Báo cáo CNVS (1)

ĐẠI HỌC Y DỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA DƯỢC

BỘ MÔN VI SINH – KÝ SINH________________________________

VI SINH

Nhóm thực tập: IVBuổi thực tập: Chiều thứ tƣ

Bàn số 2Tiểu nhóm: 4Lớp: DCQ2010

Niên khóa: 2013 - 2014Báo cáo thực hành : CÔN

STT Họ và tên sinh viên

Tổ GHI CHÚ1 Lê Thanh Chi 122 Đặng Hữu Thanh Hà 123 Nguyễn Thành Long 124 Trần Khánh Ngọc 125 Hoàng Võ Nghĩa Nhâ

n12

6 Đào Tiến Trung 12

(Nhóm IV – Chiều thứ 4 – Bàn số 2 – Ti

G NGHỆ VI SINH

DANH SÁCH SINH VIÊN THỰC TẬP

MỤC LỤC1. CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT - SINH KH Ố I VI SINH V Ậ T ............................................................................ 12. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI C Ủ A VI KHUẨ N PROBIOTIC............................................................... 43. TINH CH Ế ENZYME AMYLASE B Ằ NG ALGINAT .................................................................................................... 64. C Ố ĐỊ NH CGTase LÊN ALGINAT ............................................................................................................................ 85. CẢM ỨNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP - ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE (PAGE)............... 126. TINH CHẾ PROTEIN BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC & S ẮC KÝ TRAO ĐỔ I ION.......................................................... 14

Nhóm thực tập IV – Chiều thứ 4 Bàn số 2 – Tiểu nhóm 4

Trang iiBáo cáo thực hành : CÔN

G NGHỆ VI SINH

TUẦN 01 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT

SINH KHỐI VI SINH VẬT(Ngày 04/12/2013)

---oOo---1. TÓM TẮT LÝ THUYẾT1.1.Chọn lọc giống vi sinh vật. Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm:

Phân lập từ tự nhiên Gây đột biến Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn Bảo quản giống

Một số phương pháp phát hiện giống vi sinh vật có đặc tính mong muốn có thể dựa vào các yếu tố sau:

Chất chuyển hóa tạo ra: kháng sinh, sắc tố,… Enzym ngoại bào tác động lên các cơ chất trong môi trường Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của các vi sinh vật Sự thay đổi hình thái.

Một số phương pháp bảo quản giống (thường mang tính kinh nghiệm). Giữ giống trên thạch Giữ giống dưới lớp dầu khoáng Giữ giống trong cát Đông lạnh Đông khô

1.2.Sinh khối vi sinh vật. Sinh khối là toàn bộ số vi sinh vật thu được sau khi lên men. Trong công nghệ vi sinh, người ta sản

xuất sinh khối để thu sản phẩm nội bào hoặc probiotic. Trong thực nghiệm tiến hành thu sinh khối vi sinh vật bằng nuôi cấy ở 300C và 370C trên môi trường

TSB có bổ sung khoáng và không bổ sung khoáng, trong điều kiệ

Loại Số lƣợng Màu

2 9 Bên

ngoài

trong

Bên ngoài đục Màu

trắng

8 mm

n có lắc và không lắc để xácđịnh điều kiện nuôi cấy tối ưu theo 2 phương pháp: đo độ đục trên

máy đo quang và đếm sống. Phương pháp đo độ đục: Chọn bước sóng thích hợp. Ví dụ: Đo

OD600 với Bacillus indicus. Phương pháp đếm sống: Pha loãng dịch nuôi cấy thành nhiều cấp

độ và chọn nồng độ thích hợp cóthể đếm sống được (từ 15 đến 300 khóm trên một hộp thạch).

Bảng 1.1. So sánh 2 phương pháp đếm số lượng tế bào.Đo độ đục Đếm sống

Ƣu điểm Thao tác

nhanh,

gọn. Đếm

chính

xác số

khóm

Số lượng

vi khuẩn sống tương ứng.Nhƣợc điểm Gây sai số thừa do:

Xác vi khuẩn chết. Tạp chất trong dịch

nuôi cấy.

Dễ bị ngoại nhiễm. Khi cấy phải pha loãng huyền trọc vi

khuẩn ra nhiều cấp độ.

2. KẾT QUẢ THỰC HÀNH.2.1.Chọn lọc giống vi sinh vật.2.1.1. Phân lập chủng có khả năng tiết amylase ngoại bào.


Trang 1Báo cáo thực hành : CÔN

G NGHỆ VI SINH

Phƣơng pháp: Cấy dịch nuôi cấy lên địa thạch tinh bột và ủ qua đêm tại 370C. Dùng dung dịch

Lugol để nhận biết các khuẩn lạc có khả năng thủy phân tinh bột do tiết ra amylase ngoại bào. Kết quả: Có 20 khuẩn lạc chia thành 3 loại. Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2. Kết quả phân lập các chủng có khả năng tiết amylase ngoại bào.

Đƣờng kính vò

ngTrƣớc khi nhỏ Lugol Sau khi nhỏ

Lugol phân giải tinh bột1 5 Đục Màu nâu đen -

Bên trong đụcMàu

trắng 5

mm

3 6Bên

trong

trắng

Kêt luận: Chủng tạo khuẩn lạc 2 và 3 có khả năng tiết ra amylase

Bìa răng cưa Có

kết tủa

đục

-

ngoại bào. Nên sử dụng chủng số 3để có hiệu suất thu hoạch amylase cao nhất.

2.1.2. Phân lập chủng có khả năng tiết protease ngoại bào. Phƣơng pháp: Cấy dịch nuôi cấy lên địa thạch gelatin và ủ qua đêm tại 370C. Dùng dung dịch TCA

50% để nhận biết các khuẩn lạc có khả năng phân giải protein do tiết ra prolase ngoại bào. Kết quả: Có 15 khuẩn lạc chia thành 4 loại. Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3. Kết quả phân l ập các chủng có khả năng tiết proteas e ngoại bào.

Loại Số lƣợngMàu

Trƣớc khi nhỏ TCA Sau khi nhỏ TCA

Đƣờng kính vòngphân giải protein

1 3Viền

trắng,

trong

đục

2 3 Đục, bìa răng cưa Có kết tủa đục -3 5 Đục, bìa dợn sóng Không có

kết tủa đục 5 mm4 4 Đốm trắng nhỏ Không có kết tủa đục 9 mm

Kêt luận: Chủng tạo khuẩn lạc 3 và 4 có khả năng tiết ra protease ngoại bào. Nên sử dụng chủng số 4

để có hiệu suất thu hoạch protease cao nhất.2.1.3. Phân lập chủng có khả năng kháng kháng sinh. Chủng thử nghiệm: Staphylococcus aureus. Phương pháp vạch thẳng vuông góc :

Tiến hành : Cấy chủng thử nghiệm trên hộp thạch đã cấy sẵn chủng khảo sát (Đã ủ qua đêm ở

370C), đường cấy chủng thử nghiệm vuông góc với đường cấy chủng khảo sát. Ủ qua đêm ở 370C.

Kết quả : Khảo sát hai chùng. Chỉ có chủng (1) có khả năng tiết ra kháng sinh với khoảng cách ức

chế là 12 mm Nên sử dụng chủng (1) để nghiên cứu sản xuất kháng sinh. Phương pháp khuếch tán.

Tiến hành : Trải chủng khảo sát lên hộp thạch. Đục lỗ đường kinh 6mm bằng dụng cụ tiệt trùng.

Nạp vào các lỗ dịch nuôi cấy các chủng kiểm tra đã lọc qua giấy lọc 0,45m để loại bỏ tế bào. Tiến

hành song song với mẫu trắng. Kết quả :

Bảng 1.4. Kết quả phân l ập các chủn g có khả năng tiết kháng sinh

Chủng 1 2 3 4 ChứngĐường kính vòng ức chế (mm) 19 5 0 100


Nhiệt độ Môi trƣờng TSB

Số tế bào/mL

Lắc OD = 2,142

Lắc OD

= 2,366

Tĩnh OD = 1,163

Tĩnh OD = 1,938

Lắc OD = 2,224

Lắc OD

= 2,867

Tĩnh OD = 0,408

Tĩnh OD = 1,140


G NGHỆ VI SINH

Kết luận : Có 3 chúng tiết ra kháng sinh với mức độ tăng dần là (2) < (4) < (1) Nên sử dụng

chủng (1) để nghiên cứu sản xuất kháng sinh. Có sự ngoại nhiễm xảy ra ở ô chứa chủng (2),

nguyên nhân cói thể do dịch nuôi cấy chưa được lọc sạch tế bào sinh dưỡng.2.2.Sinh khối vi sinh vật2.2.1. Kết quả Chủng khảo sát: Bacillus indicus (vi khuẩn hiếu khí) Công thức :

Đo độ đục: Số tế bào/mL = OD600 0,8 109

Đếm sống: Số tế bào/mL = Số khóm 10số thứ tự hộp + 1. Kết quả xử lý số liệu.

Bảng 1.3. Ảnh hưở ng c ủa điều k iện nuôi cấy đến sinh khối vi sinh vật

(.109)Môi trƣờng TSB(Bổ sung khoáng)

Số tế bào/mL(.109)

300C

370C

1,7136 1,892863 khóm (5X) 0,063 88 khóm (5X) 0,088

0,9304 1,5504Không đạt - 162 khóm (5X) 0,162

1,7792 2,293634 khóm (6X) 0,34 64 khóm (5X) 0,064

0,3264 0,912Không đạt - 15 khóm (6X) 0,15

2.2.2. Nhận xét – Kết luận. Theo phƣơng pháp đo OD600

Nhiều nhất: 370C, lắc, môi trường TSB có bổ sung khoáng. Ít nhất: 370C, tĩnh, môi trường TSB.

Theo phƣơng pháp đếm sống: Nhiều nhất: 370C, lắc, môi trường TSB. Ít nhất: 300C, lắc, môi trường TSB.

Nhận xét: Có sự không tương đồng giữa các kết quả, nguyên nhân có thể do

Thao tác đo quang chưa chính xác Thao tác cấy gây nhiễm tạp, sai số do đếm.

Kết luận: Dựa trên phương pháp đếm sống, B.indicus tăng trưởng mạnh trong môi trường có nhiều

oxy (lắc), nhiệt độ và việc bổ sung khoáng vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng không rõ.



G NGHỆ VI SINH

TUẦN 02 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI

CỦA VI KHUẨN PROBIOTIC(Ngày 11/12/2013)

---oOo---1. TÓM TẮT LÝ THUYẾT Probiotic là một hoặc các vi sinh vật sống khi được đưa vào cơ thể với số lƣợng đủ dưới dạng sản

phẩm lên men hay tế bào khô sẽ tạo ảnh hưởng có lợi đến cân bằng vi sinh vật đường tiêu hóa và

do đó có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe. Các vi sinh vật dùng làm probiotic phải đạt tiêu chuẩn GRAS. Ngoài ra, do sử dụng chủ yếu bằng

đường uống nên các chủng này phải đáp ứng được một số đặc điểm sinh học như khả năng chịu

đựng acid dịch vị và dịch mật. Bài thực tâp sẽ khảo sát tỉ lệ sống sót của vi sinh vật probiotic khi tiếp xúc với các môi trường dịch vị

nhân tạo và dịch mật nhân tạo sau từng khoảng thời gian quy định bằng phƣơng pháp đếm sống.

2. KẾT QUẢ THỰC HÀNH2.1.Vật liệu thực nghiệm. Chủng vi sịnh vật khảo sát

Tế bào sinh dưỡng vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 nuôi qua đêm trên TSB đã điều chỉnh với dung

dịch NaCl 0,85% đạt khoảng 0,4.109 tế bào/mL (OD600 = 0,5).

Bào tử Bacillus subtilis PY79 nuôi 48h trên thạch DSM đã điều chỉnh với dung dịch NaCl 0,85% đạt

khoảng 0,4.109 tế bào/mL (OD600 = 0,5) Môi trường dịch vị nhân tạo: Dùng HCl đặc điều chỉnh pH 1,5 ; 2 và 3. Môi trường dịch mật nhân tạo (pH 6,8): Điều chỉnh đạt nồng độ muối mật là 0,15 ; 0,3 và 0,5%.2.2.Kết quả thí nghiệm2.2.1. Đánh giá khả năng chịu đựng dịch vị nhân tạo Tế bào sinh dưỡng

Bảng 2.1. Khảo sát khả năng chịu đựng dịch vị nhân tạo của dạng sinh dưỡng

Thời gian lắc50rpm (phút)

Số tế bào/mL (.108)Đối chứng pH 1,5 pH 2 pH 3

0 0,134 0,46 - 0,04860 - - 6.5.104 0,4990 - 84 - 4,9

Bào tử (độ pha loãng)Bảng 2.2. Khảo sát khả năng chịu đựng dịch vị nhân tạo củ

a dạng bào tửThời gian lắc50rpm (phút)

Số tế bào/mL (.108)Đối chứng pH 1 pH 2 pH 3

0 12,10 0,85 - 8,1060 - - 1,85 9,5090 1,62 0,75 2,00 16,80



G NGHỆ VI SINH

Nhận xét: v Kết luận: v2.2.2. Đánh giá khả năng chịu đựng muối mật. Tế bào sinh dưỡng (độ pha loãng)

Bảng 2.3. Khảo sát kh ả năng chịu đự ng d ịch mật nhân t ạo c ủa d ạng sinh dưỡ ng

Thời gian lắc Số tế bào/mL (.108)

50rpm (phút) Đối chứng Muối mật 0,15% Muối mật 0,30% Muối mật 0,50%

0 0,286 0,0153 0,12 4,1.103

OD

60 - - 2,3.103 3,5.103

120 0,928 - 0,008 -

Bào tử (độ pha loãng)Bảng 2.4. Khảo sát khả năng chịu đựng dịch mật nhân tạo c

ủa dạng bào tửThời gian lắc Số tế bào/mL (.10

8)50rpm (phút) Đối chứng Muối mật 0,15% Muối mật

0,30% Muối mật 0,50%0 4,30 7,30 0,096 1,0360 2,30 0,104 - -120 2,00 0,084 - -

Nhận xét: v Kết luận: v



G NGHỆ VI SINH

Tuần 03 TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINAT

(Ngày 18/12/2013)

---oOo---1. TÓM TẮT LÝ THUYẾT Emzyme amylase có ái lực mạnh trên liên kết glycoside nên có nhiều ứng dụng. Amylase thô có thể thu

nhận từ nhiều nguồn và được tinh chế để có thể ứng dụng trong y dược. Bài thực tập sử dụng amylase thu được từ khoai lang, hấp phụ trên natri alginate 2% (đệm AcONa

0,2M ; pH 4,8), kết tủa lại bằng dung dịch CaCl2 0,7M và giải hấp bằng glucose 2%. Enzyme tinh chế

được xác định hàm lượng và hoạt tính. So sánh với thí nghiệm tương tự tiến hành trên enzyme thô.

2. KẾT QUẢ THỰC HÀNH2.1.Xây dựng đƣờng chuẩn để xác định hoạt tính amylase

Bảng 3.1. Mối quan hệ giữa hàm lượng tinh bột (mg) và mật độ quang (OD)

Ống 0 1 2 3 4 5Tinh bột (mg) 0,0 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

OD = ODi – OD0 0,000 0,154 0,287 0,404 0,444 0,668

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

y = 0.6181x + 0.0171R² = 0.9749

0 0.2 0.4 0.6 0.8 11.2

Hàm lƣợng tinh bột (mg)

Hình 3.1. Mối quan hệ giữa hàm lượng tinh bột (mg) và mật độ quang (OD)

2.2.Các thông số quy trình tinh chế2.2.1. Tổng số protein (A280nm) Enzyme thô (pha loãng 50 lần)

OD280-TH = 0,258 Tổng thể tích thô: 14mL Tổng lượng protein thô: A280-TH = OD280 Vthô Độ pha loãng =

0,258 14 50 = 180,6 Enzyme tinh chế (pha loãng 10 lần)

12,85 .

10, 47% .

2.2.5. Mức tinh chế : 0,693 .

Thông số A280 U U/A280

Hiệu suất



G NGHỆ VI SINH

OD280-TC = 0,078 Tổng thể tích tinh chế: 35mL Tổng lượng protein tinh chế: A280-TC = OD280 Vtinh Độ pha loãng

= 0,078 35 10 = 27,32.2.2. Tổng hoạt tính (U) Dựa vào phương trình hồi quy: y = 0,6181x + 0,0171 với y là OD và x là lƣợng tinh bột (mg)

bị thủy phân. Enzyme thô.

ODchứng : 0,312 và ODthử = 0,09 OD = 0,222. Lượng tinh bột bị thủy phân : 0,3315 mg. Hoạt tính tổng của amylase thô (UTH):UTH = Lƣợng tinh bột bị thủy phân 10 Độ pha loãng Vthô = 0,3315

10 50 14 = 2320,5 Enzyme tinh chế.

ODchứng : 0,322 và ODthử = 0,262 OD = 0,06. Lượng tinh bột bị thủy phân : 0,0694 mg. Hoạt tính tổng của amylase tinh chế (UTC):UTC = Lƣợng tinh bột bị thủy phân 10 Độ pha loãng Vtinh = 0,069

4 10 10 35 = 242,92.2.3. Hoạt tính chuyên biệt (U/A280nm) Hoạt tính chuyên biệt

của enzyme thô:

UTH

A280TH

2320,5180,6

Hoạt tính chuyên biệt của enzyme tinh chế:

UTC

A280TC242,927,3

8,90 .

2.2.4. Hiệu suất tinh chế (%) :

U TC UTH

242,92320,5

HTCB-TC 8,90HTCB-TH 12,85

Bảng 3.2. Các thông số quá trình tinh chế

tinh chếMức

tinh chếThô 180,6 2320,5

12,85Tinh chế 27,3 242,9

8,90

2.3.Nhận xét.

10,47% 0,693

4: Tốt Tốt

OD

Bảng 3.3. Đánh giá các thông số quá trình tinh chếThông số Kết quả Tiêu chuẩn Đánh giá

Hiệu suất tinh chế 10,47% -ThấpHo ạt tính chuyên bi ệt thô 12,85Ho ạt tính chuyên bi ệt tinh 8,90TốtMức tinh chế 0,693 - Thấp



G NGHỆ VI SINH

Tuần 04 CỐ ĐỊNH CGTase LÊN ALGINAT

(Ngày 25/12/2013)---oOo---

1. TÓM TẮT LÝ THUYẾT Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) là enzyme duy nhất có khả năng chuyển hóa tinh bột và các

chất tương tự (bài thực tập dùng maltodextrin) thành cyclodextrin. Việc cố định CGTase lên alginate sẽ tận dụng được khả năng tái sử dụng của enzyme, giảm chi phí

trong nghiên cứu và sản xuất, tăng cường tính ổn định và hoạt tính của enzyme. Bài thực tập sử dụng

gel Ca-alginate để cố định enzyme theo 2 phương pháp: Bắt giữ: Cho dung dịch CaCl2 0,2M vào dung dịch chứa enzyme và

alginate. Hấp phụ: Cho dung dịch enzyme tiếp xúc với các hạt gel Ca-

alginate trong đệm Tris-HCl pH8. Các hạt gel sau khi cố định enzyme được rửa sạch bằng đệm Tris-Hcl pH8 rồi đem xác định hoạt độ

của enzyme cố định. Dịch lọc và dịch rửa các hạt gel được xác định lượng protein tự do để xác định

hàm lượng và hiệu suất của quá trình cố định enzyme lên alginate. Xác định hàm lƣợng protein: Dựa vào độ chuyển dời max của t

huốc nhuộm Coomasie BrilliantBlue từ 464 (màu mâu đỏ, dạng tự do) sang 595 (màu xanh, dạng

kết hợp với protein). Xác định hoạt độ của enzyme: Dựa vào khả năng hấp phụ các phân

tử chất vào lõi kỵ nước củacyclodextrin. Bài thực tập sử dụng phenolphthalein (pH 10,5 có

OD

màu hồng đậm), khi bị cyclodextrinhấp phụ sẽ bị giảm nồng độ và làm giảm cường độ màu.

2. KẾT QUẢ THỰC HÀNH2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng protein.

Bảng 4.1. Mối quan hệ giữa hàm lượng protein (mg) và mật độ quang (OD)

Ống Trắng 1 2 3 4Nồng độ BSA (g/mL) 0,0 10 20 30 40OD595 = ODi – OD0 0,000 0,139 0,283 0,407 `0,4890.6

y = 0.0125x + 0.01440.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

R² = 0.9904

0 5 10 15 20 25 30 35 4045

Nồng độ BSA (g/mL)

Hình 4.1. Mối quan hệ giữa hàm lượng protein (mg) và mật độ quang (OD) (phƣơng pháp Bradford)



G NGHỆ VI SINH

2.2.Xây dựng đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng -cyclodextrin (-CD).Bảng 4.2. Mối quan hệ nồng độ -CD và mật độ quang (OD)

Ống Trắng 1 2 3 4 5Hàm lượng -CD (mg) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

OD550 0,407 0,260 0,206 0,135 0,102 0,077OD550 = OD0 – ODi 0 0,147 0,201 0,272 0,315 0,3300.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0

(Độ pha loãng : 10 lần) 0,082

0,1469

y = 0.3179x + 0.0519 R² = 0.91360 0.2 0.4 0.6 0.8 1

1.2Hàm lƣợng -CD (mg)

Hình 4.2. Mối quan hệ giữa hàm lượng -CD (mg) và mật độ quang (OD)

2.3.Kết quả xác định hàm lƣợng và hiệu suất protein cố định.2.3.1. Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase Độ pha loãng: n = 200 lần. OD595: 0,149. Thế vào phương trình hồi quy y = 0.0125x + 0.0144 x = 10,768 g/mL Áp dụng công thức: Hàm lƣợng protein/mL enzyme = n x 103 Hàm lượng protein trong

chế phẩm CGTase trong 1mL chế phẩm: 200 10,768 103 = 2,1536 mg.2.3.2. Xác định hàm lượng protein cố định

Bảng 4.3. Kết quả xác định hàm lượ ng và hiệu suất cố định enzyme

Phƣơng pháp BẮT GIỮ HẤP PHỤThể tích dịch lọc + dịch rửa (mL) 50mLOD595 0,117 0,198Nồng độ protein (g/mL) 8,208 14,688Hàm lượng protein không cố định (mg)

Hàm lượng protein cố định (mg) 2,0716 2,0067Hiệu suất cố định 96,19% 93,18%

2.4.Kết quả xác định hoạt tính protein cố định.2.4.1. Xác định hoạt tính enzyme trong chế phẩm CGTase Độ pha loãng: n = 50 lần.



G NGHỆ VI SINH

ODthử = 0,367 ; ODchứng = 0,447 OD = 0,08. Thế vào phương trình hồi quy y = 0,3179x +

0,0519, ta có x = 0,0884 mg -CD = 88,4 g -CD. Hoạt tính chung của CGTase tự do (HTCTD):

Tính theo công thức : HTCTD (U / mL)

x 10 n a M t

(Trong đó: x(g) là khối lượng -CD tạo thành ; n là độ pha loãng ; a là hệ số góc của phươngtrình hồi quy, M = 1135 là khối lượng riêng của CD ; 10 = 1m

0,3179 1135 15 8,16

67 U.

2,1536 3,7921

U/

mg.

L/0,1mL là tỉ lệ enzyme tham giaphản ứng và t (phút) là thời gian phản ứng.)

Kết quả :

HTCTD =

88, 4 10 50

Hoạt tính riêng của CGTase tự do (HTRTD):

Tính theo công thức : HTR

TD (U / mg protein)

HTCTD

HL proteinTD

(Trong đó: HL proteinTD là hàm lượng protein tự do trong chế phẩm CGTase (2,1536 mg))

Kết quả : HTRTD = 8,1667

2.4.2. Xác định hoạt tính enzyme cố định. Hoạt tính chung của CGTase cố định (HTCCD) được tính theo công thức

HT

CCD (U

)

x 8,040,3 M t

(Trong đó: x(g) là khối lượng -CD tạo thành ; 8,04 g là tổng khối lượng các hạt gel thu được ; 0,3

g là khối lượng của mẫu 10 hạt gel ; M = 1135 là khối lượng riêng của CD và t (phút) là thời gian

phản ứng.) Hoạt tính riêng của CGTase cố định (HTRCD) được tính theo công thức

HTRCD (U / m

g protein)

HTCCD

HL proteinCD

(Trong đó : HL proteinCD là hàm lượng protein cố định thu được) Tỷ lệ hoạt tính là tỷ lệ giữa HTRCD và HTRTD.

Bảng 4.4. Kết quả xác định hoạt tính enzyme cố địn hPhƣơng pháp BẮT GIỮ HẤP PHỤOD550 chứng 0,364 0,318OD550 thử 0,178 0,189

OD = ODchứng – ODthử 0,186 0,129Lượng -CD (g) tạo thành 421,83 242,53

Hàm lượng protein cố định (mg) 2,07162,0067

Hoạt tính chung (U) 0,664 0,382Hoạt tính riêng (U/mg protein) 0,3205

0,1904

Tiêu chí Chế phẩm tự do

Chế phẩm

cố định

Tỷ lệ hoạt tính (HTRTD = 3,7921) 8,452%5,021%2.5.Nhận xét Hiệu suất của cả hai phương pháp cố định đều rất cao (96,19% và 93,18%), hao hụt thấp. Phương

pháp hấp phụ cho hiệu suất thấp hơn phương pháp bắt giữ. So sánh hoạt tính của enzyme theo bảng 4.5, ta thấy kết quả hoạt tính của chế phẩm cố định rất thấp

so với chế phẩm tự do.



G NGHỆ VI SINH

Bảng 4.5. So sánh kết quả xác định hoạt tính enzyme

Phương pháp bắt giữ Phương pháp hấp phụ

Hoạt tính chung 8,1667 U 0,664 U 0,382 UHoạt tính riêng 3,7921 U/mg 0,3205 U/mg

0,1904 U/mgTỉ lệ hoạt tính 100% 8,452% 5,021%

2.6.Qui trình cố định CGTase lên alginate2.6.1. Phương pháp bắt giữ

15mL dung dịch alginate 2%

+ 1 mL enzym

Hỗn hợp enzym + alginate

- Nhỏ từ từ hỗn hợp vào 30mL CaCl2 0,2M- Ủ 15 phút- Lọc lấy hạt gel Ca-alginate-enzyme- Rửa gel bằng đệm Tris-HCl pH8 (2 10mL)

Hạt gel(Enzyme cố định)

Dịch lọc + rửa(Enzyme tự do)

2.6.2. Phương pháp hấp phụ

30mL dung dịch CaCl2 0,2M

- Nhỏ vào từ từ từng giọt 15mL alginate2%enzym

Hạt gel Ca-alginate

- Cho vào 20mL đệm Tris-HCl pH8- 2mL anzyme CGTase và ủ 45 phút- Lọc lấy hạt gel Ca-alginate-enzyme- Rửa gel bằng đệm Tris-HCl pH8 (2 10mL)

Hạt gel(Enzyme cố định)

Dịch lọc + rửa(Enzyme tự do)



G NGHỆ VI SINH

Tuần 5 CẢM ỨNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢ

PĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE (PAGE

)Ngày 30/12/2013

---oOo---1. TÓM TẮT LÝ THUYẾT1.1.Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp. Dùng IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) để cảm ứng tạo thành T7 RNA polymerase giúp

cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp trong chủng E.coli BL21(DE3) mang đoạn gen amyE (mã hóa cho

-amylase) trên vector pET28b(+) Chủng sử dụng: Phân lập các vi khuẩn thuộc chủng B21(DE3) có chứa vector pET28b(+) mang đoạn

gen amyE dựa trên tiêu chí đề kháng với kanamycin (do vector pET28b(+) mang gen Kan giúp vi

khuẩn mọc được trên môi trường chứa kanamycin 30g/mL).1.2.Điện di trên gel polyacrylamide. Phân tích các protein tái tổ hợp thu được sai khi cảm ứng biểu hiện bằng IPTG để xem protein thu

được ở dạng tan hay không tan nhằm có biện pháp thu hồi và tinh c

hế thích hợp . Nguyên nhân: Do protein được biểu hiện ở mức cao trong tế bào khác tế bào nguyên thủy (khác quá

trình hâu dịch mã) sẽ làm cho protein gập lại không đúng và sẽ trở trên không tan trong môi trường

nội bào và kết tập thành các thể vùi. Kỹ thuật phân tích : PAGE biến tính (SDS-PAGE) trong hệ đệm không liên tục của Laemmli Đối tƣợng phân tích:

Môi trường nuôi cấy (có chứa IPTG) chủng E.coli BL21(DE3) có chứa gen amyE.

Môi trường nuôi cấy (không chứa IPTG) chủng E.coli BL21(DE3) có chứa gen amyE. Nội dung phân tích:

Phân tích tổng lượng protein thu được. Phân tích tổng lượng protein tan và potein không tan.


Trang 12

2. QUY TRÌNH THỰC TẬP.

Không thêm IPTS -

Lắc 200 rpm (2-3h) -

- Ly tâm 1200

0 rpm – 3 phút- Phân tán cắn trong 1/10 thể tíc

h Tris-HCl pH8, 10mmol- Thêm 40l đệm tải SD

S 4X và vortex.- Đun nóng 950C và

nạp 10L vào gel SDS-PAGEBáo cáo

thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH

Chủng E.coli AmyE/380- Phân lập trên thạch LBK30 (300C

, 24h)- Lấy một khóm cấy vào 2mL LBK30

Dịch nuôi cấy E.coliAmyE/380 (LBK30)

- Pha loãng 1:100 với LBK30 trong

2 ống nghiệm (25mL/ống)- Lắc 200 rpm (370C) tới khi đạt

OD600 = 0,6

- Thêm IPTS- Lắc 200 rpm (2-3h)

Mẫu phân tích

- Ly tâm 12000 r

pm – 3 phút- Phân tán cắn t

rong Đệm phân tán tế bào- Ủ đá 10 phút,

tán siêu âm 2 lần 30s/lần- Ly tâm 14000 r

pm – 5 phút- Nƣớc + 1/3 thể

tích đệm tải SDS 4X.Đun 950C và nạp

10L vào gel SDS-PAGE- Phân tán cắn t

rong 100L đệm tải SDS 1X.Đun 950C và nạp

10L vào gel SDS-PAGE.

Phân tích protei

n tổng

Phân tích protein tan/không tan


Báo cáo thực hành : CÔNG NGHỆ VI SINH

Buổi 6: TINH CHẾ PROTEIN BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰ

CTINH CHẾ LYSOZYME BẰNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

Ngày 08/01/2014---oOo---

1. TÓM TẮT LÝ THUYẾT1.1.Nguyên tắc của sắc ký ái lực Sắc ký ái lực ion kim loại (IMAC) sử dụng các ion hóa trị II (Cu2+, Ni2+,…) để gắn kết đặc hiệu với các

peptid có nhiều (từ 6-8 phân tử) histidine (Protein-HisTag). Protein được giải hấp phụ bằng dung

dịch chứa imidazole có nồng độ cao (~100mM). Protein thu được đem đi định lượng bằng phương

pháp đo quang OD595 với thuốc thử Bradford (Sử dụng đường chuẩn đã được thiết lập trong tuần 4.)

ON OH HN

HN

NH2histidine

N

imidazole Bài thực tập tinh chế protein thu được từ chủng E.coli AmyE/380 đã được tạo dòng (chứa vector

pET28b(+)) bằng IMAC sử dụng Ni-Sepharose. Vai trò của một số dung dịch đệm sử dụng.

Đệm chạy 1X (chứa imidazole 5mM): Rửa sạch và cân bằng cột bằng cách đẩy sạch protein

tạp còn sót lại trên nhựa sắc ký ra ngoài. Đệm rửa 1X (chứa imidazole 50mM): Rửa khỏi cột các protei

n tạp có đuôi HisTag còn sót lạitrên nhựa sắc ký ra ngoài (do chúng gắn không đặc hiệu với nhựa

). Đệm thôi 1X (chứa imidazole 100mM): Đẩy protein đích trên nhựa

OD

sắc ký ra ngoài. Đệm xả 1X (chứa EDTA 100mM): Rửa sạch imidazole ra khỏi

cột sau khi dùng bằng cách tạophức với ion Ni2+ (có gắn với imidazole), phức hợp bị rửa khỏi c

ột nhằm thu hồi imidazole. Đệm ion 1X (chứa NiSO4 100mM): Cân bằng cột trước khi dùng

và sau khi rửa với đệm xả bằngcách bổ sung ion Ni2+ còn thiếu trên nhựa do bị đệm xả rửa trôi.

1.2.Nguyên tắc của sắc ký trao đổi ion Dựa vào tính chất lưỡng tính của enzyme mà bản chất là phân tử protein. Sử dụng vật liệu mang điện

tích trái dấu với điện tích của protein (trong môi trường thích hợp) sẽ giúp phân lập các loại protein

mong muốn nhờ tạo liên kết tĩnh điện với các phân tử đó. Mỗi loại protein có một giá trị pH đẳng điện (pHi) nhất định mà tại đó protein trung hòa về điện. Tùy

vào pH môi trường mà protein có điện tích khác nhau. pH < pHi : Tích điện dương. Nhựa trao đổi ion sử dụng là

cationide. pH > pHi : Tích điện âm. Nhựa trao đổi ion sử dụng là anionide.

Bài thực tập phân lập lysozyme (pI = 10) trong môi trường pH 8 (đệm chạy chứa 50mM Tris HCl) nên

sử dụng nhựa cationide SP-sepharose FF. Protein được giải hấp phụ khỏi nhựa bằng cách thêm

đệm thôi chứa các ion với nồng độ cao (chứa 2M NaCl, 50 mM Tris Hcl pH 8) cạnh tranh gắn kết với

lysozyme. Protein thu được đem đi định lượng bằng phương pháp đo quang OD595 với thuốc thử

Bradford (Sử dụng đường chuẩn đã được thiết lập trong tuần 4.). Chỉ lấy những kết quả có OD595 từ

0,139 trở lên (tương ứng ống số 1)



G NGHỆ VI SINH

2. KẾT QUẢ THỰC HÀNH (PHẦN Sắc ký trao đổi ion)2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng protein.

Bảng 6.1. Mối quan hệ giữa hàm lượng protein (mg) và mật độ quang (OD)

Ống Trắng 1 2 3 4Nồng độ BSA (g/mL) 0,0 10 20 30 40OD595 = ODi – OD0 0,000 0,139 0,283 0,407 0,4890.6

y = 0.0125x + 0.01440.5 0.4

Hiệu suất tinh chế: H 100% 100% 2,5%.

0.3

0.2

0.1

0

R² = 0.9904

0 5 10 15 20 25 30 35 4045

Nồng độ BSA (g/mL)

Hình 6.1. Mối quan hệ giữa hàm lượng protein (mg) và mật độ quang (OD) (phƣơng pháp Bradford)2.2. Kết quả thực tập.

Bảng 6.2. Kết quả quá trình tinh chế lysosymeMẫu A B C D1 D2

D3Thể tích (mL) 1 1 3 1 1 1

OD595 0,359 0,378 0,410 0,091 0,0240,054

Nồng độ protein (µg/mL) 27,568 29,088 31,648 6,1280,768 3,168

Hệ số pha loãng 100 20 20 10 10 1Hàm lượng protein (µg) 2756,8 581,76 1898,88 61,28

7,68 3,168

Tổng khối lượng protein (ống A): 2756,8 g. Tổng khối lượng protein thu được trong các ống D: 68,96 g (Ống D3 bị loại do nằm ngoài khoảng

tuyến tính của đường chuẩn Bradford)D 68,96A 2756,8

Nhận xét: Hiệu suất tinh chế 2,5% là thấp. Tổng khối lượng protein trong C là 1898,88 68,88% tổng lượng

protein chứng tỏ dịch C chứa rấtnhiều protein tạp và mẫu tinh chế chứa rất ít protein đích.


Trang 15

3. SƠ ĐỒ QUÁ TRÌNH TINH CHẾ

3.1.Tinh chế bằng sắc ký ái lực

Cột rỗng

- Rửa sạch bằng nước cất vô

trùng- Phân tán đều nhựa sắc ký

(úp ngửa)

Cột chứa nhựa sắc ký

- Thêm 2mL Ni-Sepharose, để yên 1h

Cột chứa nhựa sắc ký(gắn Ni-Sepharose)

Hoạt hóa cột :- 0,5mL 3 lần nước cất vô

trùng- 0,5mL 5 lần đệm ion 1X.- 0,5mL 3 lần đệm chạy H

1X.


Dịch nuôi cấy E.coli- Ly tâm 10.000 rpm, 5 phú

t- Thu lấy cắn tế bào.

Cắn tế bào- Phân tán trong đệm chạy

H 1X- Tán siêu âm (giữ lạnh)- Ly tâm 10.000rpm, 5 phút

Dịch A (nƣớc nổi)

Cột đã hoạt hóa

- 0,5mL 5 đệm chạy H 1X- 0,5mL 3 đệm rửa H 1X

OD595 0,139

- Từng 1mL đệm thôi H 1X

OD595 0,139

- 0,5mL 5 đệm chạy H

1X

Cột đã cân bằng

Lấy 1,0mL nap vào cột

Dịch B

Dịch C

Dịch D


Trang 16

3.2.Tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion.

Cột rỗng- Rửa sạch bằng nước cất

vô trùng- Phân tán đều nhựa sắc k

ý (úp ngửa)

Cột chứa nhựa sắc ký

- Thêm 2mL SP-Sepharose, để yên 1h

Cột chứa nhựa sắc ký(gắn SP-Sepharose)

Hoạt hóa cột :- 0,5mL 3 lần nước cất

vô trùng- 0,5mL 5 lần đệm chạy

L 1X.


Dịch lòng trắng trứng- Ly tâm 10.000 rpm, 1

phút

Dịch A (nƣớc nổi)

Cột đã hoạt hóa

- 0,5mL 6 đệm chạy L 1X

OD595 0,139

- Từng 1mL đệm thôi L 1X

OD595 0,139

- 0,5mL 5 đệm chạy

L 1X

Cột đã cân bằng

(Bảo quản 4-80C, EtOH 24%)

Lấy 1,0mL nap vào cột

Dịch BDịch C

Dịch D


Trang 17

Documents

Báo cáo CNVS (1)