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DETERMINACION DE BACILLUS CEREUS EN AVENA
Técnica de Recuento en Placa
INTRODUCCIÓN:
BAM: Manual Analítico Bacteriológico de la FDA (Agencia de alimentos y medicamentos)La técnica a seguir para la determinación de Bacillus Cereus es la de Recuento en placa que se encuentra en la 8va Edición del BAM de acuerdo al Método de sedimentación en agar.
EQUIPOS Y MATERIALES
Placas de Petri (15 x 100 mm)
MicroscopioBastidor de tubos
Tubos de ensayoPipetas 1 ml
estériles
Asas de siembra
Matraces Erlenmeyer
Estufa Vortex mezcladorIncubadora
(30 ± 2 ° C y 35 ± 2 ° C)
Contador de colonias Quemador BunsenHomogeneizador
Autoclave
MEDIO DE CULTIVOAgar manitol yema de huevo con polimixina( Mannitol - Egg – Yolk –Polymyxine AGAR: MYP)
Emulsión estéril de yema de huevo
COMPOSICION
CONCENTRACION DEL MEDIO
Peptona
10g/L
Extracto de carne 1g/L
D-manitol
10g/L
Cloruro sódico
10g/L
Rojo fenol
0,025g/L
Agar
15g/L
1 vial de Polimixina B
Preparación del Agar MYP
Pesar 21,5 g de Agar MYP
Agitar hasta ebullición
Disolver el Agar con 450ml de agua destilada
1 2
4
Calentar el agar
3
Distribuir la mezcla en un matraz y taponear con algodón
5 6
Esterilizar en autoclave a 121 ºC (15 psi) por 15 min
Agregar 50 ml de la emulsión estéril de yema de huevo y el contenido de 1 vial de Polimixina B
Verter 15 – 20ml en placas estériles y dejar solidificar
Enfriar a 45 – 50ºC en una cubeta
Almacenar las placas en bolsas de plástico a 2-8ºC
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Preparación del diluyente buffer fosfato Butterfield( solución stock BPW)
1. Disolver 34 g de KH2PO4 en 500 mL de agua destilada
2. Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1N3. Llevar al volumen de 1 L con agua destilada
4. Esterilizar por 15 minutos a 121°C
5. Almacenar en refrigeración
6. Tomar 1.25 mL de esta solución y llevar a 1 litro con agua destilada
PREPARACION DE LA MUESTRA
10 g de avena en 90 ml de buffer fosfato de Butterfield (dilución 1/10)
Homogeneizar diluyente por 2 min a 2500 rpm
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Realizar diluciones sucesivas tomando 1 ml de la dilución 1/10 y descargándolo en un tubo que contenga 9 ml de diluyente, hasta la dilución 10 - 6
3
Mezclar cada dilución en agitador
TÉCNICA DE RECUENTO EN PLACA
Sembrar 0,1 ml de cada dilución por duplicado en la superficie de
placas de agar MYP
1
Incubar a 30°C por 24 h
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3
Diseminar el inoculo con una asa formando estrías
Formación de colonias rosadas rodeadas de una zona de precipitación (producción de lecitinasa)
Seleccionar las placas que contienen entre 15 - 150 colonias típicas rosadas con producción de lecitinasa
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5
Picar 5 ó más de las colonias típicas aisladas y transferir a una estría de agar nutritivo para confirmación. Incubar 30 °C por 24h
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EJEMPLO Teniendo en cuenta que debes seleccionar las placas que contienes entre 15 – 150 colonias .Supongamos:
En la dilución 10-4 se encontraron placas de 100 y 80 colonias, las cuales están en el rango. Luego se hace un promedio entre las colonias de ambas placas obteniendo como resultado 90 colonias.
UFC/alicuota = 90 UFC/ 0.1mL = 900 UFC/ mL UFC*(inversa del factor de dilución) = 900 * 104 = 9*106 UFC/mL de la muestra
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