MICROTESTER - Gyakorlati alkalmazások

1

2

A MICROTESTER GYAKORLATI ALKALMAZÁSA

Dr. Szakmár KatalinBudapest, 2012. február 15.

3

Minőség ellenőrzés• Élelmiszerek• Víz• Felületek• Levegő

Mikroba-pusztulási és szaporodásgátlási vizsgálatok• Fertőtlenítőszerek hatékonyságának vizsgálata• Antibiotikumok szaporodásgátló hatásának vizsgálata• Tartósítószerek hatékonyságának vizsgálata

Fermentációs iparok• Táptalaj optimalizálás

Környezetvédelem• Baktériumok aktivitásának vizsgálata

A MICROTESTER ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI

4

Tejipari alkalmazások: • Nyerstej összcsíraszámának (mezofil aerob és fakultatív

anaerob baktériumszám) meghatározása• Nyerstej Enterobaktérium számának meghatározása

A kétféle meghatározás – redox görbék eltérő alakja miatt – egyszerre, egy táptalaj

alkalmazásával elvégezhető

MINŐSÉG-ELLENŐRZÉSÉLELMISZEREK

ENTEROBAKTÉRIUM ÉS ÖSSZCSÍRASZÁM EGYIDEJŰ MEGHATÁROZÁSA

Nyerstej, 1/2 TSB (T=30 °C)

-400-300-200-100

0100200300400500

0 5 10 15 20 25

t (h)

Eh

(m

V)

0. hig. 1. hig. 2. hig. 3. hig. 4. hig

5. hig 6. hig 7. hig.

ENTEROBAKTÉRIUM ÉS ÖSSZCSÍRASZÁM EGYIDEJŰ MEGHATÁROZÁSA

Nyerstej belső kalibrációs görbe(1/2 TSB, T=30 °C)

y = 2,6486x + 1,34

R2 = 0,9895

0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5 6 7

hígítás

TT

D (

h)

Összcsira Enterobacter

MPNEnterob.=2,3x102/ml

MPNÖsszcsíra=2,3x106/ml

MÓDSZEREK IDŐIGÉNYÉNEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA

MintaLemezöntés MicroTester

lgN Időigény (h) lg MPN Időigény (h)1. 5,18 5,36

2. 5,06 5,36

3. 4,93 72 4,36 184. 6,35 6,36

5. 6,79 6,36

8

Microtester Mini készülék alkalmazása:• A készülék a termelőhöz kihelyezhető• Kezelése viszonylag egyszerű• Az adatok a tejbegyűjtés időpontjában leolvashatók

NYERSTEJ VIZSGÁLATA KÖZVETLENÜL A TEJTERMELŐNÉL

MICROTESTER MINI KÉSZÜLÉK

10

A MÓDSZER IDŐIGÉNYE

Nyerstej összcsíra kalibrációs görbéje(1/2 TSB, 30 °C)

y = -1,5014x + 15,413

R2 = 0,9596

0

2

4

6

8

10

12

14

1 2 3 4 5 6 7 8 9

lgN /ml tej

TT

D (

h)

11

SALMONELLA KIMUTATÁSA

Salmonella, tej, sajt, RVS

y = -1.524x + 15.3

y = -1.400x + 12.4

y = -2.268x + 19.8

0

5

10

15

20

0 2 4 6 8 10

lgN (cfu/cell)

TT

D (

h)

sajt tej RVS

12

AZ RVS SZELEKTIVITÁSA

Mikroba RVSTTD (h)

RVS + 10% tejTTD (h)

TSBTTD (h)

Klebsiella oxytoca - - 6,5

Escherichia coli - - 1,6

Citrobacter freundii - - 2,5

Proteus vulgaris - - 14

13

KÜLÖNBÖZŐ SALMONELLÁKKALIBRÁCIÓS GÖRBÉI

Salmonella

y = -3.512x + 25.6

y = -4.604x + 35.8

y = -1.512x + 13.8

0

5

10

15

20

25

0 2 4 6 8

lgN (cfu/cella)

TT

D (

h)

Salmonella Tiphymurium Salmonella Enteritidis Salmonella Abony

• MicroTester készülékkel a Salmonellák RVS tápoldatban kimutathatók.

• Elődúsítás nem szükséges.• A zavaró mikroflóra az RVS-ben nem szaporodik.• Élelmiszerek (tej, sajt, stb.) a tápoldathoz adása a

kimutatási időt csökkenti, de a szelektivitást nem befolyásolja.

• A Salmonella jelenlétének igazolása a MicroTesterrel végzett mérés után, a gyanús mintákból PCR-al elvégezhető.

SALMONELLA KIMUTATÁSA

LISTERIÁK KIMUTATÁSA

Listeriák redox görbéi (1/2 Fraser, 37 °C)

-400

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

500

0 5 10 15 20 25

t (h)

Eh

(m

V)

L. monocytogenes L. innocua L. ivanovi

16

EGYESÍTETT KALIBRÁCIÓS GÖRBE 1/2 FRASERBEN TEJJEL ÉS TEJ NÉLKÜL

Listeria monocytogenes TTD = -4.218.lgN + 36.99

R2 = 0.9798

0

5

10

1520

25

30

35

0 1 2 3 4 5

lgN (cfu/cella)

TT

D (

h)

1/2 Fraser 1/2 Fraser, tejjel

• Fraser levesben a listeriák jelenléte a szokásos módszernél gyorsabban kimutatható.

• A táptalaj szelektivitását a hozzáadott élelmiszer (tej) nem befolyásolja.

• A tejben leggyakoribb zavaró mikroba, az E. coli a tápoldatban nem szaporodik.

• A Listeria monocytogenes jelenléte csak további vizsgálatokkal (PCR) igazolható.

LISTERIA MONOCYTOGENES KIMUTATÁSA

Húsipari alkalmazások: • Nyershús összcsíraszámának (mezofil aerob és

fakultatív anaerob baktériumszám) meghatározása• Húskészítmények gyártásközi mikrobiológiai

minőségellenőrzése

MINŐSÉGELLENŐRZÉSÉLELMISZEREK

19

NYERSHÚS ÖSSZCSÍRASZÁMA

Nyershús

y = -3.15x + 19.456

R2 = 0.965

y = -2.9427x + 20.293

R2 = 0.9897

y = -2.6833x + 20.498

R2 = 0.9633

y = -3.6081x + 26.46

R2 = 0.9851

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7

lgN (cfu/cella)

TT

D (

h)

marha sertés csirke darálthús

20

2073/2005 EK RENDELET ELŐÍRÁSAI

Élelmiszer kategória Mikrobák n c m M

Hasított szarvasmarha, juh, kecske, ló Aerob mikrobaszám lgN=3,5 lgN=5,0

Hasított sertés Aerob mikrobaszám lgN=4,0 lgN=5,0

Darált hús Aerob mikrobaszám 5 2 5x105 5x106

Mechanikusan lefejtett hús Aerob mikrobaszám 5 2 5x105 5x106

KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSA

Határértékek(2073/2005 EK) Kimutatási idők (h)

(N=cfu/g) Klasszikus MicrotesterlgN=3,5lgN=4,0 HúslgN=5 aerob mikrobaszámlgN=5,7lgN=6,7

72

10 9 6 5 2

HÚSKÉSZÍTMÉNYEK GYÁRTÁSKÖZI ELLENŐRZÉSE

Húspépy = -0,54x + 8,5

R2 = 0,9637

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10 12 14

TTD (h)

lgN

(cf

u/c

ella

)

HÚSKÉSZÍTMÉNYEK GYÁRTÁSKÖZI ELLENŐRZÉSE

Virsli gyártásközi vizsgálati eredményeinek összehasonlítása

0

2

4

6

8

10

1 2 3 4 5 6

Minatvételi pont

lgN

(c

fu/g

)

Lemezöntés Microtester

KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSA

Mikrobaszám Kimutatási idő (h)

(N=cfu/g) Lemezöntés Microtester

lgN=6,1lgN=7,6

lgN=6,8lgN=5,8lgN=7,6lgN=7,5

72

7 4 5 7 44

• Üdítőitalok penész- és élesztőgomba számának meghatározása:– Indirekt mérés (a szaporodás során képződő CO2-ot KOH

oldatban nyeletjük el és a KOH oldat redox-potenciál változását mérjük)

MINŐSÉGELLENŐRZÉSÜDÍTŐITALOK

INDIREKT MÉRŐCELLA

27

INDIREKT MÉRÉS REDOX-GÖRBÉI

Saccharomyces cerevisiae

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50

t (h)

Eh

(m

V)

lgN=4.1 lgN=3.1 lgN=2.1lgN=1.1 lgN=0.1 steril

28

PENÉSZ- ÉS ÉLESZTŐGOMBAKALIBRÁCIÓS GÖRBÉI

Aspergillus nigerTTD(h) = -7.569.lgN + 60.7

R2 = 0.9677

20

30

40

50

60

70

0 1 2 3 4 5

lgN (cfu/cella)

TTD

(h)

(detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min)

Saccharomyces cerevisiae(detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min) TTD(h) = -7.2048.lgN + 41.3

R2 = 0.9856

0

10

20

30

40

50

0 1 2 3 4 5

lgN (cfu/cella)

TT

D (

h)

• Ivóvíz mikrobiológiai szennyezettségének gyors kimutatása

• Ásványvíz mikrobiológiai gyártásközi minőségellenőrzése

• Kezelt víz (pl. ioncserélt víz, R.O. víz, stb.) gyors mikrobiológiai vizsgálata

• Fürdővizek mikrobiológiai állapotának gyors vizsgálata

• Szennyvizek gyors mikrobiológiai vizsgálata

MINŐSÉGELLENŐRZÉSVÍZ

KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSAVÍZ

Határértékek

Kimutatási idők (h)

Klasszikus módszer

Microtester

(1000 ml)

Összcsíra 22 oC (100 cfu/ml) 37 oC (20 cfu/ml) 72

22 (1 ml)10 (1 ml)

154

Coliform (1/100 ml)Escherichia coli (1/100 ml) 24

10 (100 ml)11 (100 ml)

910

Ps. aeruginosa (1/100 ml)Enterococcus (1/100 ml) 48

20 (100 ml)14 (100 ml)

1812

31

ÁSVÁNYVÍZ VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI

Mikroba Egy sejt kimutatásához szükséges vizsgálati idő (h)

Escherichia coli 11

Citrobacter freundii 23

Pseudomonas aeruginosa 24

Enterococcus faecalis 15

32

ÜZEMI ELLENŐRZŐ VIZSGÁLATOK 1.TYLICZ (TÉTELMINŐSÍTŐ VIZSGÁLAT)

Egy membránon 3 x 250 ml-t szűrtünk, egy mérőcellába 4 membránt tettünk (egy mérőcellában egyszerre 12 palack minőségét ellenőriztük)

Palackok sorszáma 1-12. 13-24. 25-36. 37-48. 49-60. 61-72.

Laboratóriumi mérés eredménye

negatív negatív negatív negatív negatív negatív

Microtester mérés eredménye negatív negatív negatív negatív negatív negatív

33

ÜZEMI ELLENŐRZŐ VIZSGÁLATOK 2.(Zalaszentgrót, Hoffmanné & Tar-Géri, 2008)

Vizsgált mikroba

Összes mérés (db)

Egyezés a szabványos

vizsgálattal (%)

Fals pozitív eredmény

(%)

Fals negatív eredmény

(%)

Escherichia coli 942 99,89 0,11 0,00

Coliform 4674 99,87 0,00 0,13

Enterococcus 3000 99,93 0,00 0,07

Pseudomonas aeruginosa 3372 99,82 0,06 0,12

TERMÉSZETES FÜRDŐVÍZ

Velencei tó (Agárd strand)

y = -0.8416x + 11.565

R2 = 0.9871y = -0.299x + 4.7342

R2 = 0.9917

-1

0

1

2

3

0 5 10 15 20

TTD (h)

lgN

(c

fu/1

00

ml)

Enterococcus E.coli

35

VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA

Escherichia coli (Agárd strand)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

1 2 3

minta sorszáma

lgN

(cf

u/1

00 m

l)

Microtester

Plate (Szfv.)

OKI

36

Enterococcus (Agárd strand)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

1 2 3

minta sorszáma

lgN

(cf

u/1

00 m

l)

Microtester

Plate (Szfv.)

OKI

VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA

37

• Szennyvíz (Coliform: 10 cfu/ml)– Nagyobb mennyiség (100, 1000 ml) szűrésével a vizsgálati

idő lerövidíthető

• Szennyvíziszap mikrobiológiai ellenőrzése

TOVÁBBI LEHETŐSÉGEK

38

MÉRŐCELLA KÉT MEMBRÁNNAL

39

SZENNYVÍZ MÉRÉSI EREDMÉNYEI

Szennyvíz, coliformy = -1,1554x + 9,7

R2 = 0,9788

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8

lgN

TT

D

• Felületek ellenőrzése (tamponos vizsgálattal)

• Levegő mikrobiológiai tisztaságának ellenőrzése (membránszűréssel)

MINŐSÉGELLENŐRZÉSHIGIÉNIAI VIZSGÁLATOK

41

TAMPONOS VIZSGÁLATKALIBRÁCIÓS GÖRBE FELVÉTELE

42

FELÜLETEK

Kalibrációs görbe felvétele

Kalibrációs görbe y = -0.2859x + 7.2672

R2 = 0.9574

0

1

2

3

4

5

6

0 5 10 15 20 25

TTD (h)

lgM

PN

/cel

la

43

MIKROBASZÁM MEGHATÁROZÁSA

44

FELÜLETEK

Mérési eredmények összehasonlítása

Felületek összcsíraszáma

01234567

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Mintavételi pont

lgN

(cf

u/1

00 c

m2 )

Lemezöntés Microtester

• Fertőtlenítőszerek• Antibiotikumok• Tartósítószerek• Egyéb mikrobaszaporodást gátló anyagok

MIKROBA-PUSZTULÁSI ÉS SZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLATOK

Antibiotikumok

MIKROBA-PUSZTULÁSI ÉS SZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLATOK

ANTIBIOTIKUMOK

Doxycyclin y = 0.6571x + 0.4263

R2 = 0.9711

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

C (mg/ml)

lgTT

D

Amoxicillin y = 0.1759x - 0.0754

R2 = 0.9949

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7

C (mg/ml)

lgT

TD

Enrofloxacin y = 48.348x + 0.2886

R2 = 0.9946

0.000.200.400.600.801.001.201.40

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025

C (mg/ml)

lgT

TD

• Talajba került vegyszerek talaj-mikroflóra aktivitását befolyásoló hatásának vizsgálata– Például antibiotikumok hatása különböző típusú talajok

mikrobiális aktivitására

KÖRNYEZETVÉDELEM – BAKTÉRIUMOK AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA

49

Doxycyclin, talajy = 8.8762x - 11.612

y = 6.5508x - 8.295

y = 4.4082x - 0.8414

y = 13.362x - 20.614

y = 2.0662x + 4.03590

5

10

15

20

25

2.0 2.5 3.0 3.5

lgc (mg/kg)

TT

D (

h)

T1 T2 T3 T4 T5

ANTIBIOTIKUM MIKROBA AKTIVITÁST CSÖKKENTŐ HATÁSA KÜLÖNBÖZŐ TALAJOKBAN

50

Talaj

AntibiotikumCo (mg/kg)

Doxycyclin Enrofloxacin LinkomycinT5

vulkanikus 9 57 15

T3 hordalék 18 - 57

T1 homok 52 35 19

T2 agyagos termőföld 70 47 41

T4 vályog 108 - 56

ANTIBIOTIKUMOK LEGKISEBB SZAPORODÁS-GÁTLÓ KONCENTRÁCIÓI

51

• Egyszerű mérési technika• Nem igényel speciális mérőcellákat• Nincs szükség szigorú hőmérséklet-szabályozásra

– 0,5 °C pontosságú laboratóriumi termosztátok alkalmasak– (Az impedimetriás technika 0,002 °C pontosságú szabályozást igényel)

• Nincs szükség speciális táptalajokra– Alkalmazhatóak a szabványos, illetve egyéb táptalajok– (Az impedimetriás technika speciális tápleveseket igényel)

A MICROTESTER ELŐNYEI 1.

52

• Nincs szükség a minta hígítására– 100-108 cfu/mérőcella tartományban a minta hígítás nélkül mérhető

• Alkalmas membránszűréssel koncentrált, illetve tamponos minták mikrobaszámának hígítás nélküli, közvetlen meghatározására– Egyetlen mérőcellába több membránszűrő is behelyezhető.– Egyetlen mérőcella eredménye akár több liter mintát reprezentálhat

• Ásványvizek tétel-minősítése• Vízügyi haváriák gyors kimutatása

• Direkt mérésnél eredmény általában néhány órán belül– Tenyésztéses vizsgálatok időigénye néhány nap

A MICROTESTER ELŐNYEI 2.

53

• Gyors és egyszerű módszer a szaporodás- és pusztulás-kinetikai, valamint táptalaj-optimalizálási vizsgálatokhoz

• A módszer kellően szelektív– Különös előnyt jelent, hogy a táptalaj szelektivitásán túl a redox-görbe

alakja is jellemző a szaporodó mikroba-csoportra.– Ezt a szelektivitást a PCR technikán kívül egyéb módszerek nem érik el

A MICROTESTER ELŐNYEI 3.

54

• A nagy mintamennyiségből kiinduló szelektív dúsítás révén a MicroTester kiválóan alkalmazható a PCR-technika elődúsító lépéseként– A célmikrobát tartalmazó mikrobacsoportra negatív mintát nem

érdemes PCR-ral tovább vizsgálni– A mikrobacsoportra pozitív dúsítás PCR-ral közvetlenül vizsgálható, a

mikrobaszám jelentősen meghaladja a 106/ml koncentrációt– Csak a pozitivitás esélyével bíró minták kerülnek PCR vizsgálatra, ami

jelentős megtakarítást eredményez• A minta-mennyiségre vonatkoztatott fajlagos vizsgálati

költség jelentősen alacsonyabb a tenyésztéses, valamint az impedimetriás gyorsmódszerek költségénél

A MICROTESTER ELŐNYEI 4.

55

Köszönöm a figyelmet!

szk@aquilanet.hu