Caracterización bioquímica de bacterias contaminantes aisladas de plantas in vitro de mandioca (Manihot esculenta) y Eucalyptus sp. en la etapa de introducción en Biofábrica Misiones S.A.

Pasante: Rodrigo Sebastian Ramos Salas

Universidad: Católica Santa María de Arequipa

Fecha de pasantía: 3 de Febrero a 28 de Marzo

Área de pasantía: Bioinsumos

Tutora: Lic. En Genética Jimena Gutiérrez Brower

Introducción

El cultivo in vitro de tejido vegetal o micropropagación es una metodología basada en la multiplicación rápida para material vegetal aséptico in vitro. Este método se realiza a partir de cortes de órganos de una planta madura (nodos, flores, hojas, meristemos, etc) esterilizados (Enjarlic et al. 1988) y los cuales son sembrados en medios de cultivo especiales e incubados en ambientes con condiciones óptimas de luz y temperatura, este proceso normalmente se llega a realizar varias veces como subcultivos para así poder generar una mayor cantidad de brotes generados. Las etapas que abarca la micropropagación normalmente son: la desinfección del material vegetal el cual consiste en la desinfección externa de los cortes a cultivar, introducción del material in vitro que consiste en la siembra propiamente dicha de los cortes en el medio de cultivo estéril, la multiplicación de los brotes en donde se recolectan los brotes obtenidos para ser fraccionadas y nuevamente cultivados, enraizamiento en donde se cultivará los brotes en medios de cultivo especialmente diseñados para incentivar la generación de raíces y finalmente la aclimatación de los explantes enraizados en donde se debe de llevar los brotes de forma secuencial y paulatina desde las condiciones in vitro a las condiciones del campo.

En esta técnica existen problemas los cuales hacen que el procedimiento sea delicado y por ello necesita de ciertos cuidados y precauciones, esto se debe a que al tratarse de cultivos de tejidos vivos se debe de tener mayor cuidado ya que los medios que se utilizan para su cultivo son fácilmente contaminables por bacterias y hongos (Blake 1988; Enjalric et al. 1988, Legat et al 1988). La contaminación con bacterias se le considera como la más seria y puede resultar en reducción de la multiplicación y enraizamiento o incluso la muerte de los explantes (Leifert. C. et al 1989).

La contaminación bacteriana en muchos casos llega a ser bastante problemática en el caso que esta provenga de la misma planta (Cornu & Maichel, 1987), ya sea de modo exofitico o endofitico y es por ello que es de gran importancia el poder rastrear la fuente de la contaminación para así poder tomar las medidas necesarias para subsanar el problema.

Hipótesis

Por medio de pruebas bioquímicas microbiológicas, se podría identificarlos géneros bacterianos más comúnmente relacionados con la contaminación de vitroplantas de mandioca (Manihot esculenta) y Eucaliptus sp. en la fase de establecimiento in vitro y de esta manera relacionarlos con las posibles fuentes de contaminación.

Objetivo general

Identificar el género de las colonias bacterianas contaminantes en medios de establecimiento in vitro mediante pruebas bioquímicas microbiológicas e inferir la posible fuente de contaminación.

Objetivos específicos:

Generar un flujograma de identificación a través de pruebas bioquímicas de los generos bacterianos más comúnmente asociados con contaminación de los cultivos in vitro de tejidos vegetales.

Generar una posible relación entre el género de las bacterias aisladas con su fuente de contaminación.

Aislar las colonias bacterianas a partir de la contaminación presente en tubos de establecimiento in vitro de las especies de Eucaliptus sp. y Manihot esculenta.

Realizar baterías de pruebas bioquímicas microbiológicas para cada una de las colonias bacterianas aisladas.

Poner a punto los protocolos de las pruebas bioquímicas microbiológicas para la identificación bacteriana.

Generar gráficos porcentuales de las bacterias identificadas y su número con respecto a la especie del cultivo in vitro de donde se aisló.

Metodología

Primeramente se realizó una búsqueda bibliográfica con la finalidad de conocer los géneros bacterianos más comúnmente asociados con contaminación en laboratorios in vitro además de investigar acerca de la microbiota asociada a las plantas de mandioca y eucaliputs según la literatura para determinar las especies endofiticas y fitopatogenas que pudieran asociarse con las mismas. Con la información bibliográfica reunida se procedió a revisar las características bioquímicas que presentan cada uno de los géneros más comunes encontrados, para así poder encontrar cuales serían las pruebas bioquímicas más discriminatorias entre estos y de este modo poder conocer las pruebas bioquímicas microbiológicas mínimas para la identificación de los mismos. Con las pruebas bioquímicas microbiológicas mínimas para la identificación se realizó un flujograma y en base de este se procedió a realiza la parte experimental del proyecto.

Posteriormente se realizó una selección de las bacterias a cultivar a partir de tubos de establecimiento in vitro contaminados de las especies Eucaliptus sp. y Manihot esculenta los cuales fueron provistos por el banco de germoplasma de la empresa Biofábrica. Esta selección se realizó con el motivo de reducir el número de colonias a trabajar en el proyecto, puesto que la cantidad de tubos contaminados que se obtuvieron para el proyecto eran aproximadamente 240. Esta selección se realizó tomando en consideración el color, la forma, y la consistencia de la colonia presente en el tubo. Teniendo los tubos seleccionados se les rotulo y se rotulo el lote de donde provenían.

Para el aislamiento se preparó un Agar Nutritivo comercial de la empresa Britania Lab. el cual fue puesto en placas Petri, sellado con film y llevado a una refrigerado hasta su uso. En el momento del aislamiento se hizo uso de una cámara de siembra previamente limpiada y esterilizada por radiación UV con un mechero encendido, para la siembra se hizo uso de un asa bacteriológica empleando la siembra por estría en el agar. Terminada la siembra se selló la placa sembrada con film y se llevó a incubación a 28°C procurando que la placa estuviera con la tapa boca abajo.

Cuando las placas presentasen una colonia lo suficientemente visible se procedió a realizar tinciones de Gram de cada una de las colonias cultivadas, para ello se hizo nuevamente uso de la cámara de siembra y la presencia de un mechero para así abrir las placas cultivadas sin el peligro de que estas se pudieran contaminar. Con la asa bacteriológica se recolecto una pequeña cantidad de colonia y se hizo un frotis en una placa portaobjetos ayudándonos de una gota de suero fisiológico para que quede la menor cantidad de cúmulos posibles, luego de ello se selló nuevamente la placa, se llevó a la incubadora y se hizo secar el frotis a temperatura ambiente. Para la tinción se siguió el protocolo normal de la tinción de Gram y luego se llevó al microscopio teniendo cuidado de observar la morfología de la bacteria y si es gram positiva o gram negativa.

Para la prueba de catalasa se preparó unas placas portaobjetos limpias o nuevas para la reacción utilizando una placa por 8 colonias a analizar. Para ello se realizó la prueba en la cámara de siembra con un mechero, se abrió la placa sembrada y se recolecto un poco de colonia con una asa bacteriológica, luego se le dejo en la placa portaobjetos procurando espacio para las otras siete colonias faltantes. Con la muestra en el portaobjetos se agregó una gota de peróxido de hidrógeno (10 vol) y se anotó aquellas muestras que generasen burbujas o no.

Para las pruebas bioquímicas se preparó una batería de pruebas bioquímicas microbiológicas, las cuales serían las mínimas para la identificación según la revisión bibliográfica, en tubos de ensayo con tapones de goma. En cámara de siembra con presencia de mechero se sembró las colonias a analizar en cada una de las pruebas y se selló con su respectivo tapón. Terminada la siembra, se llevó la batería de pruebas a incubación a 37°C durante 72 horas.

Resultados

La búsqueda bibliográfica realizada dio como resultados la generación de un flujograma para la identificación de las bacterias más comunes como contaminación para la micropropagación, entre estas se consideró: Bacillus, Lactobacillus, Erwinia, Micrococcus, Staphylococcus, Enterobacter, Serratia, Klebsiella, Pseudomonas, Alcalinogenes, Acinetobacter (C. Leifert et al. 1989), Agrobacterium (Michael J. Sadowskky. 1980), Flavobacterium (T.A. McMeekin 1978) y Xanthomona campestris (Soudi MR et al. 2011). Revisando literatura se comparó cada una de las características bioquímicas de las bacterias elegidas, para así poder definir las pruebas bioquímicas mínimas para la identificación de cada una de estas. Con el flujograma desarrollado se comenzó a generar los protocolos de cada una de las pruebas bioquímicas para la identificación, teniendo en cuenta para esto la disposición de reactivos en las existencias de las áreas de Bioinsumos y Preparación de medios de Cultivo de la Biofabrica S.A. y dependiendo de esto realizando las variaciones correspondientes para poder elaborarlas. También con la revisión de la literatura se pudo desarrollar una posible relación entre las bacterias identificadas y la forma de contaminación o proveniencia de la bacteria (C. Leifert et al. 1989, Michael J. Sadowsky 1983, T. A. McMeekin 1978, Soudi M.R. et al. 2011).

Genero Bacteriano Proveniencia AutoresMicrococcus, Staphylococcus y Lactobacillus Piel o tejidos humanos C. Leifert et al. 1989

Bacillus Material contaminado C. Leifert et al. 1989Erwinia, Serratia, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Alcalinogenes, Acinetobacter, Agrobacterium, Flavobacterium, Xanthomona Campestris

Material vegetal

C. Leifert et al. 1989.Michael J. Sadowskky. 1098T. A. McMeekin. 1978Soudi MR et al. 2011

Tabla 1. Géneros Bacterianos y posible proveniencia según su autor

Aislamiento de las bacterias

En el aislamiento de las colonias bacterianas se obtuvo como resultado el sembrado de 20 placas sembradas de manera exitosa, siendo de estas 4 placas pertenecientes a la mandioca (Manihot esculenta) y 16 placas pertenecientes a Eucalipto (Eucaliptus sp.). Luego, según la forma de la colonia, color y especie de donde se aisló se procuró Un problema que ocurrió en el aislamiento de las bacterias es que no todas las cepas bacterianas lograron crecer de manera exitosa, esto se puede deber a que el Agar nutritivo no es un medio recomendado para el aislamiento de bacterias exigentes y por este motivo las bacterias no lograron desarrollarse de manera exitosa. Para evitar esto es recomendable el uso de medios más especializados para el aislamiento de bacterias agrícolas como es el caso del medio YDC (Medio Extracto de levadura-Dextrosa-Carbonato de Calcio) (Lorena A. et al. 2009).

Tinción de Gram y prueba de catalasa

En la tinción de Gram realizada y la prueba de catalasa se obtuvo que el 6% de las 50 bacterias seleccionadas para la identificación fueran cocos mientras que el 94% eran bacilos, de los cuales para el caso de Bacilos el 2% de estos eran Gram positivos mientras que el 98% restante eran Gram negativos, mientras que para los cocos el 33% eran Gram positivos mientras que el 67% eran Gram negativos (Grafico 1). Como se puede observar la mayoría de las bacterias contaminantes para tejido vegetal son Gram negativas mientras que una minoría es Gram positiva. Para la prueba de catalasa realizada para los bacilos Gram positivos dio como resultado que el 100% de estos eran catalasa positiva. (Grafico 1)

Grafico 1. Grafico circular porcentual de Morfología, Gram para Bacilos, Gram para Cocos y prueba de Catalasa para todas las bacterias cultivadas.

Siendo separados los resultados mostrados por las gráficas del Grafico 1 entre las especies de Eucaliptus sp. y Manihot esculenta se obtuvo el Grafico 2 y Grafico 3

Grafico 2. Grafico circular porcentual de Morfología, Gram para Bacilos, Gram para Cocos y prueba de Catalasa para las bacterias de Eucaliptus sp.

Grafico 3. Grafico circular porcentual de Morfología y Gram para Bacilos para las bacterias de Manihot esculenta

Pruebas Bioquímicas

Las pruebas bioquímicas que se realizó fueron las pruebas de Oxido reducción, Motilidad, resistencia a Glucosa y generación de ácido a partir de glucosa con el medio de Hugh Leiffson, prueba de gelatinasa con el medio Gelatina nutritiva y la prueba de tolerancia a salinidad al 4% con un caldo nutritivo salado. Los resultados obtenidos se pueden observar en la Tabla 2 permitiendo ver de este modo que la contaminación mayoritariamente se encuentra posiblemente causada por Serratia para el caso de las cepas fermentativas, mientras que por otro lado la otra mitad de la contaminación podría estar siendo causada por P. Pausimovilis de las cuales en ambos casos son contaminantes del material vegetal. Por otro lado los Staphylococcus se encontraron en menor cantidad permitiendo suponer que el indicie de contaminación por usuario es muy bajo. Para ambos casos se puede únicamente suponer ya que las pruebas bioquímicas no son determinativas.

Bacterias IdentificadasStaphylococcus 1Acinetobacter 1Bacilo 1Lactobacilo 0Alcalinogenes 1Klebsiella 1Serratia 15Erwinia / Enterobacter 6Flavobacterium 0P. Pausimovilis 12P. Fluoresens / Agrobacterium 5Pseudomona 3NO IDENTIFICADAS 4Total 50

Tabla 2. Tabla con los géneros identificados y el respectivo número de bacterias identificadas por cada género.

Procedencia de la contaminaciónUsuario 4%Material Contaminado 2%Material Vegetal 86%Desconocido 8%TOTAL 100%

Tabla 3. Tabla con los porcentajes de contaminación según posible fuente de procedencia.

Discusión

Como se observó en la caracterización bioquímica de las bacterias aisladas, la mayor parte de las bacterias que se presentan como contaminantes de los cultivos in vitro se trata de bacilos gram negativos siendo esto un indicador inicial que la contaminación por parte de errores del operario o la esterilización, según la relación descrita por C. Leifert, es muy baja ya que dichas contaminaciones vienen a ser comúnmente gram positivas. Además también se pudo observar que de estas gram negativas estaban casi en igual proporción aquellas bacterias que tuvieran comportamiento aerobio y anaerobio siendo las de comportamiento anaerobio principalmente enterobacterias, tal y como describe Mac Faddin en su libro, mientras que aquellas bacterias que presentasen un perfil aerobio serían las bacterias que normalmente se les conoce como fitopatogenas o en todo caso endofiticas, tal y como se observa en el trabajo de Lorena A. Ramirez.

Siendo la principal base de la identificación las pruebas de óxido-fermentación y la tinción de gram para poder separar las bacterias entre si se prosiguió con la separación entre estas puesto que la identificación de las bacterias únicamente por estas dos pruebas sería una identificación muy pobre y bastante incierta ya que la prueba de óxido-fermentación puede ser en muchos casos muy sensible y los resultados son muy difíciles de leer de modo mecánico, como sugiere Mac Faddin, sino que estos deben ser normalmente leídos tomando en cuenta aspectos como son el crecimiento, las zonas donde comenzó a generarse el viraje de pH y la posible presencia de contaminación de las pruebas. Por este motivo pruebas como son la motilidad y la producción de gelatinasa otorgan una mayor seguridad a la identificación de las bacterias y permite incluso corregir posibles errores en la lectura de los resultados.

Finalmente como se pudo observar en los resultados de la identificación de la Tabla 2 y Tabla 3 se puede apreciar que como se dijo la contaminación es principalmente causada por bacterias normalmente relacionadas con el material vegetal contaminado, y además que las principales bacterias contaminantes se tratarían del genero Serratia y Pseudomona. Aunque estos resultados son correctos y van de acuerdo al trabajo realizado antes por C. Leifert, existe un ligero ruido en la visión de los porcentajes ya que las condiciones de selección que se le dio a las cepas aisladas de Eucaliptus sp. no fueron las mismas que para las cepas de Manihot esculenta ya que en el primer caso se obtuvo una gran población de aproximadamente 136 bacterias aisladas de las cuales se eligió únicamente unas 26 para la identificación bioquímica, mientras que para el caso de Manihot esculenta se lograron aislar únicamente 26 bacterias de las cuales se tuvo que trabajar con 24. Aun a pesar de esta situación se puede observar en el grafico 5 y el grafico 6 que los mayores porcentajes del total les pertenece en el caso de Eucaliptus sp. les pertenece al género Erwinia/Enterobacter y a la Pseudomona fluorescens, siendo este un resultado muy parecido al que se observó en el estudio de C. Leifert y Lorena A. Ramirez, mientras que para el caso de Manihot esculenta se puede observar que los porcentajes mayores son de los generos Serratia y Pseudomona paucimovilis lo cual aunque no son tan comunes se puede ver un suceso parecido en el trabajo de C. Leifert pero para cultivos los cuales tienen un mayor tiempo de uso en comparación de cultivos que recién se están introduciendo.

Grafico 4. Porcentajes de los géneros identificados en la contaminación presentada en los tubos de establecimiento in vitro del Banco de Germoplasma.

Grafico 5. Porcentajes de los géneros identificados en la contaminación presentada en los tubos de establecimiento in vitro de Eucaliptus sp. del Banco de Germoplasma

Grafico 6. Porcentajes de los géneros identificados en la contaminación presentada en los tubos de establecimiento in vitro de Manihot esculenta del Banco de Germoplasma

Recomendaciones

En el trabajo se utilizó los medios justos para poder realizar la identificación de las bacterias, lo cual hace que sea muy posible de que las variaciones normales que hay dentro de cada bacteria pueda influir en su identificación dando un resultado erróneo, se recomienda emplear una mayor gama de pruebas bioquímicas para asegurar el género de cada bacteria.

Bibliografia

Soudi MR. et al. 2011. Minimal phenotypic test for simple differetation of Xanthomonas campestris from oter yellow-pigmented bacteria isolated from soil.

Mac Faddin. Pruebas bioquimicas para la identificación de bacterias de importancia clínica Manual Oxoid 1987 Peptonas e Hidrolizados C. I. Kado and M. G. Heskett 1970. Selective media for isolation of Agrobacterium,

Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas and Xanthomonas Northeast Laboratory SPEC-SHEET. Salt Tolerance Broth Leifert C. et al. 1989. Bacterial contaminants of micropropagated plant cultures John D. Nelson and Sharon Shelton 1966. Cultural, Biochemical and Immunological

proprieties of Mima, Herellea and Flavobacterium Species María José B. O. et al. 2010. Identificación y caracterización de bacteria asociada con

mancha foliar en papachina (Aracea) en el Pacifico Caucano

T. A. McMeekin and J. M. Shewan 1978. Taxonomic Strategies for Flavobacterium and related genera

Lorena A. Ramirez 2009. Identificación de bacterias que afectan el establecimiento in vitro de segmentos nodales de Guadua angustifolia Kunth

Michael J. Sadowsky et al. 1983. Biochemical Characterization of Fast- and Slow-Growing Rhizobia That Nodulate Soybeans