlet.

• El disolvente elegido se coloca en el matraz inferior y se lleva a ebullición.

Extracción sólido-líquido

Soxhlet

Extracción sólido-líquido

Extracción sólido-líquido

• Ver video Extracción con Soxhlet. https://youtu.be/fCK1awi0A7s

• El condensado caliente lixivia la muestra mientras se va llenando el cartucho.

• Cuando la cámara se ha llenado, la disolución se sifona y vuelve al matraz de destilación.

• El proceso se repite sucesivamente con lo que se consigue que aumente la concentración del extracto en el disolvente extractor.

Extracción sólido-líquido

• Aplicaciones:– Grasa de nuez– Grasa de cacahuate– Grasa de aceitunas– Grasa de res en trozos

Extracción en Fase Sólida (SPE)

• Potente, simple, rápida y económica técnica de limpieza de muestras, antes de su análisis por HPLC, HPLC/MS, GC o GCMS.

• Consiste en un lecho de adsorbente de partículas gruesas mantenido entre 2 discos porosos en un tubo desechable.

• El riesgo de pérdida o contaminación de la muestra es mínimo.

Extracción en Fase Sólida (Pasos)

1. Activación: Adición de un solvente para humidificar la fase sólida.

2. Acondicionamiento: Adición de un solvente compatible con la fase de la matriz de la muestra. MeOH o Acetonitrilo para hidrofílicos; hexano o CH2Cl2 para hidrofóbicos.

3. Retención: La muestra se añade a 3 mL/min.

4. Eliminación interferencias: Un solvente de adecuado eluye (lava) el material adsorbente de las impurezas.

Extracción en Fase Sólida (Pasos)

5. Secado: El adsorbente se deja secar generalmente con nitrógeno (2 a 10 min). Esencial el secado si el eluyente de lavado no es miscible con el eluyente final.

6. Elución: Se recoge el analito con un eluyente adecuado a 1 mL/min.

Extracción en Fase Sólida (SPE)

Columnas SPE con adsorbente Colector de vacío para SPE

SPE: Variables a controlar

• Tipo de fase sólida.• Tipo de eluyente.• Volumen de lecho.• Velocidad de carga de muestra.• Porosidad de fase sólida adsorbente.• Presión de vacío.

• Video SPE https://youtu.be/XMeL8IG6L0E

SPE: Clasificación

• Fase normal: Adsorbente sólido es polar, fase líquida apolar o poco polar (acetona, hexano, disolventes clorados). Los analitos polares son los retenidos en la fase sólida, mediante interacciones hidrofílicas (polar-polar, puente de H, dipolo-dipolo).

• Fase reversa: Adsorbente sólido apolar, fase líquida polar. Los analitos apolares o poco polares son retenidos en la fase sólida; la cual es una base sílica.

SPE: Clasificación

• Fase Intercambio iónico: La fase sólida tiene grupos cargados. Fase líquida generalmente acuosa. El tipo de interacciones entre el analito y la fase sólida son electrostáticas. El intercambio aniónico permite aislar compuestos ácidos, mientras que el catiónico se aplica para compuestos básicos.

SPE: Selección del Adsorbente

• Adsorbentes hidrofílicos: Los grupos ciano (CN) pueden usarse tanto en la fase normal para extraer compuestos polares como en la fase de reversa para compuestos de polaridad media. Los grupos DIOL pueden mejorar la extracción de compuestos polares.

• Adsorbentes hidrofóbicos: Actúan las fuerzas de van der Waals. Las cadenas alquílicas y aromáticas son grupos funcionales que muestran afinidad con compuestos de polaridad media y baja. Se recomienda el uso de fenilos para compuestos aromáticos, como en el caso de muchos productos de uso farmacéutico.

SPE: Selección del Adsorbente

• Adsorbentes de Intercambio: – Las fases de intercambio aniónico fuerte contienen una fuerte amina

cuaternaria. Se usan para la extracción de ácidos débiles.– Las fases de intercambio catiónico fuerte contienen un grupo sulfónico.

Extraen compuestos débilmente básicos.– La fase de intercambio aniónico débil contiene un grupo amino o

dietilamino. Se usan para la extracción de ácidos fuertes.– La fase de intercambio catiónico débil contiene un grupo carboxilo y se

usan para la extracción bases fuertes.

• Adsorbentes mixtos: Las cadenas de intercambio iónico e hidrofóbicas químicamente ligadas a la sílice ofrecen una selectividad única. Esta técnica se usa para la extracción de compuestos básicos, especialmente drogas y metabolitos, en fluidos biológicos.

SPE: Volumen de lecho

• El Volumen de Lecho se define como la cantidad mínima de solvente necesaria para humedecer una cantidad definida de adsorbente en la columna.

• Depende de la naturaleza del adsorbente. Ejemplo: Se usa aprox 120 mL para 100mg o 500 mL para 500mg de SiO2 de 60 Å.

• NOTA: Si la masa de adsorbente es demasiado grande frente al volumen de solvente se puede causar una elución incompleta.

Extracción con Fluidos Supercríticos

Extracción con Fluidos Supercríticos

• Técnica muy utilizada para la extracción de aceites esenciales (aromas y fragancias), medicinas naturales, pesticidas naturales, tabaco libre de nicotina, café y té descafeinado, productos libres de colesterol y en el tratamiento de residuos orgánicos industriales.

• Un fluido es supercrítico cuando está sometido a condiciones superiores a su presión y temperatura crítica.

Extracción con Fluidos Supercríticos

• En este estado la línea de separación de fases líquido –gas se interrumpe. Se tiene una sola fase en la que el fluido tiene propiedades intermedias entre líquido y gas (gran difusividad y alta densidad).

• Un fluido supercrítico tiene una gran capacidad de solvatación y una enorme difusividad.

• Su gran poder disolvente junto a una gran capacidad de penetración en los sólidos permite el agotamiento rápido y casi total de las sustancias extraíbles.

Extracción con Fluidos Supercríticos

• De los productos naturales pueden separarse totalmente los extractos con un alta pureza modificando la presión y la temperatura hasta el extremo.

• Fluidos más usados: CO2, Agua, Etano (C2H6), Eteno (C2H4), Propano (C3H8), Xenón(Xe), Óxido nitroso (N2O).

• Destaca sobre todos el CO2, siendo el más usado por ser no tóxico, no corrosivo, no inflamable, abundante, barato y cuyas condiciones críticas son bajas y fáciles de operar (31°C, 73 atm).

EFS: El proceso

EFS: El proceso

1. La mezcla (sólido ya molido) se carga en el extractor.

2. El CO2 es alimentado hacia el extractor mediante una bomba de alta presión (100 a 400 bar).

3. El CO2 comprimido es calentado hasta la temperatura de extracción (30 a 60 °C).

4. El gas ingresa al extractor donde disuelve a los compuestos a extraer.

EFS: El proceso

5. La mezcla CO2-extracto pasa por una válvula de reducción y enseguida a un separador (50 a 160 bar).

6. A temperatura y presión reducida, el extracto precipita espontáneamente en el separador, mientras que el CO2, libre del extracto, es reciclado al proceso.

• El CO2 se puede usar sólo o combinado con otros fluidos como metanol, amoniaco, que le permite variar su polaridad.

• Video EFS https://youtu.be/ftwTx0MmrC8

EFS: Ventajas y desventajas

Extracción con Microondas (MAE)

• La radiación de microondas se trabaja en rangos de 1 hasta 0.001 m (0.3 a 300 GHz).

Extracción con Microondas (MAE)

• La primera aplicación: Solubilización de muestras. Año: 1975.

• La radiación de microondas es una radiación ionizante que causa movimiento molecular por migración de iones y rotación de dipolos.

• El campo eléctrico ocasionado por la radiación genera un alineamiento de las moléculas del disolvente y de la muestra. Al caer el campo eléctrico se vuelve a alcanzar el desorden por medio de la liberación de energía térmica.

Extracción con Microondas (MAE)

• Calentamiento convencional VS microondas

Extracción con Microondas (MAE)

• El calentamiento por microondas va a depender de un factor dieléctrico del material a ser calentado.

• El factor indica la capacidad del material de ceder temperatura al absorber energía de microondas.

• Los diferentes equipos de radiación de microondas comerciales trabajan a 2450 MHz.

• A esta frecuencia la alineación de las moléculas, seguido de su desordenamiento ocurre 4.9x109 veces por segundo.

MAE: Formato de aplicación

• VASOS CERRADOS.

• El disolvente puede calentar por encima de la temperatura de ebullición.

• Se consigue gran eficiencia por la alta velocidad extractiva al manejar temperaturas encima del Teb.

• El equipo es un carrusel de vasos dentro de un horno de microondas, el cual gira para lograr uniformidad, ya que la radiación no es homogénea.

MAE: Formato de aplicación

• VASOS CERRADOS.

MAE: Formato de aplicación

• VASOS CERRADOS.

• Normalmente el carrusel es de 12 vasos.

• Es común que se acomoden muestras diferentes en cada vaso, para hacer diferentes extracciones.

• Los vasos tienen una membrana de ruptura que controla que no haya una sobrepresión.

• Uno de los vasos queda vacío, y es el que tiene los sensores para controlar temp y presión.

MAE: Formato de aplicación

• VASOS ABIERTOS.

• Se trabaja a presión atmosférica. La temp máxima es la Teb del disolvente.

• La energía radiante se focaliza, por lo que el calentamiento es homogéneo y muy eficiente.

• Común la incorporación de un sistema de reflujo para evitar pérdidas de los analitos volátiles.

MAE: Formato de aplicación

• VASOS ABIERTOS.

MAE: Formato de aplicación

• IMAGEN DE HORNO

Video MAE https://youtu.be/dzURn8rCOTQ

MAE: Parámetros de control

• Disolvente: – De naturaleza orgánica y con capacidad de absorber energía de

microondas.– Mezclas para asegurar adecuada capacidad de solvatación y

calentamiento por microondas.– Asegurarse que toda la muestra debe estar inmersa para evitar

que la radiación la dañe.

• Temperatura/Presión: – Que no afecten la operatividad.– Temperaturas elevadas extraen en alta cantidad los analitos.– Temperaturas mayores pierden selectividad hacia el analito.

MAE: Parámetros de control

• Potencia: – Se relaciona con la temperatura y presión. No sobrecalentar

para no degradar solvente ni crear sobrepresiones.– En vasos cerrados, a mayor vasos con muestra mayor potencia.

• Tiempo de extracción:– Largos tiempos provocan degradación de los compuestos.– Tiempo corto puede perder eficacia de extracción.

• Naturaleza de la matriz: – Elevada cantidad de agua en la matriz puede retrasar proceso.– Contenido de materia orgánica alto puede interferir.

MAE: ¿Dónde se aplica?

• Hidrocarburos aromáticos policíclicos y PCBs en suelos y sedimentos.

• Pesticidas, fenoles, compuestos organometálicos en muestras medio ambientales.

MAE: ¿Dónde se aplica?

Espacio de Cabeza (Headspace)

• Usada para determinar compuestos volátiles en muestras líquidas (o sólidas), mediante análisis de la fase vapor que está en equilibrio con la muestra en un sistema cerrado.

• Etapa previa a una cromatografía de gases.

• Como los componentes ya se encuentran en fase vapor, ya no es necesario que la muestra sea vaporizada para la CG.

Espacio de Cabeza (Headspace)

• La muestra se coloca en un vial y se cierra con un septum.

• El vial se mantiene a una temperatura determinada. Cuando se llega al equilibrio se retira una porción de la fase gas, ya sea con una jeringa o con un sistema automático de dosificación.

• Los componentes volátiles de la muestra son conducidos hasta la columna de cromatografía.

Espacio de Cabeza (Headspace)

Viales con septum

Espacio de Cabeza (Headspace)

Jeringas

Espacio de Cabeza (Headspace)

Espacio de Cabeza (Headspace)

Espacio de Cabeza (Headspace)

Espacio de Cabeza (Headspace)

Espacio de Cabeza (Headspace)

Espacio de Cabeza (Headspace)

Espacio de Cabeza (Headspace)

• La concentración de los componentes en la fase gaseosa puede incrementarse variando el pH, por adición de un electrolito, o por elevar la temperatura.

• Notar que los solutos con baja presión de vapor no podrán determinarse mediante extracción por espacio de cabeza.

Headspace: ¿Dónde aplica?

• Muestras líquidas homogéneas: aguas residuales, bebidas, refrescos, aceites, etc.

• Muestras no homogéneas líquido-sólido: sangre, leche, dispersiones de polímeros, etc.

• Muestras sólidas que dan lugar a disoluciones homogéneas: polímeros solubles, sales inorgánicas, etc.

• Muestras sólidas insolubles: especias, frutas, tabaco, olefinas de alto peso molecular, etc., (por comparación de cromatogramas).