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AULA I - NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO
MICROBIOLOGIA
As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar os
princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. Serão
utilizadas uma variedade de bactérias, sendo que algumas podem ser
patogênicas para o homem, portanto é essencial que as normas sejam
seguidas, a fim de se evitar contaminações acidentais.
NORMAS DO LABORATÓRIO
01- Conheça o Mapa de Riscos de seu local de trabalho.
02- O uso do jaleco é obrigatório.
03- Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com
reagentes e equipamentos.
04- O laboratório deve ser mantido limpo e em ordem, devendo ser dele
retirados quaisquer materiais que não tenham relação com o trabalho.
05- Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada
aula prática.
06- Lavar as mãos e calçar luvas (se for necessário) de procedimento ao
iniciar a análise, lavar as mãos antes de sair do laboratório e sempre que
for necessário. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não
tocar no material.
07- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de
iniciar a análise.
08- Utilizar exclusivamente material estéril para a análise.
09- No caso de derramamento do material contaminado, proceder
imediatamente à desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento
deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes.
10- Não comer, beber ou fumar no laboratório.
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11- Não deixar seus pertences sobre os balcões onde os experimentos
serão realizados.
12- Manter canetas, dedos, longe da boca.
13- Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de
trabalho.
14 - Todos os derramamentos, acidentes e exposições reais ou potenciais
por material infectado ou em caso de contaminação acidental devem ser
imediatamente notificados ao professor.
15 - As superfícies das bancadas devem ser recobertas com papel
absorvente, sempre que exista a possibilidade de respingamentos de
material perigoso.
16 - Nunca umedeça rótulos com a língua; use água ou rótulos auto-
adesivos.
17- Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os
deixando sobre a bancada.
18 - Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso.
19 - As sub-culturas de micro-organismos infecciosos devem ser feitas em
capelas.
20 - Os cultivos após a leitura devem ser encaminhados para esterilização,
portanto não os colocar na estufa ou despejar na pia.
21- Colocar os materiais contaminados (pipetas, lâminas e etc.) em
recipientes apropriados colocados na bancada, ou imediatamente após o
uso colocá-las imersas em desinfetantes;
22- Todos os líquidos e sólidos contaminados devem ser descontaminados
antes de eliminados ou então, reutilizados. Os materiais esterilizados em
autoclaves ou incinerados fora do laboratório deverão ser acondicionados
em recipientes fechados e impermeáveis.
23 - Desinfetar a bancada de trabalho com álcool ou lisoforme ou
hipoclorito de sódio, ao início e término de cada aula prática. Isto removerá
microorganismos que possam contaminar a área de trabalho.
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24 - Seguir as normas de uso de aparelhos. O microscópio deve ser
manuseado cuidadosamente e após o seu uso, desligá-lo, limpá-lo, e
colocar a capa.
25- Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou
substâncias inflamáveis por perto.
26- Trabalhar sempre próximo ao fogo, preservando o cuidado pessoal.
Bico de Bunsen
A utilização do Bico de Bunsen é essencial para a diminuição de
microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele
apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama
ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama
azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É
importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é
importante para que o processo de Flambagem seja executado
adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As
zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve
ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são
zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas
para a Flambagem). (fig. 1).
Figura 1
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AULA TEÓRICA E PRÁTICA II: Desinfecção e Esterilização Terminologia: ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa à destruição total de todas as formas de
vida de um material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos.
DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos
microrganismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a
potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local.
ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um
objeto, superfície ou local.
LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os
procedimentos de desinfecção ou esterilização.
I- ESTERILIZAÇÃO:
A esterilização é o processo que inativa os microorganismos presentes em
determinado material ou ambiente, portanto é o método indicado para uso em
itens que de forma alguma podem ser usados quando houver qualquer tipo de
contaminação.
A melhor maneira de garantirmos a destruição de microrganismos
presentes em instrumentos e equipamentos é mediante o uso do calor. As
maiorias dos microrganismos desenvolvem-se em temperaturas próximas a do
corpo humano, ou seja, 37ºC. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas,
são destruídos; o que não acontece quando os colocamos em contato com
baixas temperaturas, pois nesse caso o microorganismo fica apenas inibido, e
não é destruído.
Alguns microorganismos produzem esporos, que são formas de resistência,
podendo permanecer inativos por longos períodos e depois voltar ao estágio
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inicial de infectividade. Portanto as técnicas de esterilização devem destruir
tanto a célula bacteriana, como os esporos.
Existem diversos métodos de esterilização: Físicos ou Químicos. Os
métodos de esterilização mais empregados são os que utilizam o calor, seja este
úmido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur).
I.1- Esterilização por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur)
Este tipo de esterilização é realizado a temperaturas de 140ºC a 180ºC,
com tempo de exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas equipadas
com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente
alta levam a desnaturação e oxidação das proteínas, que resultam na morte dos
microorganismos.
A utilização do calor seco leva mais tempo que o calor úmido, mas como
existem materiais que não podem ser esterilizados no calor úmido, o calor seco
é o preferido. É indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de
ponta, os quais podem oxidar na presença do vapor da autoclave, e materiais
impermeáveis como ceras, pomadas e óleos.
Para ser eficiente, este processo depende de:
- Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação
do material.
- Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente
embalados.
- A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a
estufa não pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma
distância de 2 cm entre as caixas.
- O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do
material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi
atingida novamente.
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I.2- Esterilização pelo Calor Úmido
O calor úmido pode ser utilizado para destruir microrganismos presentes
em materiais através das formas de: vapor d’água, água fervente e água
aquecida abaixo de seu ponto de ebulição.
• Água fervente
É a água levada ao ponto de ebulição: 100ºC, este procedimento destrói os
microrganismos vegetativos presentes no meio líquido. Entretanto, os materiais
ou objetos contaminados não são esterilizados com segurança, pois alguns
esporos bacterianos podem resistir a 100ºC por mais de 1 hora.
• Vapor d’água
O vapor d’água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor
úmido. O aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais
eficiente para destruir os microorganismos e os esporos, que o calor seco.
A autoclavação é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos.
A penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos
microorganismos, e por este motivo é mais rápido.
A eficiência do processo de esterilização depende de alguns fatores:
� Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo
adequadamente embalados.
� O tempo deve ser contado a partir do momento em que a
temperatura de 121ºC é atingida.
� A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir
que o vapor atinja todo o material por igual.
� Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo,
neste caso deve ser novamente esterilizado.
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Controle da Esterilização
É imprescindível o controle de qualidade nos processos de esterilização.
Como se trata de um processo que inclui diversas variáveis (tempo,
temperatura, limpeza prévia, conhecimento da pessoa responsável pelo
processo, etc), se qualquer destas variáveis for negligenciada, o processo não
será efetivo e o risco de contaminação é eminente.
O controle deve ser realizado através de métodos químicos e
bacteriológicos. Os métodos químicos utilizam uma fita especial que mostra,
através da mudança de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os métodos
bacteriológicos utilizam a bactéria chamada Bacillus subtilis, que por ser
produtora de esporos, é uma eficiente indicadora da qualidade do processo.
Considerações importantes
1. É importante lembrar que é necessária uma limpeza perfeita dos
materiais/instrumentos antes de serem submetidos à esterilização. É
adequado lavar manualmente os instrumentos com detergente e água morna
antes da esterilização.
2. Depois de esterilizados, os equipamentos devem ser conservados
em embalagens apropriadas, caso contrário voltam a se recontaminar com
microrganismos presentes no ambiente.
3. Deve-se realizar o controle periódico da qualidade do processo,
através de profissionais preparados para tal procedimento.
II- DESINFECÇÃO
Este processo pode ser realizado de forma física (Pasteurização) e química
(Desinfectantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto,
intermediário ou de baixo nível, dependendo da quantidade de microrganismos
inativados.
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Exemplo: Desinfecção de alto nível: inativa todos os microrganismos, exceto
esporos. Ex: HBV, HIV e M. tuberculosis. Desinfecção de nível intermediário: é
aquela que inativa bactérias na forma vegetativa (M. tuberculosis), fungos e a
maioria dos vírus. Desinfecção de baixo nível: inativa a maioria das bactérias
na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vírus.
II.1- Desinfecção por agentes físicos:
• Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulição (100º C)
Pasteurização: é o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente
para eliminar as células vegetativas de microrganismos, mas não os esporos,
mesmo assim, considera-se como um método de desinfecção de alto nível. É
indicado o uso de temperatura de 77ºC por 30 minutos.
II.2- Desinfecção por agentes químicos:
11.2.a) Método de Desinfecção de alto nível:
• Glutaraldeído: é indicado qualquer objeto sensível ao calor, e para rápida
desinfecção de itens reutilizados. É utilizado em solução a 2% com pH
alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos.
• Formaldeído: Pode ser encontrado na forma sólida (pastilhas formalina)
ou como solução aquosa 37-40% (diluído em álcool ou água). A solução
deve ser usada por 30 minutos sendo a concentração de 8% em solução
alcoólica e 10% em solução aquosa.
• Peróxido de Hidrogênio: Age em presença de matéria orgânica e deve-se
fazer a imersão do material em solução com concentração de 3-6% por
15-30 minutos.
• Ácido Peracético: A concentração de uso é variável para a desinfecção,
sendo que o tempo de exposição deve ser no mínimo de 20 minutos.
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11.2.b) Método de Desinfecção de nível intermediário:
• Compostos Clorados: Causa a inibição de reações enzimáticas
intracelulares, desnaturação de proteínas, e inativação de ácidos
nucléicos. Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem
baixo custo e ação rápida, entretanto seu uso é limitado, pois é irritante,
instável por 24 horas, fotossensível e volátil, além de ser corrosivo para
metais. Seu uso é indicado para artigos de vidro e borracha, sendo
contra-indicado para metais (é corrosivo). Apresenta-se na forma líquida
(ex: Hipoclorito de sódio) e na forma sólida (ex: Hipoclorito de Cálcio), e o
tempo de exposição dos artigos a estes compostos é de aproximadamente
10 minutos.
• Alcoóis (Etílicos e Isopropílicos): Seu mecanismo de ação é através da
desnaturação de proteínas. São usados em concentração de 70% peso
por 10 minutos, para a desinfecção de superfícies. O uso destas
substâncias é contra-indicado para materiais médicos-cirúrgicos,
borracha, plástico e acrílico.
• Fenólicos: Seu mecanismo de ação é através do rompimento da parede
celular, precipitando proteínas, quando usado em alta concentração, e
alteração dos sistemas enzimáticos fundamentais, quando utilizado em
baixa concentração. Sua concentração para uso é de 0,4-5% sendo que o
tempo de exposição deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso é
indicado para descontaminação de ambiente hospitalar.
• Iodóforos: Sua ação é através de seu alto poder de penetração na parede
celular, levando a ruptura de proteínas. São utilizados em concentração
de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos.
11.2.c) Método de Desinfecção de baixo nível
• Álcoois: em concentrações baixas (menor que 70%)
• Compostos Clorados
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• Fenólicos: em concentração menor que 5%
• Iodóforos: em concentração menor que 30 ppm
• Compostos de Amônio Quaternário: Age através da inativação de
enzimas, desnaturação de proteínas essenciais, ruptura da membrana
celular. Sua concentração para uso é de 0,4 a 0,6% por um tempo de no
mínimo 10 minutos. É indicado para a limpeza de ambiente hospitalar
(pisos, paredes e superfícies).
• Detergentes: São agentes tensoativos, com ação detergente, umectante e
emulsionante. Podem ser classificados como Catiônicos (p. ex.
Quaternários de Amônio), Aniônicos (p. ex. sabões, detergentes
sulfatados ou sulfonados), e Enzimáticos. Este último tem como princípio
ativo enzimas proteinases, amilase e lípases, e, portanto, causam
transformações em proteínas, polissacarídeos e gorduras (ex: Endozime).
Principais Compostos Utilizados em Desinfecção e Assepsia
Agente Espectro de
ação* Uso Modo de ação Tempo de
exposição Desvantagens
Álcoois (70-80%) Gram-positivas Gram-negativas BAAR**
Antissépticos Desinfectantes
Desnaturação protéica dissolução de lipídeos
Curto (10-15 min) Pouco ativo contra esporos
Fenóis Gram-positivas Gram-negativas BAAR
Desinfectantes Desnaturação protéica
Efeito imediato Fenol puro é corrosivo e de odor desagradável
Compostos Quaternários de amônio
Gram-positivas Gram-negativas
Antissépticos Sanitizantes Desinfectantes (instrumentos cirúrgicos)
Alteração da membrana celular bacteriana
Curto (10-30 min) Não age sobre BAAR e esporos
Cloro Gram-positivas Gram-negativas BAAR
Tratamento da água
Inativação enzimática agente oxidante
Efeito imediato Odor irritante pouco ativo contra esporos
Iodo Gram-positivas Gram-negativas BAAR
Antissépticos Desinfectantes
Inativação enzimática
Efeito imediato Odor irritante pouco ativo contra esporos
Iodóforos Gram-positivas Gram-negativas BAAR
Antissépticos Desinfectantes
Inativação enzimática
Efeito imediato Pouco ativo contra esporos
Aldeídos*** Gram-positivas Gram-negativas BAAR
Desinfectantes (instrumentos e superfícies)
Desnaturação protéica agente alquilante
Curto (formas vegetativas) Prolongado (esporos)
Tempo de exposição longo
Metais pesados Gram-positivas Gram-negativas
Antissépticos Inativação enzimática
Só agem enquanto em contato
Não atuam sobre BAAR e esporos
*- Formas vegetativas; Fonte: Trabulsi, L.R., Microbiologia. Livraria Atheneu, R.J., 1991. **- Bacilos álcool-ácido resistentes; ***- Ativos contra esporos
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AULA PRÁTICA III
Técnica I: O experimento que será realizado tem por objetivo verificar a
ação de antissépticos sobre a microbiota das mãos, para tanto devem ser
seguidas as seguintes etapas:
1- Pegar uma placa de Petri contendo ágar, e dividi-la em 4 partes iguais.
Utilizar para isso a caneta de retroprojetor, fazendo a divisão na parte de
baixo da placa.
2- Identificar cada quadrante com os respectivos títulos: Controle (C), Mão
Suja (MS), Detergente (Det), Álcool 70% (A). Deve ser preparada a placa
seguindo o esquema abaixo.
3- No quadrante identificado como “ Mão Suja” o aluno deve encostar o dedo
(sem lavar) no ágar por 1 minuto.
4- A seguir o mesmo aluno deve lavar as mãos com detergente, secá-las
levemente e encostar o mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como
“Detergente” por 1 minuto.
5- O mesmo aluno deve então lavar as mãos com álcool, secá-las e encostar o
mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como “álcool” por 1 minuto.
6- A placa deve ser levada para incubação.
OBS: Nada deve encostar no quadrante identificado como “Controle”.
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AULA PRÁTICA IV (continuação Aula III - Resultados - desinfecção/assepsia)
Observe as placas do experimento da aula anterior e responda-as questões.
Em seguida entregue ao seu professor de laboratório.
1- Faça uma representação esquemática dos resultados obtidos na avaliação
da microbiota das mãos.
Crescimento Bacteriano
- + ++ +++ ++++
Placa I
Controle Mão Suja Detergente
Álcool 70%
2- Como você interpreta os resultados obtidos? Qual a importância da anti-
sepsia das mãos? Nome do(a) aluno(a): __________________________________________________
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Aula Prática V Microscopia a Fresco
Sabemos que as bactérias são seres microscópicos, portanto a sua
observação direta depende do uso do microscópio. Essa observação pode ser
feita mediante o uso de corantes ou a fresco, sem coloração.
A microscopia a fresco permite verificar viabilidade, tamanho, forma
natural das bactérias e atividades celulares como a motilidade bacteriana.
A respeito da motilidade é possível observar dois movimentos: o movimento
flagelar, que é ativo e característico de bactérias dotadas de flagelos, e o
movimento browniano, o qual é passivo e ocorre na direção das correntes
líquidas que se formam nas preparações.
Técnica: Será utilizada a técnica denominada Gota Pendente, na qual o inóculo
fica suspenso em uma lâmina escavada (lâmina de Koch).
1- Retire com uma alça esterilizada uma gotícula da cultura-teste.
2- Deposite esta gotícula no centro de uma lamínula previamente limpa e
seca.
3- Coloque um pouco de vaselina nas bordas da concavidade da lâmina
escavada, também limpa e seca.
4- Inverta a lâmina côncava sobre a lamínula de forma que a gotícula ocupe
o centro da concavidade.
5- Inverta novamente a posição da lâmina, de forma que a gotícula fique
pendente no centro da concavidade.
6- Leve a preparação ao microscópio e focalize a gota com objetiva de 40x
com luz reduzida (as bactérias possuem índice de refração próximo ao da
água).
Diferencie os dois tipos de movimento: ativo (flagelar) e passivo (browniano). O
movimento flagelar é caracterizado pelo deslocamento, pela mudança da
posição da bactéria, enquanto que o browniano não acarreta mudança na
posição, não há deslocamento autônomo da bactéria.
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Para fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta
aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.
1- Desenhe o que foi visualizado na observação direta de microrganismos,
exemplificando o movimento observado.
2- Qual é a finalidade da utilização da técnica de gota pendente? Nome do(a) aluno(a): __________________________________________________
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Prática VI
Aula Teórica e Prática de Meios de Cultivo e Técnicas de Semeadura Meios de Cultivo Os meios de cultivo, também chamados meios de cultura, são complexos que se
destinam ao cultivo artificial de microrganismos.
As técnicas de semeadura permitem que o cultivo destes microrganismos nos
meios de cultura seja eficiente e que as seguintes finalidades sejam atingidas:
- crescimento bacteriano;
- isolamento bacteriano;
- estudo da morfologia colonial;
- pesquisa de patogenicidade;
- pesquisa das características bioquímicas.
Os meios de cultivo devem conter as substâncias exigidas pelas bactérias para
o seu crescimento e multiplicação. Para que possam fazer a síntese de sua
própria matéria nutritiva devem dispor de fontes de carbono (proteínas,
açúcares), fontes de nitrogênio (peptonas) e fontes de energia. São também
necessários alguns sais inorgânicos, vitaminas e outras substâncias
favorecedoras do crescimento.
Classificação dos meios de cultivo:
- Quanto à consistência:
• Meios líquidos: são aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma
solução aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto,
ou seja o meio sofre uma turvação.
• Meios semi-sólidos: são aqueles que possuem na sua composição, além dos
nutrientes, uma pequena porcentagem de um polissacarídeo proveniente
de algas marinhas, chamado ágar. São geralmente utilizados em tubos e a
partir desse tipo de cultura é possível observar a motilidade bacteriana.
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• Meios sólidos: são aqueles que possuem uma porcentagem maior de ágar
(cerca de 15 g/litro de água destilada), além dos nutrientes. Podem ser
dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade.
Através do meio sólido em placas de Petri é possível, utilizando-se a
técnica do esgotamento, conseguir o isolamento de colônias bacterianas e,
portanto, é o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial.
Já a cultura em ágar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano
com a obtenção de uma biomassa de microrganismos.
- Quanto à função:
• Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de
microrganismos pouco exigentes. Ex: caldo simples.
• Meios de enriquecimento: são adicionadas ao meio simples substâncias
enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: Ágar
sangue.
• Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados
microrganismos em detrimento de outros, geralmente pela adição de
substâncias inibidoras. Ex: Ágar Salmonella-Shigella.
• Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de
microrganismos com características relativamente definidas, o que permite
diferenciar um grupo ou uma espécie de microrganismo. Ex: Ágar
MacConkey.
• Meios de manutenção: são aqueles destinados a manter a viabilidade de
uma cultura bacteriana. Ex: Ágar Nutriente.
-Quanto à natureza:
• Meios animados: são constituídos de células vivas, como animais de
laboratório, tecidos vivos ou ovo embrionado.
• Meios inanimados: não possuem células vivas. Podem ser naturais ou
sintéticos. Naturais são aqueles que possuem substâncias provenientes da
natureza, e o sintético contém substâncias obtidas em laboratório. Ainda
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podemos obter meios de cultivo semi-sintéticos, que são resultantes da
união dos dois anteriores.
Os meios de cultivo são preparados e armazenados seguindo um rigoroso
controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades
nutricionais e garantida a esterilidade até o momento de sua utilização.
Técnica de Semeadura
A escolha da técnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com
o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo, porém algumas regras
devem ser seguidas nas inoculações:
- A agulha e alça de níquel-cromo (também chamada de agulha e alça de
platina) devem ser esterilizadas por flambagem antes e após qualquer
cultivo. Tome cuidado de esfriá-las antes da coleta.
- Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de
Bunsen.
- Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a
bancada durante o cultivo.
Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar
ou rasgar o ágar, pois poderá ocorrer acúmulo de bactérias neste setor do
meio além de alterar as condições de crescimento bacteriano.
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Figura 1
Técnica I: Meio Líquido
1- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é
apresentada.
2- Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo e agite
a alça.
Técnica II: Meio semi-sólido
1- Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que
lhe é fornecida.
2- Faça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias no meio de
cultivo semi-sólido (Figura 2).
Figura 2
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Técnica III: Meio sólido (ágar inclinado)
1- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é
apresentada.
2- Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba
fazendo estrias na superfície do Agar (Figura 3).
Técnica IV: Meio sólido (Placa de Petri – técnica do esgotamento)
1- Divida a Placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta
retroprojetor na parte de baixo da placa.
2- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é
apresentada.
3- Faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor
forma possível toda a superfície da placa.
Figura 4
Figura 3
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Para fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.
1- Cite os três tipos de meio de cultivo utilizados na aula prática e suas finalidades.
2- Qual a finalidade do cultivo em meio sólido em placa de Petri através de estrias de esgotamento? Explique.
3- Como se analisa o resultado obtido no crescimento do meio semi-sólido? Nome do(a) aluno(a): __________________________________________________
21
Aula Prática VII
Microscopia de Gram A parede celular de bactérias Gram-positivas difere-se das bactérias Gram-
negativas pela presença de uma espessa camada de peptidoglicano e pela
ausência de uma membrana externa. Esta diferença de constituição da parede
celular é a base da coloração de Gram, uma técnica primordial no diagnóstico
microbiológico, visto que através dela se definem características morfológicas e
tintoriais da bactéria em pesquisa.
A coloração de Gram consiste em tratar bactérias sucessivamente com
cristal violeta ou genciana, lugol, álcool-acetona e fuccina (ou safranina). O
cristal violeta/genciana e o lugol formam um complexo denominado
iodopararosanilina, o qual confere coloração roxa tanto pelas bactérias Gram-
positivas, quanto as Gram-negativas. Com a adição de álcool-acetona, as
bactérias Gram-negaticas liberam o complexo formado, pois a camada de
peptidoglicano é de pequena espessura, enquanto que as Gram-positivas retêm
o complexo, permanecendo roxas. A adição de fuccina (ou safranina) não altera
a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada as bactérias Gram-
negativas, que foram descoloridas pelo álcool-acetona.
Técnica:
-Esfregaço da cultura bacteriana líquida:
1- Flambe uma alça, deixe esfriar, mantendo-a próximo a chama.
2- Retire uma amostra da cultura com a alça e deposite no centro da lâmina.
3- Espalhe o material com a alça em movimento circular, obtendo um
esfregaço de forma oval, uniforme e fino.
4- Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se
cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o
material fique bem aderido.
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-Esfregaço de cultura bacteriana sólida:
1- Flambe uma alça, deixa esfriar, mantendo-a próximo a chama.
2- Retire uma gota da água estéril e deposite sobre a lâmina.
3- Flambe novamente a alça, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura
sólida.
4- Leve a amostra até a gota de água depositada sobre a lâmina, e
homogeinize com movimentos circulares, para obter um esfregaço de forma
oval, uniforme e fino.
5- Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como
se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o
material fique bem aderido.
- Adição de Corantes:
1- Coloque a lâmina com o esfregaço sobre um suporte.
2- Cubra a lâmina com cristal violeta (Gram I) e deixe agir por 1 minuto.
3- Lave a lâmina em jato fraco de água corrente, do lado contrário ao esfregaço.
4- Cubra a lâmina com lugol (Gram II), deixe agir por 1 minuto e depois lave
novamente a lâmina.
5- Cubra a lâmina com a solução de álcool-acetona (Gram III), verifique a
descoloração que deve ocorrer em cerca de 20 segundos.
6- Cubra a lâmina com fuccina Gram IV), deixe agir por 30 segundos, e,
novamente lave a lâmina.
7- Seque inicialmente o lado da lâmina oposto ao esfregaço com papel toalha, e
a seguir seque o restante da lâmina na chama do bico de Bunsen (como se
estivesse “cortando” a chama).
8- Leve a lâmina ao microscópio e observe em objetiva de imersão. (Não
esqueça de colocar uma gota de óleo para imersão sobre o esfregaço).
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Para fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta
aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.
1- Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio,
mostrando a morfologia bacteriana e a reação tintorial.
2- Fale sobre o fundamento da técnica de Gram. Nome do(a) aluno(a): __________________________________________________
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Aula Prática VIII
Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (ANTIBIOGRAMA)
Antibiogramas são bioensaios conduzidos “in vitro” que visam testar a
sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. A proposta primária deste teste
é guiar o clínico na escolha do agente apropriado para a terapia. Os testes de
rotina fornecem dados acumulados, que são informações sobre os agentes para
uso empírico. Além disso, estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a
atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de
bactérias resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada
qualitativamente como sensível, intermediário ou resistente; ou
quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC
(minimun bactericidal concentration).
1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de
diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio
sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação
determina-se MIC e/ou MBC.
2- Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um
teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são
colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo.
A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível, formando um
halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas.
Para a garantia desta técnica, alguns fatores são essenciais:
− Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton, que se
caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias
antagônicas.
− Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de
bactérias, devendo-se realizar a coloração de Gram. A densidade do
inóculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padrão de turbidez
(Escala de Mac-Farland).
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�SWAB
Técnica:
Para cumprir os objetivos desta aula será utilizado o método de difusão:
1- Sature um swab de algodão com a suspensão bacteriana (Fig 1). Remova o
excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo.
2- Semeie a suspensão sobre a superfície estéril de uma placa contendo ágar
(Muller-Hinton), utilizando sucessivamente três direções para obter um
inóculo uniformemente espalhado sobre toda a superfície do ágar ( Fig 2 ).
3- Distribua cinco discos de antibiótico, sendo cada um de um antimicrobiano
diferente, sobre a superfície do ágar inoculado, seguindo o esquema abaixo
(Fig 3). Deixe uma distância de aproximadamente 1 cm entre a borda da
placa e o disco.
4- Pressione levemente os discos para que não se desprendam durante a
incubação.
5- Incube as placas por 24 horas a 37°C.
Figura 1
Figura 2
Figura 3
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AULA IX
Análise dos Resultados
(Antibiograma)
Através da análise dos resultados poderemos classificar os microrganismos
testados em: “resistente”, “intermediário”, “moderadamente sensível”, e
“sensível”, dependendo da formação ou não de halo inibitório e também de seu
diâmetro (Fig 4).
No caso de formação de um halo inibitório, este deve ter seu diâmetro
medido, e a medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas
(Fig 5). De modo geral, estas tabelas determinam medidas de diâmetro, e dessa
forma a medida encontrada em cada caso pode então ser enquadrada em uma
das quatro categorias supracitadas.
Figura 4
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FIGURA 5: Exemplo de Tabela de Halos de Sensibilidade
Antimicrobi
ano Código [µg]
Halos de Inibição (mm)
Resisten
te
Intermediá
rio
Moderadam
ente
sensível
Sensív
el
Bacitracina BAC 10 < 8 9 a 12 - > 13
Cefotaxima CTX 30 < 14 - 15 a 22 > 23
Gentamicina GEN 10 < 12 13 a 14 - > 15
Tetraciclina TET 30 < 14 15 a 18 - > 19
Vancomicina VAN 30 < 9 10 a 11 - > 12
EXEMPLO: Se para um determinado microrganismo, utilizando-se o
antimicrobiano Gentamicina, foi medido o diâmetro de um halo de inibição e
constatou-se que este era de 16 mm, tal microrganismo deve ser classificado
como sensível para a Gentamicina. Entretanto se o diâmetro do halo fosse de
13 mm o microrganismo seria classificado como intermediário a Gentamicina.
No caso de não formação de um halo de inibição, o microrganismo seria
considerado resistente.
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Para fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório. 3- Descreva os resultados obtidos, indicando qual a bactéria utilizada, a
formação ou não do halo de inibição para cada antimicrobiano utilizado, indicando o tamanho do halo, caso este tenha se formado, e a classificação da bactéria a respeito de sua sensibilidade a cada antimicrobiano.
2- Explique como se forma um halo de inibição. Nome do(a) aluno(a): __________________________________________________
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Aula Prática X
Contagem de Microrganismos
Exemplos: Escova dental ou outros materiais...
O experimento a ser realizado, tem por objetivo a verificação da presença
de microrganismos na escova dental, através de procedimentos quantitativo
(contagem) e qualitativo (coloração de Gram).
Técnica:
1- Mergulhar a escova dental em balão ou erlenmeyer com caldo
nutritivo estéril (trabalhe próximo à chama do Bico de Bunsen).
2- Agite a solução por 5 minutos.
3- Retire a escova.
4- Faça a diluição, retirando, com auxílio de uma pipeta esterilizada,
1ml da solução e transferindo para um tubo contendo 9 ml de solução
salina.
5- Agite bem o tubo.
6- Repita os procedimentos 4 e 5 para cada nova diluição sempre
pegando uma amostra de 1 ml da última solução preparada, e não se
esquecendo de a cada nova diluição utilizar uma nova pipeta esterilizada.
7- Retire 0,1 ml, utilizando uma pipeta esterilizada, da solução com
diluição de 10-1.
8- Espalhe por toda a superfície da placa de ágar, utilizando a alça de
Drigalski (de vidro).
9- Repita os procedimentos 7 e 8 para as diluições de 10-2, 10-3, 10-4
e 10-5 , não esquecendo de identificar as placas com as diluições
correspondentes a cada uma.
10- Leve as placas para incubar.
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AULA XI Análise dos Resultados
Continuação da aula Contagem de Microrganismos
1- Análise quantitativa:
O objetivo desta análise é determinar o número de bactérias por ml, para isso:
- Selecione uma das placas incubadas, que contenha entre 30 e 300 colônias;
- Conte o número de colônias;
- Calcule, no espaço abaixo reservado, a quantidade de microrganismos
utilizando a seguinte fórmula:
* UFC significa Unidade Formadora de Colônia, uma vez
que a contagem feita é referente às colônias e não às
células presentes.
** 10 é um fator de correção.
EXEMPLO: Se são contadas 105 colônias em uma placa onde foi feita diluição de 10-2, o cálculo final será:
UFC= 105 x 10 x 102 = 1,05 x 105 UFC/ml
2- Análise dos microrganismos através do método de Gram. O objetivo desta análise é verificar o tipo de microrganismos presentes segundo:
forma, arranjo e reação tintorial (Gram positivo ou Gram negativo).
- Com a alça esterilizada, retire uma gota do tubo de ensaio com água destilada
e deposite sobre a lâmina.
UFC* = (nº de colônias) x 10** x (diluição utilizada para contagem)
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- Com a alça esterilizada, retire 2 a 3 colônias da placa com as culturas
bacterianas.
- Leve a massa bacteriana até a gota previamente depositada sobre a lâmina, e
misture com movimentos circulares, formando um esfregaço de forma
aproximadamente oval.
- Seque a lâmina na chama do bico de Bunsen.
- Core a lâmina, através do método de Gram. (siga as instruções da Técnica de
adição de corantes Aula Prática VI).
CÁLCULO DA UFC
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Responda-as questões e entregue ao seu professor de laboratório. 4- Calcule a quantidade de microrganismos (UFC), seguindo as instruções da
Análise Quantitativa, dos cultivos feitos a partir de microrganismos da escova dental.
5- O que se pode concluir a respeito da quantidade de microrganismos
encontrados na escova dental ? 6- Utilizando o método de Gram, quais os tipos bacterianos foram
predominantemente observados dentre os microrganismos encontrados na escova dental?
Nome do(a) aluno(a): __________________________________________________
