گياهيي ها بيماري وآفات ١٣٩١ اسفند ،۲ شماره ،٨٠ جلد

درختان پرتقال تامسون ناول در شرق مازندران در يروس پسوروز مرکبات، عامل عارضه نقش حلقويو

۲، سيد وحيد علوي۱يفائزه فلک

۱و فرشاد رخشنده رو

ي، تهرانقات تهران، دانشگاه آزاد اسالميم و تحق، واحد علويعيو منابع طب ي، دانشکده کشاورزياهيگ يشناس يماريگروه ب -۱

يمازندران، سار يعيو منابع طب يقات کشاورزيمرکز تحق ،يپزشک اهيگ قاتيبخش تحق -۲ )١٣٩١ دی؛ تاريخ پذيرش: ۱۳۹۱ مرداد(تاريخ دريافت:

دهيچکدرختان يرو يا ر عارضهياخ هاي در سال. ستا جهان در مرکبات يزا خسارت هاي يماريباز يکيعامل )،CPVمرکبات ( پسوروز روسيو

يرو يحلقو هاي ا لکهيل نقوش ياز قب يجاد عالئميده که باعث ايترنج در شرق استان مازندران مشاهده گرديا سينارنج هاي هيتامسون ناول با پاد يزش شديگردد. درختان مبتال دچار ر میمسن يها برگ يبر رو يزرد رنگ گسترده و حلقو هاي وه بالغ، به خصوص در اطراف گلگاه، و لکهيمرفت. يه درختـان مبـتال صـورت پـذ بهـار هـاي از سرشاخه يفوق نمونه بردار يماريعامل ب يگردند. به منظور بررس می يوه از زمان رنگ اندازيم

روس پسوروز مرکبات در يد حضور وي، مو MA-13C5پادتن تک همسانه و با استفاده از مير مستقيغ يزايه با انجام االيک اوليسرولوژ هاي يبررس-ICRSV ،CRSV-4 ،CPV يها هيجدا اب مرتبط يجفت آغازگر اختصاص چهار ) باRT-PCRمراز معکوس(يپل يره ايواکنش زنج آلوده بود. هاي نمونه

RNA2 وCPV-CPG بـا فقـط يبررسـ مـورد يها نه. نموصورت گرفت اصله درخت پرتقال تامسون ناول يشده از س يجمع آور هاي برگ روی دسـت بـه ه قطعـ شد. طولر يتکث bp۲۱۸ ياختصاص قطعه کي وواکنش داده )CRSV-4( يحلقولکه روسيوه يا جداب مرتبط ياختصاص آغازگر

ه انتخاب شـده يهفت جدا بود. مشابه آمده، دست به جهانر مناطق يسا درپسوروز مرکبات روسيو يحلقولکه هاي هيجدا از که يا قطعه با آمدهج به دسـت آمـده و تشـابه يک شدند. با توجه به نتايتفک يکيولوژين محک به دو گروه بها ايگ يجاد شده روي، بر اساس عالئم ايساز نموده يبرا

ن يختلف، ام هاي روس پسوروز مرکبات گزارش شده از کشوريو يلکه حلقو هاي هير جدايمورد مطالعه با سا هاي هيجاد شده توسط جدايعالئم ا داد. يروس پسوروز مرکبات جايو Bپ يتوان در گروه بدون عالئم تنه ت میرا ها هيجدا .)CRSV( مرکبات يروس لکه حلقوي، وي، نموده سازOphiovirus، )CPVروس پسوروز مرکبات (يو ي كليدي:ها واژه

Citrus psorosis virus, Causal Agent of Ring Pattern Disorder in Thomson Navel Trees in East of Mazandaran

F. FALAKI1, S. V. ALAVI2 and F. RAKHSHANDEHROO1

1. Dep. of Plant Pathology, College of Agriculture and Natural Resources, Islamic Azad University, Tehran Science and Research Branch, Iran 2- Plant Protection Division, Mazandaran Agricultural and Natural Resources Research Center, Sari, Iran

Abstract

Citrus psorosis virus (CPV) is causal agent of one of the important citrus diseases in the world. A disorder was observed on Thomson Navel orange trees on sour orange or citrange rootstocks, with ring spot symptoms on mature fruits, especially around the stylar end. It had often caused expanded yellow ring lesions on mature leaves. Severe fruit abscission was occurred in the infected trees. Leaf samples were collected from spring flashes of the infected trees and tested by TAS-ELISA, using Citrus psorosis virus (CPV) 13C5 monoclonal antibody and CPV infections were confirmed. RT-PCR was done with four pair primers closely related to ICRSV, CRSV-4, CPV-RNA2 and CPV-CPG on leaves of thirty infected Thomson Navel orange trees. The samples only amplified by CRSV-4 primers and produced a fragment about 218bp. This fragment length size was similar to the fragment obtained from CPV ring spot isolates from Florida and Argentina. Seven isolates were selected for biological indexing and based on the indicator plants divided into two groups. Based on the serological, molecular and biological results, the isolates can be settled into Citrus psorosis virus, B type group, without bark scaling symptoms. Key words: Citrus psorosis virus (CPV), Ophiovirus, Ring spot isolates, Biological indexing.

Corresponding author: alavi_v@yahoo.com

١٦٢ ضه نقش حلقوي در درختان پرتقال تامسون ناول در شرق مازندرانويروس پسوروز مرکبات، عامل عارو همکاران: فلکی

مقدمهگـزارش ۱۸۹۶سال بيماري پسوروز مركبات اولين بار در

(Swingle and Webber, 1896) انتقــال آن از ۱۹۳۶و در ســالـ طر يهــا کـره ي. پ(Fawcett, 1936)د يـ ق پيونـد مشـخص گرد ي

ن عارضه توسط يدرختان مبتال به ا يبرگ يها در نمونه يويروسDerrick et al. (1988) مشاهده شـد. ايـن ويـروس گونـه تيـپ

عضـــو خـــانواده تنهـــاو ايـــن جـــنس Ophiovirusجـــنس Ophioviridae متعلق به اين جنس از نظـر يها است. تمام گونه

اي پيكره اين ويروس رشتهباشند. میشكل پيكره و ژنوم مشابه اسـت. nm۳بـا قطـر ييهـا پيچ خـورده بـه صـورت حلقـه و

ي هـا نانومتر و پيكره ۷۶۰تا ۶۹۰تر به طول ي كوچكها پيكرهاي آن تك رشـته RNA تر است. ژنوم برابر بلند ۴بزرگتر حدود

و ۱۶۴۴، ۸۱۸۴ يهـا بـا انـدازه يو سـه قسـمت يت منفيبا قطب به جرم حـدود يني). پروتئMilne, 2005( د استينوکلئوت ۱۴۵۴

kDa۴۸-۴۹ ـ يپوشـش پروتئ يبه عنوان واحـد سـاختمان در ين ).Derrick et al., 1988( ده استيشناسايي گرد CRSV-4ه يجدا

ي ها ه و در سلولاين ويروس محدود به آوند آبكشي نشدــن يپارانشــيم ــل يــگرد ييز شناســاي ده اســت. حــداقل دو عام

ـ با دو ت Bپسوروز و Aپسوروز يها به نام يروسيو پ عالئـم ي انـد پسـوروز مـرتبط دانسـته يمـار يرا بـا ب يدرختان باغ يرو)Danos, 1989; Frison and Taher, 1991ـ ). از جمله عالئم را ج ي

سته شدن فلس مانند تنه درخـت پوسته پو ، Aپ پسوروز يدر تگردد. میظاهر يسالگ ۱۵تا ۱۰است که معموالً در ها و شاخهبـوده، امـا يمسـن معمـوالً فاقـد عالئـم مشخصـ يها در برگ

ن يگردد. مهـم تـر میي جوان ظاهر ها در برگ يروشن يها رگهـ ذکـر گرد Bپسـوروز پ يت يکه برا يعالئم ده، ورقـه شـدن ي

باشـد کـه مـی و جدا شدن آن از چـوب پوست تنه يسرتاسرـ در تنه د يک شکاف طوليبه صورت يگاه شـود. در مـی ده يي مسـن هـا گسترده زرد رنگ در برگ يها ، لكهين درختانيچن

ـ به صورت پا ي هـا مواقـع لكـه يشـود و برخـ مـی دار ظـاهر يـ پد هـا ز روي ميوهيک نيا نکروتيحلقوي زرد دار شـده اسـت ي

)Klotz, 1973; Roistacher, 1991; Whiteside et al., 1989 .(

سـتان از نهالدر Bن آلوده به پسـوروز يريپرتقال ش يها وندکيپدر و انـد و مـرگ شـده يرشد باز مانده و دچار نکروز عمـوم

سه تا شش سال يز پس از انتقال به باغ و در طيموارد ن يبرخ ;Klotz, 1973; Roistacher, 1991( انـد افتـه يج زوال يبعد به تدر

Whiteside et al., 1989; Duran-Vila and Moreno, 2000.( در يئم ظاهر، بر اساس عالجهانبيشتر مناطق زير كشت مركبات

ياشاره شده، و در موارد محـدود يمارين بيا به احتمال وجود يسرولوژيكي و مولكولي آلودگ بيولوژيكي، يها با انجام آزمونــه و ــان ب ــدرخت ــت ي ــات ثاب اســتشــده روس پســوروز مرکب

)Fawcett and Bitancourt, 1943; Roistacher, 1991; Whiteside et al., 1989ن مطالعــات صــورت گرفتــه در يچــه اولــ ). اگــر

ک نمـوده اسـت، يتفک B و Aپ يخصوص پسوروز، آن را به تـ نشـان داده کـه جدا يبعـد يها ياما بررس از يمختلفـ يهـا هي

متفـاوت يوجود دارد که موجب بروز عالئم جهانپسوروز در ک يهر ياز چند عالئم ذکر شده برا يکي تنهاا ين دو نژاد ياز ا Fawcett and( اند دهيدرختان مرکبات گرد يرا رو ها ن نژادياز ا

Cochran, 1942; Wallace, 1957.(

ي زرد رنـگ و هـا جاد لكهيدر ا ها هيبعضي از جدا توانايي يو گاه ها پوست ميوه يرو يي مسن و گاهها حلقوي در برگ

تنه درختان مرکبـات، سـبب يرو يبدون ظهور عالئم مشخصبه عنوان لكه حلقوي مركبات تحت عنوان عامـل ها شد تا سال

;Wallace and Drake, 1968( شوندک بيماري جداگانه مطرح ي

Roistacher, 1993; Da Graça et al., 1991تفـاوت در ). با وجود يکي، تا کنون اختالفات سرولوژB و Aن دو نژاد ينوع عالئم ماب

Navas-Castillo( ذکر نشده اسـت ها ن آنيب يقيدق يا مولکولي

et al., 1991; Roistacher, 1993; Martín et al., 2005ان ي)، در سالـ تفک يبـرا يا تک همسـانه يها تناز پاد رياخ و هـا هيـ ک جدايروس ين ويا يها هيپ)جداي(سروت يکيسرولوژ يها ن گروهييتع

,.Djelouah et al., 2000; Roistacher et alاستفاده شـده اسـت (

2000; Alioto et al., 1999پسـوروز مرکبـات از يماري). عامل ب افتـه يانتقال ين علفها ايگ عصاره برگ آلوده به يزنه يق مايطر

).Alioto et al., 2001; Garnsey and Timmer, 1980( اســت

١٦٣ ۱۳۹۱، اسفند ۲، شماره ۸۰ي گياهي: جلد ها آفات و بيماري

ق نـوع يـ ن دقيـي انتقال طبيعي پسوروز بدون تعيي از ها گزارشعـت يدر حال حاضر گسـترش آن در طب يناقل منتشر شده، ول

ده است. اين ويروس از يوندک آلوده اثبات گرديق پياز طر تنهااز طريق تنهاز يرا ن Aشود و نژاد پسوروز میطريق بذر منتقل ن

Weathers and( اند منتقل نموده يشگاهيط آزمايسس و در شرا

Harjung, 1964.( تنهـا يلکه حلقـو يماريب يدر هندوستان نوع ــارنگ ــان ن ــويک ياز درخت × Kinnow )Citrus nobilis Lour ن

C. deliciosa Tenora (ــزارش ــل آن گ ــه عام ــت ک ــده اس ش)ICRSV Indian citrus ringspot virus, ــاوت از CRSV)، متف)Sharma et al., 2004; 2009( ـ گونه ت به عنوان و پ در جـنس ي

Mandarivirus خــانواده وFlexiviridae قــرار گرفتــه اســت )Adams et al., 2004; Rustici et al., 2002; Thind et al., 1998.(

منتشر شـده کـه بـر اسـاس عالئـم ييها ران گزارشيدر ابا يماريب ينوع يمشاهده شده در درختان مرکبات، ضمن معرف

روس يـ و يوه، عامل آن نـوع يبرگ وم يرو يعالئم لکه حلقو Citrus ring pattern virusمرکبـات يروس نقش حلقويبا نام و

,.Dehyar and Habashi, 1974; Ebrahimi et al( عنوان شده است

1988; Bove, 1995ـ ه به ويشب ي) که عالئم يروس لکـه حلقـو ي) را Timmer and Garnsey, 1980; Roistacher, 1991( مرکبـات

درختان واجـد عالئـم يمل آمده روبه ع ياند. بررس نشان دادهص ياز عـدم تشـخ يروس پسوروز مرکبات در گرگان، حاکيو

ا و يتاليا AgriTestشرکت يبا پادتن تک همسانه ا يکيسرولوژـ تنهـا در يل شدن باند اختصاصـ يتشک م درصـد از يهفـت و ن

مراز با يپل يا رهيشده در واکنش زنج يست نمونه جمع آوريدو ين پوششـ يژن پـروتئ يشـده از رو يطراح استفاده از آغازگر

ان يدر سـال ). Ebadi, 2007( روس پسوروز مرکبات بوده استيو يرو يحلقو يها با عالئم لکه يروسيعارضه شبه و ير نوعياخ

ـ وه همراه با ريبرگ و م يدر آسـتانه بلـوغ رو يهـا وهيـ زش ميدرختان پرتقال تامسون ناول در باغات شـرق اسـتان مازنـدران

ـ ا عامـل ا يـ ن علت ييبه منظور تع ين بررسيده شد و امشاه ن ي عارضه صورت گرفت.

يروش بررس

قطعـه بـاغ واجـد درختـان پرتقـال ۲۳از : ينمونه بردارسال و ۱۸تا ۱۵ يه نارنج با محدوده سنيپا يتامسون ناول رو

استان مازنـدران يک هکتار در منطقه شرقيش از يبا مساحت بد بـه عمـل آمـده و باغـات ينکا) بازد بهشهر و يها (شهرستان

برگ و يرو يواجد درختان پرتقال تامسون با عالئم لکه حلقودند. سپس با حرکت در دو قطـر يمشخص گرد )۱ وه (شکليمو عالمـت يين باغات، درختان واجد عالئم مورد نظر شناسايا

چهـار جـوان از يهـا شدند. هر نمونه شامل سرشـاخه يگذارد عالئـم بـود. طـول هـر سرشـاخه نمونـه سمت درختان واج

متر در نظر گرفته شـد. هـر يسانت ۲۰تا ۱۵شده معادل يبردارجداگانه قرارداده شد و پـس از ثبـت يکيسه پالستينمونه در ک

د. يشگاه منتقل گرديمشخصات به آزما

درانوه پرتقال تامسون ناول در شرق مازنيبرگ و م يرو يعالئم لکه حلقو - ١شکل Fig.1. Ring spot symptoms on leaves and fruits of Thomson Navel orange in East of Mazandaran

١٦٤ ضه نقش حلقوي در درختان پرتقال تامسون ناول در شرق مازندرانويروس پسوروز مرکبات، عامل عارو همکاران: فلکی

زا يمورد استفاده، آزمون اال يآزمون سرولوژ: آزمون االيزا) TAS-ELISA( م سه طرفه پـادتن ير مستقيچ غيبه روش ساندو

بـه 13C5 يا پـادتن تـک همسـانه ن آزمون با استفاده از يا بود.) و بـه ايتاليااز Milneدکتر ييو مثبت (اهدا يهمراه کنترل منف

به )Martin et al., 2004( يراتييبا تغ 1999) .Alioto et alروش ( گرفت.انجام ريشرح ز

ــادتن ــه م 13C5 ابتــدا پ ــب ــافر پوششــ ۴۰۰۰/۱زان ي يدر بـ يم Na2CO3، ۷۰مـوالر يليم ۲۵( ) NaHCO3 ،pH9.6مـوالر يل

تر از آن در هـر چاهـک از بشـقابک يکروليم ۱۲۰و ق شدهيرقـ اال ختـه شـد و بـه ير) MaxiSorp® Plate, Nunc, Denmark( زاي

قرار گرفت. سپس پنج مرتبه C۳۷° يساعت در دما چهارمدت ۸( بـا بـافر شستشـو هـا قـه چاهـک يک دقيو هر بار به مدت

ر موال يليم KH2PO4، ۷/۲موالر يليم Na2HPO4 ،۵/۱موالر يليمKCl ،۱۴/۰ ــوالر ــيم NaCl ،۳م ــوالر يل ــد NaN3 ،۱/۰م درص

Tween-20 ،pH7.4( .گـرم بافـت بـرگ جـوان ۱/۰شسته شـد چهـار شـده از ينمونه بردار يها تکه برگ از سرشاخه چهار(

ک يشده با يجمع آور يها ک از نمونهيسمت درخت) از هر Na2HPO4 ،۵/۱مـوالر يلـ ي(هشت م يريتر بافر عصاره گيل يليم NaCl ،۳موالر KCl ،۱۴/۰موالر يليم KH2PO4، ۷/۲موالر يليم ،PVP-10000درصد Tween-20 ،۲درصد NaN3 ،۱/۰موالر يليم

ون سـترون و سـرد هـا در )pH7.4، ير بدون چربيدو درصد شتر از عصـاره بـه دسـت آمـده در يکروليم ۱۰۰و يريعصاره گ قرار گرفـت. C۴° يک شب در دمايخته و به مدت يچاهک ر

ــا ــ تنه ــک (ياول ــرا )A1ن چاه ــر م يب ــحــذف اث ــذب ي زان جبشـقابک ).Blank( به آن افزوده نشد ياهيرن، عصاره گياست يپل

ـ يکروليم ۱۰۰شسته شـد و يمانند مرحله قبل يبـاد يتـر از آنت13C5 ق شده بود، يرق ۱۰۰۰/۱زان يبه م يريکه در بافر عصاره گ

C۳۷° يقه در دمايدق ۹۰ت خته شده و به مدير ها درون چاهکـ قرار داده شد. بشقابک مانند قبل شسته شد و پادتن ته ه شـده ي

ن فسـفاتاز يم آلکـال ين موش و متصل بـه آنـز يه گاماگلوبوليعل)Boehringer Mannheim Co., Germanyبه يريگ ) در بافر عصارهتـر از آن در چاهـک يکروليم ۱۰۰ق شد و يرق ۱۰۰۰۰/۱ زانيم

شـد. ينگهـدار C۳۷° يقه در دمايدق ۹۰مدت خته شد و بهيرترو يتـر محلـول پـاران يکروليم ۱۰۰بشـقابک، يپس از شستشو

ــفن ــفات ي ــرق ۱۰۰۰/۱ل فس ــترا ي ــافر سوبس ــده در ب ۱۰( ق ش) در MgCl2 ،pH9.5موالر يليم ۵/۰ن، ياتانول آم يموالر د يليم

اتاق و دور يقه در دمايدق ۸۰خته شد و به مدت يهر چاهک ردر طول موج ها زان جذب چاهکيمم قرار گرفت. يمستق از نورــانومتر توســط دســتگاه ٤٠٥ -ELISA Reader( دريــرزا يــاال ن

Stat Fax2100, USA( زان جذب يکه م ييها نمونه و يريگاندازه) را يمنفـ (کنتـرل عصاره نمونه سـالم يسه برابر چاهک حاو

گرفته شد. در نظر CPVنشان دادند، به عنوان نمونه آلوده به و يزبـان يدامنـه م يبه منظور بررس: ها هيجدا ينموده ساز

ن هـا ايـ گ يرو يمورد بررسـ يها هيجاد شده، جداينوع عالئم ا يدر مـورد آلـوده سـاز شـدند. يه کـوب ير مايمحک به شرح ز

جمـع يهـا از بـرگ نمونـه يري، عصاره گين محک علفها ايگبه نسـبت pH7م با يسموالر فسفات پتا ۱/۰شده در بافر يآور

ل سرد انجام ياستر ينيون چها ) در يحجم -ي( وزن ک به دويگرفت. عصاره به دست آمده با پودر کاربوراندوم و بـا اسـتفاده

ــاز دســتکش ــار مصــرف روي ن محــک شــامل هــا ايــگ يک بChenopodium quinoa و Gomphrena globosa چهار ، در مرحله

يشده به آرامـ يه کوبيما ياه شد. سپس برگ كوبي مايه يبرگب دو برگ با ياه به ترتيدر هر گ دند.يبا آب مقطر شستشو گرد

ـ مال يبـا آب مقطـر اسـتر به عنوان شـاهد عصاره و دو برگ ه ي ۲۵± ۵ و در حرارت يا ط گلخانهين تحت شراها ايگ شد. يکوب

يو به صورت روزانه به مدت دو هفتـه مـورد بررسـ ينگهدار ).(Ahlawat and Pant, 2008; Sharma et al., 2009 قـرار گرفـت

ي بــذري هــا نهــالمرکبــات، يهــا نهــال يجهــت آلــوده ســازــ ــارنج محل ــاله ن ــه س ــا س ــيدو ت ــوي، س ــم س نگليتروملو رق

[C. paradisi Macf. × P. trifoliata (L.) Raf.(cv ‘Swingle’)] ،ـ ترنج رقـم ترو يسـ Citrus sinensis × Poncirus trifoliata [ ري

[(cv ‘Troyer’) دو سـاله ي هـا اهچهيو به منظور بررسي بيشتر گ ينـارنگ , محلـي يمرکبات شامل پرتقال تامسون نـاول، نـارنگ

× Citrus paradisi (cv ‘Duncan’) [ نـوال يتـانجلو رقـم م انشو،

١٦٥ ۱۳۹۱، اسفند ۲، شماره ۸۰ي گياهي: جلد ها آفات و بيماري

Citrus reticulata (cv ‘Dancy’) [ , فـروت رقـم دانكـن گريـپ, Citrus limon (L.)[ ورکـا يليمـوترش رقـم , رقـم پـيج ينارنگ

Burm.f. (cv ‘Eureka’)[ ه يــپا يرقــم كلمــانتين رو يو نــارنگدو نهـال از هـر . ن محـك اسـتفاده شـد ها ترنج به عنوان گيايس

براي هـر . در نظر گرفته شد يتكرار براي هر نمونه مورد بررس هـا نهـال محك، دو جوانه برگي از هر نمونه پيونـد شـد. نهال

الصـاق نهـال مشخصـات بـراي هـر سرزني شده و برچسـب شـدند. عالئـم ينگهـدار يا ط گلخانـه يدر شرا ها نهال. ديگردر پوست يتنه و ز يرشد هر سه ماهه و عالئم رو و نحوه يبرگ

,.Roistacher et al( قرار گرفتند يابيجده ماه مورد ارزيپس ازه

2000; Sarachu et al., 1988(. معکـوس يمراز با نسـخه بـردار يلپ يا رهيواکنش زنج

)RT-PCR( :استخراج RNA بـا اسـتفاده از يبرگ يها از نمونه ) صورت گرفت.GF-1)Vivantis Co., USA يت خالص سازيک

ع دريگرم برگ پودر شده با ازت ما ١/٠زان يهر نمونه، م يبرامخلوط و بافر RNAseاز ي/. آب مقطر عارml ۲وپ سرد با يت

فوژ در دور بـاال بـه ياستخراج به آن اضافه شد. پـس از سـانتر -RNA% اضـافه و از سـتون ٨٠زان هم حجـم بـه آن اتـانول يم

Binding فوژ در يقــه ســانتريعبـور داده شــد. پــس از پـانزده دق12000gفوژ و ينتر، بــافر شستشــو بــه آن افــزوده و مجــدداً ســا و DNAse Iميآنـز يع اسـتخراج شـده، مخلـوط حـاو يبـه مـا

RNase Inhibitor فوژ به مدت يقه سانتريافزوده و پس از پنج دقع به دست آمده بـه يفوژ و مايقه در در دور باال سانتريپانزده دق

خالص کل مورد استفاده قرار گرفت. RNAعنوان ۲۰۰ يهـا هدر لول (cDNA synthesis)مکمل DNAساخت

خـالص RNA تـر يکروليسترون با استفاده از پنج م يتريکروليمــل، ــوس يپ ۴۰ ک ــازگر معک ــول آغ ــارو (C-primer)کوم چه

صورت گرفت. پس از افزودن آب 5x RT-PCR تر بافريکروليمنجاه پل براي رساندن حجم کل محلول واکنش به يزه استريونيدگـراد يدرجـه سـانت ۹۴قه در يدق ۳به مدت ها تر، لولهيکروليم

ـ يو بالفاصله بـه رو (Denaturation)قرار داده شده خ منتقـل ي (annealing)اتـاق يقه در دمايدق ۳۰س از آن به مدت پشدند.

ميواحـد آنـز ۵مخلـوط درون هـر لولـه، بـه نگهداري شدند.MMuLv-Reverse Transcriptase ــوط يکروليو دو م ــر از مخل ت

(dATP, dTTP, dGTP, dCTP) dNTP mix ــت ــا غلظ ۴/۰ببه محلول واکنش افزوده شـد. ها هر يك از باز يموالر برا يليم

گـراد يدرجـه سـانت ۳۷سـاعت در ۱مخلوط حاصل به مـدت مراز يلپ يا رهيواکنش زنج .)Garcia et al., 1997( شد ينگهدار

(cDNA) الگـو DNA يتر محلول حاويکروليپنج مبا استفاده از

کومول از هر يپ ٢٠و با استفاده از مرحله قبل به دست آمده در يلکـه حلقـو يهـا روسيـ ي اختصاصـي و هـا ک از آغـازگر ي

ــد ــات يهنــ ,'ICRSV U:5'-CCAACTGGATGAAAT-3 [مرکبــ

D:5'-GAGCCAAGCGTTCAGA-3' [ )Nagpal et al., 2005( لکــه ،ــات ــوي مرکبـ ,'CRSV ] U:5'-ACAATAAGCAAGACAAC-3حلقـ

D:5'-CCATGTCACTTCTATTC-3' [ )Garcia et al., 1997( ،RNA2 ــات ــوروز مرکبـ ,'CPV ] D:5'- GAAAGTAGTCATCCTT-3پسـ

GACAACTTCCTCCTCC-3' U:5'- [ )De La Torre et al., 2002( ,'CPV.D:5'- TCTGTTTTTGTCAACAACACACTCC-3 [ و

GCTTCCTGGAAAAGCTGATG-3' U:5'- [ )Barthe et al., 1998( در) Primus25-MWG Biotech, Germany( لرکيدســتگاه ترموســا

ــ .انجــام شــد ــه حرارت ــرا يبرنام ــتکث يب درجــه ٩٤ر شــامل يـ اول يواسرشـت سـاز يقه برايگراد به مدت پنج دق يسانت ه و ي

٣٠گـراد بـه مـدت يدرجه سانت ٩٤( يچرخه حرارت ٣٥سپس ٣٠گراد بـه مـدت يدرجه سانت ٥٠، يواسرشت ساز يه برايثان يه برايثان ٦٠گراد به مدت يدرجه سانت ٧٢ اتصال و يه برايثان

يقه برايگراد به مدت پنج دق يدرجه سانت ٧٢ان ير) و در پايتکث . )Garcia et al., 1997; De La Torre et al., 2002( بود ييهار نيتکث

جه و بحثينت

ـ قطعه بـاغ بازد ٢٣از :ينمونه بردار د شـده، شـش بـاغ يودو قطعه بـاغ در شهرسـتان قطعه باغ در شهرستان نکا چهار(

برگ و يرو يبهشهر) واجد درختان پرتقال با عالئم لکه حلقو يدرخت پرتقال تامسون ناول رو ۳۰در مجموع از وه بودند.يم شد. ين باغات نمونه برداريدر ا ه نارنجيپا

١٦٦ ضه نقش حلقوي در درختان پرتقال تامسون ناول در شرق مازندرانويروس پسوروز مرکبات، عامل عارو همکاران: فلکی

ن آزمـون يـ شـده در ا يآور نمونه جمع يس: آزمون االيزاـ توسط مقرار گرفت. م يمورد بررس يهـا زان جـذب چاهـک ي

کـه يبـود، در حـال ٢٠٣/٠عصاره نمونه سالم برابـر بـا يحاواز يشده جذب يجمع آور يها عصاره نمونه يحاو يها چاهکعصـاره بـرگ يداشتند. چاهک حـاو ٢٩٠/١تا ٦٧٧/٠ حداقل

ـ را داشت. ا ٥٩٤/١ معادل يشاهد مثبت متوسط جذب ج ين نتـا ي يبـا سـ 13C5 يا مسانهنشان دهنده واکنش مثبت پادتن تک ه

شده از درختان پرتقال تامسون نـاول واجـد ينمونه جمع آوروه در شرق اسـتان مازنـدران يبرگ و م يرو يعالئم لکه حلقو

د ين پادتن مويشده با ا يآور جمع يها بود. واکنش مثبت نمونهن يروس پسوروز مرکبات است و احتماالً از ايبا و ها ارتباط آنـ و يمولـد لکـه حلقـو يها هيص جدايتشخ يپادتن برا روس ي

ر هـا توان استفاده نمـود. اظ میران يپسوروز مرکبات در شمال ان پادتن تـک ين خصوص و امکان استفاده از ايدر ا ينظر قطع يهـا هين جدايدر ب ها هيپ جداين تيص ايتشخ يبرا يا همسانه

ـ مختلف پسوروز کـه احتمـاالً در شـمال ا ران وجـود دارنـد، ي است. يليتکم يها يمند به بررسازين

گلخانـه يت فضـا يبـا توجـه بـه محـدود : نموده سـازي مازندران و يعيو منابع طب يقات کشاورزينه در مرکز تحقيقرنط

درختـان پرتقـال تامسـون يکسان بودن عالئم رويبا توجه به ک نمونه، و از ين باغات در شهرستان نکا يک از ايناول، از هر

يزبانيدامنه م يبررس يان بهشهر سه نمونه برادو باغ در شهرستـ (جدا ن هفـت نمونـه يد. ايانتخاب گرد ـ ه) بـه ترت ي ب تحـت ي

دند.يگرد ينامگذار M7تا M1عنوانه انتخاب شده بر اساس نوع يهفت جدا: مرکبات يها نهال

ـ و پا يبـذر يها نهال يجاد شده رويعالئم ا يهـا ونـدک يپ -هيگـروه ونـد پوسـت در دو يق پيـ رشده از ط يه کوبيمرکبات ما

يرو يعالئـم مشخصـ هـا هيه جدايقرار گرفتند. کل يکيولوژيب ينگل، نارنج، پرتقـال تامسـون، نـارنگ يتروملو سويس يها نهالجـاد ينـوال ا يانشو و تـانجلو رقـم م يج، نارنگيپ ي، نارنگيمحل

ــد. جدا ــنکردن ــا هي ــروه اول M4و M1،M2 ،M3 يه در گـ ده شـدند، بـه ا قـرار دا يکيولوژيب بـرگ يب کـه رو يـ ن ترتي

زرد يهـا پ فروت دانکن لکهين و گريکلمانت ينارنگ يها نهالورکـا نکـروز لبـه يمـوترش يل ي) و رو۲ (شـکل جاد کردنديا

و M5، M6 يهـا هيدند، اما جداي) را باعث گرد۳(شکل ها برگM7 ــروه دوم ب ــه در گ ــوژيک ــم داده شــدند يجــا يکيول عالئ

يهـا هيجاد نکردند. جداين محک اها اين گيا يرا رو يمشخصرا بـه ير نقاط زرد رنگـ يترنج ترويس يها برگ يگروه دوم رو

ن ي) کــه چنــ۴دنـد( شــکل يک موجــب گرديســتميصـورت س ). ۱(جدول ديگروه دوم مشاهده نگرد يها هيدر جدا يعالئم

شده با يه کوبيما كلمانتين ينارنگ روي برگ زردي ها لكه -۲ شکل )M4و M1،M2 ،M3( گروه اول يها هيجدا

Fig.2. Yellow spots on Clementine mandarin leaf, inoculated with the first group isolates (M1, M2, M3 and M4).

شـده بـا يه کـوب يـ ورکا ماي برگ ليمو ترش يها لبه نکروز -۳ شکل )M4و M1،M2 ،M3( گروه اول يها هيجدا

Fig.3. Leaf edge necrosis of Eureka lemon, inoculated with the first group isolates (M1, M2, M3 and M4)

١٦٧ ۱۳۹۱، اسفند ۲، شماره ۸۰ي گياهي: جلد ها آفات و بيماري

شده يه کوبير مايترنج ترويبرگ س يرنگ رو نقاط زرد -۴شکل )M7و M5، M6( گروه دوم يها هيبا جدا

Fig.4. Yellow spots on Troyer citrange leaf, inoculated with the second group isolates (M5, M6, and M7)

مـورد يهـا هيـ عصاره بـرگ جدا يه کوبيما: ين علفها ايگمنجـر بــه تشــكيل Chenopodium quinoaبــرگ روي يبررسـ

شـامل يکيولوژين گروه بياول يها هي. جداشد يموضعي ها لكهM1 ،M2 ،M3 و M4 ــه ــا لک ــع يه ــروزه يموض ــفنک د و يس يموضـع يها لکه M7و M5 ،M6 ن گروه شامليدوم يها هيجدا

يرو هـا هيه جداي). کل۵(شکل جاد کردندينکروزه قرمز رنگ اک را ينکروت يموضع يها لکه Gomphrena globosaن ها ايبرگ گ

هاي ويروسي مطالعـه شـده در جدايه ).۶(شکل موجب شدندــه ايجــاد لکــه ــا توجــه ب ــن بررســي ب اي موضــعي روي هــ اي

Gomphrena globosa و عالئم باغي متفاوت باICRSV به نظـر ،رسد که از نظر بيولوژيکي ارتباطي با ايـن ويـروس داشـته نمی

باشند. حداقل دو عامل ويروسي را با بيماري پسـوروز مـرتبط که پسوروز حقيقـي يـا Aاند. نوع اول آن يعني پسوروز دانسته

اي شـدن بر اساس عالئم رگه رگه کالسيک ناميده شده است ويابـد. گـردد و انتقـال مکـانيکي نمـی ها مشخص می روي برگ

که لکه حلقوي مرکبات نيز ناميده شده، Bدومين نوع، پسوروز تـوان بـر اسـاس ) و مـی Danos, 1989( يابد انتقال مکانيکي می

هـان علفـي آن را شناسـايي نمـود عالئم ايجاد شده روي گيـا (Frison and Taher, 1991). اختالف اصلي بين تيپA و تيپB

هـاي مسـن و برخـي ويروس پسوروز بروز عالئم روي بـرگ در پوسـته پوسـته Bها و شديدتر بـودن تيـپ مواقع روي ميوه

ويـروس پسـوروز مرکبـات بـوده Aنمودن تنه نسبت به تيـپ ).Timmer et al., 1978; Garnsey and Timmer, 1988است (

ــکل ــرگ –۵ش ــا ب ــما يه ــوبي ــده يه ک .Chenopodium quinoaش گروه اول يها هيبا جدا يه کوبياز ما يد ناشينکروزه سف يموضع يها لکه :۱)M1 ،M2 ،M3 و M4 ـ از ما ينکـروزه قرمـز ناشـ يموضع يها لکه :۲)؛ ه ي

.)M7 و M5 ،M6گروه دوم ( يها هيبا جدا يکوبFig. 5. Inoculated leaves of Chenopodium quinoa. 1: white

necrotic local lesions, inoculated with the first group isolates (M1,

M2, M3 and M4); 2: red necrotic local lesions, inoculated with the

second group (M5, M6, and M7)

Gomphrenaاه يـ گ بـرگ ينکـروزه رو يموضـع يها لکه -۶شکل

globosa روس پسوروز مرکبـات در شـرق يو يها هيشده با جدا يه کوبيما مازندران

Fig.6. Necrotic local lesions on the leaves of Gomphrena globosa,

inoculated with Citrus psorosis virus isolates in East of Mazandaran

1

2

١٦٨ ضه نقش حلقوي در درختان پرتقال تامسون ناول در شرق مازندرانويروس پسوروز مرکبات، عامل عارو همکاران: فلکی

ـ ن يحفاظت تقاطع يها بر اساس آزمون مشـخص شـده زيو مشـابه بـا Aد از پسـوروز يک فرم شدي Bاست که پسوروز

CRSV ستيکسان با آن نيباشد اما می )Da Graça et al., 1993 .(رفتـه شـده يبه عمل آمـده، پذ يليتفص يها ين در بررسيهمچن

ــ تنهــا CRSV اســت کــه د از پســوروز اســتيپ شــديــک تي)Roistacher, 1993; Da Graça et al., 1991.( از يانــواع

ر يروس پسوروز مرکبات در سايو يمولد لکه حلقو يها هيجدان يمطالعه شده در ا يلکه حلقو يها هي، مشابه جداجهانمناطق اه محــک يــگي رو يموضــع يهــا جــاد لکــهي، باعــث ايبررسـ

Chenopodium quinoa ط ي، عدم پوسته پوسته شدن تنـه در شـراپ يبرگ گر يک رويستميس يزرد حلقو يها و بروز لکه يباغ

ـ گرد يا ط گلخانـه يفروت در شرا ,.Da Graça et al( ده بودنـد ي

1993; Sarachu et al., 1988 ج بـه دسـت ي). بـا توجـه بـه نتـا ـ مورد مطالعه را مشـابه بـا جدا يها هيآمده، جدا ماننـد ييهـا هي

CRSV-4 )Da Graça et al., 1991; Vogel and Bove, 1980،( ـ بـدون عالئـم تنـه و Bپ يه تدر گرو توان می روس پسـوروز ي

.داد يمرکبات جا معکـوس: يمراز با نسخه بـردار يلپ يا رهيواکنش زنج

شده از درختـان پرتقـال تامسـون نـاول يع آورمنمونه ج يسـ و يبـا آغـازگر اختصاصـ تنها يواجد عالئم لکه حلقو روس ي

در يک قطعـه اختصاصـ ير شده و يتکث )CRSV( ينقش حلقون قطعه با قطعه ي). اندازه ا۷(شکل جاد نمودنديا bp۲۰۰حدود

bp۲۱۸ ـ يه آرژانتيـ جدا ين جفـت آغـازگر بـرا يکه توسط ا ينـ ر گرديروس پسوروز مرکبات تکثيو )، Garcia et al., 1997( دهي

يشـامل آغـازگر اختصاصـ هـا آغـازگر ريسـا مطابقت داشت. )، Nagpal et al., 2005( مرکبـات يلکـه حلقـو يروس هنـد يو ) وRNA2 )De La Torre et al., 2002مـرتبط بـا هـاي غـازگر آ

RNA3 )Barthe et al., 1998روس پسوروز مرکبات قادر بـه ي) وچند هاي تنپاد نبودند. يمورد بررس يرانيا هاي هيص جدايتشخ

ين پوششـ يه پـروتئ يـ د شـده عل يتول يا ا تک همسانهيهمسانه ييصـوص توانـا در خ يج متفاوتيروس پسوروز مرکبات، نتايو

اند روس پسوروز مرکبات داشتهيمختلف و هاي هيص جدايتشخ

)Derrick et al., 1988; Ebadi, 2007; Da Graça et al., 1993.(

به دست آمده از درختان پرتقال يها هيقطعه حاصل از جدا -۷شکل ه يـ جدا ير شده توسـط آغـازگر اختصاصـ ي، تکثيواجد عالئم لکه حلقو

CRSVيها هيروس پسوروز مرکبات( جدايو M1 تاM7 جدا شده از درختانشده از درخت فاقد ي: نمونه جمع آور H، يپرتقال واجد عالئم لکه حلقو

)جفت باز ۱۰۰با فواصل ي: مارکر نردبان Markerعالئم ، Fig.7. The obtained fragment from collected isolates of the

orange trees with ring spot symptoms, amplified by the specific primer of Citrus psorosis virus-CRSV isolate (M1 to M7, the seven collected isolates; H, healthy samples collected from trees without any symptoms; Marker, molecular marker ladder with 100 bp intervals)

ن هـا ايو گ يزبانيدامنه م يبه عمل آمده رو يها يسدر برر

ـ ني کيولوژيمحک، از نظر ب ـ يز اختالفـات ي يهـا هيـ ن جدايدر بــف و ــمختل ــت ي ــته اس ــود داش ــات وج ــوروز مرکب روس پس

)Roistacher, 1991; Da Graça et al., 1993; Sharma et al.,

يا رهيـ ج به دست آمـده در واکـنش زنج يبه نتا با توجه .)2009ـ میمراز، يپل ـ يا يهـا هيـ ن جدايتـوان احتمـال داد کـه ب و يران

ـ و يمولد لکـه حلقـو يها هيجدا روس پسـوروز مرکبـات در يد حفاظـت شـده يمشابه و شـا يا ، قطعهها گر ازکشوريد يبرخ يوجود داشته باشد و بتوان از آن براروس ين ويا RNA1 يرو

گـر يد ياز سـو اسـتفاده نمـود. ها هين گروه از جدايا ييشناسا يهـا هيـ ص جدايدر تشـخ 13C5 يا پادتن تک همسـانه ت يقابل

ييشناسا ين پادتن را براي، امکان استفاده از ايمولد لکه حلقوروس پسوروز مرکبات در يو يمولد لکه حلقو يها هير جدايسا د. ينما میگر مناطق کشت مرکبات را مطرح يد

١٦٩ ۱۳۹۱، اسفند ۲، شماره ۸۰ي گياهي: جلد ها آفات و بيماري

روس پسوروز مرکبات، به دست آمده از درختان پرتقال تامسون ناول شرق مازندرانيه ويهفت جدا ينموده ساز -۱جدول Table 1. Indexing of seven Citrus psorosis virus isolates, obtained from Thomson Navel trees in East of Mazandaran

محل نمونه برداري و عالئم باغي روي درختان پرتقال تامسون ناول نمونه برداري شده

Sampling site and the symptoms on sampled Thomson Navel orange trees

ميزبان و عالئمHost and symptoms

گروه بيولوژيکيBiological group

جدايهIsolate

رنج سيت

وير

تر Tr

oyer

citr

ange

رکا يو

شوتر

ليم Eu

reka

lem

on

کن دان

وت فر

يپگر

Dun

can

grap

efru

it

گينارن

تين

لمانک

Clem

entin

e m

anda

rin

ي حلقوي کلروزه روي ها نقوش و لکه واجد تنه، پوسته شدن فاقد عالئم نکا، ، ريزش ميوهدر قسمت گلگاه ي جوان و مسن و ميوه مخصوصاًها برگ

Neka, without any bark scaling symptoms, with chlorotic patterns and ring spots on mature and immature leaves and fruits, especially around the stylar

end, fruit abscission

- tns cl cl 1 M1

ي حلقوي کلروزه روي ها نقوش و لکه واجد تنه، پوسته شدن فاقد عالئم نکا، ، ريزش ميوهدر قسمت گلگاه مسن و ميوه مخصوصاًي جوان و ها برگ

Neka, without bark scaling symptoms, with chlorotic patterns and ring spots on mature and immature leaves and fruits, especially around the stylar end,

fruit abscission

- tns cl cl 1 M2

ي حلقوي کلروزه روي ها نقوش و لکه واجد تنه، پوسته شدن فاقد عالئم نکا، ، ريزش ميوهي جوان و مسن و ميوه مخصوصا در قسمت گلگاهها برگ

Neka, without any bark scaling symptoms, with chlorotic patterns and ring spots on mature and immature leaves and fruits, especially around the stylar

end, fruit abscission

- tns cl cl 1 M3

ي حلقوي با ترشح صمغ روي ميوه، ها فاقد عالئم برگي و تنه، واجد لکه ،قائمشهر ريزش ميوه

Ghaemshahr, without any bark and leaf symptoms, with ring spots along with gumming on fruit, fruit abscission

- tns cl cl 1 M4

ي حلقوي با ترشح صمغ روي ميوه، ها فاقد عالئم برگي و تنه، واجد لکه ،رقائمشه ريزش ميوه

Ghaemshahr, without any bark and leaf symptoms, with ring spots along with gumming on fruit, fruit abscission

cs - - - 2 M5

حلقوي کلروزه روي يها نقوش و لکه واجد تنه، پوسته شدن فاقد عالئم ،ساري ي مسن و ميوهها برگ

Sari, without any bark scaling symptoms, with chlorotic patterns and ring spots on mature leaves and fruits

cs - - - 2 M6

ي حلقوي کلروزه روي ها نقوش و لکه واجد تنه، پوسته شدن فاقد عالئم ،ساري ي مسن و ميوهها برگ

Sari, without any bark scaling symptoms, with chlorotic patterns and spots on mature leaves and fruits

cs - - - 2 M7

cl :زرد، يها لکهtns: برگ، يها نکروز لبهcs : ،بدون عالئم: (-)نقاط زردرنگ cl: Chlorotic lesions, tns: tip necrosis of leaves, cs: Chlorotic spots, (-): without any symptoms

اريزسپاسگار ي، به خاطر در اختياز سرکار خانم مهندس فاطمه پورول

شـاهد يهـا و نمونـه 13C5 مونوکلونـال يبـاد يقرار دادن آنتـ يا و دکتـر م يمورنـو از اسـپان دكتر يي(اهداز شده يليوفيل از يلن

ــتاليا ــماي ــ مانه ي) ص ــدرداني م ــكر و ق ــردد. از اتح يتش ــادگ ه ي

يباغداران مازندران که از هر گونه همکـار يتعاون يها شرکت د.يآ يبه عمل م يند، سپاسگزارا ه غ ننمودينه درين زميدر ا

١٧٠ ضه نقش حلقوي در درختان پرتقال تامسون ناول در شرق مازندرانويروس پسوروز مرکبات، عامل عارو همکاران: فلکی

References ADAMS, M. J., J. F. ANTONIW, M. BAR-JOSEPH, A. A.

BRUNT, T. CANDRESSE, G. D. FOSTER, G. P. MARTELLI, R. G. MILNE and C. M. FAUQUET, 2004. The new plant virus family Flexiviridae and assessment of molecular criteria for species demarcation, Archives of Virology, No. 149: 1045–1060.

AHLAWAT, Y. S. and R. P. PANT, 2008. Indian citrus ringspot virus, In: Characterization, Diagnosis and Management of Plant Viruses, Volume 2: horticultural crops (RAO, G. P., A. MYRTA, K. S.LING, eds.). p. 97-107.

ALIOTO, D., M. GANGEMI, S. DEAGLIO, S. SPOSATO, E. LOISONI and R. G. MILNI, 1999. Improved detection of Citrus psorosis virus using polyclonal and monoclonal antibodies, Plant Pathology, No. 48: 735-741.

ALIOTO, D., M. MALFITANO, A. PELUSO, D. BOSCIA, and R. G. MILNE, 2001. Variability amongst Citrus psorosis virus (CPsV) sources in Campania, Italy, Abstracts, Proc. 14th Conf. IOCV. p. 439-440.

BARTHE, G. A., T. L. CECCARDI, K. L. MANJUNATH, and K. S. DERRICK, 1998. Citrus psorosis virus: nucleotide sequencing of the coat protein gene and detection by hybridization and RT–PCR, Journal of General Virology, No. 79: 1531-1537.

BOVE, J. M. 1995. Virus and Virus-Like Disease of Citrus in the Near East Region, FAO Rome. 518 pp.

DA GRAÇA, J. V., M. BAR-JOSEPH and K. S. DERRICK, 1993. Imrnunoblot detection of citrus psorosis in Israel using citrus ringspot antiserum, Proc. 12th Conf. IOCV. p. 432- 434.

DA GRAÇA, J. V., R. F. LEE, P. MORENO, E. L. CIVEROLO and K. S. DERRICK, 1991. Comparison of citrus ringspot, psorosis and other virus like agents of citrus. Plant Disease, No. 75: 613-61 6.

DANOS, E. 1989. Development of psorosis-citrus pathosystems in controlled-environment chambers, Rivista di Agricoltura Subtropicale e Tropicale. No. 83: 275-282.

DE LA TORRE, S. M. E., C. LOPEZ, O. GRAU and M. L. GARCIA, 2002. RNA2 of Citrus psorosis virus is of negative polarity and has a single open reading frame in

its complementary strand, Journal of General Virology, No. 83: 1777-1781.

DEHYAR, K. and M. HABASHI, 1974. Citrus ring pattern virus in the Caspian Sea area of Iran, Iranian Journal of Plant Pathology, No. 10: 17-20.

DERRICK, K. S., R. H. BRLANSKY, J. V. DA GRACA, R. F. LEE, L. W. TIMMER and T. K. NGUYEN, 1988. Partial characterization of a virus associated with citrus ringspot, Phytopathology, No. 78: 1298-1301.

DJELOUAH, K., O. POTERE, D. BOSCIA, A. M. D'ONGHIA and V. SAVINO, 2000. Production of monoclonal antibodies to Citrus psorosis associated virus, Proc. 14th Conf. IOCV. p. 152-159.

DURAN-VILA, N. and P. MORENO, 2000. Enfermedades de los Cítricos, Ediciones Mundi-Prensa, Madrid, Spain. 248 pp.

EBADI, A. 2007. Detection and distribution of Citrus psorosis virus (dominant type) by polymerase chain reaction( PCR) molecular method in Gorgan province and suburbs area, M.Sc. Thesis, Faculty of Agriculture, Gorgan Agricultural and Natural Sciences University. 69 pp. (in Persian with English summary).

EBRAHIMI, Y., F. ANVARI and K. SHAKHOLLESLAMI, 1988. Evaluation of eleven different cultivars as ring pattern virus disease indicator plants in Northern Iran, Proc. 10th Conf. IOCV. p. 62-64.

FAWCETT, H. S. 1936. Citrus Diseases and Their Control, 2nd ed., McGraw-Hill, New York. 659 pp.

FAWCETT, H. S. and A. A. BITANCOURT, 1943. Comparative symptomatology of psorosis varieties on citrus in California, Phytopathology, No. 33: 837-864.

FAWCETT, H. S. and L. C. COCHRAN, 1942. Symptom expression of psorosis of citrus as related to kind of inoculums, Phytopathology, No. 32: 22.

FRISON, E. A. and M. M. TAHER, 1991. Technical Guidelines for the Safe Movement of Citrus Germplasm, FAO/IBPGR, Rome, Italy, 45 pp.

GARCIA, M. L., M. E. SANCHEZ DE LA TORRE, E. DAL BO, K. DJELOUAH, N. ROUAG, E. LUISONI, R. G. MILNE and O. GRAU, 1997. Detection of Citrus psorosis-ringspot virus using RT-PCR and DAS-ELISA, Plant Pathology, No. 46: 830-836.

GARNSEY, S. M. and L. W. TIMMER, 1980. Mechanical transmissibility of Citrus ringspot virus isolates from Florida, Texas and California, Proc. 8th Conf. IOCV. p.

١٧١ ۱۳۹۱، اسفند ۲، شماره ۸۰ي گياهي: جلد ها آفات و بيماري

174-179. GARNSEY, S. M. and L. W. TIMMER, 1988. Local lesion

isolate of Citrus ringspot virus induces psorosis bark scaling, Proc. 10th Conf. IOCV. p. 334-339.

KLOTZ, L. J. 1973. Color Hand book of Citrus Diseases, 4th ed., Berkeley: University of California. 121 pp.

MARTIN, S., C. LOPEZ, M. L. GARCIA, G. NAUM-ONGANIA, O. GRAU, R. FLORES, P. MORENO and J. GUERRI, 2005. The complete nucleotide sequence of Spanish isolate of Citrus psorosis virus: Comparative analysis with other Ophioviruses, Archives of Virology, No. 150: 167-176.

MARTIN, S., D. ALIOTO, R. G. MILNE, S. M. GARNSEY, M. L. GARCIA, O. GRAU, J. GUERRI and P. MORENO, 2004. Detection of Citrus psorosis virus by ELISA, molecular hybridization, RT-PCR and immunosorbent electron microscopy and its association with citrus psorosis disease, Eur. Journal of Plant Pathology, No. 110: 747-757.

MILNE, R. G. 2005. Genus Ophiovirus, Proc. 8th Conf. IOCV. p. 673-679.

NAGPAL, A., S. SHARMA, B. SINGH, G. RANI, A. A. ZAIDI, V. HALLAN and G. S. VIRK, 2005. In vitro production of Indian citrus ringspot virus - free plants of kinnow mandarin (Citrus nobilis Lour × C. deliciosa Tenora) by ovule culture, Journal of Plant Biotechnology, No. 7(4): 259-265.

NAVAS-CASTILLO, J. N, P. MORENO, J. F. BALLESTER-OLMOS, J. A. PINA and A. HERMOSO DE MENDOZA, 1991. Detection of a necrotic strain of citrus ringspot virus in Star Ruby grapefruit in Spain, Proc. 11th Conf. IOCV. p. 345-351.

ROISTACHER, C. N. 1991. Graft -Transmissible Diseases of Citrus, FAO: Rome. 286 pp.

ROISTACHER, C. N. 1993. Psorosis- A review, Proc. 12th Conf. IOCV. p. 139-154.

ROISTACHER, C. N., A. M. D'ONGHIA and K. DJELOUAH, 2000. Defining psorosis by biological indexing and ELISA, Proc. 14th Conf. IOCV, p. 144-151.

RUSTICI, G., R. G. MILNE and G. P. ACCOTTO, 2002. Nucleotide sequence, genome organization and phylogenetical analysis of Indian citrus ringspot virus, Archives of Virology, No. 147: 2215–2224.

SARACHU, A. N., E. L. ARRESE, C. CASAFUS, N. B.

COSTA, M. L. GARCIA, O. GRAU, G. M. MARCO, and A. ROBLES, 1988. Biological assay and preliminary isolation of citrus psorosis disease agent from Argentina, Proc. 10th Conf. IOCV. p. 343-347.

SHARMA S., B. SINGH, G. RANI, A. ZAIDI, V. HALLAN, A. NAGPAL and G. S. Virk, 2004. Current status of Indian citrus ringspot virus (ICRSV) in kinnow orchards of Punjab and neighboring states, Journal of Current Bioscience, No. 2: 132–135.

SHARMA, S., B. SINGH, A. NAGPAL, G. S. VIRK and A. A. ZAIDI, 2009. Indexing tools for Indian citrus ringspot virus (ICRSV), The Open Biology Journal, No. 2: 27-31.

SWINGLE, W. T. and H. J. WEBBER, 1896. The principal disease of Citrus fruits in Florida. US Department of Agriculture, Division of Vegetable Physiology and Pathology, Bulletin, 8.

THIND, S. K., J. N. SHARMA, P. K. ARORA and S. S. CHEEMA, 1998. Effect of Citrus ringspot virus on quality of Kinnow mandarin fruits. Indian Journal of Virology, 14 (1): 91-92.

TIMMER, L. W. and GARNSEY, S. M. 1980. Natural spread of Citrus ringspot virus in Texas and its association with psorosis-like diseases in Florida and Texas, Proc. 8th Conf. IOCV. p. 167-173.

TIMMER, L. W., S. M. GARNSEY and J. J. MCRITCHIE, 1978. Comparative symptomatology of Florida and Texas isolates of Citrus ringspot virus on citrus and herbaceous hosts, Plant Disease Reporter, No. 62: 1054-1058.

VOGEL, R. and J. M. BOVE, 1980. Citrus ringspot in Corsica, Proc. 8th Conf. IOCV. p. 180-182.

WALLACE, J. M. 1957. Virus-strain interference in relation to symptoms of psorosis disease of citrus, Hilgar. No. 27: 223-245.

WALLACE, J. M. and R. J. DRAKE, 1968. Citrange stunt and ringspot, two previously undescribed virus diseases of citrus, Proc. 4th Conf. IOCV. p. 177-183.

WEATHERS, L. G. and M. K. HARJUNG, 1964. Transmission of citrus viruses by dodder, Cuscuta subinclusa, Plant Disease Reporter, No. 48: 102-103.

WHITESIDE, J. O., S. M. GARNSEY and L. W. TIMMER, 1989. Compendium of Citrus Diseases, APS Press. 80pp.

١٧٢ ضه نقش حلقوي در درختان پرتقال تامسون ناول در شرق مازندرانويروس پسوروز مرکبات، عامل عارو همکاران: فلکی