Variabilité génétique de Plasmodium: implications pour le développement de vaccins et le...

Variabilité génétique de Plasmodium: implications pour le développement de

vaccins et le diagnostique

Physiopathologie, Immunologie et Génétique

25/ 3/2011

Moya Alvarez Violeta

Siribié Mohamadou

PlanPlan

I. Introduction

• Définitions: variabilité et polymorphisme génétique.

II. Polymorphismes génétiques de Plasmodium : implications pour le diagnostic

• Le Test de Diagnostique rapide: bases et limites.

• Caractéristiques et variabilité de HRP-2.

• Implications de la variabilité génétique de HRP2 pour le diagnostique d’infection par

Plasmodium falciparum.

III. Polymorphismes génétiques de Plasmodium : implications pour le

développement de vaccins

• Carte des antigènes parasitaires et implications pour le développement des vaccins.

• Polymorphismes génétiques et cibles des vaccins: CSP, MSP-1, 3 et Pfs25.

• Vaccins contre Plasmodium dans ses différents stades parasitaires.

• Perspectives sur le développement de vaccins.

IV. Conclusion

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PlanPlan

I. Introduction

• Définition: variabilité et polymorphisme génétique.

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• Polymorphisme: séquences d’ADN différentes au

sein du même allèle.

• Variabilité génétique: ensemble des versions

d’un gène résultant des différentes forces

évolutives:

I. DI. Dééfinitions et dfinitions et dééterminants de lterminants de l’é’évolution volution

ggéénnéétique tique

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mutation

migration

dérive

sélection

PlanPlan

II. Polymorphismes génétiques de Plasmodium : implications pour le diagnostic

• Le Test de Diagnostique rapide: bases et limites.

• Caractéristiques et variabilité de HRP-2.

• Implications de la variabilité génétique de HRP2 pour le diagnostique d’infection par

Plasmodium falciparum.

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IIII. Le Test de Diagnostic Rapide I. Le Test de Diagnostic Rapide I

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• Importance significative pour l’amélioration du diagnostic en

termes de santé publique.

• Dispositifs d'immunochromatographie à flux latéral.

• La plupart détectent

des protéines spécifiques de P. falciparum: PfHRP2, Pf-pLDH.

antigènes de P. falciparum et antigens pan-spécifiques: aldolase ou

pan-malaria pLDH.

• Performance du test diagnostic dépend de :

• Dégré de variation antigénique limité pour l’aldolase et la pLDH.

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IIII. Le Test de Diagnostic Rapide II. Le Test de Diagnostic Rapide II

HRP-2

IIII. Caract. Caractééristiques de HRPristiques de HRP--2 2

• HRP-2: Histidin Rich Protein 2.

• Spécifique de Plasmodium falciparum.

• Demi-vie de 10 jours.

• Exprimée lors des stades asexués.

• Variabilité des gènes qui la codifient

� variabilité protéique de HRP-2

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Problématique: en quelle mesure la variabilité de HRP-2 influence la détection de

Plasmodium falciparum avec les tests de diagnostic rapide?

IIII. Principes de l. Principes de l’’immunochromatographieimmunochromatographie de de

flux latflux latééralral

IIII. Variabilit. Variabilitéé de HRPde HRP--2 2

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• Au laboratoire, différences significatives entre les épitopes reconnus par les 4

différents anticorps présents dans les TDR et des anticorps « candidats » pour être

inclus dans les TDR.

���� Y-a-t-il des différences entre la séquence du gène codifiant pour le HRP-2?

IIII. Etude de la variabilit. Etude de la variabilitéé de HRPde HRP--22

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•Au laboratoire, 75 clones et isolats de Plasmodium falciparum de 19 pays différents

sont analysés.

•Amplification du gène codifiant pour la HRP-2 de Plasmodium falciparum par PCR.

•Les cultures de Plasmodium falciparum sont diluées dans du sang non-parasité ayant

un hématocrite de 40%.

•9 suspensions à des densités erythrocytaires croissantes 65-100000 cellules/ μl sont

analysées avec deux TDR standard.

•Analyse statistique des différentes séquences pour établir leur analogie.

•Modèle logistique de prédiction de la positivité du test à partir des séquences

retrouvées.

IIII. R. Réésultats de lsultats de l’é’étude de la variabilittude de la variabilitéé de HRPde HRP--22

• Sources de variation en HRP2:

� Différences dans la séquence des bases

� Différence dans le nombre de répétitions de paires de bases

� Délétion du gène dans 1 cas(absence).

• 56 séquences différentes, dont 43 uniques.

• 14 aminoacides différents

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Genetic Diversity of Plasmodium falciparum Histidine-Rich Protein 2 (PfHRP2) and Its

Effect on the Performance of PfHRP2-Based Rapid Diagnostic

IIII. Diff. Difféérentes srentes sééquences gquences géénnéétiques codifiant tiques codifiant

HRPHRP--22

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1

1

1

1 1

1

1

1

11

1

11

111

1

1

1: Séquences uniques retrouvées une seule fois.

Séquences retrouvées plus d’une fois. (Chaque couleur correspond à une

séquence différente).

• Certaines séquences retrouvées dans tous les gènes de HRP-2.

• A un risque α =5%,

Pas de différences significatives entre la séquence totale du gène en

fonction de l’aire géographique.

Différences significatives dans la répétition de certaines séquences.

IIII. Implications de la variation g. Implications de la variation géénnéétique pour tique pour

le TDRle TDR

• Tous les isolats cultivés in vitro sont détectés par les TDR à partir

d’une densité de 1000 érythrocytes/μl.

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IIII. Limites de l. Limites de l’é’étudetude

• Manque de terrain: étude réalisé à partir de clones et isolats de laboratoire.

• Choix arbitraire des échantillons.

• Choix arbitraire des antigènes.

� Manque de représentativité. Biais de sélection.

• Modèle prédictif non représentatif et absence d’analyse exploratoire.

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IIII. Perspectives pour une prochaine . Perspectives pour une prochaine éétude et tude et

applications sur les TDRapplications sur les TDR

• Réalisation de l’étude à partir de parasites de cas incidents.

• Etude randomisée, multicentrique en aveugle avec une couverture géographique maximale.

• Considérations éthiques.

• Possibilité de reconnaissance d’épitopes différents de la part de l’anticorps « de reconnaissance » et de l’anticorps « de signalement » ou application d’autres anticorps.

• Etude sur la « prospection évolutive » des mutations.

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Variabilité génétique de Plasmodium 16

• Besoin de réalisation d’une étude qui parte des conditions

réelles avant de tirer des conclusions sur l’effet de la

variabilité génétique de HRP-2 sur la sensibilité des TDR.

Jusqu’à présent, aucune étude n’a fait preuve d’un vrai

impact sur le terrain.

PlanPlan

III. Polymorphismes génétiques de Plasmodium : implications pour le développement

de vaccins

• Carte des antigènes parasitaires

• Polymorphismes génétiques: CSP, MSP-1 et Pfs25.

• Implication pour le développement Vaccins contre Plasmodium

• Perspectives - solutions

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Figure 1: Carte des antigènes parasitaires représentant une cible

Polymorphisme gPolymorphisme géénnéétique du gtique du gèène CSP ne CSP

(1)(1)

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� CSP: localisée sur la surface du sporozoïte mature

� Locus polymorphe localisé sur le chromosome 3 des

parasites plasmodiaux gène

Figure 2: Organisation du gène codant la protéine circumsporozoïtaire

(CSP) de Plasmodium.

Polymorphisme gPolymorphisme géénnéétique du gtique du gèène CSP (2)ne CSP (2)

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Tableau I: Diversité nucléotidique au niveau de l’épitope Th2R du gène CSP dans

différentes localisations géographiques

(A A Escalante et al. 2002)

Localités n Th2R

µ Nhap Hapdiv

Kenya 51 0.09772(0.00525) 29 0.966

Gambie 17 0.08789(0.01110) 11 0.912

Sénégal 11 0.07446(0.01010) 7 0.909

Caméroun 9 0.07143(0.00875) 7 0.944

Brésil 9 0.02646(0.01956) 2 0.222

Vénézuéla 10 0.08466(0.00739) 6 0.867

Inde 11 0.01840(0.00686) 4 0.491

Thailande 24 0.03990(0.00873) 6 0.598

Séquences Totales 174 0.07917(0.00323) 50 0.937

n = Nombre d'échantillons des séquences par localité µ = diversité nucléotidique

Nhap= Nombre d'haplotypes Hapdiv = diversité des haplotypes

Polymorphisme gPolymorphisme géénnéétique du gtique du gèène MSP 1 (1)ne MSP 1 (1)

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�Protéine est synthétisée sous forme d'un précurseur de

195 kDa présent sur le schizonte.

�Locus polymorphe localisé sur le chromosome 9

�Gène: 17 blocs comprenant 5 régions conservées + 5 semi-

conservées et 7 variables (Tanabe et al., 1987)

Figure 3 : Organisation du gène codant la protéine Pf MSP I.

SemiSemi--conservedconserved regionregion Variable Variable regionregion

Polymorphisme gPolymorphisme géénnéétique du gtique du gèène MSP 1 (2)ne MSP 1 (2)

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Tableau II: Fréquence des allèles du bloc 2 du gène MSP I selon les années dans des

souches péruviennes

Description allèle Nombre fréquence fréquence fréquence fréquence

1998-1999 2003-2005 2006

K1-126 67 0.4962 0.4898 0.5625 0.463

MAD20-144 49 0.363 0.4082 0.25 0.3889

K1-99 8 0.0593 0 0.1563 0.0556

K1-117 4 0.0296 0 0 0.0741

K1-117 5 0.037 0.0816 0 0.0185

MAD20-135 1 0.0074 0 0.0313 0

K1-81 1 0.0074 0.0204 0 0

K1 total allèle = 85 MAD20 total allèle = 50 (SM Chenet et al. 2008)

p-value testing year-study difference = 0,0167

Implication pour le dImplication pour le dééveloppement des veloppement des

vaccins(1)vaccins(1)

�Vaccins pré – érythrocytaires: contre sporozoïtes et

schizontes hépatiques.

� Exemples: Vaccins RTS,S/ASO2A (CSP+ AgS

Hb+ASO2A)

- réduit 34% risque de nouvelle infection sur 15

semaines chez les adultes (Bojang KA et al, 2001)

- Contre 45% de nouvelle infection, 30% accès

palustre et 57% formes graves chez les

enfants en Mozambique au cours des 6 1er

mois (Alonso PL et al, 2004) Phase IIb

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Implication pour le dImplication pour le dééveloppement des vaccins (2)veloppement des vaccins (2)

� En Gambie et au Mozambique: efficacité égale entre

groupes des vaccinés et des contrôles en fin de suivi.

� Hypothèse: une bonne partie de l’efficacité serait liée à

l’adjuvant plutôt qu’au CSP(G. Snounou et al. 2005)

� Limite: vaccin ne permettrait pas d’induire une immunité

long terme et on suggère que son effet s’attenue

rapidement avec le temps

� Explication possible: Une variation antigénique (JN

Waitumbi et al.2009).

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Implication pour le dImplication pour le dééveloppement des vaccins (3)veloppement des vaccins (3)

�Vaccins contre stades sanguins asexués: contre les

mérozoïtes.

� Vaccin recombinant B: RESA + MSP1 + MSP2 (allèle

3D7) + Adjuvant à base d’huile (B. Genton et al. 2001. Phase 1-

2b A phase 1–2b double-blind, randomized, placebo-controlled trial in 120

children (5–9 years old)).

� Prévalence faible de parasites portant la forme

allélique 3D7-MSP2 (correspondant à celle dans le

vaccin) et une incidence plus élevée des épisodes

morbides associés à des parasites FC27-type.

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Implication pour le dImplication pour le dééveloppement des vaccins (4)veloppement des vaccins (4)

� Limite: vaccin ne contenant qu’une seule version des allèles

naturellement exprimé par les parasites:

Protection contre les parasites portant cet allèle

+ sélection des parasites avec variant antigénique

FC27+ immunité réduite

� Explications: polymorphisme allélique des Ag

� Solution potentielle: rajouter l’allèle manquant dans le vaccin.

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Implication pour le dImplication pour le dééveloppement des vaccins (5)veloppement des vaccins (5)

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Figure 3: Courbe de survie de Kaplan-Meier comparant les épisodes positifs aux parasites de

types 3D7- and FC27 chez les sujets après le traitement avec le placebo ou le vaccin pré -

érythrocytaire recombinant.

Perspectives Perspectives -- SolutionsSolutions

� Recherche continue sur:

- polymorphisme génétique

- Nouveaux antigènes

� Vaccins à base des zones non polymorphes (Ex: 19kDa PfMPS1)

et/ou vaccins polyvalents avec variants alléliques

(Vaccins multivalents)

� Adjuvants puissants (pas trop réactogènes) pour

compenser la faible immunogénicité des Ag.

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PlanPlan

IV. Conclusion

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ConclusionConclusion

� Grande variabilité génétique de HRP-2, mais pas d’études sur

le terrain sur son influence dans les TDR.

� Polymorphisme génétique + variabilité antigénique =

difficultés difficulté de la mise au point des vaccins

� Espoir +++: poursuite de l’effort

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MISAOTRAMISAOTRA25/03/2011 Variabilité génétique de Plasmodium 31

BibliographieBibliographie

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