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ENZIME: RELATION
Ribulose 5 phosphate
Ribose 5 phosphate R5Pi
AHumans
BT. brucei
Atracttive drug tagger
ENZIME
Ribose 5 phosphate isomerase (Rpi) catalyzes the interconversion: ribulose 5 phosphate (Ru5P) ribose 5 phosphate (R5P).
Transformation from group aldose to ketose.
Transition to the non oxidative branch of the PPP
The reaction mechanism involves an initial opening of furanose ring of R5P, followed by the aldolase-ketose isomerization, via a cis-enediolate high energy intermediate.
Trypanosoma
Trypanosomatides protozoa.
Monophyletic group of unicellular protist parasites.
Different species infect vertebrates causing trypanosomiasis.
Trypanosoma
Transmitted by invertebrates such as biting insects, or penetrate the skin.
Complex life cycle.
Has a variety of different ways in the invertebrate host, and guests vertebrate cells take a form feature called trypomastigote
Trypanosoma brucei
Kingdom: Protist
Phylum: Euglenozoa
Class: Kinetoplastea
Order: Trypanosomatid
Genus: Trypanosome
Species: T. brucei
Trypanosoma brucei
Causes African trypanosomiasis (sleeping sickness)
Subspecies:
T. b. gambiense…chronic tripanosomiasis slow start.
T. b. rhodesiense,… tripanosomiasis quick start.T. b. brucei,… African (or nagana) animal
trypanosomiasis.
unusual features
• Only large mitochondria with mitochondrial DNA condensed structure, in association with the basal body of the flagellum, unusually constitutes the mechanism of cell cytoskeleton organization
• Unique and remarkable cover variant surface glycoprotein (VSG) in order to avoid the host immune system
Due to the large difference between these two hosts, the
cell undergoes complex changes to facilitate survival in the insect gut and blood of
mammals.
OBJECTIVE
Investigate the importance
of RpiB in T. brucei bloodstream
form viability and infectivity.
MATERIALES Y MÉTODOS
Declaración éticaInvestgación
IBMC.INEB
Parlamento europeo
Acreditación de la dirección veterinaria
portuguesa
CULTIVO
Cultivo Conjunto de técnicas
Mantenimiento, supervivencia, diferenciación, crecimiento y
función.
Preservando sus propiedades
Fisiológicas
Químicas
Genéticas
Med
io d
e cu
ltivo
Sustrato
Nutrientes
Condiciones abiótica
Mantenimiento, supervivencia,
diferenciación, crecimiento y función.
PCR
PC
R
Amplificación directa de un gen o fragmento de
DNA o indirecta de RNA
Enzimas
De 20-40 ciclos
Pasos: Desnaturalización, alineamiento y síntesis
Se obtuvieron los genes de R5Pi DNA genómico
Producto:
* Aislación
* Purificación
* Clonación
* Secuenciación
DNA Recombinante
Molécula de DNA artificial que proviene de la unión de DNA = origen.
Se emplea para la producción de proteínas.
Qué se necesita:
1. DNA donador
2. DNA receptor
3. Enzimas de restricción.
4. Ligasas
UNA VEZ OBTENIDO EL DNA RECOMBINANTESE INSERTA EN UNA BACTERIA PARA LA
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE
Ensayo enzimáticoEnsayo enzimático
Actividad, inhibición y cinética enzimática
Curva
La reacción de equilibrio
Rapidez de formación del producto o desaparición del sustrato
Hay 2 tipos
Continuos
Discontinuos
InmunofluoresenciaIn
mun
oflu
ores
enci
a
Técnica inmunoquímica con marcador de
fluorocromo
Utiliza reacción Ag-Ac
Puede ser de 2 tipos:
Directa
Indirecta
Permeabilización con Digitonina
Digitonina
Digitalis purpurea
Detergente
Ataca el colesterol
Permeabiliza las membranas
cells.
F. s
angr
e
Permeabilización
con Dig.
Acceder a contenidos
citoplasmáticos de las cells.
Sobrenadante se midió por W.B:
*Enolasa
*Aldolasa
*R5Pi
Transgénicos
También llamados OMG.Organismo vivo creado a partir de la
manipulación de sus genes.
MEJORAR CONDICIONES
Northern Blot
Reconocimiento de secuencias específicas de RNA
¿Cómo se realiza?
1.Aislar RNA
2.Electroforesis.
3.Fijación a medio sólido.
4. Hibridación.
5. Separación.
6. Autoradiográfia
RNA presente en la Forma sanguínea
Western Blot
Identificación de proteínas.
¿Cómo se hace?
1. Electroforesis (SDS/PAGE)
2. Transferencia al filtro con Ac.
3. Identificación de proteínas
Cuantificación proteínas
Parásitos en sangre
Proteína recombinante
DISCUSSIONAUTHOR CONCLUSION AGREE DISAGREE
Stern Al Et al
TbRpiB has the ability of using bothe R5P or Ru5P as subtrates, but with remarkable preference for Rub5P
.Jensen BC
Et alThe levels of TbRPIB mRNA in logarithic phase procyclic forms
compared to bloodstream forms are higher.
X.Colasante C
Et alMake a proteomic analysis that failed to
find TbRpiB enzime in purified glycosomes.
.Ong HB
Et al TbRpiB is not the fist protein reported
as dispensable under estandar laboratory culture condictions but crucial for parasities growth in tHe animal host.
.
.
CONCLUSIONS
Is very important Identify and know the metabolics pathways, its enzymes or obligatory steps to use as pharmacological targets.
To study the importance of an enzyme, we have to make a lot of techniques to identify its action, origin, cinetic profile, location, concentration and the mechanism of inhibition
In the study is corraborated use of RpiB as a drug target. Consider non only the possiblity of using it against African sleeping sickness, but tuberculosis, a real affliction of our enviroment.
The odds must be open to new investigations, searching for that drug target in multiple pathological agents.
BIBLIOGRAFÍA
Martinez Sanchez, Lina Maria. Biologia molecular.7.ed.Medellin: UPB. Fac.Medicina.
Castaño, María Eugenia. Cultivos celulares. Biogénesis, principios de la virología.
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