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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PAVIA
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani”
Laurea Magistrale in Biotecnologie Industriali
Dipartimento di Scienze del Farmaco
Studio delle cinetiche di vinificazione di un vino
Bonarda dell’Oltrepò Pavese vinificato in purezza
Relatore: Prof.ssa Maria Daglia
Correlatore: Dott.ssa Alessandra Leoni
Tesi Sperimentale di Claudia Buscaglia
Anno Accademico 2013/2014
1
INDICE
1. INTRODUZIONE pag. 4
1.1 LA VITICOLTURA IN OLTREPO’ PAVESE pag. 5
1.2 CROATINA pag. 6
1.2.1 Riferimenti normativi pag. 6
1.2.2 Sinonimi pag. 6
1.2.3 Descrizione ampelografica di foglie e grappoli pag. 7
1.2.4 Fenomeni vegetativi pag. 7
1.2.5 Caratteristiche ed attitudini colturali pag. 8
1.2.6 Coltivazione pag. 8
1.3 I MICRORGANISMI DELL’UVA pag. 9
1.4 IL PROCESSO DI VINIFICAZIONE pag. 12
1.4.1 Fermentazione alcolica pag. 13
1.4.2 Fermentazione malolattica pag. 15
2. SCOPO DEL LAVORO pag. 17
3. MATERIALI E METODI pag. 20
3.1 CAMPIONE pag. 21
3.2 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E DEI TERRENI pag. 21
3.2.1 Preparazione del campione per analisi chimiche pag. 21
3.2.2 Preparazione del campione per analisi microbiologiche pag. 21
3.2.3 Terreni e Tamponi pag. 22
2
3.3 APPARECCHIATURE E METODI pag. 22
3.3.1 Spettrofotometro pag. 22
3.3.2 Titolatore pag. 23
3.3.3 Analizzatore enologico pag. 23
3.3.4 Distillatore enologico pag. 24
3.3.5 Microscopio ottico pag. 24
3.3.6 Conta della concentrazione cellulare pag. 25
3.3.7 Protocollo di estrazione del DNA di lievito pag. 25
3.3.8 PCR pag. 26
3.3.9 Elettroforesi su gel di agarosio pag. 27
4. RISULTATI E DISCUSSIONE pag. 29
4.1 MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO
PREVENDEMMIALE pag. 30
4.1.1 Conta della concentrazione cellulare sui grappoli
di Croatina pag. 30
4.1.2 Riconoscimento di muffe e lieviti pag. 31
4.2 MONITORAGGIO CHIMICO PREVENDEMMIALE pag. 33
4.2.1 Zuccheri, pH e Acidità totale pag. 33
4.2.2 Il rame pag. 34
4.2.3 Il colore pag. 35
4.3 MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO E
CHIMICO DEL PROCESSO FERMENTATIVO pag. 37
4.3.1 Monitoraggio microbiologico pag. 37
4.3.2 Monitoraggio chimico pag. 39
4.4 ISOLAMENTO DEI CEPPI DI LIEVITO E
SELEZIONE DEL CEPPO DI Saccharomyces cerevisiae
STARTER pag. 44
3
4.4.1 Isolamento dei lieviti coinvolti nel processo fermentativo pag. 44
4.4.2 Selezione del ceppo starter pag. 45
4.5 PROVA DI MICROVINIFICAZIONE pag. 48
4.5.1 Pressatura dell’uva Croatina pag. 48
4.5.2 Inoculo della coltura starter pag. 48
4.5.3 Monitoraggio microbiologico pag. 49
4.5.4 Monitoraggio chimico pag. 54
5. CONCLUSIONI pag. 59
5.1 Conclusioni pag. 60
5.2 Prospettive future pag. 65
6. BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA pag. 66
ALLEGATI pag. 68
4
1. INTRODUZIONE
5
1.1 LA VITICOLTURA IN OLTREPO’ PAVESE
Va in premessa richiamato il dato che l’Italia, con circa 45 milioni di hl di vino
prodotti, copre il 17% della produzione mondiale di vino. Un risultato frutto anche di
una crescita qualitativa, con circa il 60% di vini D.O.C., D.O.C.G. e I.G.T., da cui
discende un giro di affari stimabile attorno ai 13,5 miliardi di euro all’anno, con
l’aggiunta di oltre 2 miliardi di euro di indotto. In un contesto generale stimolante, va
registrato il costante consistente calo del consumo di vino in Italia, passato dai 45 litri
pro-capite all’anno nel 2007, ai 43 nel 2009 e con la prospettiva di scendere sotto i 40,
quando ancora negli anni ‘70 si sfioravano i 120 litri pro-capite. Le cause di questo
calo sono complesse e molteplici; tra queste sembra emergere la contrazione dei
consumi, come conseguenza immediata della crisi economica globale, e una pressione
mediatica caratterizzata anche da allarmismi sull’uso dell’alcool, che hanno accelerato
il cambio di stile di vita degli italiani [1].
L’Oltrepò Pavese si caratterizza per una forte connotazione agricola e per alcune
eccellenze agroalimentari costituite, innanzitutto, dal settore vitivinicolo [2]. La
viticoltura dell’Oltrepò Pavese è nota e apprezzata sin da tempi molto remoti e si è
specializzata fino a caratterizzarne il paesaggio collinare. Le fonti storiografiche
antiche concordano nell’attribuire l’inizio della coltivazione della vite, e
conseguentemente della vinificazione, ai Greci e agli Etruschi. E’ opinione fondata che
furono proprio gli Etruschi, nel corso della loro fase espansionistica nel VI secolo a.C.,
a portare la coltura della vite nella Pianura Padana. L’Oltrepò Pavese si caratterizza
quindi per un’antica e profonda vocazione vitivinicola che dura da più di duemila anni
e che, attraverso una lunga evoluzione, è giunta all’attuale conformazione: una
superficie di 1.098 chilometri quadrati, dei quali un terzo di pianura e due terzi di
collina e montagna; di questi il 30% circa appartiene alla zona di produzione D.O.C.,
con 13.600 ettari a vigneto pari al 13% circa dell’intera area dell’Oltrepò, di cui quasi
l’80% produce uva D.O.C. Molti e variegati sono i vini D.O.C. prodotti nell’area
oltrepadana: 8 tipologie di vini rossi, 2 di rosati, 11 di bianchi, 2 spumanti classici e 8
spumanti Charmat, per un totale di quasi 45 milioni di bottiglie prodotte annualmente
(di cui più di 11 milioni di Spumante), anche se quasi l’80% appartiene alle prime
quattro tipologie, nell’ordine Bonarda, Barbera, Riesling Italico e Pinot Nero [1].
6
Dal punto di vista vitivinicolo l’Oltrepò Pavese si distingue in Italia per l’importanza e
la peculiarità delle produzioni. Le colline dell’Oltrepò costituiscono la terza area di
produzione di vini certificati in Italia per numero di ettari a vite iscritti all’Albo
Vigneti (dopo il Chianti e l’Astigiano) e per ettolitri prodotti e il primo bacino
vitivinicolo della Lombardia (con il 63% della superficie vitata produce il 55% del
vino dell’intera regione). I vitigni più coltivati sono Croatina (4.000 ettari), Barbera
(3.000), Pinot Nero (quasi 3.000), Riesling (1.500), Moscato (500). Con questi vitigni
si copre l’84% dell’intera superficie viticola dell’Oltrepò. La produzione di Pinot
Nero in Oltrepò rappresenta circa il 75% dell’intera produzione nazionale del vitigno,
così come la Croatina rappresenta circa il 70% dell’intera produzione nazionale [3].
La viticoltura oltrepadana si trova oggigiorno ad affrontare le attuali sfide del settore,
tra cui la richiesta da parte di un sempre maggior numero di consumatori di prodotti di
qualità e nei quali sia riconoscibile il legame con il territorio di origine [2].
1.2 CROATINA
1.2.1 Riferimenti normativi
Nome: Croatina N.
Codice: 071
Sinonimi ufficiali: Croatina N.
Annotazioni: Esclusivamente per la designazione dei vini delle DOP Oltrepò Pavese e
Colli Piacentini
Data di ammissione: 25/05/1970, decreto pubblicato sulla G.U. 149 del 17/06/1970
[4].
1.2.2 Sinonimi
Il nome “Croatina” subisce nella pratica varie deformazioni, che non sono proprie di
determinate zone e località, ma derivano evidentemente da pronunce individuali
diverse. In Oltrepò Pavese sono in uso il nome “Croatina” e alcune sue varianti (o
taluna delle sue varianti): “Crovattina, Croattina, Croata, Crovattino, Croatino,
7
Crovalino, Crovettina”, ecc. Sono utilizzati anche i sinonimi “Neretto” per l’Oltrepò
Pavese e “Uva Vermiglia” per Voghera [4].
1.2.3 Descrizione ampelografica di foglie e grappoli
Le foglie sono di media grandezza, pentagonali, più lunghe che larghe, quinquelobate
o trilobate. La pagina superiore delle foglie è glabra, mentre quella inferiore è
aracnoidea, con le nervature di 1°-2°-3° ordine aracnoidee. Il lembo risulta alquanto
piegato a coppa, con superficie liscia o molto lievemente ondulata. I lobi sono un po’
contorti. L’angolo alla sommità dei lobi terminali è acuto. I denti laterali sono
sensibilmente regolari a due grandezze, prevalentemente convessi oppure rettilinei, a
base larga. Il colore risulta verde cupo sulla pagina superiore (che presenta una
lucentezza opaca), con nervature principali più chiare, verde chiaro sulla pagina
inferiore, con nervature principali sfumate di rosso all’inserzione sul picciolo. Il
picciolo è corto o medio-corto. In autunno le foglie assumono una colorazione
dapprima verde con larghe chiazze di color rosso vinoso, poi rossa e gialla.
Il grappolo maturo è grande (20-25 cm), conico, alato, di media compattezza o
compatto. Il peduncolo è di lunghezza media (circa un terzo della lunghezza del
grappolo), semi-legnoso, piuttosto grosso, ben visibile. Presenta pedicelli medio-corti,
di color rosso feccioso; cercini evidenti, di color rosso violaceo; e pennelli corti ed
incolori. L’acino è medio, di forma sferoide o appena visibilmente ellissoidale,
regolare, con sezione trasversale circolare e ombelico non persistente. La buccia è
abbastanza pruinosa, di color turchino regolarmente diffuso, piuttosto spessa,
consistente e coriacea. Il succo è incolore; la polpa succosa, a sapore semplice. I
vinaccioli sono solitamente due per acino e sono sempre presenti [4].
1.2.4 Fenomeni vegetativi
Germogliamento: generalmente nella terza decade di Aprile.
Fioritura: verso il 20 Giugno.
Invaiatura: verso il 15-18 Agosto.
Lignificazione: verso il 5 Agosto.
Maturazione dell’uva: fra la I e la IV epoca, nella prima decade di Ottobre.
Caduta delle foglie: dalla fine di Ottobre alla metà di Novembre [4].
8
1.2.5 Caratteristiche ed attitudini colturali
La “Croatina” presenta molta vigoria, richiedendo una potatura lunga e ricca; una
produzione generalmente abbondante e una resistenza abbastanza notevole all’oidio e
al marciume dell’uva in annate non molto piovose ed una resistenza non superiore al
comune alla peronospora, mentre teme le tignole.
L’uva Croatina viene utilizzata essenzialmente per la vinificazione. Tuttavia, dato il
suo sapore zuccherino e dato che, per la sua resistenza al marciume, si conserva bene,
trova anche un buon impiego per il consumo diretto [4].
1.2.6 Coltivazione
La coltivazione è consigliata in Piemonte e idonea in Lombardia, Emilia-Romagna,
Sardegna e nella provincia di Verona.
La varietà è ammessa nelle seguenti denominazioni di origine e/o indicazioni
geografiche:
- DOC: Bonarda dell'Oltrepò Pavese, Bramaterra, Buttafuoco dell'Oltrepò
Pavese o Buttafuoco, Casteggio, Cisterna d'Asti, Colli di Parma, Colli
Piacentini, Colli Tortonesi, Colline Novaresi, Coste della Sesia, Gutturnio,
Oltrepò Pavese, Piemonte, San Colombano al Lambro o San Colombano,
Sangue di Giuda dell'Oltrepò Pavese o Sangue di Giuda, Valli Ossolane.
- IGT: Alto Mincio, Barbagia, Bergamasca, Colli del Limbara, Collina del
Milanese, Delle Venezie, Emilia o dell'Emilia, Forlì, Isola dei Nuraghi,
Marmilla, Nurra, Ogliastra, Parteolla, Planargia, Provincia di Mantova,
Provincia di Nuoro, Provincia di Pavia, Quistello, Ravenna, Romangia, Ronchi
Varesini, Rubicone, Sabbioneta, Sebino, Sibiola, Terrazze Retiche di Sondrio,
Terre Lariane, Tharros, Trexenta, Vallagarina, Valle del Tirso, Valli di Porto
Pino, Veneto, Verona o Provincia di Verona o Veronese.
L’evoluzione della superficie vitata dal 1970 ad oggi, rilevata dai censimenti ISTAT
(dati espressi in ettari) è apprezzabile nella seguente tabella [4]:
9
Anno Superficie vitata in ettari
1970 5250
1982 5802
1990 4487
2000 3280
2010 5684
Tabella 1.1 Superficie coltivata a Croatina
Figura 1.1 Fotografie del vitigno
La figura mostra, a titolo d’esempio, la foto di una foglia di Croatina, a sinistra, e di un
grappolo di Croatina, a destra.
1.3 I MICRORGANISMI DELL’UVA
La vite e i grappoli d’uva presentano una complessa ecologia microbica che include
funghi filamentosi, lieviti e batteri con differenti caratteristiche fisiologiche ed effetti
sulla produzione di vino [5].
I grappoli d’uva rappresentano la prima fonte di comunità microbiche, coinvolte in
modo prominente nella qualità del frutto, nel processo di vinificazione e nella qualità
finale dei vini. La superficie dei grappoli fornisce un ambiente ricco di nutrienti per i
microrganismi, che cambiano durante il processo di maturazione dell’uva [6].
10
Alcune specie di microrganismi si ritrovano solo sulla pianta, come i microrganismi
responsabili delle patologie della vite (tra cui i funghi parassiti fitopatogeni e i funghi
saprofiti), mentre altre hanno la capacità di sopravvivere e crescere anche nei vini e
costituiscono il consorzio microbico del vino (Wine Microbial Consortium WMC).
Questo consorzio comprende specie di lievito, i batteri acido lattici e i batteri acido
acetici [5].
I microrganismi presenti sull’uva possono essere suddivisi in diversi gruppi in accordo
alla specificità tecnologica che hanno sia sulla vite, sia nella produzione di vino. La
vite e i grappoli d’uva possono essere colpiti da diverse patologie, di cui le più
conosciute sono la peronospora (Plasmopara viticola), l’oidio (Erysiphe necator), e la
muffa grigia (Botrytis cinerea), che vengono controllate attraverso applicazioni
fitochimiche preventive. Inoltre, i grappoli d’uva possono essere colonizzati da muffe
saprofite (Cladosporium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp.) responsabili di
diversi marciumi del grappolo e della produzione di micotossine. I funghi finora citati
non hanno alcuna capacità di crescere nei vini e il loro effetto sulla qualità dei vini è
dovuto unicamente al livello di danno apportato al frutto. Contrariamente, i
microrganismi del WMC sono in grado di vivere e crescere nei vini. Le specie
appartenenti al WMC possono essere suddivise in tre gruppi:
- Le specie facilmente controllabili o innocue, senza la capacità di danneggiare il
vino quando sono applicate le good manufacturing practises (GMP’s). Queste
specie includono i basidiomiceti che non sono in grado di fermentare gli
zuccheri del succo d’uva né di sopravvivere nel vino e il fungo dimorfo
ascomicete Aureobasidium pullulans.
- Le specie fermentanti, responsabili della conversione degli zuccheri e
dell’acido malico. Appartengono a questo secondo gruppo le specie di
ascomiceti ossidative debolmente fermentanti o fermentanti (Candida spp.,
Kloeckera apiculata/Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia spp., Pichia spp.)
presenti nelle fasi di pre-fermentazione o all’inizio del processo fermentativo.
Tra queste i lieviti apiculati e i lieviti formanti film (come Pichia spp.) sono
considerati dei comuni contaminati dei grappoli, del succo e del vino, con la
capacità di produrre sapori cattivi. I lieviti fermentanti includono quelli
responsabili del processo fermentativo tra questi Saccharomyces cerevisiae è il
11
più importante, ma altre specie (S. bayanus, S. pastorianus e S.paradoxus)
possono condurre o partecipare al processo.
- Le specie dannose in sensu stricto, responsabili delle alterazioni del vino anche
quando sono applicate le GMP’s. Tra queste si ritrovano le specie responsabili
della produzione di sapori cattivi (per esempio Dekkera bruxellensis) o della
formazione di sedimenti e intorbidamenti (per esemoio Zygosaccharomyces
bailii).
Per quanto concerne i batteri, i batteri acido acetici sono considerati innocui in quanto
sono facilmente controllabili in GMP’s. Mentre i batteri acido lattici sono più difficili
da collocare: tra questi troviamo Oenococcus oeni che è il principale responsabile della
fermentazione malolattica e specie di Lactobacillus e Pediococcus che possono essere
responsabili di fermentazioni spontanee e possono in alcuni casi risultare dannose [5].
La comunità microbica dei grappoli è influenzata da diversi fattori sia biotici, sia
abiotici: il pH dei frutti, i livelli di composti contenenti carbonio e azoto, le piogge, la
temperatura, lo stadio di maturazione della vite e il suo stato di salute [6].
La popolazione dei lieviti sui grappoli d’uva è approssimativamente compresa tra 102 e
104 cellule/g. I grappoli d’uva sani sono colonizzati principalmente da specie di
Candida e Pichia ubiquitarie e altamente eterogenee. In generale, è possibile
suddividere i lieviti e i batteri appartenenti al WMC in tre gruppi:
- I lieviti basidiomiceti ossidativi oligotrofici, i funghi simili ai lieviti A.
pullulans e i batteri acido lattici (Lactobacillus spp., O. oeni). Si tratta di
specie ubiquitarie favorite da un ambiente povero di nutrienti e dalla presenza
di grappoli sani.
- I lieviti ascomiceti ossidativi copiotrofici (molte specie di Candida), i lieviti
apiculati debolmente fermentanti (Hanseniaspora spp.), i lieviti formanti film
(Pichia spp.) e i lieviti fermentanti (C. zemplinina, Metschnikowia spp.).
Queste specie aumentano durante il processo di maturazione della vite a
causa dell’aumento della disponibilità di nutrienti.
- I lieviti copiotrofici fortemente fermentanti (Saccharomyces spp.,
Torulaspora spp., Zygosaccharomyces spp., Lachancea spp. e Pichia spp.) e i
batteri acido acetici aerobi obbligati (Gluconobacter spp.,
Gluconoacetobacter spp., Acetobacter spp.). La proliferazione di questo terzo
12
gruppo di lieviti è direttamente correlata a un aumento della disponibilità di
nutrienti risultante da un danno nel grappolo d’uva. Le specie di
Saccharomyces sono tuttavia presenti in piccole quantità e con una frequenza
bassa anche in presenza di grappoli danneggiati e un loro isolamento
necessita l’utilizzo di tecniche di arricchimento. [5].
1.4 IL PROCESSO DI VINIFICAZIONE
La vinificazione è una delle più antiche tecnologie applicate dall’uomo e oggi
rappresenta uno dei più prosperosi processi biotecnologici utilizzati. La vinificazione è
il risultato di una serie di trasformazioni biochimiche portate avanti dall’azione di
differenti enzimi appartenenti a diversi microrganismi: i lieviti e i batteri [7].
La vinificazione è un complesso processo microbico nel quale lieviti e batteri giocano
un ruolo fondamentale. Dopo la pigiatura, i lieviti, in particolare S. cerevisiae,
consumano lo zucchero del mosto per produrre etanolo durante la fermentazione
alcolica. In seguito, i batteri acido lattici, in particolare O. oeni, convertono l’acido
malico in acido lattico durante la fermentazione malolattica. Entrambi, lieviti e batteri,
producono aromi responsabili delle proprietà sensoriali del vino. Quando entrambe le
fermentazioni sono completate, le popolazioni microbiche devono essere ridotte perché
i metabolismi microbici post-fermentativi possono pregiudicare le qualità
organolettiche del vino. È molto importante monitorare la presenza di questi
microrganismi sulla buccia dei grappoli d’uva, nel mosto in fermentazione,
nell’equipaggiamento utilizzato per la vinificazione e nella fase di invecchiamento del
vino [8].
Le tappe classiche della vinificazione in rosso sono le seguenti:
- Operazioni meccaniche sulle uve – pigiatura, diraspatura, riempimento della
vasca;
- Fermentazione – fermentazione alcolica principale e macerazione;
- Svinatura – separazione del vino dalle vinacce per sgrondatura e pressatura;
- Fermentazioni di completamento – esaurimento degli ultimi grammi di
zucchero con la fermentazione alcolica e fermentazione malolattica [9].
13
1.4.1 Fermentazione alcolica
La trasformazione più importante che avviene nel mosto durante il processo di
vinificazione è la fermentazione alcolica degli zuccheri, in particolare degli esosoi
(glucosio e fruttosio), che porta alla produzione di etanolo e diossido di carbonio e alla
formazione di un elevato numero di sottoprodotti. La fermentazione può essere
condotta utilizzando i lieviti indigeni presenti naturalmente sui grappoli d’uva oppure
aggiungendo lieviti selezionati a mosti leggermente solfitati. Negli ultimi anni,
quest’ultima pratica risulta la più applicata. Nelle fasi iniziali della fermentazione,
differenti specie di lieviti indigeni presenti nei grappoli apportano un contributo
importante. Le specie predominanti appartengono ai generi Brettanomyces, Candida,
Cryptococcus, Debaromyces, Dekkera, Hanseniaspora, Hansenula, Kloechera,
Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Torulaspora, Schizosaccharomyces e
Zygosaccharomyces. Con l’avanzamento della fermentazione, queste specie dette
“non-Saccharomyces” muoiono, lasciando spazio alla specie S. cerevisiae, più
tollerante all’etanolo, di predominare e completare il processo fermentativo [7].
Un elevato numero di studi ha messo in luce i diversi fattori che influenzano la
fermentazione, limitando la crescita e l’attività metabolica dei lieviti:
- I fattori della vinificazione, come la temperatura di vinificazione, il pH e la
concentrazione degli zuccheri nel succo d’uva;
- La disponibilità limitata dei nutrienti;
- L’effetto inibitorio dell’etanolo che può rappresentare un fattore di stress
chimico;
- Altri fattori di stress, quali la presenza di elevati livelli di SO2 e CO2, la
presenza di microrganismi competitivi come alcune specie di batteri acido
acetici o di lieviti killer produttori di tossine killer.
I principali meccanismi biochimici del metabolismo del lievito durante la
fermentazione alcolica sono riassunti nella Figura 1.2. Quando la concentrazione di
zucchero è elevata, come nel mosto, S. cerevisiae può metabolizzare unicamente
attraverso la via fermentativa. La trasformazione del glucosio in etanolo avviene
attraverso la glicolisi, con la produzione di piruvato, che è in seguito trasformato in
etanolo e CO2 da due addizionali reazioni enzimatiche. In condizioni anaerobiche, una
piccola frazione degli zuccheri del mosto, approssimativamente l’8%, è trasformata in
14
glicerolo e piruvato attraverso la fermentazione gliceropiruvica. Durante il processo
fermentativo, i lieviti producono, a partire dal piruvato, una serie di composti volatici
che vanno a costituire il cosiddetto “bouquet di fermentazione”: tra questi i principali
sono gli alcoli superiori, gli acidi grassi, le aldeidi e gli esteri. Inoltre, vengono a
formarsi dei prodotti indesiderati, quali H2S e altri composti solforici volatili, i diacetili
e altri composti carbonilici correlati e anche alcuni composti fenolici volatili
indesiderati: si tratta di composti aromatici considerati negativi o sgradevoli [7].
Figura 1.2 Rappresentazione schematica dei principali meccanismi biochimici del
metabolismo dei lieviti durante la fermentazione alcolica.
15
1.4.2 Fermentazione malolattica
La fermentazione malolattica è condotta da batteri acido lattici e solitamente avviene
pochi giorni dopo la fermentazione alcolica. Si tratta di un processo molto importante,
perché cambia la composizione del vino e ne migliora le qualità organolettiche. Il
principale effetto della fermentazione malolattica è la riduzione dell’acidità totale del
vino e l’aumento del suo pH, come risultato della decarbossilazione dell’acido L-
malico in acido L-lattico. Inoltre, l’attività dei batteri gioca un ruolo importante nella
stabilizzazione del vino e ne assicura un arricchimento nella composizione aromatica.
Tutto l’acido malico, che rappresenta il più importante acido organico del vino insieme
all’acido tartarico, è degradato. Oltre a ridurre l’acidità totale del vino, la
fermentazione malolattica produce un cambiamento delle caratteristiche
organolettiche, perché il sapore più pungente dell’acido malico è rimpiazzato dal
sapore più delicato dell’acido lattico. I batteri acido lattici associati ai mosto d’uva e ai
vini appartengono a quattro generi: Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus e
Pediococcus, ma nella maggior parte dei casi la fermentazione malolattica è condotta
da O. oeni [7].
Alcuni batteri acido lattici possono diminuire la qualità del vino ed essere considerati
dannosi. Questo avviene:
- Se la fermentazione malolattica è condotta in presenza di zuccheri. In queste
condizioni, i batteri possono metabolizzare gli esosi producendo, oltre ad
etanolo e CO2, anche acido acetico, aumentando considerevolmente l’acidità
del vino.
- Se producono acroleina, che può reagire con i tannini e produrre un sapore
amaro sgradevole.
- Se sintetizzano polisaccaridi extracellulari a partire dagli zuccheri residui,
portando ad un deterioramento del vino.
- Se producono il cosiddetto “mousy off-flavour”.
- Se portano alla formazione di composti dannosi per la salute, quali
l’etilcarbammato e le amine biogene [7].
Il controllo della fermentazione può essere fatto determinando le cellule vitali di lievito
per conteggio, dopo 48 ore di crescita, delle colonie formate dopo spatolamento di 100
16
μl della soluzione di lievito opportunamente diluita su un mezzo nutritivo solido in una
piastra Petri. Oltre al controllo microbiologico, è possibile seguire la fermentazione
con determinazioni chimiche più semplici e immediate, quali la quantità di zuccheri
consumati nel caso della fermentazione alcolica e quella di acido malico consumato
nel caso della fermentazione malolattica [9].
Il monitoraggio dei ceppi di S. cerevisiae coinvolti nel processo fermentativo può
essere condotto utilizzando un’amplificazione delle sequenze delta del DNA del lievito
attraverso PCR. Si tratta di un metodo semplice, ceppo-specifico e riproducibile [10].
17
2. SCOPO DEL LAVORO
18
La presente ricerca, oggetto della tesi, è stata sviluppata durante il tirocinio svolto
presso il laboratorio di analisi di Riccagioia S.C.p.A., Centro di Ricerca, Formazione e
Servizi della Vite e del Vino.
Lo scopo della ricerca è stato lo studio sul campo dell’andamento prevendemmiale del
vitigno Croatina e il successivo monitoraggio delle uve da esso derivate durante la fase
di fermentazione spontanea del mosto ottenuto, fino al completamento del processo di
vinificazione. Questo studio ha portato all’identificazione dei principali fattori che
partecipano e influenzano il processo fermentativo.
È stato pertanto necessario suddividere il presente lavoro di tesi in due parti: una fase
prevendemmiale e una fase fermentativa, i campioni provenienti da entrambe le fasi
sono stati sottoposti a monitoraggio costante, effettuato tramite analisi chimiche e
microbiologiche. Durante il monitoraggio microbiologico della fase fermentativa sono
stati isolati i lieviti implicati nel processo di fermentazione. I ceppi di lievito
individuati sono stati conservati come colture pure glicerinate, mantenute alla
temperatura controllata e costante di –80°C, e tra questi è stato scelto un ceppo di
Saccharomyces cerevisiae che è stato in seguito utilizzato come starter per una prova
di microvinificazione. Le analisi chimiche e microbiologiche sono state effettuate sul
vino sottoposto a microvinificazione e i risultati ottenuti sono stati comparati con
quelli ottenuti dalla fermentazione di tipo spontaneo.
L’obiettivo di questo lavoro è stato pertanto quello di seguire in modo costante e
dettagliato l’andamento dell’uva Croatina dal campo, all’ottenimento del mosto
sottoposto a fermentazione fino ad arrivare al completamento del processo di
vinificazione, andando ad analizzare due vini: il primo ottenuto con una fermentazione
spontanea e il secondo con una fermentazione indotta (inoculando un ceppo di S.
cerevisiae indigeno); e cercando di ottenere dei prodotti finiti di Bonarda dell’Oltrepò
Pavese. Si è inoltre testata la capacità di un lievito indigeno selezionato, naturalmente
presente sull’uva, di portare a termine la vinificazione. L’utilizzo di un lievito
autoctono può essere visto come un modo di valorizzazione del prodotto, in quanto
marcatore di tipicità del vino oggetto di studio.
L’ottenimento di vini finiti è necessario per poter effettuare in seguito eventuali analisi
sui composti nutraceutici presenti, confrontando un vino sottoposto a processo di
19
macerazione (vino fermentato spontaneamente) a uno ottenuto da un mosto privo di
bucce e, quindi, non macerato (vino sottoposto a microvinificazione).
20
3. MATERIALI E METODI
21
3.1 CAMPIONE
Le analisi chimiche e microbiologiche sono state effettuate su uva di qualità Croatina,
proveniente da un vigneto controllato a partire dalla fase di invaiatura dell’uva (dal 26
Agosto 2014) e sono state portate avanti per un mese. I campionamenti sono stati fatti
a cadenza settimanale fino al giorno della vendemmia (avvenuta il 24 Settembre 2014).
Le analisi di monitoraggio sono continuate sul mosto in vinificazione, ottenuto
dall’uva Croatina in purezza, per tutta la durata della fermentazione di tipo spontaneo
avvenuta con processo di macerazione. I campionamenti, nella fase di fermentazione,
sono stati fatti ogni 48 ore nelle prime fasi del processo fermentativo e
successivamente a cadenza settimanale. A partire dal 31 Ottobre 2014 sono state
effettuate ogni 48 ore le analisi su 10 l di mosto, ottenuto da uva Croatina non
macerata, sottoposto al processo di microvinificazione indotto con l’inoculo di un
ceppo starter selezionato di Saccharomyces cerevisiae.
3.2 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E DEI TERRENI
3.2.1 Preparazione del campione per analisi chimiche
I grappoli sono campionati in sacchetti di plastica e pigiati direttamente all’interno dei
sacchetti per ottenere il mosto da sottoporre alle analisi successive. Il mosto in
vinificazione è campionato in bottigliette di plastica e sottoposto a filtrazione prima di
essere analizzato. All’inizio del processo fermentativo, il mosto, risultato molto
torbido, è stato centrifugato a 2500 rpm per 3 minuti prima di procedere con le analisi.
Per le analisi in Wineflow il mosto di Croatina che ha subito il processo di
macerazione è stato decolorato a contatto con il carbone, in quanto si tratta di un vino
rosso, e successivamente filtrato per eliminare i residui di carbone.
3.2.2 Preparazione del campione per analisi microbiologiche
I grappoli e il mosto di Croatina sono campionati in sacchetti di plastica sterili. Il
campionamento viene eseguito cercando di mantenere il più possibile una condizione
di sterilità. I grappoli vengono pigiati manualmente direttamente all’interno del
sacchetto e il mosto ottenuto per pigiatura, come quello già in vinificazione, viene
opportunamente diluito con acqua peptonata (la cui composizione è descritta nel
22
paragrafo 3.2.3) per poter essere piastrato. Tutte le procedure microbiologiche sono
svolte sotto cappa utilizzando materiali sterili.
3.2.3 Terreni e Tamponi
- Composizione dell’Acqua peptonata (g/l) e relativo valore di pH: Triptone
10,0 g/l, NaCl 5,0 g/l, Acqua distillata q.b., pH 7,2.
- Composizione del terreno Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD) Agar
(g/l) e relativo valore di pH: Estratto di lievito 10,0 g/l, Peptone 20,0 g/l,
Glucosio 20,0 g/l, Agar 15,0 g/l, Acqua distillata q.b., pH 5,5.
- Composizione del mezzo colturale Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD)
(g/l) e relativo valore di pH: Estratto di lievito 10,0 g/l, Peptone 20,0 g/l,
Glucosio 20,0 g/l, Acqua distillata q.b., pH 5,5.
- Composizione del terreno Wallister’s Laboratory (WL) Nutrient Agar
(mg/l) e relativo valore di pH: Estratto di lievito 4000,0 mg/l, Caseina
idrolizzata 5000,0 mg/l, Glucosio 50000,0 mg/l, Potassio diidrogenofosfato
550,0 mg/l, Cloruro di potassio 425,0 mg/l, Cloruro di calcio 125,0 mg/l,
Solfato di magnesio 125,0 mg/l, Cloruro di ferro 2,5 mg/l, Verde di bromo
cresolo 22,0 mg/l, Agar 17000,0 mg/l, Acqua distillata q.b., pH 5,5.
I terreni e i tamponi vengono sterilizzati in autoclave a 120°C per 30 minuti. I terreni,
una volta sterilizzati, vengono piastrati sotto cappa su piastre Petri con un diametro di
90 mm e lasciati solidificare.
3.3 APPARECCHIATURE E METODI
3.3.1 Spettrofotometro
Lo strumento utilizzato è Lambda 35 UV/VIS Spectrometer (Perkin Elmer). L’analisi
del colore sul mosto e sul vino è stata svolta tramite spettrofotometria a doppio raggio.
23
L’analisi del campione è fatta applicando il programma Wine color analysis, che
sottopone il campione a una scansione da 780 nm a 380 nm. Il campione di vino è
caricato in cuvettes di quarzo e analizzato contemporaneamente al bianco (costituito da
acqua distillata). Lo strumento misura i valori di assorbanza a 420, 520 e 620 nm e i
valori L*, a* e b*, che, inseriti in programmi di calcolo reperibili online [11, 12],
permettono il calcolo della componente di rosso (R), verde (G) e blu (B) presente nel
campione.
3.3.2 Titolatore
Lo strumento utilizzato è T 50 (Mettler Toledo). Il titolatore automatico ha permesso
l’analisi del pH del mosto, effettuata su circa 40 ml di mosto a una temperatura
controllata di 20°C, e l’analisi dell’acidità totale in acido tartarico espressa in g/l.
Quest’ultima è stata effettuata su 10 ml di mosto a cui sono aggiunti 60 ml di acqua
distillata e usando NaOH 0,1 M come titolante. Sul vino in fase di affinamento sono
state valutate la solforosa libera e la solforosa totale (derivata dalla somma della
solforosa libera con la solforosa combinata, costituita dalla SO2 legata ai composti
organici che entrano nella composizione del vino) espresse in mg/l. La misura è stata
effettuata con una titolazione potenziometrica: è stato aggiunto a 50 ml di vino una
piccola quantità di ioduro di potassio KI come catalizzatore e si è poi proceduto con la
titolazione utilizzando dello iodio I2 0,01 N come titolante. La determinazione
dell’acidità totale è avvenuta applicando il metodo ufficiale previsto dall’OIV e
descritto nel Compendium dei metodi internazionali di analisi, alla sezione acidità
totale [13], e recepiti in Gazzetta ufficiale (G.U.) dell’Unione europea C 43/1 del
19/02/2010.
3.3.3 Analizzatore enologico
L’analizzatore enologico utilizzato è il Wineflow (Gibertini), che permette l’analisi del
contenuto in g/l di Glucosio/Fruttosio e di Acido L-Malico. Le analisi sono condotte
utilizzando dei reattivi enzimatici che sfruttano l’assorbanza nell’UV per effettuare la
reazione NAD → NADH e sono forniti dalla stessa ditta dello strumento. Il vino viene
opportunamente diluito utilizzando l’Enodil, una soluzione idroalcolica, come
diluente: il fattore di diluizione è in funzione del limite di linearità del metodo che si
24
vuole eseguire e della concentrazione attesa del campione. Il limite di linearità dello
strumento è di 5,0 g/l nel caso dell’Acido L-Malico 0-5 e di 4,0 g/l nel caso di
Glucosio/Fruttosio. Sul vino in fase di affinamento sono state svolte le analisi per
valutare il contenuto in Acido L-Lattico e in Acido Acetico (come espressione
dell’acidità volatile), entrambi espressi in g/l. La procedura di analisi ha comportato
l’utilizzo di reattivi enzimatici forniti dalla Gibertini e ha previsto le stesse accortezze
descritte sopra. Le analisi si sono svolte applicando il metodo ufficiale previsto
dall’OIV e descritto nel Compendium dei metodi internazionali di analisi, alle sezioni
Acido L-Malico, Glucosio e fruttosio e Acido Lattico [13], e recepiti in G.U.
dell’Unione europea C 43/1 del 19/02/2010.
3.3.4 Distillatore enologico
Lo strumento utilizzato è il Super Dee (Gibertini), che ha permesso la determinazione
del titolo alcolometrico volumico (TAV) effettivo nei vini in fermentazione. Il vino
viene distillato dopo aggiunta di 4 gocce di silicone, usato come agente antischiuma, e
circa 10 ml di calcio ossido 2M (120 g/l), che previene l’eventuale distillazione di
composti acidi volatili. La soluzione idroalcolica che si ottiene, è analizzata per
determinare il contenuto alcolico del vino e la sua densità tramite l’utilizzo di una
bilancia idrostatica. La bilancia idrostatica di cui il laboratorio è fornito è Super
Alcomat (Gibertini). La determinazione del TAV è avvenuta applicando il metodo
ufficiale previsto dall’OIV e descritto nel Compendium dei metodi internazionali di
analisi, alla sezione grado alcolico per volume [13], e recepiti in G.U. dell’Unione
europea C 43/1 del 19/02/2010.
3.3.5 Microscopio ottico
I microrganismi isolati durante la fase prevendemmiale sui grappoli d’uva e i lieviti
isolati durante la fase fermentativa, sono stati osservati al microscopio utilizzando un
ingrandimento di 40X, ideale per visualizzare lieviti e muffe. Sono state inoltre scattate
delle foto di come appaiono le colonie al microscopio grazie alla presenza di una
videocamera, collegata a un computer, posta tra l’obiettivo e le lenti oculari.
25
3.3.6 Conta della concentrazione cellulare
Per la conta della concentrazione cellulare è stato applicato il metodo ufficiale
riconosciuto nel Compendium dei metodi internazionali di analisi dell’OIV, alla
sezione analisi microbiologiche di vini e mosti [13].
I campioni sono diluiti opportunamente dapprima con acqua peptonata e in seguito 100
μl di campione sono distribuiti uniformemente per spatolamento su terreno WL
Nutrient Agar.
Per il calcolo della concentrazione cellulare si contano sulle piastre, incubate per 48
ore a una temperatura costante e controllata di 25 ± 2°C, le unità formanti colonie
(UFC), applicando la seguente formula:
UFC/ml = ∑C / (1*n1 + 0,1*n2) d1
Dove:
∑C = somma del numero di colonie delle piastre contabili;
n1 = numero di piastre della prima diluizione considerata contabile;
n2 = numero di piastre della seconda diluizione considerata contabile;
d1 = fattore di diluizione relativo alla prima diluizione considerata contabile.
Si considerano contabili le piastre che hanno un numero di colonie compreso tra 10 e
300.
3.3.7 Protocollo di estrazione del DNA di lievito
Il protocollo per l’estrazione degli acidi nucleici da lievito utilizzato in questo lavoro è
stato quello proposto da Querol (1992) [14]. In breve, le cellule sono state coltivate
overnight in 5 ml di brodo YEPD. La coltura è stata centrifugata a 3500 rpm per 20
minuti. Il pellet è stato sospeso in 500 μl di una soluzione contenente 0,9 M sorbitolo,
0,1 M EDTA a pH 7,5 a cui sono stati aggiunti 500 μg/ml di enzima litico zymoliasi e
14mM ß-mercaptoetanolo (1μl/ml). Le provette sono state incubate a 30°C per 60
minuti, miscelando ogni 30 minuti, per lisare la parete cellulare. Gli sferoplasti così
ottenuti sono stati centrifugati a 3500 rpm per 15 minutu e il pellet è stato sospeso in
500 μl di Tris-HCl 0,05 M, 0,02M EDTA a pH 7,4. Dopo risospensione, 50 μl di sodio
dodecil solfato (SDS) al 10% è stato aggiunto e la miscela è stata incubata a 65°C per
30 minuti. Subito dopo, 200 μl di acetato di potassio 5 M sono stati aggiunti per
permettere la precipitazione delle proteine e le provette sono state poste in ghiaccio per
26
30 minuti. Il lisato è stato quindi centrifugato a 14000 rpm in una eppendorf per 5
minuti. I surnatanti sono stati trasferiti in eppendorf nuove ed il DNA è stato
precipitato mediante aggiunta di 1 isovolume di isopropanolo (circa 800 μl). Le
eppendorf sono state nuovamente centrifugate a 14000 rpm per 10 minuti. Il DNA è
stato lavato con etanolo al 70% (1 ml) e poi centrifugato a 14000 rpm per 5 minuti. Il
pellet è stato essiccato a 50°C per 15 minuti, dissolto in 75 μl di soluzione TE (10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA a pH 8) e mantenuto a 4°C per 12 h. L’estratto è stato trattato
con 0,5 mg/mL RNasi a 37°C per 30 minuti. Infine, il DNA è stato conservato a -20°C.
La concentrazione e la purezza di DNA è stata determinata misurando l’A260nm e
l’A280nm.
3.3.8 PCR
L’analisi delle sequenze interdelta è stata condotta per lo studio dei lieviti isolati nel
corso del processo fermentativo del mosto di Croatina: valutando la presenza di
Saccharomyces cerevisiae e il grado di diversità tra i lieviti spontanei. Il genoma di S.
cerevisiae contiene sequenze ripetute di DNA, le sequenze delta, associate al
trasposone Ty1. Gli elementi delta costituiscono le ripetizioni terminali (LTR) della
sequenza dei trasposoni Ty1 e Ty2 in lievito; questi si possono trovare sia associati al
retrotrasposone, sia dispersi nel genoma, in questo caso prendono il nome di “elementi
delta”. Il numero e la posizione di questi elementi hanno una certa variabilità
intraspecifica che può essere utilizzato come un’impronta digitale genetica per
identificare i ceppi di S. cerevisiae. Si tratta di una metodica che prevede
un’amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction). L’amplificazione è
stata condotta per gli isolati selezionati durante il monitoraggio fermentativo basandosi
sullo studio del marcatore molecolare interdelta. Il protocollo sperimentale prevede
l’amplificazione di specifiche zone del genoma comprese tra due sequenze delta
tramite l’utilizzo di primers specifici e separazione elettroforetica dei prodotti di
amplificazione per valutarne la qualità. La reazione di PCR è stata condotta partendo
dal DNA genomico degli isolati in un volume finale di 25 μl contenente 10 μl di
miscela per l’amplificazione delle sequenze interdelta Hot Start (composta da Buffer
1X, MgCl2 2 mM, dNTPs 200 μM, Taq-polimerasi 1U), 2,5 μl di primer δ12, 2,5 μl di
primer δ21, il campione di DNA quantificato e acqua sterile filtrata fino a raggiungere
27
il volume finale di 25 μl. La sequenza nucleotidica dei primers utilizzati è riportata
nella seguente tabella [10]:
Primer Sequenza nucleotidica (5’-3
’)
Temperatura
di Melting
δ 12
TCAACAATGGAATCCCAAC
Tm 54°C
δ 21 CATCTTAACACCGTATATATGA Tm 54°C
Con la PCR (Eppendorf) di cui il laboratorio è dotato, è stato applicato il seguente
ciclo termico:
1) 95°C per 3 minuti DENATURAZIONE INIZIALE
2) 95°C per 30 secondi DENATURAZIONE
3) 42°C per 30 secondi ANNEALING
4) 72°C per 2 minuti ESTENSIONE
5) 95°C per 30 secondi DENATURAZIONE
6) 45°C per 30 secondi ANNEALING
7) 72°C per 2 minuti ESTENSIONE
8) 72°C per 7 minuti ESTENSIONE FINALE
3.3.9 Elettroforesi su gel di agarosio
I prodotti di amplificazione sono stati separati tramite corsa elettroforetica su gel di
agarosio al 2,5% (p/v) in TAE 1X (contenetnte Trisbase (T), Acido acetico (A) e
EDTA (E)), utilizzando come riferimento un marker di pesi molecolari noti. La
separazione dei frammenti è stata eseguita a 100V per 90 minuti. Il gel di agarosio
utilizzato ha la seguente composizione:
Agarosio 3,75 g
TAE 1X 150 ml
Bromuro di etidio 6 μl
Per 5 cicli
Per 30 cicli
28
In ogni pozzetto sono stati caricati 15 μl di DNA amplificato e 2μl di Blu di
bromofenolo (BBF), come addensante e tracciante per valutare l’avvenuta corsa
elettroforetica. Il gel viene visualizzato utilizzando un transilluminatore a raggi UV.
29
4. RISULTATI E DISCUSSIONE
30
4.1 MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO PREVENDEMMIALE
4.1.1 Conta della concentrazione cellulare sui grappoli di Croatina
Il monitoraggio microbiologico sui grappoli è stato svolto nel mese precedente la
vendemmia. I grappoli di Croatina, campionati in buste di plastica sterili, sono stati
pigiati manualmente all’interno delle buste per ottenere il mosto. Il mosto è stato
diluito utilizzando come tampone l’acqua peptonata e le diluizioni 10-1
, 10-2
e 10-3
sono state piastrate per spatolamento su terreno WL Nutrient Agar. Le piastre ottenute
sono state incubate in termostato a 25 ± 2°C per 48 ore, per permettere la crescita dei
microrganismi. L’analisi delle piastre ha permesso la conta delle colonie. La scelta di
utilizzare un mezzo colturale generico, diluendo semplicemente il campione, senza
l’utilizzo di mezzi di arricchimento specifici (come l’uso di particolari mezzi colturali,
antibiotici o condizioni d’incubazione diverse), ha permesso l’isolamento delle specie
più rappresentative e aventi una velocità di crescita maggiore. Si è così ottenuto il
grafico della cinetica dell’andamento della popolazione microbica, costituita dalle
specie più rappresentative, sui grappoli d’uva.
Grafico 4.1 Cinetica dell’andamento della popolazione microbica sull’uva
Il grafico riporta la cinetica dell’andamento della popolazione microbica sui grappoli di
Croatina. Il picco massimo si riscontra nella settimana precedente la raccolta dell’uva, con una
concentrazione cellulare di 1,51 x 104 UFC/g.
0,00E+00
2,00E+03
4,00E+03
6,00E+03
8,00E+03
1,00E+04
1,20E+04
1,40E+04
1,60E+04
19-ago-14 29-ago-14 08-set-14 18-set-14 28-set-14
UFC
/g
Campionamento
UFC/g
UFC/g
31
Dalla Grafico 4.1 si può vedere un aumento esponenziale dei microrganismi a partire
dalla terza settimana precedente la vendemmia, con un picco massimo corrispondente
alla settimana immediatamente precedente la raccolta dell’uva.
4.1.2 Riconoscimento di muffe e lieviti
È stato possibile, grazie alla morfologia delle colonie e all’analisi di quest’ultime al
microscopio ottico, distinguere due tipologie di microrganismi dominanti: le muffe e i
lieviti. Basandoci sulla percentuale di muffe e lieviti, rispetto alla totalità dei
microrganismi ottenuti dall’analisi sui grappoli nel corso del monitoraggio, è stato
possibile vedere una decrescita delle muffe a favore di un aumento dei lieviti nel corso
della maturazione dell’uva, a partire dalla fase di invaiatura fino a raggiungere la
completa maturazione. È possibile apprezzare l’andamento dei microrganismi isolati
nel seguente grafico:
Grafico 4.2 Percentuale di muffe e lieviti
La figura mostra l’andamento della percentuale di muffe e lieviti presenti sulla superficie dei
grappoli di Croatina nel corso del monitoraggio. È possibile riscontrare un aumento del
numero di lieviti e una rispettiva diminuzione di quello delle muffe con l’avvicinarsi della
vendemmia.
L’analisi al microscopio ha permesso, in base alla morfologia delle colonie osservate,
di ricondurre presumibilmente la maggior parte delle muffe isolate durante il
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80%
90%
100%
% Lieviti
% Muffe
32
monitoraggio alla specie Cladosporium, mentre la maggior parte dei lieviti alla specie
Candida. Si tratta di un’identificazione basata unicamente sull’analisi microscopica.
Durante il monitoraggio le colonie di muffe e lieviti, che hanno mostrato una differente
morfologia su terreno WL Nutrient Agar, sono state isolate e conservate come colture
pure glicerinate a -80°C, creando una libreria di isolati, e potranno essere utilizzate in
futuro per ulteriori studi più approfonditi.
Figura 4.1 Confronto tra piastre in momenti diversi del monitoraggio
La figura mostra, a titolo di esempio, le foto delle piastre corrispondenti alla diluizione 10-1
. In
queste piastre, che corrispondono al secondo campionamento, a sinistra, e al quarto
campionamento, a destra (non contabile), si può vedere il passaggio da una maggioranza di
muffe sul totale della popolazione microbica dei grappoli a una di lieviti.
Figura 4.2 Immagine al microscopio di muffe e lieviti
La figura mostra le foto che indicano come appaiono una muffa, a sinistra, e un lievito, a
destra, isolati durante il monitoraggio microbiologico sui grappoli di Croatina, osservati al
microscopio ottico con ingrandimento 40X.
33
4.2 MONITORAGGIO CHIMICO PREVENDEMMIALE
4.2.1 Zuccheri, pH e Acidità totale
Nella fase prevendemmiale sono stati valutati alcuni parametri chimici.
È stato monitorato l’andamento degli zuccheri attraverso una scala di gradi Brix. La
misura è stata fatta utilizzando un densimetro portatile DMA 35 N PAAR e misurando
la densità del mosto alla temperatura di 20°C. Il grado Brix rappresenta la percentuale
di zucchero in peso: moltiplicando il grado Brix per 10, si ottiene il peso dello
zucchero in 1 kg di mosto. Esiste una tabella di conversione fra i gradi Brix e il titolo
alcolometrico potenziale dei mosti (TAP), che è possibile consultare in allegato. 18°
Brix corrispondono ad un valore di TAP di circa 10% vol. I valori di gradi Brix sono
aumentati da 20,1° fino a raggiungere 25,4°, che approssimativamente corrisponde a
un valore di TAP di 15% vol.
Sono stati inoltre analizzati gli andamenti di pH e acidità totale: il pH si è mantenuto
piuttosto costante, oscillando da 3,17 e 3,32; mentre l’acidità è diminuita da un valore
di 10,71 g/l a un valore di 5,03 g/l.
Campionamento °Brix pH Acidità totale in
ac. tartarico (g/l)
26/08/2014 20,1 3,17 10,71
02/09/2014 22,1 3,23 8,38
09/09/2014 22,2 3,37 8,13
16/09/2014 22,5 3,35 5,83
24/09/2014 25,4 3,32 5,03
Tabella 4.1 Tabella riassuntiva dei valori chimici rilevati
La tabella riporta, per ogni campionamento effettuato prima della vendemmia, i valori di
°Brix, pH e acidità totale in acido tartarico rilevati.
34
Grafico 4.3 Andamento degli zuccheri espressi come °Brix
Grafico 4.4 Andamento di pH e acidità totale
4.2.2 Il rame
È stato valutato, tra gli altri parametri chimici, anche il contenuto in rame del mosto tal
quale ottenuto per pigiatura manuale di alcuni grappoli di Croatina. Gli acini,
provenienti dal grappolo campionato, sono stati pigiati all’interno di un mortaio, dopo
aver lavato e asciugato la superficie di questi ultimi per evitare contaminazioni del
succo con il rame eventualmente legato alla polvere presente sul grappolo, con
15
17
19
21
23
25
27
24-ago 03-set 13-set 23-set 03-ott
°BRIX
°BRIX
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
24-ago 03-set 13-set 23-set 03-ott
pH
ACIDITA' Tot (g/l)
35
l’utilizzo di un pestello e di un colino per facilitare l’allontanamento delle bucce. Il
mosto così ottenuto è stato diluito 1:10 con acqua distillata e demineralizzata e
successivamente analizzato per spettrofotometria di assorbimento atomico, applicando
il metodo ufficiale previsto dall’OIV [13]. Lo strumento ha elaborato la concentrazione
di rame in ppm e questo ha permesso di riscontrare una graduale diminuzione della
presenza di rame sui grappoli di Croatina. I dati riguardanti il contenuto in rame non
sono più stati significativi nel mosto in fermentazione, dove il rame è stato ritrovato in
concentrazioni trascurabili.
Il seguente grafico ha permesso di schematizzare l’andamento della concentrazione di
rame:
Grafico 4.5 L’andamento del rame
Il grafico mostra l’andamento del rame sui grappoli d’uva. Questo grafico permette di
visualizzare la diminuzione progressiva della presenza di rame, fino ad arrivare a
concentrazioni trascurabili.
4.2.3 Il colore
In ultimo è stato valutato il colore del mosto tal quale ottenuto dalla pigiatura manuale
di alcuni grappoli di Croatina. Durante questa fase prevendemmiale si è riscontrato un
andamento pressoché parallelo dei valori di rosso, verde e blu, come si può vedere dal
grafico riportato sotto.
0 2 4 6 8
10 12 14
26
/08
/20
14
28
/08
/20
14
30
/08
/20
14
01
/09
/20
14
03
/09
/20
14
05
/09
/20
14
07
/09
/20
14
09
/09
/20
14
11
/09
/20
14
13
/09
/20
14
15
/09
/20
14
Rame (ppm)
Rame (ppm)
36
Campionamento A420 A520 A620 L* a* b* R G B
26/08/2014 0,2000 0,2462 0,0354 88,58 15,13 8,61 255 210 204
02/09/2014 1,0000 0,9760 0,4260 52,65 24,42 21,9 181 115 95
09/09/2014 0,3011 0,2822 -0,019 89,02 20,58 17,62 255 209 190
16/09/2014 1,7560 1,3760 0,5625 40,73 29,12 36,46 152 75 38
24/09/2014 0,9870 1,0620 0,3160 54,13 34,82 24,19 194 103 90
Tabella 4.2 Tabella riassuntiva dei dati del colore
La tabella riporta i valori di assorbanza e i valori di L*, a* e b* rilevati dallo strumento e i
valori di R, G e B calcolati con l’ausilio di un programma di calcolo.
Grafico 4.6 L’andamento delle componenti R, G e B nel campione
Il grafico riporta l’andamento delle componenti di rosso (R) , verde (G) e blu (B) presenti nel
mosto di Croatina prima della vendemmia.
0
50
100
150
200
250
300
24-ago 29-ago 03-set 08-set 13-set 18-set 23-set 28-set
B
R
G
37
3. MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO E CHIMICO DEL PROCESSO
FERMENTATIVO
4.3.1 Monitoraggio microbiologico
Il monitoraggio microbiologico è stato svolto durante il processo fermentativo del
mosto ottenuto dall’uva Croatina in purezza, con lo scopo di ottenere un vino Bonarda
in purezza. La fermentazione è stata condotta con processo di macerazione e in modo
spontaneo, sfruttando il potere fermentativo dei lieviti indigeni presenti naturalmente
sull’uva. Il mosto in fermentazione, campionato in buste di plastica sterili, è stato
diluito utilizzando come tampone l’acqua peptonata e le opportune diluizioni sono
state piastrate per spatolamento su terreno WL Nutrient Agar. Le piastre ottenute sono
state incubate in termostato a 25 ± 2°C per 48 ore, per permettere la crescita dei lieviti
impiegati nel processo fermentativo. L’analisi delle piastre ha permesso la conta delle
colonie. Si è così ottenuto il grafico della cinetica dell’andamento della fermentazione.
Figura 4.3 Piastre ottenute durante il monitoraggio microbiologico
La figura mostra, a titolo di esempio, le foto delle piastre che corrispondono alle diluizioni 10-4
(A), 10-5
(B) e 10-6
(C). Si può notare la presenza di colonie morfologicamente differenti di
38
lieviti (in accordo con una fermentazione di tipo spontaneo). La foto C riporta una piastra non
contabile, dal momento che contiene un numero di colonie contabili inferiore a 10.
L’analisi delle piastre, oltre a permettere la conta delle colonie, ha confermato
l’avvenuta fermentazione di tipo spontaneo. Infatti, la morfologia delle colonie su
terreno WL Nutrient Agar è apparsa diversa. Questo è una dimostrazione del fatto che i
lieviti, coinvolti nel processo fermentativo, appartengono a ceppi diversi di S.
cerevisiae. La differente morfologia delle colonie ha permesso l’isolamento di queste
come colture pure.
Grafico 4.7 Cinetica del processo fermentativo
Il grafico riporta la cinetica dell’andamento della fermentazione del mosto di Croatina. Il picco
massimo si riscontra all’ottavo giorno di fermentazione, con una concentrazione cellulare di
1,57 x 107 UFC/ml.
La curva della fermentazione è stata seguita fino al ventinovesimo giorno, giorno in
cui si può iniziare ad apprezzare un declino nella curva della cinetica di fermentazione.
La fine della fermentazione è stata determinata attraverso l’analisi dei parametri
chimici, in particolare la concentrazione in g/l di glucosio e fruttosio. Questo
parametro ha permesso di considerare conclusa la fermentazione al quarantottesimo
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
18-set-14 28-set-14 08-ott-14 18-ott-14 28-ott-14
UFC
/ml
Campionamento
UFC/ml
UFC/ml
39
giorno dalla vendemmia, avendo rilevato un contenuto in glucosio e fruttosio pari a
1,123 g/l. I lieviti indigeni sono riusciti a portare a termine la fermentazione, benché
questa sia stata piuttosto lunga.
4.3.2 Monitoraggio chimico
Il monitoraggio chimico ha permesso di seguire i principali parametri chimici durante
il processo fermentativo. I valori di pH, acidità totale in acido tartarico espressa in g/l e
il contenuto in zuccheri, inizialmente espresso come °Brix e successivamente valutato
come concentrazione della miscela di glucosio e fruttosio espressa in g/l, sono stati
analizzati per tutto il corso della fermentazione. Quando la densità del mosto è
diminuita, e quindi è diminuito il suo contenuto zuccherino (indice dell’avanzamento
della fermentazione) fino a concentrazioni misurabili con metodi chimici, sono stati
analizzati anche i valori della densità del distillato idroalcolico, ottenuto per
distillazione del mosto in vinificazione, della densità del vino e il titolo alcolometrico
volumico effettivo (TAV), attraverso l’utilizzo di una bilancia idrostatica. I risultati
ottenuti sono riportati nella seguente tabella:
40
Data pH
Acidità
tot. in
ac.
tartarico
(g/l)
°Brix Gluc/Frutt
(g/l)
Acido
Malico
(g/l)
TAV Densità
Distillato
Densità
Vino
D°20
26/09/2014 3,35 5,18 23,7 - - - - -
28/09/2014 3,52 6,57 22,3 - - - - -
01/10/2014 3,50 5,91 19,3 - - - - -
03/10/2014 - - 16,3 - - - - -
06/10/2014 - - 14,7 - - - - -
08/10/2014 3,55 6,47 11,7 - - - - -
10/10/2014 3,63 6,09 9,9 - - - - -
13/10/2014 3,62 6,32 7,5 - - - - -
15/10/2014 3,68 6,55 5,6 - - - - -
17/10/2014 3,59 6,82 4,0 43,390 1,255 10,78 0,98550 1,01350
20/10/2014 3,55 6,58 - 26,810 1,256 11,62 0,98450 1,00815
22/10/2014 3,73 6,63 - 19,850 1,215 - - -
03/11/2014 3,62 7,62 - 4,057 1,273 13,63 0,98200 0,99500
10/11/2014 3,53 7,30 - 1,100 1,300 13,38 0,98250 0,99400
17/11/2014 3,43 6,58 - 1,400 1,200 14,73 0,98095 0,99405
24/11/2014 3,48 7,01 - 1,112 1,454 13,35 0,98255 0,99375
03/12/2014 3,57 6,90 - 1,123 1,537 14,03 0,98175 0,99350
Tabella 4.3 Tabella riassuntiva dei valori chimici rilevati
La tabella riporta i valori di pH, acidità totale in acido tartarico, °Brix, glucosio e fruttosio,
acido malico, titolo alcolometrico volumico effettivo (TAV), densità del distillato e densità del
vino rilevati durante il monitoraggio chimico.
I campioni sono stati inoltre sottoposti all’analisi spettrofotometrica per valutarne il
colore. Per ogni campione sono stati valutati i valori di assorbanza a 420 nm, 520 nm e
620 nm e i valori di L*, a* e b*, che hanno permesso di calcolare la componente di
rosso, verde e blu presente nel campione. I risultati ottenuti sono riportati nella
seguente tabella:
41
Campionamento A420 A520 A620 L* a* b* R G B
26/09/2014 1,7893 4,4089 0,4687 30,03 58,73 39,45 153 0 11
01/10/2014 4,4625 12,8310 1,4270 10,54 41,59 18,17 78 0 0
03/10/2014 5,3990 15,0130 1,8120 6,17 35,38 10,64 59 0 0
06/10/2014 5,5700 14,5840 2,0140 2,89 30,10 4,99 48 0 0
08/10/2014 5,1109 13,4671 1,7185 6,91 36,34 11,92 62 0 0
10/10/2014 5,6501 14,3140 1,9840 3,88 31,77 6,69 52 0 0
13/10/2014 5,6460 13,5170 2,0730 2,32 29,22 4,00 45 0 0
15/10/2014 5,5030 13,3990 1,8890 5,24 33,90 9,04 56 0 0
17/10/2014 5,8060 13,8930 1,9940 4,48 32,84 7,73 53 0 0
20/10/2014 5,7790 13,3160 1,9760 4,79 33,32 8,26 55 0 0
22/10/2014 5,9130 13,3250 1,9700 5,20 34,03 8,97 56 0 0
03/11/2014 5,1875 11,4471 1,7519 7,18 36,86 12,37 64 0 0
10/11/2014 3,4550 5,6842 1,1174 13,69 44,45 23,30 89 0 0
17/11/2014 3,4254 5,8230 1,1057 14,17 45,34 24,11 91 0 0
24/11/2014 3,8545 6,4144 1,2714 11,30 41,52 19,36 79 0 0
03/12/2014 3,9549 6,6577 1,2838 11,32 41,73 19,43 80 0 0
Tabella 4.4 Tabella riassuntiva dei dati del colore
La tabella riporta i dati relativi al colore del mosto in fermentazione, rilevati durante il
monitoraggio chimico del vino.
42
Grafico 4.8 Grafico dell’andamento di pH, acidità totale e acido malico
Grafico 4.9 Grafico dell’andamento degli zuccheri valutati in °Brix
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
13-set 03-ott 23-ott 12-nov 02-dic 22-dic
pH
ACIDITA' Tot (g/l)
A. Malico (g/l)
0
5
10
15
20
25
13-set 23-set 03-ott 13-ott 23-ott 02-nov 12-nov 22-nov 02-dic 12-dic
° BRIX
° BRIX
43
Grafico 4.10 Grafico dell’andamento degli zuccheri valutati in concentrazione di glucosio
e fruttosio e dell’alcool
Grafico 4.11 Grafico dell’andamento dei parametri del colore R, G e B
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
13-set 03-ott 23-ott 12-nov 02-dic 22-dic
Glucosio/Fruttosio (g/l)
Alcool
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
13-set 23-set 03-ott 13-ott 23-ott 02-nov 12-nov 22-nov 02-dic 12-dic
Co
lore
Campionamento
B
R
G
44
4.4 ISOLAMENTO DEI CEPPI DI LIEVITO E SELEZIONE DEL CEPPO DI
Saccharomyces cerevisiae STARTER
4.4.1 Isolamento dei lieviti coinvolti nel processo fermentativo
Durante il monitoraggio microbiologico della fase di fermentazione del mosto, sono
stati isolati alcuni lieviti a ogni monitoraggio. L’isolamento è avvenuto prelevando con
un’ansa sterile un’aliquota della colonia selezionata e strisciandola poi su una piastra
con terreno YEPD Agar. Gli isolati sono stati incubati e fatti crescere a una
temperatura controllata di 25 ± 2°C per 48 ore. In seguito gli isolati sono stati trasferiti
in un brodo di coltura, inoculando con l’utilizzo di un’ansa sterile un’aliquota di una
colonia del lievito isolato in 2,5 ml di brodo YEPD. Le colture sono quindi state fatte
crescere in termostato a 25 ± 2°C per 48 ore. Sono stati in seguito aggiunti di 450 μl di
glicerolo al 100% e si è trasferito 1 ml di coltura glicerinata in una eppendorf
mantenuta a -80°C.
Monitoraggio Colture glicerinate
Mosto 1° 24-09 M1Lb, M1Lv
Mosto 3° 26-09 M3Lv, M3Lb
Mosto 6° 29-09 M6Lb, M6Lvs, M6Lvc
Mosto 8° 01-10 M8Lb, M8Lvs, M8Lvc
Mosto 10° 03-10 M10Lb, M10Lvs, M10Lvc
Mosto 13° 06-10 M13Lb, M13Lv
Mosto 15° 08-10 M15L1, M15L2, M15L3
Mosto 20° 13-10 M20L1, M20L2, M20L3
Mosto 22° 15-10 M22L1, M22L2, M22L3
Mosto 24° 17-10 M24L1, M24L2
Mosto 27° 20-10 M27L1, M27L2, M27L3
Tabella 4.5 Libreria degli isolati
La tabella riporta i codici dei lieviti isolati ad ogni monitoraggio e conservati come colture
pure a -80°C.
45
Figura 4.4 Lievito isolato come coltura pura
La figura rappresenta, a titolo di esempio, un tipico isolato di una coltura di lievito pura.
4.4.2 Selezione del ceppo starter
Per ridurre i tempi di analisi e partendo dal presupposto che i lieviti isolati dai primi
monitoraggi sono per lo più lieviti apiculati e ceppi di S. cerevisiae con un basso
potere fermentativo e una bassa resistenza a valori elevati di etanolo, sono stati valutati
in analisi successive solo i lieviti isolati dagli ultimi sei tempi del monitoraggio.
È stato estratto il DNA da questi sedici lieviti, seguendo il protocollo descritto nel
paragrafo 3.3.6.
Il DNA estratto è stato quantificato con l’utilizzo dello spettrofotometro, analizzando
l’assorbanza a 260 nm (per valutare la presenza di DNA) e a 280 nm (per valutare
l’eventuale contaminazione da proteine).
46
Campione A 260 nm A 280 nm μg/μl DNA Grado di
purezza
M13 Lv 0,273 0,140 2,73 1,95
M13 Lb 0,185 0,123 1,85 1,50
M15 L1 0,224 0,148 2,24 1,51
M15 L2 0,215 0,130 2,15 1,65
M15 L3 0,343 0,184 3,43 1,86
M20 L1 0,148 0,103 1,48 1,44
M20 L2 0,124 0,087 1,24 1,43
M20 L3 0,184 0,147 1,84 1,25
M22 L1 0,771 0,428 7,71 1,80
M22 L2 0,961 0,528 9,61 1,82
M22 L3 0,734 0,405 7,34 1,81
M24 L1 0,598 0,342 5,98 1,75
M24 L2 0,716 0,401 7,16 1,79
M27 L1 0,921 0,510 9,21 1,80
M27 L2 0,700 0,351 7,00 1,99
M27 L3 0,833 0,460 8,33 1,81
Tabella 4.6 Quantificazione del DNA estratto
La tabella riporta, per ciascun lievito testato, i valori di assorbanza a 260 nm e 280 nm, la
concentrazione di DNA espressa in μg/μl (ottenuta applicando la formula A260nm x 50 / μl
DNA impiegati) e il grado di purezza (cioè il rapporto tra A 260 nm / A 280 nm). Si ritiene che
un grado di purezza inferiore a 1,6 sia indice di una contaminazione proteica.
Il DNA estratto è stato quindi amplificato tramite PCR, applicando il metodo descritto
nel paragrafo 3.3.8. Gli amplificati ottenuti sono stati visualizzati attraverso
elettroforesi su gel di agarosio al 2,5%. L’osservazione del gel elettroforetico con luce
UV ha permesso di visualizzare i profili interdelta dei ceppi testati: la presenza di
bande ha confermato che i lieviti valutati erano effettivamente ceppi di S. cerevisiae. I
47
profili visualizzati hanno confermato l’avvenuta fermentazione di tipo spontaneo,
dimostrata dalla presenza di profili differenti e quindi di diversi ceppi di S. cerevisiae.
Tra questi è stato scelto un ceppo di S. cerevisiae da utilizzare come starter per una
prova di microvinificazione su 10 l di mosto ottenuto da uva di qualità Croatina
raccolta nella stessa vigna da cui si era raccolta l’uva della prima sperimentazione: la
scelta è ricaduta su un ceppo presente in modo costante negli ultimi tre tempi di
monitoraggio, che si è pertanto mantenuto attivo nell’ultima settimana di monitoraggio
microbiologico. Si tratta quindi, presumibilmente, di un ceppo in grado di tollerare
concentrazioni alcoliche elevate e con un alto potere fermentativo.
Il ceppo di Saccharomyces cerevisiae scelto è quello indicato con il codice M27L1.
Figura 4.5 Profilo interdelta del ceppo starte selezionato
La figura riporta il profilo visualizzato su gel elettroforetico dopo amplificazione delle
sequenze interdelta del ceppo di S. cerevisiae utilizzato come starter per una prova di
microvinificazione.
48
4.5 PROVA DI MICROVINIFICAZIONE
4.5.1 Pressatura dell’uva Croatina
Dal momento che la prova di microvinificazione è stata effettuata a un mese dalla
vendemmia, è stato necessario congelare il mosto privo delle bucce.
Per l’ottenimento di mosto limpido, senza presenza di bucce e semi, le uve sono state
versate direttamente all’interno di una pressa idraulica. Il principio di funzionamento
di tale pressa sfrutta la pressione dell’acqua: un cilindro, costituito da una membrana in
gomma ad uso alimentare, si gonfia con l’entrata dell’acqua e l’uva da pressare viene
quindi schiacciata tra la membrana e un cilindro in acciaio inox forato, da cui fuoriesce
il succo.
La pressa utilizzata in cantina ha una capacità di 80 l ed è usata nelle prove di
microvinificazione. L’utilizzo di questo strumento consente di effettuare una
pressatura soffice con una buona resa in succo delle uve, poiché la pressione
all’interno della membrana di gomma flessibile viene scaricata uniformemente verso la
gabbia esterna per tutta la sua lunghezza.
4.5.2 Inoculo della coltura starter
Per procedere con l’inoculo del ceppo di S. cerevisiae selezionato nei 10 l di mosto
limpido privo delle bucce, è stato necessario ottenere un’adeguata concentrazione
cellulare del lievito.
50 μl di coltura glicerinata del ceppo denominato con il codice M27L1 sono stati
inoculati dapprima in 5 ml di brodo colturale YEPD. Dopo una notte di crescita a una
temperatura controllata di 25 ± 2°C, 2 ml di coltura sono stati trasferiti in 400 ml di
brodo YEPD. La coltura è stata fatta crescere per una notte a 25 ± 2°C e
successivamente è stata trasferita in quaranta provette (10 ml di coltura per ogni
provetta). Le provette sono state centrifugate e il pellet, costituito dalle cellule di
lievito, è stato risospeso in 1 ml di brodo YEPD. Il contenuto delle provette è stato
trasferito in due falcon (20 ml di coltura per ogni falcon), che sono state conservate in
frigorifero a 4°C. Il contenuto delle falcon è quindi stato trasferito in acqua distillata
sterile e, in ultimo, inoculato nel mosto opportunamente scongelato.
49
Si è ipotizzato un inoculo avvenuto con una concentrazione cellulare di circa 4 x 105
UFC/ml.
La fermentazione è stata fatta partire in laboratorio, in condizioni controllate, a una
temperatura di circa 20/22°C. In seguito, la vasca contenete il mosto sottoposto a
microvinificazione, è stata posta in cantina a una temperatura di circa 16/18°C per
mimare il più possibile le condizioni avute nella precedente fermentazione.
Figura 4.6 Vasca utilizzata nella prova di microvinificazione
La figura mostra la foto della vasca, in acciaio inox, contenente i 10 l di mosto privo di bucce
nel quale è avvenuto l’inoculo del ceppo starter selezionato e il successivo processo
fermentativo.
4.5.3 Monitoraggio microbiologico
Il monitoraggio microbiologico è stato svolto durante il processo fermentativo del
mosto sottoposto a microvinificazione: Bonarda da microvinificazione. La
fermentazione è stata condotta senza processo di macerazione e inoculando un ceppo
di S. cerevisiae, selezionato tra quelli naturalmente presenti durante la fermentazione
spontanea seguita in precedenza, come starter. Il mosto in fermentazione, campionato
in buste di plastica sterili, è stato diluito utilizzando come tampone l’acqua peptonata e
le opportune diluizioni sono state piastrate per spatolamento su terreno WL Nutrient
Agar. Le piastre ottenute sono state incubate e mantenute a una temperatura controllata
di 25 ± 2°C per 48 ore, per permettere la crescita del lievito responsabile del processo
50
fermentativo. L’analisi delle piastre ha permesso la conta delle colonie. Si è così
ottenuto il grafico della cinetica dell’andamento della fermentazione.
Figura 4.7 Piastre ottenute durante il monitoraggio microbiologico
La figura mostra, a titolo di esempio, le foto delle piastre che corrispondono alle diluizioni 10-2
(A), 10-3
(B) e 10-4
(C). Si può notare la presenza di colonie uguali dal punto di vista
morfologico (in accordo con una fermentazione indotta). La foto C riporta l’unica piastra
contabile, dal momento che le piastre rappresentate nelle foto A e B contengono un numero di
colonie contabili superiore a 300.
L’analisi delle piastre, oltre a permettere la conta delle colonie, ha inizialmente
confermato l’avvenuta fermentazione di tipo indotto. Infatti, la morfologia delle
colonie su terreno WL Nutrient Agar è apparsa la stessa. Questo è una dimostrazione
del fatto che i lieviti, coinvolti nel processo fermentativo, appartengono allo stesso
ceppo di S. cerevisiae. Per una conferma definitiva del corretto andamento della
fermentazione indotta con uno starter selezionato, sono state isolate sedici colonie di
lievito, otto dal primo giorno di monitoraggio e otto dall’ultimo giorno. Queste sono
state conservate come colture pure e analizzate in prove successive.
51
Grafico 4.12 Cinetica del processo fermentativo
Il grafico riporta la cinetica dell’andamento della fermentazione del mosto sottoposto a
microvinificazione. Il picco massimo si riscontra al sesto giorno di fermentazione, con una
concentrazione cellulare di 3,7 x 106 UFC/ml.
La curva della fermentazione è stata seguita fino al trentaquattresimo giorno, giorno in
cui si può apprezzare un declino nella curva della cinetica di fermentazione. La fine
della fermentazione è stata determinata attraverso l’analisi dei parametri chimici, in
particolare la concentrazione in g/l di glucosio e fruttosio. Questo parametro ha
permesso di considerare conclusa la fermentazione al quarantesimo giorno dal suo
inizio, avendo rilevato un contenuto in glucosio e fruttosio pari a 0,8 g/l. Il lievito
indigeno testato, isolato durante la fermentazione spontanea di Croatina monitorata in
precedenza, è riuscito a portare a termine la fermentazione, che ha avuto una durata
pressoché uguale alla fermentazione di tipo spontaneo.
Per confermare che la fermentazione è stata iniziata e portata a termine dallo stesso
ceppo di S. cerevisiae utilizzato come starter, i sedici lieviti isolati e conservati come
colture pure durante la fermentazione sono stati ulteriormente testati. Dapprima è stato
isolato il DNA da questi lieviti. La quantificazione del DNA estratto è avvenuta
tramite analisi spettrofotometrica.
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
28-ott-14 07-nov-14 17-nov-14 27-nov-14 07-dic-14
UFC
/ml
Campionamento
UFC/ml
UFC/ml
52
Campione A 260 nm A 280 nm μg/μl DNA Grado di
purezza
L 1 0,220 0,042 2,20 5,24
L 2 0,368 0,161 3,68 2,28
L 3 0,304 0,159 3,04 1,91
L 4 0,283 0,120 2,83 2,36
L 5 0,434 0,184 4,34 2,36
L 6 0,444 0,155 4,44 2,86
L 7 0,181 0,053 1,81 3,42
L 8 0,211 0,064 2,11 3,30
L 9 0,384 0,149 3,84 2,58
L 10 0,523 0,209 5,23 2,50
L 11 0,488 0,190 4,88 2,57
L 12 0,503 0,245 5,03 2,05
L 13 0,331 0,159 3,31 2,08
L 14 0,542 0,230 5,42 2,36
L 15 0,421 0,207 4,21 2,03
L 16 0,434 0,173 4,34 2,50
Tabella 4.7 Quantificazione del DNA estratto
La tabella riporta, per ciascun lievito testato, i valori di assorbanza a 260 nm e 280 nm, la
concentrazione di DNA espressa in μg/μl (ottenuta applicando la formula A260nm x 50 / μl
DNA impiegati) e il grado di purezza (cioè il rapporto tra A 260 nm / A 280 nm). Si ritiene che
un grado di purezza inferiore a 1,6 sia indice di una contaminazione proteica.
Il DNA estratto è stato quindi amplificato tramite PCR, applicando il metodo descritto
nel paragrafo 3.3.8. Gli amplificati ottenuti sono stati visualizzati attraverso
elettroforesi su gel di agarosio al 2,5%. L’osservazione del gel elettroforetico con luce
UV ha permesso di visualizzare i profili interdelta dei ceppi testati: si è osservata la
presenza di un unico profilo, uguale per tutti e sedici i lieviti testati. Tale profilo è lo
stesso del ceppo selezionato, denominato con il codice M27L1, e visibile in Figura
4.11. Questo ha confermato il corretto svolgimento della prova di microvinificazione.
53
Figura 4.8 Gel elettroforetico dell’amplificazione delle sequenze interdelta
La figura riporta la foto del gel elettroforetico visualizzato con luce UV. Il gel riporta i profili
dei ceppi di lievito testati, dopo amplificazione delle sequenze interdelta tramite PCR.
Figura 4.9 Immagine al microscopio del ceppo starter di S. cerevisiae
La figura riporta l’immagine del ceppo di S. cerevisiae M27L1 osservato al microscopio
elettronico con ingrandimento 40X.
54
4.5.4 Monitoraggio chimico
Sono stati seguiti gli andamenti dei principali parametri chimici e del colore durante il
processo fermentativo del mosto sottoposto a microvinificazione. È importante
sottolineare che i valori la cui determinazione ha richiesto quantitativi maggiori di vino
(quali il TAV e le densità del distillato e del vino), sono stati determinati con frequenza
minore rispetto agli altri, data la scarsità del vino Bonarda da microvinificazione a
disposizione (10 l). I risultati ottenuti sono riportati nelle seguenti tabelle:
Data pH
Acidità
tot. in
ac.
tartarico
(g/l)
°Brix Gluc/Frutt
(g/l)
Acido
Malico
(g/l)
TAV Densità
Distillato
Densità
Vino
D°20
31/10/14 3,45 7,07 23,2 - 1,6 - - -
03/11/14 3,45 7,51 17,2 - - - - -
05/11/14 3,47 5,96 11,9 - - - - -
07/11/14 3,53 6,76 8,8 - - - - -
10/11/14 3,47 8,20 5,3 - - - - -
12/11/14 3,44 6,58 3,2 - - - - -
14/11/14 3,25 6,66 2,3 - - - - -
17/11/14 3,27 7,97 1,2 - - 11,60 1,00365 0,98455
19/11/14 - - - 18,3 1,2 - - -
24/11/14 3,48 6,39 - 11,3 0,7 12,34 0,99775 0,98370
26/11/14 - - - 8,5 0,4 - - -
03/12/14 3,62 5,53 - 2,4 0,1 13,11 0,99275 0,98280
09/12/14 3,54 5,23 - 0,8 - 13,27 0,99235 0,98260
Tabella 4.8 Tabella riassuntiva dei valori chimici rilevati
La tabella riporta i valori di pH, acidità totale in acido tartarico, °Brix, glucosio e fruttosio,
acido malico, titolo alcolometrico volumico effettivo (TAV), densità del distillato e densità del
vino rilevati durante il monitoraggio chimico del mosto in microvinificazione.
55
Questi risultati mettono in evidenza che nel vino sottoposto a microvinificazione si è
sviluppata la fermentazione malolattica. Infatti, il valore di acido malico, espresso in
g/l, è diminuito progressivamente da un valore iniziale di 1,6 a un valore finale di 0,1.
La diminuzione della concentrazione di acido malico ha portato analogamente ad una
diminuzione dell’acidità totale e a un aumento del pH .
Data A420 A520 A620 L* a* b* R G B
31/10/14 1,1168 1,6504 0,2910 45,79 53,00 23,82 192,52 61,45 70,98
03/11/14 2,6268 2,4785 1,0920 16,53 28,91 23,08 81,41 17,83 4,92
05/11/14 1,1643 1,2121 0,2943 50,32 42,19 29,39 194,00 86,65 71,40
07/11/14 1,0895 1,1942 0,3172 49,85 40,71 24,32 189,44 87,25 78,81
10/11/14 1,0459 1,1585 0,3056 50,62 40,51 22,92 191,09 89,52 82,96
12/11/14 1,1080 1,1384 0,3127 50,82 38,98 26,16 190,57 91,37 77,85
14/11/14 1,2626 1,2525 0,4140 45,48 36,23 26,18 171,33 80,49 65,26
17/11/14 1,0272 1,0904 0,2322 54,03 43,00 27,07 205,65 95,58 84,14
19/11/14 1,3174 1,1865 0,4284 45,80 33,03 29,33 168,95 84,14 60,40
24/11/14 1,5319 1,2157 0,4041 45,66 35,11 37,89 172,88 81,50 45,04
26/11/14 1,3805 1,0151 0,4056 49,62 27,08 36,22 173,95 98,45 56,46
03/12/14 1,4237 0,9635 0,4441 49,59 22,15 36,32 167,37 102,19 55,77
09/12/14 1,2659 0,8075 0,4113 54,46 16,83 34,19 173,49 118,27 70,71
Tabella 4.9 Tabella riassuntiva dei dati del colore
La tabella riporta i dati relativi al colore del mosto in fermentazione, rilevati durante il
monitoraggio chimico del vino.
I parametri G e B si sono ritrovati durante tutto il monitoraggio del vino Bonarda da
microvinificazione, come si può apprezzare anche nel Grafico 4.16. Questo è dovuto al
fatto che il vino sottoposto a microvinificazione non ha subito il processo di
macerazione. È interessante, inoltre, notare nella Tabella 4.9 come si sia verificato una
diminuzione del colore del vino in concomitanza con la partenza della fermentazione
malolattica. Cosa che non si è verificata nel vino Bonarda in purezza sottoposto a
fermentazione spontanea, nel quale non è avvenuta alcuna fermentazione malolattica.
56
Questo indica come la fermentazione malolattica, oltre a influenzare il vino in diverse
caratteristiche organolettiche, influenzi il colore finale del vino, diminuendone la
componente rossa e aumentandone quella verde.
Grafico 4.13 Grafico dell’andamento di pH, acidità totale e acido malico
Grafico 4.14 Grafico dell’andamento degli zuccheri espressi in °Brix
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
28-ott-14 07-nov-14 17-nov-14 27-nov-14 07-dic-14 17-dic-14
pH
ACIDITA' Tot (g/l)
A. Malico (g/l)
0
5
10
15
20
25
28-ott-14 02-nov-14 07-nov-14 12-nov-14 17-nov-14 22-nov-14
°BRIX
°BRIX
57
Grafico 4.15 Grafico dell’andamento degli zuccheri valutati in concentrazione di glucosio
e fruttosio e dell’alcool
Grafico 4.16 Grafico dell’andamento dei parametri del colore R, G e B
In data 30 Gennaio 2015 sono state svolte le analisi sul vino in fase di affinamento.
È opportuno ricordare che i vini oggetto di studio hanno subito alcuni trattamenti di
cantina durante il processo di vinificazione. Il Bonarda in purezza è stato svinato dopo
un mese dalla vendemmia: le bucce e i vinaccioli sono stati allontanati, ponendo fine al
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
28-ott-14 07-nov-14 17-nov-14 27-nov-14 07-dic-14 17-dic-14
Glucosio/Fruttosio (g/l)
Alcool
0
50
100
150
200
250
28-ott-14 07-nov-14 17-nov-14 27-nov-14 07-dic-14 17-dic-14
Co
lore
Campionamento
B
R
G
58
processo di macerazione. Entrambi i vini, il Bonarda in purezza e il Bonarda da
microvinificazione, sono stati trasferiti in vasche pulite al termine della fermentazione,
dove sono stati solfitati. Con solfitazione s’intende l’aggiunta di diossido di zolfo al
vino. Il diossido di zolfo presenta diverse proprietà:
- È un antisettico: inibisce lo sviluppo dei microrganismi;
- È un antiossidante;
- È un antiossidasico: inibisce istantaneamente l’azione degli enzimi ossidasici
(tirosinasi, laccasi);
- Combina l’etanale e altri composti simili, protegge l’aroma dei vini ed elimina
la nota di svanito [9].
La quantità di SO2 da impiegare nei vini ha da sempre sollevato numerose questioni:
occorre evitare dosi eccessive sia per motivi igienici, sia per prevenire alterazioni
indesiderate sull’aroma del vino. La legislazione dell’UE ha perciò progressivamente
ridotto le dosi limite fino ad arrivare a 160 mg/l per i vini rossi e a 210 mg/l per quelli
bianchi [9].
I risultati di queste analisi conclusive sono riportati nel Capitolo 5.
59
5. CONCLUSIONI
60
5.1 Conclusioni
Lo studio ha permesso di seguire le varie fasi del processo di vinificazione di un vino
Bonarda dell’Oltrepò Pavese in purezza, dal campo fino al raggiungimento del
prodotto finito, e di un vino Bonarda da microvinificazione ottenuto dalla stessa uva.
Controllo prevendemmiale
L’analisi prevendemmiale, effettuata nel mese precedente la vendemmia, ha permesso
di individuare i cambiamenti verificatesi nell’uva dall’invaiatura fino al momento della
maturazione. I cambiamenti principali sono stati: la composizione microbica dei
grappoli, con un aumento sempre maggiore del numero di lieviti, rispetto a quello delle
muffe, durante il progredire della maturazione; il cospicuo aumento del contenuto
zuccherino e la diminuzione dell’acidità totale in acido tartarico. Si è, inoltre, potuto
notare una diminuzione della concentrazione di rame, espressa in ppm, presente sui
grappoli d’uva, fino a raggiungere concentrazioni trascurabili al momento della
vendemmia.
Controllo microbiologico
I controlli microbiologici hanno permesso di seguire la fermentazione spontanea del
mosto, ottenuto dall’uva Croatina in purezza, per opera dei lieviti autoctoni,
naturalmente presenti sui grappoli d’uva al momento della raccolta. Tali lieviti sono
stati isolati, a costituire una libreria, e mantenuti a -80°C; e tra questi è stato scelto, in
seguito ad analisi di biologia molecolare, un ceppo di S. cerevisiae da utilizzare come
starter per una prova di microvinificazione. L’analisi microbiologica ha dimostrato
come sia la fermentazione spontanea, sia la fermentazione indotta, abbiano avuto esito
positivo, portando alla produzione di due vini finiti. La scelta del ceppo starter si è
quindi rivelata particolarmente felice, in quanto esso è stato in grado di portare a
termine la fermentazione, dimostrando di avere un elevato potere fermentativo e
un’elevata resistenza all’etanolo. Le fermentazioni hanno avuto una durata simile, di
circa quaranta giorni, con una cinetica di fermentazione che ha dimostrato la presenza
di un picco di cellule di lievito maggiore nella fermentazione spontanea, con 1,57 x 107
UFC/ml, rispetto alla fermentazione indotta (3,7 x 106 UFC/ml).
61
Controllo chimico
Il monitoraggio chimico durante il processo fermentativo del mosto d’uva ha permesso
di controllare l’intero processo di vinificazione, rendendolo un processo tracciabile in
ogni sua parte. Si è trattato di uno studio di particolare importanza perché,
verosimilmente, i due vini sono derivati da uve analoghe. Sono stati, infatti, ricavati a
partire da un’uva di qualità Croatina in purezza, proveniente dallo stesso vigneto e
raccolta da filari vicini a pochi giorni di distanza. I fattori di diversità sono stati:
- La presenza nel Bonarda in purezza di più ceppi di lievito autoctoni. Il
Bonarda da microvinificazione contiene, invece, solamente un ceppo di S.
cerevisiae autoctono, la cui unica presenza è stata dimostrata da analisi di
biologia molecolare;
- La presenza di bucce e vinaccioli nel Bonarda in purezza, che hanno portato
ad un vino ottenuto con processo di macerazione, mentre il Bonarda da
microvinificazione non ha avuto alcun processo di macerazione. Il processo di
macerazione ha come conseguenza la presenza nel vino di composti ad attività
nutraceutica quali polifenoli, antocianine e tannini;
- La quantità di mosto sottoposta a vinificazione: circa 1 hl per il Bonarda in
purezza e 10 l per il Bonarda da microvinificazione.
Le cinetiche di vinificazione dei principali parametri chimici analizzati hanno
permesso di valutare che i vini hanno seguito percorsi di vinificazione simili nel caso
del contenuto zuccherino, del TAV e della densità del distillato. Le differenze ritrovate
riguardano una minore acidità totale e il conseguente aumento di pH nel Bonarda da
microvinificazione, dovuti allo sviluppo della fermentazione malolattica; e una
maggiore densità del vino nel Bonarda in purezza, dovuta alla presenza di composti
estratti durante il processo di macerazione, di cui il Bonarda da microvinificazione è
privo. Le differenze tra i vini oggetto di studio sono derivate principalmente dai diversi
trattamenti di cantina a cui sono stati sottoposti piuttosto che dalle diverse
fermentazioni impiegate.
Il colore
Il controllo costante delle componenti del colore nei due vini oggetto di studio ha
messo in luce l’importanza del processo di macerazione sul colore finale del vino e ha
62
dimostrato come la fermentazione malolattica incida, oltre che su differenti
caratteristiche organolettiche, anche nel diminuire l’intensità finale del colore. Si è
notato che nel Bonarda in purezza, sottoposto a processo di macerazione, le
componenti G e B scompaiono fin dall’inizio del processo fermentativo, mentre nel
Bonarda da microvinificazione, non macerato, sono presenti tutte e tre le componenti
del colore (R, G e B) per tutto il processo fermentativo e anche nel vino finito.
Schede tecniche
Di seguito sono riportate, in Tabella 5.1, le schede tecniche dei vini Bonarda in
purezza e Bonarda da microvinificazione. I dati riportati si riferiscono alle analisi
conclusive svolte sul vino in fase di affinamento, in data 30 Gennaio 2015, e di cui è
possibile vedere i rapporti di prova riportati in allegato.
Bonarda in purezza Bonarda da
microvinificazione
pH 3,38 3,41
Acidità tot. in acido
tartarico (g/l) 7,34 5,98
Glucosio/Fruttosio (g/l) 1,12 0,31
Acido L-Lattico (g/l) 0,25 1,12
Solforosa libera (mg/l) 74,67 2,53
Solforosa totale (mg/l) 107,83 52,94
Acido acetico (g/l) 0,48 0,69
TAV 13,67 13,22
Densità Distillato 0,98220 0,98270
Densità Vino D°20 0,99350 0,99055
A420nm 4,8191 2,2075
A520nm 8,9723 1,4216
A620nm 1,5273 0,6624
R 71 132
G 0 63
B 0 15
Tabella 5.1 Schede tecniche dei vini Bonarda in purezza e Bonarda da microvinificazione
63
Dall’analisi delle schede tecniche dei due vini è possibile individuarne le analogie e le
differenze a prodotto finito.
Una prima differenza è dovuta alla fermentazione malolattica, che si è verificata nel
vino Bonarda da microvinificazione, e ha portato come conseguenza una diminuzione
dell’acidità totale e un conseguente aumento del pH, come si può vedere dal grafico
seguente:
Grafico 5.1 Confronto dei valori di pH, acidità totale in acido tartarico e acido L-lattico
nei vini oggetto di studio
I vini risultano avere delle analogie per quanto riguarda la concentrazione finale di
zuccheri (espressa come concentrazione in g/l di glucosio e fruttosio), il TAV e la
densità del distillato, mentre la densità del vino, valutata a una temperatura di 20°C,
risulta più elevata nel Bonarda in purezza. Questo è dovuto alla presenza dei prodotti
derivati dalle bucce e dai vinaccioli durante la macerazione. Le analogie dimostrano,
invece, che i due diversi tipi di fermentazione impiegati, spontanea e indotta, non
hanno avuto grandi ripercussioni sulle caratteristiche finali del vino e possono essere
apprezzate nel grafico seguente:
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Bonarda in purezza
Bonarda da microvinificazione
pH
Acidità Tot. in Acido Tartarico (g/l)
Acido L-Lattico (g/l)
64
Grafico 5.1 Valore zuccherino, TAV e densità del distillato e del vino rilevati nei vini in
fase di affinamento
Per quanto riguarda i dati relativi al colore (visibili in allegato), è stato possibile
rilevare delle differenze: il Bonarda in purezza contiene unicamente la componente
rossa, mentre il Bonarda da microvinificazione contiene tutte e tre le componenti del
colore (rosso, verde e blu). Il primo vino risulta quindi di colore rosso, mentre il
secondo assume una colorazione mattonata. Tali differenze sono dovute
principalmente al processo di macerazione al quale è stato sottoposto il vino Bonarda
in purezza. L’assenza del processo di macerazione nel vino Bonarda da
microvinificazione sarà interessante nei futuri studi riguardanti i composti ad attività
nutraceutica presenti o meno nei due vini, in quanto saranno valutati i contributi che la
buccia dà alla composizione finale del vino per quanto riguarda la presenza di
polifenoli, antocianine e tannini.
0
2
4
6
8
10
12
14
B. in Purezza
B. da Micro
Glucosio/Fruttosio (g/l)
TAV
0,976
0,978
0,98
0,982
0,984
0,986
0,988
0,99
0,992
0,994
B. in Purezza
B. da Micro
Densità Distillato
Densità Vino D°20
65
Grafico 5.3 Valori di assorbanza A420nm, A520nm, A620nm e di R, G e B nei due vini
Un’ultima differenza rilevata riguarda l’acidità volatile, valutata come contenuto di
acido acetico espresso in g/l, e la solforosa libera e totale, espresse in mg/l, rilevate nei
due vini. In questo caso, la principale causa è da ritrovare nei trattamenti di cantina a
cui i vini sono stati sottoposti e alle differenti quantità di mosto sottoposte a
vinificazione. La presenza di una concentrazione maggiore di acido acetico nel vino
Bonarda da microvinificazione può essere anche una conseguenza della fermentazione
malolattica. Infatti, alcuni batteri acido lattici possono metabolizzare gli zuccheri esosi,
se presenti in quantità ancora elevate nel mosto, a produrre, oltre che etanolo e CO2,
acido acetico. Il seguente grafico permette di visualizzare queste differenze:
0
20
40
60
80
100
120
140
A420nm A520nm A620nm B R G
Bonarda in purezza
Bonarda da microvinificazione
66
Grafico 5.4 Valori di solforosa libera e totale e acidità volatile
5.2 Prospettive future
I vini oggetto di studio, Bonarda in purezza e Bonarda da microvinificazione, saranno
sottoposti in futuro a ulteriori analisi. Questi vini sono stati, infatti, prodotti per lavori
futuri volti a valutare la presenza dei composti ad attività nutraceutica, analizzando il
contributo effettivo della macerazione sui metaboliti con una valenza salutistica
presenti nel vino. In particolare, saranno analizzati in LC-MS, per valutare gli aromi
non volatili, e in GC-MS, per valutare gli aromi volatili presenti.
Inoltre, sarà effettuata un’analisi organolettica per valutarne la gradevolezza.
0
20
40
60
80
100
120
Solforosa libera (mg/l)
Solforosa totale (mg/l)
Bonarda in purezza
Bonarda da microvinificazione
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Bonarda in purezza Bonarda da microvinificazione
Acido Acetico (g/l)
67
6. BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA
1) Distretto agroalimentare di qualità del vino dell’Oltrepò Pavese – Bonarda e Pinot
dell’Oltrepò.
http://www.google.it/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=4&ved=0CDEQFj
AD&url=http%3A%2F%2Fwww.pavia.coldiretti.it%2FRenderImg.aspx%3FCI%3D43
069167&ei=jNm7VIuIG4G9ULqpgZAG&usg=AFQjCNHQGt38a8sbkVWcJNIQFtI5
8yj0RA
2) Luciamo M., Storia di un territorio rurale – Vigne e vini nell’Oltrepò Pavese –
Ambiente, società, economia. FrancoAngeli. 2010
3) http://oltrepòpavese.com/op-in-cifre
4) Pecile M., Zavaglia C., Ciardi A., Croatina. catalogoviti.politicheagricole.it.
5) Barata A., Malfeito-Ferreira M., Loureiro V., The microbial ecology of wine grape
berries. International Journal of Food Microbiology. 2012, 153: 243-259
6) Martins G., Miot-Sertier C., Lauga B., Claisse O., Lonvaud-Funel A., Soulas G.,
Masneuf-Pomarède I., Grape berry bacterial microbiota: Impact of the ripening
process and the farming system. International Journal of Food Microbiology. 2012,
158: 93-100
7) Moreno-Arribas M. V., Polo M. C., Winemaking Biochemistry and Microbiology:
Current Knowledge and Future Trends. Food Science and Nutrition. 2006, 45: 265-
286
8) Renouf V., Claisse O., Lonvaud-Funel A., Inventory and monitoring of wine
microbial consortia. Appl Microbiol Biotechnol. 2007, 75: 149–164
68
9) Ribéreau-Gayon P., Dubourdieu D., Donèche B., Lonvaud A., Trattato di enologia I
– Microbiologia del vino Vinificazioni. Edagricole. 2005
10) Xufre A., Albergaria H., Gìrio F., Spencer-Martins I., Use of interdelta
polymorphisms of Saccharomyces cerevisiae strains to monitor population evolution
during wine fermentation. J Ind Microbiol Biotechnol. 2011, 38: 127-132
11) http://www.easyrgb.com/index.php?X=CALC
12) http://www.workwithcolor.com/color-converter-01.htm
13) COMPENDIUM OF INTERNATIONAL METHODS OF ANALYSIS – OIV:
http://www.oiv.int/oiv/info/itmethodesinternationalesvin
14) Querol A., Barrio E., Huerta T., Ramon D., Molecular Monitoring of Wine
Fermentations Conducted by Active Dry Yeast Strains. Applied and Environmental
Microbiology. 1992, 2948-2953
69
ALLEGATI
10.00
10.20
10.40
10.60
10.80
11.00
11.20
11.40
11.60
11.80
12.00
12.20
12.40
12.60
12.80
13.00
13.20
13.40
13.60
13.80
14.00
14.20
14.40
14.60
14.80
15.00
15.20
15.40
15.60
15.80
16.00
16.20
16.40
16.60
16.80
17.00
17.20
40.05
40.85
41.70
42.50
43.35
44.20
45.00
45.85
46.70
47.55
48.35
49.20
50.05
50.90
51.75
52.60
53.45
54.30
55.15
56.00
56.85
57.70
58.55
59.40
60.25
61.10
62.00
62.85
63.70
64.55
65.40
66.30
67.15
68.00
68.90
69.75
70.65
5.60
5.75
5.85
5.95
6.05
6.20
6.30
6.40
6.50
6.60
6.75
6.85
6.95
7.05
7.20
7.30
7.40
7.50
7.65
7.75
7.85
7.95
8.10
8.20
8.30
8.40
8.55
8.65
8.75
8.85
9.00
9.10
9.20
9.30
9.40
9.55
9.65
8.60
8.75
8.95
9.10
9.30
9.45
9.65
9.80
10.00
10.15
10.30
10.50
10.65
10.85
11.00
11.20
11.35
11.50
11.70
11.85
12.05
12.25
12.40
12.55
12.75
12.90
13.10
13.25
13.45
13.65
13.80
13.95
14.15
14.30
14.50
14.65
14.80
4,80
4.95
5.10
5.20
5.30
5.45
5.60
5.70
5.85
6.00
6.10
6.20
6.35
6.50
6.60
6.70
6.90
7.00
7.10
7.20
7.35
7.50
7.60
7.75
7.90
8.00
8.15
8.30
8.40
8.50
8.65
8.80
8.90
9.05
9.20
9.30
9.45
TABELLA DI COMPARAZIONE S.I.M. - JAULMES - ICUMSA
BRIX OECHSLEd 20/20
BAUME' BABO ALCOOLPROBABILE
enotre
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TABELLE DI COMPARAZIONE
DEI VALORI RIFRATTOMETRICI, DENSIMETRICI
ED ALCOOL PROBABILE NEI MOSTI D'UVA
GRADO BRIXIl grado Brix corrisponde ai kg di saccarosio per 100 kg di soluzione.
OECHSLE' (Oe.)Corrisponde alle prime tre cifre decimali della densità relativa 15/15.Il grado Oechslè può essere riferito anche alla densità 20/20 con opportuna correzione.
Correzioni da apportare alla lettura al rifrattometro eseguita a temperature diverse da 20° C.
8° C
10° C
12° C
14° C
16° C
18° C
20° C
0,60
0,60
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
22° C
24° C
26° C
28° C
30° C
32° C
34° C
0,10
0,20
0,40
0,60
0,70
0,90
1,10
TOGLIERE AGGIUNGERE
temp. temp. correzionecorrezione
Correzioni da apportare al grado Oechslè dei mosti letto a temperature diverse da 15° C
6° C
8° C
10° C
12° C
14° C
15° C
2,20
1,80
1,40
0,80
0,30
0,00
16° C
18° C
20° C
22° C
24° C
26° C
28° C
30° C
32° C
34° C
0,30
0,80
1,40
2,10
2,80
3,50
4,20
4,90
5,70
6,50
TOGLIERE AGGIUNGERE
temp. temp. correzionecorrezione
La correzione viene applicata al valore del grado zuccherino.
17.40
17.60
17.80
18.00
18.20
18.40
18.60
18.80
19.00
19.20
19.40
19.60
19.80
20.00
20.20
20.40
20.60
20.80
21.00
21.20
21.40
21.60
21.80
22.00
22.20
22.40
22.60
22.80
23.00
23.20
23.40
23.60
23.80
24.00
24.20
24.40
24.60
24.80
25.00
25.20
25.40
25.60
25.80
26.00
26.20
26.40
26.60
26.80
27.00
27.20
27.40
27.60
27.80
28.00
9.60
9.70
9.85
10.00
10.10
10.25
10.40
10,50
10.65
10.80
10.90
11.05
11.20
11.30
11.45
11.60
11.70
11.85
12.00
12.10
12.25
12.40
12.50
12.65
12.80
12.90
13.05
13.20
13.35
13.50
13.60
13.75
13.90
14.00
14.15
14.30
14.45
14.60
14.70
14.85
15.00
15.10
15.25
15.40
15.50
15.65
15.80
15.95
16.10
16.20
16.35
16.50
16.60
16.75
15.00
15.15
15.30
15.50
15.70
15.85
16.05
16.20
16,40
16.55
16.70
16.90
17.05
17.25
17.40
17.60
17.75
17.90
18.10
18.25
18.45
18.60
18.80
18.95
19.10
19.30
19.45
19.65
19.80
20.00
20.15
20.35
20.50
20.70
20.85
21.00
21.20
21.40
21.55
21.70
21.90
22.05
22.25
22.40
22.60
22.75
22.95
23.10
23.25
23.45
23.60
23.80
23.95
24.15
71.50
72.40
73.25
74.15
75.00
75.90
76.75
77,65
78.55
79.40
80.30
81.20
82.10
82.95
83.85
84.75
85.65
86.55
87.45
88.35
89.25
90.15
91.05
91.95
92.85
93.75
94.65
95.55
96.45
97.40
98.30
99.20
100.10
101.05
101.95
102.85
103.80
104.70
105.65
106.55
107.50
108.40
109.35
110.25
111.20
112.15
113.05
114.00
114.95
115.85
116.80
117.75
118.70
119.65
9.75
9.90
10.00
10.10
10.20
10.35
10.45
10,55
10.65
10.75
10.90
11.00
11.10
11.20
11.35
11.45
11.55
11.65
11.80
11.90
12.00
12.10
12.20
12.35
12.45
12.55
12.65
12.80
12.90
13.00
13.15
13.25
13.35
13.45
13.55
13.70
13.80
13.90
14.00
14.10
14.25
14.35
14.45
14.60
14.70
14.80
14.90
15.00
15.15
15.25
15.35
15.45
15.60
15.70
TABELLA DI COMPARAZIONE S.I.M. - JAULMES - ICUMSA
BRIX OECHSLEd 20/20
BAUME' BABO ALCOOLPROBABILE
AEROMETRO BAUME'La scala comprende valori da 0 a 66. Lo zero corrisponde a d15/15 = 1 e il 66 a d15/15 = 1,8427 quella del acido solforico puro.
Correzioni da apportare al grado Baumè dei mosti letto a temperature diverse da 15° C
6° C
8° C
10° C
12° C
14° C
15° C
0,30
0,30
0,20
0,10
0,00
0,00
16° C
18° C
20° C
22° C
24° C
26° C
28° C
30° C
32° C
34° C
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,50
0,60
0,70
0,80
TOGLIERE AGGIUNGERE
temp. temp. correzionecorrezione
MOSTIMETRO BABO DI KLOSTERNEUBURGRicavato dal saccarometro Brix o Balling, dopo aver tenuto in conto le sostanze estrattive del mosto, esprime la percentuale in peso (% p/p) di zucchero, praticamente i kg di zucchero contenuti in 100 kg di mosto.
Correzioni da apportare al grado Babo dei mosti letto a temperature diverse da 15° C
6° C
8° C
10° C
12° C
14° C
15° C
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0,00
16° C
18° C
20° C
22° C
24° C
26° C
28° C
30° C
32° C
34° C
0,00
0,10
0,20
0,40
0,50
0,60
0,70
0,90
1,00
1,10
TOGLIERE AGGIUNGERE
temp. temp. correzionecorrezione
Correzioni da apportare al grado Babo dei mosti letto a temperature diverse da 17,5° C
6° C
8° C
10° C
12° C
14° C
15° C
16° C
17° C
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
18° C
20° C
22° C
24° C
26° C
28° C
30° C
32° C
34° C
0,00
0,10
0,20
0,40
0,50
0,60
0,70
0,90
1,00
TOGLIERE AGGIUNGERE
temp. temp. correzionecorrezione
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