Seediscussions,stats,andauthorprofilesforthispublicationat:https://www.researchgate.net/publication/259488817

DrugresistanceproteinsLRP,Pgp,MRP1,MRP3andMRP5inovariancancerpatients

ARTICLEinCESKAGYNEKOLOGIE/CESKALEKARSKASPOLECNOSTJ.EV.PURKYNE·DECEMBER2013

Source:PubMed

CITATION

1

READS

39

5AUTHORS,INCLUDING:

JanLaco

CharlesUniversityinPrague

129PUBLICATIONS627CITATIONS

SEEPROFILE

Availablefrom:JanLaco

Retrievedon:05February2016

www.prolekare.cz | stazeno: 2.1.2014 | login: 0937000728

5452013, 78, č. 6 ČESKÁ GYNEKOLOGIE

Sedláková I.1, Laco J.2, Tošner J.1, Špaček J.1, Čermáková E.3

ABSTRACT

Objective: To evaluate the correlation of drug re-sistance proteins LRP (Lung Resistance Protein), Pgp (P-glycoprotein), MRP1 (Multidrug Related Protein, Multidrug Resistance–Associated Protein), MRP3 a MRP5 with clinical – pathological factors and to find the clinical outcome of these data in ovarian cancer patients.Design: Prospective study.Setting: Department of Obstetrics and Gynecology, Charles University in Prague, Faculty of Medicine and University Hospital Hradec Kralove.Methods: 111 patients with epithelial ovarian cancer who underwent primary surgery from 2006–2010 had specimens stained with imunohistochemistry for LRP, Pgp, MRP1, MRP3, MRP5. Results: The histological subtype of epithelial ovarian cancer correlated to the LRP, Pgp, MRP1 and MRP3 expression. Patients with late ovarian cancer had a higher MRP1 compared to early stage ovarian can-cer (I+II 71.6% (CI 60–100), III+IV 83.6% (CI 100–100),

SOUHRN

Cíl studie: Cílem této práce je stanovení protei-nů rezistence LRP (Lung Resistance Protein), PgP (P-glykoprotein), MRP1 (Multidrug Related Protein, Multidrug Resistance – Associated Protein), MRP3 a MRP5 a zjištění jejich klinického významu u pacientek s karcinomem ovaria. Typ studie: Prospektivní klinická studie.Název a sídlo pracoviště: Porodnická a gynekologická klinika LF UK a FN, Hradec Králové.Metodika: Stanovení proteinů rezistence (LRP, Pgp, MRP1, MRP3, MRP5) jsme provedli u 111 vzorků ova-riálních karcinomů u pacientek operovaných na PGK FNHK v letech 2006–2010. Proteiny rezistence jsme

p = 0.03). Correlation of MRP1 with grading was found (G1 60.83% (CI 10–100), G2 36.80% (CI 20–100), G3 88.87% (CI 100–100), p = 0.039). Patients with high Pgp, MRP1 and MRP3 expression had significantly shor-ter progression-free survival. (Kaplan-Meier test – PFS, Pgp < 85% Med PFS 23 months (CI 8–37) vs > 85% Med PFS 11 months (CI 7–17), p = 0.054), (MRP1 < 85% Med PFS 33 months (CI 11–49) vs > 85% Med PFS 11 months (CI 7–16), p = 0.046).Conclusion: We found clinical significance of LRP, Pgp, MRP1 and MRP3 expression in ovarian cancer patients. MRP5 expression did not correlate with neither histo-pathological parameters nor progression free survival. MRP1 have some additional predictive and prognostic value for the clinical outcome of patients with ovarian carcinoma.

KEYWORDS

ovarian carcinoma – LRP – Pgp/ABCB1 – MRP1/ABCC1 – MRP3/ABCC3 – MRP5/ABCC5 – drug resistance

stanovili metodou dvoustupňové imunohistoche-mie.Výsledky: LRP, Pgp, MRP1 a MRP3 vykazovali výrazné rozdíly hodnot v závislosti na histologickém typu ova-riálního karcinomu (MRP1 p = 0,023, MRP3 p = 0,056). Stupeň diferenciace významně ovlivnil pouze hodnoty MRP1 (G1 60,83 % (CI 10–100), G2 36,80 % (CI 20–100), G3 88,8 7% (CI 100–100), p = 0,039). Nárůst MRP1 od časných stadií (I+II) k pokročilému onemocnění (III+IV) byl významný (I+II 71,6 % (CI 60–100), III+IV 83,6 % (CI 100–100), p = 0,03). Pacientky s kompletní odpovědí na primární léčbu měly nižší hodnoty LRP, Pgp a MRP1 v porovnání s ostatními ženami. Medián délky PFS byl významně kratší u skupiny pacientek s Pgp a MRP1 nad 85 % v porovnání s pacientkami s hodnotami těchto

1Porodnická a gynekologická klinika LF UK a FN, Hradec Králové, přednosta doc. MUDr. J. Špaček, Ph.D., IFEPAG2Fingerlandův ústav patologie LF UK a FN, Hradec Králové, přednosta prof. MUDr. A. Ryška, Ph.D.3Ústav lékařské biofyziky LF UK, Hradec Králové, přednosta doc. MUDr. J. Hanuš, CSc.

Proteiny rezistence LRP, Pgp, MRP1, MRP3 a MRP5 u pacientek s karcinomem ovariaDrug resistance proteins LRP, Pgp, MRP1, MRP3 and MRP5 in ovarian cancer patients

Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim: www.prolekare.cz/prohlaseni

www.prolekare.cz | stazeno: 2.1.2014 | login: 0937000728

546 ČESKÁ GYNEKOLOGIE 2013, 78, č. 6

ÚVODOvariální karcinom je šestým nejčastějším kar-

cinomem u  žen v  České republice, reprezentuje 1,7 % ze všech nově diagnostikovaných neoplazmat (3,7 % u žen). Je odpovědný za 2,7 % všech úmrtí na rakovinu (6,2 % u žen) (zdroj dat: ÚZIS ČR, www.svod.cz). Výsledky přežití pacientek se za posled-ních 20 let zlepšily minimálně [4]. Standardní primární léčba se skládá z chirurgického výkonu a chemoterapie (paklitaxel + platinový preparát) u naprosté většiny pacientek s karcinomem ova-ria. Hlavním klinickým problémem současné cy-tostatické léčby ovariálního karcinomu je léková rezistence na cytostatika (chemorezistence). Jejím následkem je selhání léčby [6].

Kompletní odpověd na primární chemoterapii je vysoká, mezi 50–70 %. Přesto 50–75 % pacientek s pokročilým ovariálním karcinomem onemocně-ní relabuje a  dochází k  vývoji lékové rezistence, zejména mnohočetné lékové rezistence (MDR). Maligní buněčné populace mohou být vůči che-moterapii rezistentní již v primární léčbě. V tomto případě jde o tzv. přirozenou (primární) rezistenci. Získaná (sekundární) rezistence vzniká až v prů-běhu cytostatické léčby, kdy se původně citlivé buňky stávají rezistentními a  účinnost cytosta-tické léčby se snižuje. Pokud při ztrátě citlivosti k jednomu přípravku vzniká současně rezistence na jiné, většinou strukturálně příbuzné cytosta-tikum, hovoříme o rezistenci zkřížené. Byly však popsány případy zkřížené rezistence mezi protiná-dorovými léčivy lišícími se jak strukturálně, tak mechanismem účinku. Takové případy rezisten-ce pak nazýváme mnohočetná léková rezistence (multidrug resistance, MDR). MDR vysvětluje případy necitlivosti některých nádorů k alterna-tivním léčebným režimům, obsahujícím nové druhy cytostatik, nepoužitým v  původní léčbě. Typická (klasická) MDR je zapříčiněna membráno-vým P-glykoproteinem (Pgp), který je produktem MDR1 genu. Jako atypická MDR jsou souhrnně označovány všechny mechanismy mnohočetné lékové rezistence, na kterých se neúčastní Pgp [17].

Jedním ze základních mechanismů vzniku MDR je transportní funkce některých transmembránových proteinů ze skupiny tzv. ABC-transportérů (ATP binding cassette proteins). Jedním z nejvýznam-nějších ABC-transportérů přispívajících k rozvoji MDR je právě P-glykoprotein (Pgp). Jde o  trans-membránový glykoprotein o  velikosti 170  kDa tvořený 1280 aminokyselinami [22]. Pgp/MDR je běžně exprimován v játrech, ledvinách, střevech, mozku, děloze, varlatech a placentě [15]. Z toho vyplývá i jeho fyziologická funkce, kterou je pře-devším řízení absorpce, distribuce a exkrece celé řady xenobiotik včetně řady klinicky významných léčiv. Brání také průniku xenobiotik do mozku či reprodukčních orgánů [21]. Pgp je kódován ge-nem MDR1 (ABCB1). Exprese proteinu koreluje s expresí na úrovni genu [11]. Substráty Pgp jsou řada protinádorových léčiv, jako vinka-alkaloidy, antracykliny, taxany, kolchicin a aktinomycin D [15]. Taxany jsou standardní součástí chemotera-pie první linie pokročilého ovariálního karcinomu. Při zvýšené expresi Pgp/MDR mohou být taková léčiva za účasti transportní funkce Pgp předčasně vylučována z nádorových buněk, což může způso-bit pokles účinku dané léčby.

V roce 1992 byl objeven druhý ABC transportér nazývaný multidrug resistance-associated protein (MRP, MRP1/ABCC1). MRP1 byl následně rozpoznán jako prototyp nové podskupiny transportérů, ze kterých MRP1 zůstává jako nejlépe charakteri-zovaný [3, 9]. Lung resistance protein (LRP) je další protein rezistence [20]. Biologická funkce exprese LRP v normálních i nádorových buňkách není zatím plně vysvětlena. Předpokládá se, že se podílí na intracelulární redistribuci léčiv. Počet léků asociovaných s LRP je podstatně menší než u  Pgp a  MRP1 a  zahrnuje alkylační cytostatika jako melfalan, cyklofosfamid a platinové prepa-ráty [13]. Nejdůležitější geny ABC transportních proteinů podílející se na lékové rezistenci zahrnují MDR1/ABCB1 (Pgp), několik členů z  podskupiny MRP/ABCC a ABCG2 [7]. Úloha ABC transportérů v klinické rezistenci, a zejména rezistenci u che-

Čes. Gynek., 2013, 78, č. 6, s. 545–553

proteinů rezistence pod 85 % (Kaplanův-Meierův test pro PFS, Pgp < 85 % Med PFS 23 měs. (CI 8–37) vs > 85 % Med PFS 11 měs. (CI 7–17), p = 0,054), (MRP1 < 85 % Med PFS 33 měs. (CI 11–49) vs > 85% Med PFS 11 měs. (CI 7–16), p = 0,046).Závěr: Prokázali jsme klinický význam stanovení LRP, Pgp, MRP1 a MRP3 u pacientek s karcinomem ovaria. MRP5 nemá podle našich výsledků klinický význam u pacientek s karcinomem ovaria. MRP1 se z proteinů

rezistence ukazuje jako nejperspektivnější prediktiv-ní a  prognostický faktor u  pacientek s  karcinomem ovaria.

KlíČOVÁ SLOVAkarcinom ovaria – LRP – Pgp/ABCB1 – MRP1/ABCC1 – MRP3/ABCC3 – MRP5/ABCC5 – chemorezistence

Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim: www.prolekare.cz/prohlaseni

www.prolekare.cz | stazeno: 2.1.2014 | login: 0937000728

5472013, 78, č. 6 ČESKÁ GYNEKOLOGIE

monaivních pacientů se solidními nádory je stále předmětem mnoha diskusí.

Cílem této práce je zhodnocení proteinů re-zistence LRP (Lung Resistance Protein), Pgp (P-glycoprotein), MRP1 (Multidrug Related Protein), MRP3 a MRP5 a jejich klinicko-patologic-kého významu u pacientek s karcinomem ovaria. Zhodnocení hodnot sledovaných proteinů rezis-tence v závislosti na stadiu onemocnění, stupni

diferenciace, histologickém typu, typu léčebné od-povědi a délce období do progrese onemocnění.

METODIKA A SOUBOR PACIENTEK

Stanovení proteinů rezistence LRP, PgP, MRP1, MRP3, MRP5

Proteiny rezistence LRP (Lung Resistance Protein), Pgp (P-glycoprotein), MRP1 (Multidrug Related Protein), MRP3 a  MRP5 jsme stanovili standardním postupem dvoustupňovou imuno-histochemií ve Fingerlandově ústavu patologie ve Fakultní nemocnici Hradec Králové. Materiál získaný při operaci byl po odběru rutinně fixován v 10% formalinu. Ve všech případech byl proveden standardizovaný odběr tkáně na histologické (a ná-sledné imunohistochemické) vyšetření. Byly ode-brány vždy nejméně tři vzorky z nádoru (zpravidla 1 bloček na 1 cm nádoru) se zaměřením na pouzdro, popřípadě periferii tumoru. Tkáňové bločky byly dále zpracovány standardní histologickou tech-nikou a zality do parafinu. Z každého bločku byly krájeny řezy o tloušťce 2–3 μm. Tyto řezy se použily jednak k rutinnímu barvení hematoxylinem-eozi-nem, jednak k imunohistochemickému vyšetření.

Obr. 3 Difuzní cytoplazmatická pozitivita MRP1 (zvětšeno 100×)Obr. 2 Difuzní jaderná i cytoplazmatická pozitivita Pgp (zvět-šeno 400×)

Obr. 4 Fokální cytoplazmatická pozitivita MRP3 (zvětšeno 100×) Obr. 5 Negativita MRP5 (zvětšeno 100×)

Obr. 1 Difuzní cytoplazmatická pozitivita LRP (zvětšeno 400×)

Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim: www.prolekare.cz/prohlaseni

www.prolekare.cz | stazeno: 2.1.2014 | login: 0937000728

548 ČESKÁ GYNEKOLOGIE 2013, 78, č. 6

Stanoven byl histologický typ nádoru a stupeň jeho diferenciace.

Parafinové bločky byly imunohistochemicky vyšetřeny za použití těchto primárních protilá-tek: Pgp (klon C494, LabVision, Fremont, USA, ředění 1:50), LRP (klon 9D6, LabVision, ředění 1:20), MRP1 (klon 33A6, Novocastra, Newcastle upon Tyne, United Kingdom, ředění 1:100), MRP3 (klon DTX 1, Novocastra, ředění 1:100) a  MRP5 (klon 69, Novocastra, ředění 1:50). Antigeny Pgp, LRP, MRP1 a  MRP5 byly demaskovány inkubací v citrátovém pufru (pH 6) při teplotě 95 °C po do-bu 30 minut (Pgp a LRP), resp. 60 minut (MRP1 a MRP5). Protein MRP3 byl demaskován v pufru S 3308 (DakoCytomation, Glostrup, Dánsko) (pH 6) při teplotě 95 °C po dobu 60 minut. K imunohis-tochemickému vyšetření byla použita nepřímá imunohistochemická metoda s použitím avidin-biotinového vizualizačního systému EnVision+ (DakoCytomation).

Ve světelném mikroskopu pak byla kvantita-tivně hodnocena pozitivita reakce, tj. procento pozitivních (hnědě zbarvených) nádorových bu-něk: Pgp – membránová popř. i  cytoplazmatic-ká pozitivita, LRP – cytoplazmatická pozitivita, MRP1 – membránová, případně i cytoplazmatická pozitivita, MRP3 – membránová, případně i  cy-toplazmatická pozitivita, MRP5 – membránová a cytoplazmatická pozitivita (obr. 1, 2, 3, 4, 5).

Soubor pacientekStanovení proteinů rezistence (LRP, Pgp, MRP1,

MRP3, MRP5) jsme provedli u 111 vzorků epiteliál-ních ovariálních karcinomů u pacientek operova-ných na Porodnické a gynekologické klinice FNHK v letech 2006–2010 (tab. 1). Pacientky před danou

operací neprodělaly chemoterapii ani žádnou jinou léčbu pro ovariální karcinom. Šlo o pacientky s no-vě zjištěným karcinomem ovaria – chemonaivní. Žádná z těchto pacientek nebyla v minulosti léčena pro jiný karcinom. Všechny pacientky měly před operací podepsaný informovaný souhlas s odběrem vzorků tkáně – schválený Etickou komisí FNHK. Celkem 83 pacientek z tohoto souboru dostalo po- dle současných doporučených standardů v rámci adjuvantní pooperační chemoterapie první linie 6 cyklů kombinace paklitaxel (175 mg/m2) a karbo-platina (AUC 5–6) a mělo zároveň dostatečné follow up pro sledování klinických parametrů.

Průměrný věk testovaných pacientek byl 64,4 let (33–89 let). Stadium bylo stanoveno podle FIGO kla-sifikace (International Federation of Obstetrics and Gynecology). Za časné onemocnění jsme považova-li stadium I+II a za pokročilé onemocnění stadium III+IV. Celkem bylo 22 pacientek se stadiem I, 9 pa- cientek se stadiem II, 73 pacientek se stadiem III a 7 pacientek se stadiem IV. Histopatologický typ ovariálního karcinomu byl stanoven podle WHO klasifikace (World Health Organization). Dobře diferencovaný ovariální karcinom v tomto souboru mělo 12 pacientek, 21 pacientek středně diferen-covaný ovariální karcinom a 73 pacientek špatně diferencovaný karcinom ovaria. U 3 pacientek byl diagnostikován nediferencovaný ovariální kar-cinom. U  2 pacientek nebyl stupeň diferenciace určen. Serózní ovariální karcinom mělo 83 žen, mucinózní ovariální karcinom 5 pacientek, endo-metroidní ovariální karcinom mělo 14 pacientek a 6 žen mělo světlobuněčný ovariální karcinom. Pacientky s jinými histologickými typy ovariální-ho karcinomu ani borderline tumory jsme do této práce nezahrnuli.

Klinické údaje jsme zpětně dohledali z doku-mentace pacientek. Minimální follow-up pro sledování klinických údajů bylo 2,5 roku. Deset pacientek z našeho souboru nesplňovalo požada-vek minimálního follow up 2,5 roku, 9 pacientek dostalo chemoterapii na jiném pracovišti, 5 pa-cientek bylo diagnostikováno v  časném stadiu a  chemoterapii nedostávaly vůbec, 3 pacientky zemřely ještě před zahájením chemoterapie nebo v průběhu vlastního podání chemoterapie a 1 pa-cientka chemoterapii odmítla. Zhodnocení kli-nických údajů jsme tedy provedli u 83 pacientek z našeho souboru. Léčebnou odpověď na primární léčbu jsme hodnotili podle RECIST kritérií (RECIST 1.1). Typ léčebné odpovědi jsme stanovili na zá-kladě výsledků objektivního vyšetření, Ca 125, rtg plic a CT břicha po skončení chemoterapie první linie. Všechny pacientky s časným onemocněním (I + II) v našem souboru měly kompletní odpověď na primární léčbu. Kompletní odpověď na primární léčbu jsme zaznamenali celkem u  72 pacientek

Charakteristika n %Stadium (FIGO)I 22 19,8

II 9 8,1

III 73 65,8

IV 7 6,3

Stupeň diferenciaceG1 12 10,9

G2 21 19,1

G3 73 66,4

Histologický typ nádoruSerózní adenokarcinom 83 69,2

Endometroidní OCa 14 11,7

Mucinózní OCa 5 4,2

Světlobuněčný OCa 6 5,0

Nediferencovaný OCa 3

Tab. 1 Charakteristika souboru

Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim: www.prolekare.cz/prohlaseni

www.prolekare.cz | stazeno: 2.1.2014 | login: 0937000728

5492013, 78, č. 6 ČESKÁ GYNEKOLOGIE

(prům. věk 62,44 let; min. 47, max. 80), částečnou odpověď na primární léčbu u 5 žen (pr. věk 67,8 let; min. 60, max. 80), „stable disease“ u  jedné pa- cientky (56 let) a progresi onemocnění po skončení primární léčby u 5 žen z našeho souboru (pr. věk 65,0 let; min. 57, max. 70). Za délku PFS (progres-sion free survival, období do progrese onemocnění) jsme hodnotili období od dosáhnutí kompletní remise onemocnění do objevení se recidivy, potvr-zené laboratorně i zobrazovacími metodami.

Pro popis souboru byly použity deskriptivní metody statistiky. Pro hodnocení jsme použili průměrné hodnoty a pro stanovení míry rozptylu jsme využili 95% interval spolehlivosti (CI – con-fidence interval). Porovnání jednotlivých skupin bylo provedeno neparametrickým Mannovým-Whitneyho testem případně Kolmogorovovým-Smirnovovým testem v  případě tří skupin byla použita Kruskalova–Wallisova neparametrická analýza rozptylu. Log-rank test pro porovnání Kaplanových-Meierových křivek pro PFS. Za sta-tisticky významnou jsme považovali hladinu vý-znamnosti p < 0,05 a  na hranici statistické vý-znamnosti p = 0,05–0,1.

VÝSLEDKYPrůměrný věk pacientek s  epiteliálním ova-

riálním karcinomem byl 64,47 let (min. 33, max. 89). Při porovnání hodnot LRP, Pgp, MRP1, MRP3, MRP5 v závislosti na věku pacientek s využitím vě-kové hranice 50 let jsme nezaznamenali významné rozdíly. Pacientek ve věku nižším než 50 let bylo 12 a 99 žen bylo ve věku nad 50 let. Pouze Pgp byl nižší u  pacientek ve věkové kategorii pod 50 let v porovnání s pacientkami nad 50 let věku (68 % vs. 89 %).

LRP, Pgp, MRP1 a  MRP3 vykazovaly výrazné rozdíly hodnot v závislosti na histologickém typu ovariálního karcinomu (MRP1 p = 0,023, MRP3 p = 0,056). Nejvyšší hodnoty LRP, Pgp, MRP1 a  MRP3 u  mucinózního ovariálního karcinomu v porovnání s ostatními histologickými typy jsme i přes malý počet v této skupině prokázali opakova-

ně. Nejnižší hodnoty jsme zjistili u endometroid-ního ovariálního karcinomu (tab. 2). Stupeň dife-renciace významně ovlivnil pouze hodnoty MRP1, které narůstaly směrem od dobře diferencovaného ke špatně diferencovanému karcinomu ovaria (G1 60,83 % [CI 10–100], G2 36,80 % [CI 20–100], G3 88,87 % [CI 100–100], p = 0,039). Ostatní námi sledované proteiny se významně neměnily v  zá-vislosti na stupni diferenciace, a to ani v případě porovnání G1+G2 versus G3.

Prokázali jsme vztah proteinů rezistence s po-kročilostí onemocnění. Nárůst MRP1 od časných stadií (I + II) k pokročilému onemocnění (III + IV) byl významný: I+II 71,6 % (CI 60–100), III+IV 83,6% (CI 100–100), (p = 0,03) (graf 1). LRP, Pgp, MRP3 a MRP5 nekorelovaly s pokročilostí onemocnění. Peroperační velikost nádoru ani velikost nádorové-ho rezidua po primární operaci nevykazovaly vztah s žádným z námi sledovaných proteinů rezistence. Stejně tak jsme nezjistili významnější vztah mezi LRP, Pgp, MRP1, MRP3, MRP5 a výskytem trom-bocytopenie v průběhu podání chemoterapie první linie ve složení paklitaxel + karboplatina.

Pro posouzení vztahu proteinů rezistence s kli-nickým průběhem onemocnění jsme zařadili do studie pouze pacientky, které dostaly 6 cyklů pri-mární pooperační chemoterapie ve složení paklita-xel (175 mg/m2) a karboplatina (AUC 5–6). V této čás-ti jsme hodnotili pouze pacientky s dostatečným „follow up“, u kterých jsme mohli přesně dohledat data o klinickém průběhu onemocnění. Zvlášť jsme

Histologický typ Serózní n=83

Mucinózní n=5

Endometroidní n=14

Nediferencovaný n=2

Světlobuněčný n = 6

pr. věk (min, max) 65,2 (40-89) 60,6 (42-71) 63,6 (51-79) 58,5 (51-66) 62,1 (52-67)p % CI % % CI % % CI % % CI % % CI %

LRP 0,391 75,2 80-100 100,0 100-100 65,3 0-100 15,0 10-20 70,0 20-100

Pgp 0,199 74,1 90-100 96,0 90-100 53,7 10-100 40,0 0-80 71,6 20-100

MRP1 0,023* 85,7 100-100 96,0 90-100 63,5 0-100 80,0 60-100 45,0 10-90

MRP3 0,056* 2,8 0-0 40,0 5-80 0 0-0 50,0 0-100 0 0-10

MRP5 0,697 3,5 0-0 2,0 0-5 4,28 0-0 0 0-60 0 0-0

Tab. 2 Proteiny rezistence LRP, Pgp, MRP1, MRP3, MRP5 a histologický typ ovariálního karcinomu

Graf 1 MRP1 a stadium onemocnění u pacientek s karcinomem ovaria (p = 0,03)

Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim: www.prolekare.cz/prohlaseni

www.prolekare.cz | stazeno: 2.1.2014 | login: 0937000728

550 ČESKÁ GYNEKOLOGIE 2013, 78, č. 6

porovnávali skupinu pacientek se stadiem I + II a skupinu pacientek se stadiem III + IV. Ve skupině pa-cientek s  časným onemocněním (I  + II) dosáhly všechny pacient-ky po skončení primární léčby kompletní remise onemocnění (RECIST 1.1). Porovnávali jsme proteiny rezistence v jednotlivých kategoriích: kompletní odpověď (n = 72, pr. věk 62,2 let), částečná odpověď (n = 5, pr. věk 67,8 let), „stable disease“ (n = 1, 56 let), pro-grese onemocnění (n = 5, pr. věk 65,0 let). U LRP, Pgp a MRP1 na-růstaly hodnoty postupně od nej-nižších (u pacientek s kompletní odpovědí) po nevyšší (u pacientek s progresí onemocnění). Následně jsme porovnali skupinu pacientek s kompletní odpovědí versus ostat-ní pacientky. Pacientky s komplet-ní odpovědí na primární léčbu mě-ly nižší hodnoty LRP, Pgp a MRP1 v porovnání s ostatními pacient-kami (částečná odpověď, „stable disease“, progrese onemocnění). Nejvyšší hodnoty měly pacientky s prokázanou progresí onemocně-ní (tab. 3). U MRP3 a MRP5 jsme nezaznamenali významnější vztah k  léčebné odpovědi u  pacientek s ovariálním karcinomem.

Pacientky s vyššími hodnotami Pgp, MRP1, MRP3 měly také vyš-ší riziko recidivy. Pacientky s vy-sokou expresí Pgp a  MRP1 měly významně kratší období do obje-vení se recidivy v porovnání s pa-cientkami s nízkou expresí těchto proteinů rezistence. LRP a MRP5 neměly vliv na výskyt recidivy ani

Graf. 2 Kaplanova-Meierova křivka přežití pro DFI – P-glykoprotein (Pgp) (p=0,054)Pgp < 85 % versus > 85%

Graf. 3 Kaplanova-Meierova křivka pro DFI – Multidrug Related Protein 1 ( MRP1)MRP1 < 85 % versus > 85%

Stadium I+II Stadium III+IV

P CR n=25 CR n=47 PR n=5 SD n=1 Prog n=5věk % CI % % CI % % CI % % CI % % CI %LRP 0,286 82,5 70-100 69,5 60-100 87,5 70-100 100 - 100 100-100

Pgp 0,717 70,4 60-100 76,4 80-100 80,0 50-100 90,0 - 92,0 85-100

MRP1 0,694 72,4 60-100 86,8 100-100 92,0 80-100 100 - 82,0 55-100

MRP3 0,925 8,0 0-0 7,4 0-0 0 0-0 0 - 20,0 0-50

MRP5 0,829 0,4 0-0 8,7 0-0 0 0-0 0 - 0 0-0CR – kompletní odpověď, PR – částečná odpověď, SD – „stable disease“, Prog – progrese onemocnění

Tab. 3 LRP, Pgp, MRP1, MRP3 a MRP5 a typ léčebné odpovědi (RECIST 1.1)

Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim: www.prolekare.cz/prohlaseni

www.prolekare.cz | stazeno: 2.1.2014 | login: 0937000728

5512013, 78, č. 6 ČESKÁ GYNEKOLOGIE

na délku období do progrese onemocnění (PFS). Pro zhodnocení vztahu proteinů rezistence s  délkou PFS jsme stanovili dvě kategorie pro Pgp a MRP1 < 85 % versus > 85 % a pro MRP3 kategorii 0 % ver-sus ostatní. Rozdělení jsme stanovili vlastní, na základě posouzených dat, protože v dosud publiko-vaných studiích věnovaných hodnocení klinického významu proteinů rezistence Pgp a MRP1 nejsou rozdělení jednotná a nalezení odpovídajících ka-tegorií je stále předmětem výzkumu. Hodnotili jsme délku PFS (progression free survival, období do progrese onemocnění) u  skupiny pacientek s hodnotou Pgp a MRP1 vyšší než 85 % se skupi-nou pacientek s hodnotou Pgp a MRP1 menší než 85 %. Medián délky PFS byl statisticky významně kratší u skupiny pacientek s Pgp a MRP1 nad 85 % v  porovnání s  pacientkami s  hodnotami těchto proteinů rezistence pod 85 % (Kaplanův-Meierův test pro PFS, Pgp < 85 % Med PFS 23 měs. (CI 8–37) vs > 85 % Med PFS 11 měs. (CI 7–17), p = 0,054), (MRP1 < 85 % Med PFS 33 měs. (CI 11–49) vs > 85 % Med PFS 11 měs. (CI 7–16), p = 0,046) (graf 2, 3). Na hranici statistické významnosti jsme nalezli kratší délku PFS u skupiny pacientek s nulovou expresí MRP3 v  porovnání se skupinou žen s  vyšší hodnotou MRP3 (= 0 % Med PFS 11 měs. (CI 9–17) vs > 0 % Med PFS 37 měs. (CI 19–37), p = 0,062) (graf 4).

DISKUSEChemorezistence je hlavním klinickým problé-

mem současné systémové léčby pacientek s karci-nomem ovaria. Proteiny rezistence LRP, Pgp, MRP se podílejí na vzniku chemorezistence. Z  dosud publikovaných prací věnovaných proteinům re-

zistence vyplývají nejednotná da-ta. Problematika vzniku primární chemorezistence ovariálního kar-cinomu není stále jednoznačně objasněna. Z  toho důvodu jsou velmi přínosné práce studující podstatu primární chemorezis-tence na konkrétních vzorcích nádorové tkáně od jednotlivých pacientek, a ne na vypěstovaných uniformních buněčných liniích. Ačkoli nově zkoumaná cytostatika nevedou k významnému prodlou-žení přežití, zůstává chemoterapie stále základem systémové léčby ovariálního karcinomu. I v přípa-dě klinických studií jsou nové typy následné primární léčby (biologic-ká léčba, imunoterapie) podávány zatím „pouze“ v kombinaci s pri-mární chemoterapií. Stanovení chemorezistence by mohlo přispět

k predikci pacientek primárně nevhodných k sou-časné standardní primární chemoterapii a násled-né individualizaci systémové léčby u  pacientek s karcinomem ovaria.

V této studii jsme stanovili proteiny rezistence LRP, Pgp, MRP1, MRP3, MRP5. Takto komplexní zhodnocení proteinů rezistence z  jednotlivých vzorků ovariálních karcinomů u pacientek s jed-ním typem chemoterapie nebylo dosud publiko-váno. Data ohledně klinického významu protei-nů MRP3 a MRP5 u ovariálního karcinomu jsou ojedinělá. Zjistili jsme velmi významné rozdíly hodnot zejména LRP, Pgp, MRP1 a MRP3 u jed-notlivých histologických typů ovariálního karci-nomu. I přes malý počet pacientek s mucinózním ovariálním karcinomem jsme zaznamenali opět nejvyšší hodnoty LRP, Pgp, MRP1 a MRP3 v porov-nání s  ostatními histologickými typy. Přestože v našem souboru šlo o malou skupinu pacientek s  mucinózním ovariálním karcinomem, mohla by tím být vysvětlena klinicky špatná odpověď pa- cientek s tímto histologickým typem ovariálního karcinomu na primární chemoterapii ve složení paklitaxel + karboplatina. Na druhé straně nejniž-ší hodnoty proteinů rezistence jsme zaznamenali u endometroidního ovariálního karcinomu. I zde můžeme najít korelaci s  klinickým průběhem, protože endometroidní ovariální karcinom větši-nou dobře odpovídá na standardní chemoterapii první linie. Různé zastoupení proteinů rezistence u  jednotlivých histologických typů ovariálního karcinomu potvrzuje různorodost chování jed-notlivých histologických typů ovariálního karci-nomu včetně odlišné odpovědi na jeden typ pri-mární chemoterapie. Právě zastoupení proteinů

Graf. 4 Kaplanova-Meierova křivka pro DFI - Multidrug Related Protein 3 ( MRP3)MRP3 = 0 % versus > 0%

Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim: www.prolekare.cz/prohlaseni

www.prolekare.cz | stazeno: 2.1.2014 | login: 0937000728

552 ČESKÁ GYNEKOLOGIE 2013, 78, č. 6

rezistence může mít velký význam v úspěšnosti následné systémové léčby pacientek s ovariálním karcinomem.

Pacientky s  karcinomem prsu s  vysokou ex-presí Pgp/MDR léčené antracykliny nebo taxany přežívaly kratší dobu než pacientky léčené jinými režimy [22]. Izquierdo et al. sledovali expresi LRP, MRP a Pgp u ovariálních karcinomů. Pouze LRP prokázali jako independentní prognostický faktor odpovědi na chemoterapii a přežití [14]. Goff et al. naopak nezaznamenali rozdíl hodnot LRP a MRP u pacientek chemosenzitivních a chemorezistent-ních [8]. Další studie u  ovariálního karcinomu taktéž neprokázala význam exprese LRP ve vztahu k  léčebné odpovědi u  pacientek s  karcinomem ovaria [2]. Naše výsledky ukazují malý klinický význam LRP u pacientek s karcinomem ovaria.

Materna et al. prokázali prognostický význam Pgp a  MRP2 u  pacientek s  karcinomem ovaria [16]. Pro posouzení významu míry exprese Pgp pro predikci úspěšnosti chemoterapie je rozho-dujícím faktorem výběr cytostatika. V  případě použití cytostatik, která jsou substráty Pgp, např. taxany, existuje předpoklad, že terapie může vést ke vzniku mnohočetné lékové rezistence. Díky případně zvýšené expresi Pgp mohou být taková léčiva za účasti transportní funkce Pgp předčasně vylučována z nádorových buněk, což může způ-sobit pokles účinku léčby [22]. Data o  významu Pgp u ovariálního karcinomu jsou zatím nejvíce prozkoumána, ale stále jsou nejednotná. V  de-vadesátých letech v  začátcích intenzivnějšího sledování exprese MDR/Pgp u  solidních nádorů byly publikovány práce, které u nepředléčených ovariálních karcinomů nenalezly žádnou expresi [5] nebo velmi nízkou expresi tohoto proteinu [10, 18]. To je zcela v kontroverzi s našimi závěry, kdy opakovaně prokazujeme u naprosté většiny ovari-álních karcinomů určitou míru exprese proteinů rezistence u chemonaivních pacientek. Tedy u pa-cientek bez jakékoli předchozí chemoterapeutické léčby [19]. Při porovnání hodnot MDR v nádorové tkáni a párových vzorcích okolní přiléhající ne-nádorové tkáně bez morfologicky detekovaných nádorových buněk u pacientek s karcinomem prsu byla nalezena indukce exprese MDR po podání chemoterapie i  v  nenádorové tkáni [22]. Starší studie neprokázaly prognostický význam Pgp pro počáteční odpověď na chemoterapii [2, 12, 14]. Novější práce v  souladu s  našimi výsledky pro-kázaly negativní korelaci exprese Pgp s léčebnou odpovědí u pacientek s karcinomem ovaria [10, 16, 23]. Zcela určitě zde bude velmi významně ovlivňovat výsledky i použitá metodika ke stano-vení exprese.

Exprese MRP byla prokázána u více než dvou třetin epiteliálních ovariálních karcinomů [1,

14]. Izquierdo et al. nalezli expresi MRP u  68 % epiteliálních ovariálních karcinomů stadia III/IV a exprese byla limitována hlavně v cytoplazmatic-ké membráně [14]. Goff et al. zjistili expresi MRP u 66 % epiteliálních ovariálních karcinomů [8], nezaznamenali však asociaci s  chemorezisten-cí. Tyto výsledky potvrdily i  další studie, které nenalezly významný vztah mezi expresí MRP a chemorezistencí ovariálního karcinomu [1, 2, 14]. Yakirevich et al. nalezli statisticky význam-nou korelaci mezi silnou expresí Pgp a  kratším přežitím u pacientek s karcinomem ovaria. Delší interval přežití měly pacientky Pgp negativní v porovnání s ženami s Pgp pozitivním tumorem. MRP1 a LRP podle jejich výsledků neměly vliv na délku přežití [23].

ZÁVĚRProkázali jsme klinický význam stanovení LRP,

Pgp, MRP1 a MRP3 u pacientek s karcinomem ova-ria. MRP5 podle našich výsledků vůbec nekoreluje se základními histopatologickými vlastnostmi ani s průběhem onemocnění u pacientek s karci-nomem ovaria. Z našich dat se z proteinů rezis-tence ukazuje jako nejperspektivnější prediktivní a prognostický faktor u pacientek s karcinomem ovaria MRP1.

Tento projekt vznikl za podpory grantu NT 14107 IGA MZ CR.

LITERATURA

1. Arao, S., Suwa, H., Mandai, M., et al. Expression of multidrug resistance gene and localization of P-glycoprotein in human pri-mary ovarian cancer. Cancer Res, 1995, vol. 54, p. 1355–1359.2. Arts, HJ., Katsaros, D., de Vries, FG., et al. Drug resistance-associated markers P-glycoprotein, multidrug resistance-associa-ted protein 1, multidrug resistance-associated protein 2, and lung resistance protein as prognostic factors in ovarian carcinoma. Clin Cancer Res, 1999, 5, p. 2798–2805.3. Borst, P., Evers, P., Kool, M., Wijnholds, J. A family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins. J Natl Cancer Inst, 2000, 92, p. 1295–1302.4. Cibula, D., Petruželka, L., a  kol. Onkogynekologie, 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2009. 5. Codegoni, AM., Broggini, M., Pitelli, MR., et al. Expression of genes of potential importance in the response to chemotherapy and DNA repair in patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol, 1997, 65, p. 130–137.6. Fruehauf, PJ., Alberts, DS. In vitro drug resistance versus che-mosensitivity: two sides of different coins. J Clin Oncol, 2005, 23, p. 3641–3643.

Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim: www.prolekare.cz/prohlaseni

www.prolekare.cz | stazeno: 2.1.2014 | login: 0937000728

5532013, 78, č. 6 ČESKÁ GYNEKOLOGIE

7. Glavinas, H., Krajcsi, P., Cserepes, J., et al. The role of ABC transporters in drug resistance, metabolism and toxicity. Curr Drug Deliv, 2004, 1, p. 27.8. Goff, AB., Paley, JP., Greer, EB., Grown, MA. Evaluation of chemoresistance markers in women with epithelial ovarian carci-noma. Gynecol Oncol, 2001, 81, p. 18–24.9. Gottesman, MM., Fojo, T., Bates, SE. Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters. Nat Rev Cancer, 2002, 2, p. 48–58.10. Holzmayer, TA., Hilsenbeck, S., Von Hoff DD., Roninson, IB. Clinical correlates of MDR1 (P-glycoprotein) gene expression in ovarian and small-cell lung carcinomas. J Natl Cancer Inst, 1992, 84, p. 1486–1491.11. Charpin, C., Vielh, P., Duffaud, F. et al. Quantitative immu-nocytochemical assays of P-glycoprotein in breast carcinomas: correlation to messenger RNA expression and to immunohis-tochemical prognostic indicators. J Natl Cancer Inst, 1994, 86, p. 1539–1545.12. Ikeda, K., Sakai, K., Yamamoti, R., et al. Multivariate analysis for prognostic significance of histologic sybtype, GST-pi, MDR-1, and p-53 in stages II–IV ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer, 2003, 13, p. 776–784.13. Izquierdo, MA., Schoemaker, RH., Flens, MJ., et al. Over- lapping phenotypes of multidrug resistance among panels of hu-man cancer-cell lines. Int J Cancer, 1996, 65, p. 230–237.14. Izquierdo, M.A., van der Zee, AG., Vermorken, JB., et al. Drug resistance-associated marker LRP for prediction of response to chemotherapy and prognosis in advanced ovarian carcinoma. J Natl Cancer Inst, 1995, 87, p. 1230–1237.15. Kuwano, M., Uchiumi, T., Hayakawa, H., et al. The basic and clinical implications of ABC transporters, Y-box-binding protein-1 and angiogenesis-related factors in human malignancies. Cancer Sci, 2003, 94, p. 9–14.16. Materna, V., Pleger, J., Hoffmann, U., Lage, H. RNA- -expression of MDR1/P-glycoprotein, DNA-topoisomerase I, and

MRP2 in ovarian carcinoma patients: correlation with chemothe-rapeutic response. Gynecol Oncol, 2004, 94, p. 152–160.17. Nosková, V., Hajdúch, M., Mihál, V., Cwiertka, K. Mechanismy mnohočetné lékové rezistence a jejich význam pro klinickou praxi. Klin Onkol, 2000, 13, s. 4–9.18. Rubin, SC., Finstad, CL., Hoskins, WJ., et al. Expression of P-glycoprotein in epithelial ovarian cancer: evaluation as a marker of multidrug resistance. Am J Obstet Gynecol, 1990, 163, p. 69–73.19. Sedláková, I., Laco, J., Tošner, J., et al. Proteiny rezistence a chemorezistence u pacientek s karcinomem ovaria. Klin Onkol, 2012, 25, p. 457–463.20. Scheffer, GL., Wijngaard, PL., Flens, MJ., et al. The drug re-sistance related protein LRP is the human major vault protein. Nat Med, 1995, 1, p. 578–582.21. Schinkel, AH. P-Glycoprotein, a gatekeeper in the blood-brain barier. Adv Drug Deliv Rev, 1999, 36, p. 179–194.22. Václavíková, R., Hubáčková, M., Kubala, E., et al. Exprese genu mnohočetné lékové rezistence 1 (MDR1) a její význam v roz-voji a terapii karcinomu prsu. Klin Onkol, 2007, 3, p. 253–259.23. Yakirevich, E., Sabo, E., Naroditsky, I., et al. Multidrug re-sistance-related phenotype and apoptosis-related protein ex-pression in ovarian serous carcinomas. Gynecol Oncol, 2006, 100, p. 152–159.

MUDr. Iva Sedláková, Ph.D.Porodnická a gynekologická klinika FN

Sokolská 581500 05 Hradec Králové

iva.sedlakova@ fnhk.czz

Tento clanek podleha autorskemu zakonu a jeho vyuziti je mozne v souladu s pravnim prohlasenim: www.prolekare.cz/prohlaseni