Embed Size (px)
Citation preview
1
FRAKSINASI SENYAWA AKTIF BEREFEK
MUKOLITIK DARI EKSTRAK HEKSAN DAUN PARE
(Momordica charantia L.)
ALFRED YUSUF
N111 08 010
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2013
2
FRAKSINASI SENYAWA AKTIF BEREFEK
MUKOLITIK DARI EKSTRAK HEKSAN DAUN PARE
(Momordica charantia L.)
SKRIPSI
untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi
syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana
ALFRED YUSUF
N111 08 010
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2013
3
FRAKSINASI SENYAWA AKTIF BEREFEK
MUKOLITIK DARI EKSTRAK HEKSAN DAUN PARE
(Momordica charantia L.)
ALFRED YUSUF
N111 08 010
Disetujui oleh :
Pembimbing Utama
Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt. NIP. 19641231 199002 1 005
Pembimbing Pertama
Dr. Mufidah, S.Si., M.Si., Apt. NIP. 19730309 199903 2 002
Pembimbing Kedua
Dr. Hj. Sartini, S.Si., M.Si., Apt. NIP.19611111 198703 2 001
Pada tanggal, 31 Juli 2013
4
PENGESAHAN FRAKSINASI SENYAWA AKTIF BEREFEK
MUKOLITIK DARI EKSTRAK HEKSAN DAUN PARE (Momordica charantia L.)
ALFRED YUSUF N111 08 010
Dipertahankan dihadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Pada tanggal 31 Juli 2013
Panitia Penguji Skripsi
1. Ketua
Drs. Abdul Muzakkir Rewa, M.Si., Apt. : ……………....
2. Sekretaris
Usmar, S.Si., M.Si, Apt. : ……………….
3. Ex Officio
Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt. : ……………….
4. Ex Officio
Dr. Mufidah, S.Si., M.Si., Apt. : ……………….
5. Ex Officio :
Dr. Hj. Sartini, S.Si., M.Si., Apt : ……………….
6. Anggota
Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt. : ……………….
Mengetahui : Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA., Apt. NIP. 19560114 198601 2 001
5
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini adalah karya
nyata sendiri, tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk
memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan sepanjang
sepengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah
ditulis atau diterbitkan oleh orang lain kecuali yang secara tertulis diacu
dalam naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila di kemudian hari terbukti bahwa pernyataan saya ini tidak
benar, maka skripsi dan gelar yang diperoleh, batal demi hukum.
Makassar, 31 Juli 2013
Penyusun
Alfred Yusuf
6
UCAPAN TERIMA KASIH
Segala pujian, hormat dan kemuliaan hanya kepada Tuhan Yesus
yang senantiasa nyata dalam kehidupan kita karena hanya atas limpahan
kasih dan karunia-Nya sehingga skripsi ini dapat diselesaikan sebagai
salah satu syarat dalam memperoleh gelar kesarjanaan pada Program
Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Hasanuddin.
Penghormatan dan terima kasih yang setinggi-tingginya penulis
sampaikan kepada Ayahanda Yusuf, S.Pd. dan Ibunda Lebok atas doa
yang tiada putusnya, kasih sayang, dukungan, dan ketulusan hati untuk
tidak pernah menyerah sehingga penulis bisa menyelesaikan kuliah
sampai saat ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada saudara-
saudaraku yang tercinta Kakak Milda, Adik Anti dan Nobel untuk
dukungan dan sukacita yang boleh penulis alami bersama mereka.
Dalam penyusunan skripsi ini tentu ada banyak kendala yang penulis
alami. Namun, berkat dukungan dan bantuan berbagai pihak, akhirnya
penulis dapat melewati kendala-kendala tesebut. Oleh karena itu, penulis
dengan tulus menucapkan terima kasih dan penghargaan setinggi-
tingginya kepada :
1. Bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si.,Apt. sebagai pembimbing utama,
Ibu Dr. Mufidah, S.Si., M.Si.,Apt. sebagai pembimbing pertama dan Ibu
Dr. Hj. Sartini, S.Si., M.Si.,Apt. sebagai pembimbing kedua.
7
2. Dekan Fakultas Farmasi, Ibu Prof. Dr. Elly Wahyuddin, DEA., Apt.,
Wakil Dekan I Bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt., Wakil Dekan II
Ibu Prof.Dr.rer.nat. Hj. Marianti A. Manggau, Apt., Wakil Dekan III
Bapak Drs. Abd. Muzakkir Rewa, M.Si., Apt., dan Almarhum Bapak Drs.
Kusharyono, MS.,Apt. sebagai penasehat akademik.
3. Bapak dan Ibu dosen serta staf pegawai pada Fakultas Farmasi
Universitas Hasanuddin.
4. Terima kasih juga buat teman-teman seperjuangan dalam penelitian ini
Wahyudiana Tahir, Dwi Astuti, Multi Sri Megawati, Dian Ekawati,
Muhammad Raihan terimakasih telah menjadi partner yang setia,
mendengarkan keluh, kesah, kegalauan, dan suka duka penulis mulai
dari awal hingga selesainya penulisan skripsi ini. Terima kasih juga buat
Anti, Ais, Angela yang senantiasa memberikan dukungan dan candaan
selama penelitian ini.
5. Kepada saudara-saudaraku angkatan 2008 (STEROID) Fakultas
Farmasi UNHAS terkhusus buat Ferliem, Dwi Wahyudi, Suswanda
Surya, Fajrin Raharjo, Hasanuddin, Made Sandi, Purwalinggar,
Rahmawati Mastura, A. Karyawati, Rahmatun Sahra serta teman-teman
semua terima kasih banyak atas semua persaudaraan dan
persahabatan yang telah kalian tuliskan dalam episode perjalanan
hidup penulis.
8
6. Seluruh komponen persekutuan PMKO Filadelfia Mipa_Farmasi Unhas
yang boleh menjadi rekan-rekan sepelayanan dan juga terus
memberikan doa dan motivasi dalam studi dan pelayanan. Terkhusus
untuk teman-teman PA Firdaus dan Petra Kak Soni, Agus Wahyudi,
Johan, Daud terima kasih untuk kebersamaan dan proses berbagi suka
maupun duka.
7. Terima kasih juga buat saudara-saudaraku Semani Crew Pua’ Aris,
Pua’ Dian, Pua’ Daen, Pua’ Abner, Tanta Handa yang menjadi tempat
untuk saling berbagi.
8. Kepada seluruh pihak yang tidak sempat disebutkan yang telah turut
dalam penyelesaian penelitian ini.
Penulis sangat menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini
masih banyak kekurangan dan jauh dari bentuk kesempurnaan sehingga
saran dan kritik yang membangun sangat diharapkan oleh penulis
kedepannya. Akhir kata penulis berharap karya kecil yang penulis
persembahkan ini dapat memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan
dimasa yang akan datang. Amin.
Makassar, 31 Juli 2013
Penulis
9
ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian tentang fraksinasi senyawa aktif yang
berefek mukolitik dari ekstrak heksan daun pare (Momordica charantia L.).
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan fraksinasi senyawa aktif
yang berefek mukolitik dari ekstrak heksan daun pare (Momordica
charantia L.). Daun pare (Momordica charantia L.) diekstraksi dengan
menggunakan pelarut heksan. Ekstrak yang diperoleh kemudian
difraksinasi dengan eluen campuran heksan-etil asetat dengan kepolaran
yang semakin meningkat sehingga diperoleh 4 fraksi yaitu fraksi I, II, III
dan IV. Kemudian diuji aktivitas mukolitiknya pada konsentrasi 0,25% dan
1% b/b. Uji aktivitas mukolitiknya dilakukan secara in vitro yang
berdasarkan waktu alir larutan uji menggunakan viskometer Ostwald.
Diperoleh data bahwa fraksi I paling aktif dari fraksi yang lain. Selanjutnya
fraksi I difraksinasi dengan campuran eluen heksan-etil asetat dengan
kepolaran yang semakin meningkat. Diperoleh 4 subfraksi yaitu subfraksi
F-Ia, F-Ib, F-Ic dan F-Id. Kemudian subfraksi tersebut diuji aktivitas
mukolitiknya dan diperoleh data bahwa subfraksi F-Ia adalah subfraksi
yang paling aktif dari subfraksi yang lain. Subfraksi F-Ia selanjutnya
dikarakterisasi dengan menggunakan alat KCKT. Diperoleh data bahwa
ada satu peak pada panjang gelombang 254 nm dengan luas area
terbesar dengan wakru retensi 13,476 menit dan pada panjang gelombang
366 nm ada satu peak dengan luas area terbesar dengan waktu retensi
3,219 menit yang dapat diusulkan sebagai senyawa utama yang berefek
mukolitik.
Kata kunci: Daun pare, heksan, mukolitik, fraksi, KCKT.
10
ABSTRACT
Study of fractionation of mucolitic active compound from leaves
extract bitter melon (Momordica charantia L.) has been done. The purpose
of this study was to fractionation the active compound which effective as
mucolitic from pare leaves extract (Momordica charantia L.). Pare leaves
(Momordica charantia L.) extracted with hexane. Crude extract were
fractionated with the mixture of hexane-ethyl acetate on increased polarity
and derived 4 fractions (I, II, III, and IV). The fractions then tested for the
mucolitic activity on the concentration 0,25% and 1%w/w. The mucolitic
test were done in vitro based on the viscocity of the test solution on
Ostwald viscometer. The data collected showed that fraction I is the most
active fraction and then fractionated with the mixture of hexane-ethyl
acetate on increased polarity. The result were 4 subfraction (F-Ia, F-Ib, F-
Ic and F-Id. Those subfraction were tested for the mucolitic activity and the
data showed that the F-Ia subfraction was the most active of all.
Subfraction F-Ia then were characterized with the HPLC and showed that
there is one peak on 254 nm with the widest area at retention time of
13.476 minutes and another peak on 366 nm at retention time of 3.219
minutes which could be assumed as the active compound effective as
mucolitic.
Keyword: Pare leaves, hexane, mucolitic, fraction, HPLC.
11
DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PERSETUJUAN………………………………………………. iii
LEMBAR PENGESAHAN………………………………………………… iv
SURAT PERNYATAAN…………………………………………………... v
UCAPAN TERIMA KASIH .................................................................. vi
ABSTRAK .......................................................................................... ix
ABSTRACT ........................................................................................ x
DAFTAR ISI ....................................................................................... xi
DAFTAR GAMBAR ............................................................................ xiv
DAFTAR TABEL ................................................................................ xv
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................... xvi
DAFTAR SINGKATAN …………………………………………………… xvii
BAB I PENDAHULUAN ...................................................................... 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................. 3
II.1 Uraian Tanaman Pare ...................................................... 3
II.1.1 Klasifikasi Tanaman ....................................................... 3
II.1.2 Nama Lokal .................................................................... 3
II.1.3 Morfologi Tumbuhan ...................................................... 4
II.1.4 Tempat Tumbuh ............................................................. 5
II.1.5 Kandungan Kimia .......................................................... 6
II.1.6 Kegunaan ....................................................................... 6
II.2 Metode Ekstraksi Bahan Alam ......................................... 7
12
II.2.1 Tujuan Ekstraksi ............................................................. 7
II.2.2 Jenis-Jenis Ekstraksi ...................................................... 7
II.3 Metode Pemisahan ........................................................... 8
II.3.1 Kromatografi Lapis Tipis ................................................. 8
II.3.2 Kromatografi Cair Vakum ............................................... 9
II.4 Mukolitik ............................................................................ 10
II.5 Uji Efek Mukolitik ............................................................... 12
II.5.1 Prinsip Metode ............................................................... 12
II.5.2 Evaluasi Pengujian......................................................... 13
II.6 Viskositas.......................................................................... 14
II.7 Metode Analisis ................................................................. 17
II.7.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .................................... 17
II.7.2 Penggunaan, Keuntungan dan Keterbatasan KCKT…… 18
II.7.3 Sistem Peralatan KCKT……………………………………. 20
II.7.4 Interpretasi Data…………………………………………….. 24
II.7.5 Profil Puncak dan Pelebaran Puncak…………………….. 26
BAB III METODE PENELITIAN .......................................................... 27
III.1 Alat dan Bahan ................................................................. 27
III.2 Penyiapan Bahan Penelitian ............................................ 27
III.3 Ekstraksi dan Fraksinasi Sampel ..................................... 28
III.3.1 Ekstraksi Sampel........................................................... 28
III.3.2 Fraksinasi Sampel ......................................................... 28
III.4 Uji Mukolitik ...................................................................... 29
III.4.1 Pengumpulan Mukus Usus Sapi ................................... 29
III.4.2 Pembuatan Larutan Dapar Fosfat.……………………. 29
13
III.4.3 Pembuatan Larutan 20%b/b ......................................... 29
III.4.4 Pembuatan Kontrol Negatif ........................................... 29
III.4.5 Pembuatan Kontrol Positif............................................. 30
III.4.6 Pembuatan Larutan Uji................................................. 30
III.4.7 Uji Aktivitas Mukolitik....................................................... 30
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................ 32
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................ 39
V.1 Kesimpulan ..................................................................... 39
V.2 Saran ............................................................................... 39
DAFTAR PUSTAKA.......................................................................... 40
LAMPIRAN ..................................................................................... 43
14
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Asetilsistein…………………………………………. ………………… 11
2. Viskometer Ostwald ……………………………….………………….. 16
3. Profil KLT ekstrak heksan daun pare (Momordica charantia L.) ..... 32
4. Profil KLT subfraksi I ekstrak heksan daun pare (Momordica charantia L.)………………………………………………………........ 35
15
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Tabel data hasil pengujian aktivitas mukolitik hasil fraksinasi ekstrak heksan Daun Pare (Momordica charantia L.) ................... 33
2. Tabel data hasil pengujian aktivitas mukolitik ekstrak heksan Daun Pare (Momordica charantia L.) ........................................... 35
3. Tabel data hasil profil subfraksi Ia ekstrak heksan Daun Pare (Momordica charantia L.)……………………………………………. 37
16
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Skema Kerja………………………….......................................... 42
2. Skema Kerja Uji Aktivitas Mukolitik……………………………… 43
3. Perhitungan Aktivitas Mukolitik..……………………………...… 44
4. Foto Pengujian..………………………………………………...… 62
5. Analisis Data….…………………………………………….…….. 63
6. Profil KLT Ekstrak Heksan Daun Pare (Momordica charantia L.)..…….………………………………………………… 70
7. Profil KLT Fraksi I Ekstrak Heksan Daun Pare (Momordica charantia L.)……..……………………..………….… 71
8. Profil KCKT Subfraksi Ia………..…………..…………………… 72
17
DAFTAR SINGKATAN
BJ : bobot jenis
BNJ : beda nyata jelas
Cps : centipoises
FT-IR : fourier transform infrared
HPLC : high performance liquid chromatography
KCKT : kromatografi cair kinerja tinggi
LC : liquid chromatography
MS : mass spectrometer
pH : power of hydrogen
SH : sulfuhidril
TFA : trifluoro acetic acid
UV : ultraviolet
18
BAB I
PENDAHULUAN
Batuk adalah suatu refleks fisiologi pada keadaan sehat maupun
sakit dan dapat ditimbulkan oleh berbagai sebab. Refleks batuk lazimnya
diakibatkan oleh rangsangan dari selaput lendir saluran pernapasan yang
terletak dibeberapa bagian dari tenggorkan (1). Refleks batuk ini terjadi
akibat terangsangnya reseptor batuk yang terdapat disaluran nafas
ataupun diluar saluran nafas oleh rangsangan yang bersifat kimiawi
maupun mekanis. Rangsangan yang dapat mencetuskan batuk antara lain
udara dingin, benda asing seperti debu, radang atau edema mukosa
saluran nafas, tekanan terhadap saluran nafas misalnya oleh tumor, lendir
pada saluran nafas, kontraksi pada saluran nafas (2).
Ada dua jenis batuk yaitu batuk produktif dan batuk non-produktif.
Batuk produktif merupakan suatu mekanisme perlindungan dengan fungsi
mengeluarkan zat-zat asing seperti kuman, debu dan dahak dari batang
tenggorokan. Untuk meringankan dan mengurangi frekuensi batuk maka
diberikan terapi simptomatis dengan obat-obat pereda batuk. Salah satu
zat yang dapat digunakan adalah mukolitika. Mukolitika memiliki gugus
sulfuhidril (-SH) bebas dan berdaya mengurangi kekentalan dahak. Zat
mukolitika lainnya adalah bromheksin dan ambroksol yang bekerja dengan
jalan memutuskan serat-serat mukopolisakarida (3).
Daun pare merupakan salah satu diantara sekian banyak tumbuhan
obat yang digunakan sebagai obat batuk. Salah satu mekanisme
19
pengobatan batuk dengan menggunakan mukolitika. Khasiat daun pare
antara lain untuk mengatasi disentri, bisul, kencing manis, kencing nanah,
batuk, kanker, radang tenggorokan, menambah nafsu makan, pelancar
ASI, radang kulit bernanah (4).
Momordica charantia L. banyak mengandung senyawa metabolit
sekunder diantaranya adalah senyawa metabolit sekunder turunan
triterpenoid, senyawa metabolit sekunder turunan flavonoid, dan senyawa
metabolit sekunder turunan steroid. Senyawa-senyawa metabolit sekunder
tersebut berupa glikosida ataupun aglikon. Selain senyawa metabolit
sekunder Momordica charantia L. pun mengandung senyawa fenolik
seperti polifenol, senyawa asam lemak yaitu asam butirat, asam palmitat,
asam linoleat, dan asam stearat serta mengandung protein (5).
Daun pare (Momordica charantia L.) memiliki manfaat untuk
mengobati batuk khususnya batuk berdahak maka dilakukanlah kegiatan
penelitian ini. Adapun tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan
fraksinasi senyawa aktif yang berefek mukolitik dari ekstrak heksan daun
pare (Momordica charantia L.). Hasil penelitian ini diharapkan dapat
memberikan informasi ilmiah mengenai senyawa mukolitik yang terdapat
dalam daun pare (Momordica charantia L.).
20
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Uraian Tanaman Pare
II.1.1 Klasifikasi
Dunia : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Anak divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae
Anak kelas : Dialypetalae
Bangsa : Cucurbitales
Keluarga : Cucurbitaceae
Marga : Momordica
Jenis : Momordica charantia L. (6,7).
II.1.2 Nama Lokal Tanaman Pare
Sumatera (prieu, peria, foria, pepare, kambeh, poria), Jawa (paria,
pare pahit, pare, pepareh), Nusa Tenggara (paya, paria, truwuk, paita,
paliale, pania, pepule), Sulawesi (paya, pudu, bentu, paria, belenggede,
palia), Maluku (apariane, papari, kakriane, taparipong, papariano, popare,
peppare) (5).
21
II.1.3 Morfologi (6,8,9).
Batang : batang berusuk lima, panjang 2-5 m, yang muda
berambut rapat. Bertangkai yang panjangnya 1,5-5,3 cm,
letak berseling, bentuknya bulat panjang dengan panjang
3,5-8,5 cm, lebar 4 cm, berbagi menjari 5-7, pangkal
berbentuk jantung, warnanya hijau tua, yang muda
berambut cukup rapat.
Daun : daun tunggal dengan panjang 3,5-8,5 cm, lebar 4 cm,
berbagi menjari 5-7, pangkal berbentuk jantung, garis
tengah 4-17 cm berbintik-bintik tembus cahaya, taju
bergigi kasar hingga berlekuk menyirip, warnanya hijau
tua. Daun pare yang tumbuh liar disebut daun tudung
yang lebih berkhasiat sebagai obat.
Bunga : tangkai bunga 5-15 cm dekat pangkalnya dengan daun
pelindung berbentuk jantung hingga ginjal, kelopak bentuk
lonceng dengan banyak rusuk atau tulang membujur yang
berakhir pada 2-3 sisik yang melengkung ke bawah.
Mahkota berbentuk roda, taju berbentuk memanjang
hingga bulat telur terbalik, bertulang 1,5-2 X 1,3 cm,
bunga jantan benang sari 3, kepala sari orange, semula
bergandengan satu dengan lainnya kemudian lepas, bakal
buah berparuh panjang, berduri tempel, halus dan
22
berambut panjang, putik 3, berlekuk 2 dalam atau 1
diantaranya utuh.
Buah : buah bulat memanjang berbentuk seperti silindris,
permukaan buahnya berbintil-bintil tidak beraturan dengan
panjang 8-30 cm, warna buah hijau dan jika sudah masak
jika dipecah akan berwarna orange dengan 3 katup.
Biji : biji banyak, berwarna coklat kekuningan pucat.
II.1.4 Tempat Tumbuh
Tanaman pare (Momordica charantia L.) adalah sejenis tanaman
menjalar dengan buahnya panjang bergerigi dan runcing ujungnya. Pare
banyak terdapat di daerah tropika, tumbuh baik di dataran rendah dan
dapat ditemukan tumbuh liar di tanah terlantar, tegalan, serta
dibudidayakan atau ditanam di pekarangan dengan dirambatkan di pagar,
untuk diambil buahnya. Tanaman ini tidak memerlukan banyak sinar
matahari, sehingga dapat tumbuh subur di tempat-tempat yang agak
terlindung. Tanaman setahun, merambat atau memanjat dengan alat
pembelit atau sulur dengan karakteristik umum berbentuk spiral,
banyak bercabang, dan berbau tidak enak. Tanaman pare mempunyai
biji banyak, coklat kekuningan, bentuknya pipih memanjang, keras
(9,10,11).
Ada 3 jenis tanaman pare, yaitu pare gajih, pare kodok dan pare
hutan. Pare gajih berdaging tebal, warnanya hijau muda atau keputihan,
23
bentuknya besar dan panjang dan rasanya tidak begitu pahit. Pare
kodok buahnya bulat pendek, rasanya pahit. Pare hutan adalah pare
yang tumbuh liar, buahnya kecil-kecil dan rasanya pahit. Buah pare yang
digunakan pada penelitian ini adalah jenis pare gajih. Untuk memperoleh
buah yang panjang dan lurus, biasanya pada ujung buah yang masih
kecil digantungkan batu. Daun dari pare yang tumbuh liar, dinamakan
daun tundung. Daun ini dikatakan lebih berkhasiat bila digunakan
untuk pengobatan. Daun dan buahnya yang masih muda dapat dimakan
sebagai lalapan mentah atausetelah dikukus terlebih dahulu, lalu dimasak
sebagai sayuran, tumis, sambal goreng, serta gado-gado. Tanaman ini juga
dapat digunakan untuk membunuh serangga. Perbanyakan atau
pembudidayaan tanaman pare dilakukan dengan biji (9,11).
II.1.5 Kandungan Kimia
Daun pare mengandung momordisina, momordina, flavonoid,
polifenol, saponin, terpen, vitamin A, dan C serta minyak lemak yang
terdiri dari asam oleat, asam linoleat, asam stearat dan L. oleostearat
(9,12,13,14).
II.1.6 Kegunaan
Daun pare digunakan pada disentri, kencing manis,
membangkitkan nafsu makan, nifas, pelancar ASI, sakit liver, bisul (obat
luar) digunakan 1 buah segar lalu dilumatkan dan diborehkan, radang kulit
bernanah (obat luar). Sedangkan akar pare digunakan pada disentri
amoeba (9,13,15).
24
II.2 Metode Ekstraksi Bahan Alam (16)
II.2.1 Tujuan Ekstraksi
Tujuan ekstraksi adalah untuk menarik komponen-komponen kimia
yang terdapat dalam bahan alam baik dari tumbuhan, hewan dengan
menggunakan pelarut organik tertentu. Proses ekstraksi ini berdasarkan
pada kemampuan pelarut organik untuk menembus dinding sel dan masuk
dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dalam
pelarut organik dan karena adanya perbedaan antara konsentrasi di dalam
dan konsentrasi di luar sel, mengakibatkan terjadinya difusi pelarut organik
yang mengandung zat aktif ke luar sel. Proses ini berlangsung secara
terus-menerus sampai terjadi keseimbangan konsentrasi zat aktif di dalam
dan di luar sel.
II.2.2 Jenis-Jenis Ekstraksi
Proses ekstraksi dapat dilakuakn secara panas dan dingin.
Ekstraksi secara panasi yaitu dengan metode refluks dan destilasi uap air
sedangkan ekstraksi dingin yaitu dengan maserasi, perkolasi dan
sokhletasi.
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi
dilakukan dengan cara merendam 10 bagian serbuk simplisia dengan 75
bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari
cahaya sambil berulag-ulang diaduk. Pengadukan diperlukan untuk
meratakan konsentrasi larutan di luar butir serbuk simplissia sehingga
dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya derajat perbedaan
25
konsentrasi yang sekecil-keilnya antara larutan di dalam dan di luar sel.
Cairan penyari akan meneembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga
sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut karena adanya
perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan di luar
sel maka larutan yang terpekat didesak keluar sel sehingga terjadi
keseimbangan konsentrasi antara larutan di dalam sel dan diluar sel.
II.3 Metode Pemisahan
II.3.1 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi merupakan teknik pemisahan dengan menggunakan
fase diam dan fase gerak. Kromatografi dapat digunakan untuk tujuan
analisis kualitatif dan analisis kuantitatif serta dapat digunakan untuk
tujuan preparatif. Kromatografi lapis tipis merupakan bentuk kromatografi
planar selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Fase diamnya berupa
lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukung oleh
lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat plastik. Prinsipnya sangat
sederhana yakni campuran solut yang akan dipisahkan ditotolkan pada
permukaan lempeng tipis lalu dikembangkan didalam chamber
menggunakan fase gerak yang sesuai. Kekuatan interaksi yang berbeda
antara molekul solut dengan fase diam atau fase gerak akan
menghasilkan mobilitas dan pemisahan yang berbeda (16).
II.3.2 Kromatografi Cair Vakum
Kromatografi cair vakum dapat diartikan sebagai suatu proses yang
dilakukan pada suatu kolom pendek dengan pengisapan untuk
26
mempercepat aliran pelarut. Fase diam (sorben) dipadatkan di dalam
kolom pendek atau corong Buchner. Sorben dipadatkan dengan mengetuk
pinggir kolom pada saat pengisian kemudian menekan lapisan atas
sorben dengan benda yang memiliki permukaan yang rata sambil terus
diisap dengan pompa vakum. Pemadatan diselesaikan dengan melepas
alat vakum lalu menuangkan pelarut dengan kepolaran rendah melalui
permukaan sorben lalu diisap dengan pompa vakum. Pemadatan kolom
tepat bila aliran pelarut membentuk garis mendatar, jika tidak sorben
harus dikeringkan, dipadatkan ulang, lalu diuji kembali. Ketika semua
pelarut telah melewati kolom, sisa pelarut yang terperangkap di antara
partikel sorben harus dikeluarkan melalui pengisapan.
Sampel yang telah dilarutkan di dalam pelarut yang cocok atau yang
telah dicampur dengan sejumlah kecil sorben atau bahan inert diletakkan
di atas padatan sorben. Jika menggunakan larutan sampel, pelarut harus
diisap ke dalam padatan kolom. Sepotong kertas saring dengan diameter
yang sama dengan diameter kolom ditempatkan di atas sorben untuk
menghindari kekacauan sorben pada saat penambahan pelarut.
Kemudian kolom dielusi dengan campuran pelarut dengan meningkatkan
kepolaran pelarut secara berangsur-angsur. Sebelum pelarut selanjutnya
dimasukkan, sorben harus diisap sampai kering dan eluen berisi fraksi
sampel dikumpulkan dalam tabung reaksi atau labu erlenmeyer (17).
Kromatografi vakum memiliki keuntungan tersendiri yaitu sederhana,
cepat, dan tepat. Jumlah maksimal sampel yang digunakan hampir sama
27
dengan kromatografi kilat. Akan tetapi, tidak jarang digunakan sampel
melebihi muatan untuk memisahkan campuran sederhana atau untuk
menyederhanakan campuran senyawa untuk pemisahan yang lebih lanjut.
Pada kondisi ini, muatan sampel dapat mencapai 10% (b/b) atau lebih dari
massa sorbent. Jika dibandingkan dengan kromatografi kilat, pergantian
pelarut labih mudah karena bagian atas kolom memiliki tekanan atmosfer
(17).
II.4. Mukolitik
Mukolitika adalah obat-obat yang dapat membantu menurunkan
viskositas sputum, khususnya dari saluran nafas bagian bawah. Sehingga
mengubah sifat fisika kimia dari mukus yang menyebabkan viskositas
mukus menurun dan akan lebih mudah untuk dibatukkan. Obat ini dapat
meringankan pernafasan, sesak nafas dan terutama pada serangan asma
hebat yang dapat mematikan jika sumbatan lendir sedemikian kentalnya,
sehingga tidak dapat dikeluarkan (3).
Mukolitika memiliki gugus sulfuhidril (-SH) bebas dan berdaya
mengurangi kekentalan dahak (mukus=lendir, lisis=larut) dan
mengeluarkannya. Senyawa sistein membuka jembatan disulfida diantara
makromolekul yang terdapat dalam dahak. Bromheksin dan ambroksol
bekerja dengan jalan memutuskan serat-serat mukopolisakarida (3).
Asetilsistein dan bromheksin adalah obat yang bekerja sebagai
mukolitik. Asetilsistein menurunkan vikositas lendir bronkhus dengan
memutuskan jembatan disulfida protein dari molekul lendir. Metabolit
28
utama bromheksin yaitu ambroksol diduga mempunyai kerja mukolitik
dengan kemungkinan kerjanya menstimulasi pembentukan zat aktif
permukaan (surfaktan), sehingga adhesi lendir pada epitel bronkhus akan
berkurang (18).
Gambar 1. Asetilsistein (Fluimucil®, Mucolytikum Lappe®)
Mukolitika memiliki gugus sulfuhidril (-SH) bebas dan berdaya
mengurangi kekentalan dahak dan mengeluarkannya. Senyawa sistein
dan mesna membuka jembatan disulfide diantara makromolekul yang
terdapat dalam dahak. Bromheksin dan ambroksol bekerja dengan jalan
memutuskan serat-serat mukopolisakarida. Mukolitika digunakan dengan
efektif pada batuk dengan dahak yang kental sekali seperti pada
bronchitis, emfisema, dan mucoviscidosis. Zat-zat ini mempermudah
pengeluaran dahak yang telah menjadi lebih encer melalui proses batuk
atau dengan bantuan gerakan silia dari epitel. Tetapi pada umumnya zat-
zat ini tidak berguna bila gerakan silia terganggu misalnya pada perokok
atau akibat infeksi (3).
29
II.5 Uji Efek Mukolitik
II.5.1 Prinsip Metode (19)
Larutan mukus dipaparkan pada pH=7, di tambahkan sediaan obat
dengan konsentrasi tertentu, lalu diinkubasi pada 370C selama 1 jam.
Viskositas dan bobot jenis larutan diukur dengan alat viskometer dan
piknometer. Bahan-bahan yang digunakan adalah sediaan obat yang di
uji, mukus lambung atau usus sapi, zat pembanding asetilsistein.
Salah satu viskometer yang digunakan untuk uji viskositas
berdasarkan sifat alirnya adalah viskometer kapiler dimana viskositas
cairan Newton dapat ditentukan dengan mengukur waktu yang dibutuhkan
bagi cairan tersebut untuk lewat antara dua tanda ketika mengalir karena
gravitasi melalui suatu tabung kapiler vertikal, contohnya viskometer
Oswald.
Waktu yang dibutuhkan oleh zat cair yang diselidiki untuk mengalir
diantara dua tanda tersebut dibandingkan dengan waktu yang dibutuhkan
oleh zat cair yang telah diketahui viskositasnya (biasanya air).
II.5.2 Evaluasi Pengujian
Viskositas dari cairan Newton bisa ditentukan dengan mengukur
waktu yang dibutuhkan bagi cairan tersebut untuk lewat antara dua tanda
ketika ia mengalir karena gravitasi melalui suatu tabung kapiler vertikal
yang dikenal sebagai viskometer Ostwald. Waktu alir dari cairan yang diuji
dibandingkan dengan waktu yang dibutuhkan bagi suatu cairan yang
30
viskositasnya sudah diketahui (biasanya air) untuk lewat antara dua tanda
tersebut. Jika ɳ1 dan ɳ2 masing-masing adalah viskositas dari cairan yang
tidak diketahui dan cairan standar,ρ1 dan ρ2 merupakan kerapatan dari
masing-masing cairan serta t1 dan t2 adalah waktu alir dalam detik.
Viskositas absolut dari cairan yang tidak diketahui, ɳ1 ditentukan dengan
mensubstitusi harga percobaan dalam persamaan:
Perhitungan viskositas untuk semua larutan dilakukan dengan
memakai rumus :
Keterangan :
t = waktu yang dibutuhksn oleh cuplikan untuk mengalir dalam detik
BJ = bobot jenis (gram/ml)
Potensi larutan uji dihitung maknanya secara statistik (20,21).
II.6 Viskositas (4)
Viskositas adalah suatu ungkapan yang menyatakan tahanan yang
mencegah zat cair untuk mengalir. Makin tinggi viskositasnya, maka makin
besar tahanannya, maka jika suatu zat/bahan diklasifikasikan menurut tipe
alir dan diformasinya, maka pada umunya zat dapat dibagi menjadi dua
kategori, yaitu: sistem newton dan sistem non newton. Pemilihannya
31
tergantung dari apakah sifat alirnya sesuai dengan hukum alir newton atau
tidak.
a. Zat dengan Sistem Newton
Viskoksitas adalah suatu pernyataan yang menyatakan tahanan
yang mencegah zat cair untuk mengalir. Makin tinggi viskositas, akan
makin besar tahanannya. Makin tinggi viskositas suatu zat cair, makin
besar gaya per satuan luas (tekanan geser) yang dibutuhkan untuk
menghasilkan kecepatan geser tertentu.
Kurva yang menggambarkan sifat alir dinamakan reogram. Reogram
diperoleh dengan menyatakan F terhadap G yang untuk sistem Newton
memiliki koefisien viskositas konstan yang tidak bergantung dari jumlah
absolute tegangan geser yang terdapat atau dari turunnya geseran yang
berkuasa. Untuk menentukan viskositas cairan Newton dapat digunakan
semua alat pengukur viskositas, misalnya viskometer Ostwald, Hoppler,
Brookfield, dan Stormer. Satuan viskositas adalah poise, yaitu gaya gesek
yang diperlukan untuk menghasilkan kecepatan 1 cm/dt antara 2 bidang
paralel dari zat cair yang luasnya 1 cm2 dan dipisahkan oleh jarak 1 cm.
Pada zat yang beraliran Newton besarnya viskositas suatu cairan
berbanding lurus dengan gaya per satuan luas (shearing stress) yang
diperlukan untuk menghasilkan suatu rate of share tertentu.
Viskositas sistem Newton menggambarkan suatu konstanta materi
yang semata-mata tergantung dari suhu dan dalam praktek ukuran yang
dapat diabaikan dari tekanan organik, karbondioksida (misalnya paraffin
32
cairan kental dan paraffin cairan encer), gliserol, malam cairan kental dan
malam cairan encer seperti juga minyak lemak. Tetapi juga sistem yang
pada suhu kamar adalah kekentalan struktur, seperti lemak dan vaselin,
memiliki sikap aliran kekentalan ideal dalam keadaan lebur. Lagi pula
sikap rheologis dari sistem banyak bahan juga tergantung dari konsentrasi
bahan.
Gambar 2. Viskometer Ostwald
b. Zat Dengan Sistem Non Newton
Zat bukan Newton adalah zat yang tidak mengikuti persamaan alur
Newton. Termasuk di dalamnya adalah sistem disperse heterogen cair
dan padat seperti larutan koloidal, emulsi, suspensi cair, salep, dan produk
yang serupa. Bilaman a bahan bukan Newton dianalisa di dalam
viskometer dan hasilnya dibuat grafik, akan dihasilkan berbagai kurva
konsistensi yang mewakili tiga kelas aliran, yaitu plastik, pseudoplastik,
dan dilatan.
33
Waktu yang dibutuhkan oleh zat cair yang diselidiki untuk mengalir
diantara dua tanda tersebut dibandingkan dengan waktu yang dibutuhkan
oleh zat cair yang telah diketahui viskositasnya (biasanya air).
II.7 Metode Analisis
II.7.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut
dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dikembangkan
pada akhir tahun 1960 dan awal tahun 1970 oleh Csaba Horvat. KCKT
merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang
antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi, poliner, dan industri
makanan. (22,23).
Di dunia internasional KCKT dikenal dengan HPLC atau lebih
singkat LC (Liquid Chromatography). Pernyataan High Performance
dihubungkan dengan kinerjanya yang tinggi dengan kolom yang
panjangnya hanya 5-25 cm memberikan pemisahan yang baik (24).
Berbeda dengan analisis dengan KLT, sistem KCKT untuk analisis
senyawa alami adalah sistem terbalik yakni fase diam nonpolar
sedangkan fase gerak adalah polar. Umumnya untuk analisis senyawa
metabolit sekunder dari tumbuhan digunakan KCKT tipe fase terbalik
yakni menggunakan fase diam nonpolar seperti C18 (oktadesil silica atau
ODS). Biasanya fase gerak yang digunakan adalah kombinasi antara air,
metanol, asetonitril dengan modifikasi keasaman dengan asam formiat,
34
TFA (tri fluoro acetic acid) atau asam fosfat dengan pH tertentu. Di dalam
KCKT ada dua sistem fase gerak yang digunakan yaitu sistem isokratik
(komposisi fase gerak tetap sama selama elusi) dan gradient (komposisi
fase gerak berubah-ubah selama elusi) (25).
Prinsip kerja KCKT sebenarnya tidak berbeda dengan prinsip-
prinsip kromatografi yang lain yaitu pemisahan komponen-komponen
sampel dengan cara melewatkan sampel pada suatu kolom yang
selanjutnya dilakukan pengukuran kadar masing-masing komponen-
komponen tersebut dengan suatu detektor. Kerja detektor bermacam-
macam tetapi pada dasarnya membandingkan respon dari komponen
sampel dengan respon dari larutan standar (26).
II.7.2 Penggunaan, Keuntungan, dan Keterbatasan Metode KCKT
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa
organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian
(impurities), analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-
volatil), penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion,
isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan dan senyawa-senyawa dalam
jumlah sekelumit (trace elements) dalam jumlah banyak dan dalam skala
proses industri. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar
senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam
nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar-
kadar senyawa akibat obat, produk hasil samping proses sintesis, atau
produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi, memonitor sampel-
35
sampel yang berasal dari lingkungan, memurnikan senyawa dalam suatu
campuran, memisahkan campuran, kontrol kualitas, dan mengikuti
jalannya reaksi sintesis (24).
KCKT mempunyai beberapa keunggulan seperti (26):
1. Waktu analisisnya relatif singkat berkisar 5-30 menit.
2. KCKT dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dengan presisi yang
tinggi dengan koefisien variasi dapat kurang dari 1%.
3. KCKT juga merupakan teknik analisis yang peka.
4. Kolom dapat dipakai kembali. Berbeda dengan kromatografi cair
klasik, kolom KCKT dapat dipakai kembali. Banyak analisis dapat
dilakukan pada kolom yang sama sebelum kolom itu harus diganti.
5. Ideal untuk molekul besar dan ion. Secara khusus senyawa model ini
tidak dapat dipisahkan dengan kromatografi gas karena keatsiriannya
rendah.
6. Detektor KCKT dapat divariasi, disesuaikan dengan senyawa yang
akan dianalisis.
7. Ketepatan dan ketelitiannya yang relatif tinggi di jajaran teknik analisis
fisiko-kimia.
8. Bannyak pilihan fase gerak dari derajat pro KCKT
9. Dapat terpadu dengan instrument multiplek yang melahirkan konsep
instrument terpadu (hyphenated instrument) seperti LC-MS atau
LC/FT-IR/MS
36
Keterbatasan metode KCKT adalah tidak dapat mengudentifikasi
senyawa kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa
(MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks maka
resolusi yang baik sulit diperoleh (27).
II.7.3 Sistem Peralatan KCKT (25)
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas : wadah fase gerak,
pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau
integrator perekam.
1. Wadah Fase Gerak dan Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut
kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase
gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1-2 liter
pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam dan sifat-sifat komponen sampel. Untuk fase
normal (fase diam polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut, sementara untuk fase
terblik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum
digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-
37
partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus
dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen-
komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan
fase terbalik adalah campuran buffer dengan metanol atau campuran air
dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang
paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon
dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis
alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding
dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut, yakni : pompa
harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa
adalah gelas, baja tahan karat, teflon, atau batu nilam. Pompa yang
digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3ml/menit. Untuk
tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan 20ml/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis
38
pompa dalam KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan, dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe
pompa dengan tekanan konstan.
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke
dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom
menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan
katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal
atau eksternal.
4. Kolom
Ada dua jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan
kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase
diam untuk berlangsungnya proses pemisahan zat terlarut/senyawa.
Kolom mikrobor mempunyai tiga keuntungan yang utama dibanding
dengan kolom konvensional, yaitu :
a. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lambat (10-100µl/menit).
b. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung spektrometer massa.
39
c. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena zat terlarut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel
terbatas misalnya sampel klinis.
5. Detektor
Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan
di dalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. Dua jenis detektor yang
dikenal di dalam KCKT adalah :
a. Detektor universal
Yaitu detektor yang bisa langsung digabungkan kedalam instrument
KCKT tanpa memerlukan tambahan sistem khusus. Contoh :
detektor UV-Vis, detektor indeks refraksi, detektor fluorescence dan
detektor hantaran.
b. Detektor khusus
Yaitu detektor yang memerlukan sistem khusus agar bisa
digunakan sebagai detektor dalam KCKT, contoh : FT-IR (Fourier
Transform Infrared Spectroscopy), MS (Mass Spectrometer).
II.7.4 Interpretasi Data (27)
Adapun analisis KCKT dapat digunakan untuk :
1. Analisis kualitatif
Analisis kualitatif dengan KCKT harus ada senyawa standar sebagai
pembanding. Senyawa yang belum diketahui dalam cuplikan yang
dimungkinkan senyawa A dan kemudian kita menginjeksikan
40
senyawa murni A sebagai referensi, maka kita dapatkan 2
kemungkinan :
a. Data waktu retensi tidak sama, maka senyawa-senyawa tersebut
tidak sama.
b. Data waktu retensi sama, maka keduanya mungkin mirip atau
sama, tetapi dapat merupakan senyawa yang berbeda karena
senyawa yang berbeda kadang-kadang mempunyai waktu retensi
yang sama.
Pada instrumen KCKT yang dirancang dengan baik, waktu retensi
sangat terulang. Simpangan baku waktu retensi sekitar 0,2-2% tergantung
pada instrumen kolom dan pelarut. Makin besar derajat keterulangan
waktu retensi, maka makin besar kepastian kita dalam membeda-bedakan
berbagai senyawa yang diidentifikasi. Dengan membandingkan waktu
retensi senyawa pembanding dengan waktu retensi senyawa yang
diidentifikasi, kita dapat mengidentifikasi puncak secara kualitatif.
2. Analisis Kuantitatif
Dasar analisis ini adalah pencatat memberikan sinyal atau
kromatogram yang sebanding dengan banyaknya komponen atau
senyawa dalam cuplikan. Batasan-batasan dalam analisis
kuantitatif adalah :
a. Kisaran konsentrasi sangat terbatas, yaitu masih dalam kisaran
linearitas detektor (pembanding konsentrasi yang terbesar
dengan terkecil dimana respon detektor masih linear). Jika
41
jumlah cuplikan besar dipaksakan, maka detektor tidak mampu
mendeteksi.
b. Respon detektor. Jenis detektor yang berbeda memberikan
respon yang berbeda terhadap komponen cuplikan. Perbedaan
ini dalam hal waktu retensi dan ketinggian puncak.
Pengukuran puncak dapat dilakukan dengan cara :
a. Pengukuran ketinggian puncak
Cara ini merupakan cara yang paling mudah dan cepat, yaitu
dengan cara mengukur ketinggian dari puncak sampai garis
dasar.
b. Luas puncak
Cara ini menggunakan cara yang paling banyak digunakan. Baik
digunakan secara manual dengan tangan ataupun dengan mesin
secara otomatis yang dikenal dengan integrator.
II.7.5 Profil Puncak dan Pelebaran Puncak (24)
Profil konsentrasi solut yang bermigrasi akan simetris jika rasio
distribusi solut konstan selama di kisaran konsentrasi keseluruhan puncak,
sebagaimana ditunjukkan oleh isoterm sorpsi yang linear yang merupakan
plot konsentrasi solut dalam fase gerak. Meskipun demikian, kurva
isotherm akan berubah menjadi jenis pincak asimetris yakni membentuk
puncak yang berekor (tailing) dan adanya puncak pendahulu (fronting) jika
ada perubahan rasio distribusi solut kea rah yang lebih baik. Baik tailing
maupun fronting tidak dikehendaki karena dapat menyebabkan pemisahan
42
kurang baik dan data retensi kurang reprodusibel. Jika terjadi, maka
pengurangan jumlah solut yang akan dilakukan kromatografi akan
memperbaiki bentuk puncak akan tetapi adanya desorpsi yang lambat
masih dapat menyebabkan tailing.
43
BAB III
METODE PENELITIAN
III.1 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini anatara lain bejana
maserasi, seperangkat alat kromatografi cair vakum, seperangkat alat
kromatografi lapis tipis, timbangan analitik (Sartorius®), timbangan kasar,
gelas piala 1000 ml dan 500 ml (Pyrex®), satu set alat rotary evaporator
(Buchi®), spektrofotometer UV-VIS (Hewlett-Packard®), FT-IR (Bruker®),
seperangkat alat KCKT(UFLC Shimadzu®).
Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel daun pare
(Momordica charantia L), etanol, n-heksan, metanol, kloroform, etil asetat,
H2SO4 10%, lempeng KLT, silica gel 60 PF 254, air suling.
III.2 Penyiapan Bahan Penelitian
Sampel daun pare (Momordica charantia L) diambil dari daerah
perkebunan pare di Kabupaten Gowa. Daun yang diambil adalah daun
yang masih hijau. Sampel daun yang dikumpulkan dibersihkan lalu
dikeringkan dengan oven pada suhu 400c selama tiga hari. Sampel yang
telah kering kemudian ditimbang dan diekstraksi dengan metode
maserasi.
44
III.3 Ekstraksi dan Fraksinasi Sampel
III.3.1 Ekstraksi Sampel
Sebanyak 700 gram sampel daun pare (Momordica charantia L)
yang telah dikeringkan dimasukkan ke dalam bejana maserasi kemudian
ditambahkan pelarut heksan sampai seluruh sampel terendam seluruhnya.
Bejana maserasi ditutup rapat dan disimpan di dalam tempat yang
terlindung dari sinar matahari langsung. Proses maserasi dilakukan
selama tiga hari yang dibantu dengan pengadukan. Kemudian dilakukan
proses remaserasi. Filtrat disaring dan ekstrak cair yang diperoleh
dikumpulkan lalu diuapkan pelarutnya dengan menggunakan alat rotary
evaporator sampai diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental yang diperoleh
lalu dikumpulkan dan ditimbang. Diperoleh ekstrak kental sebanyak 2,5
gram.
III.3.2 Fraksinasi Sampel
Ekstrak heksan kemudian difraksinasi dengan menggunakan
kromatografi cair vakum dengan fase diam silika gel dan fase gerak
heksan, heksan-etil asetat dan metanol dengan perbandingan heksan-etil
asetat (50:1), (40:1), (30:1), (20:1), (10:1), (5:1), (1:1), (1:5), (1:25), etil
asetat, etil asetat-metanol (1:1) dan metanol. Fraksi yang diperoleh
diuapkan lalu profil komponennya diidentifikasi secara KLT dengan
penampak noda UV 254 nm, UV 366 nm dan pereaksi semprot H2SO4
10%. Fraksi yang memiliki kesamaan profil KLT digabung.
45
III.4 Uji Mukolitik
III.4.1 Pengumpulan Mukus Usus Sapi
Usus sapi yang diperoleh dibersihkan dari kotoran dan sisa-sisa
makanan yang masih ada dalam usus dengan cara diurut secara
perlahan-lahan. Usus sapi kemudian dipotong membujur dan lapisan
mukus dikerok. Mukus yang terkumpul digunakan dalam keadaan masih
segar.
III.4.2 Pembuatan Larutan Dapar Fosfat pH 7
Larutan dapar pH 7 dibuat dengan mencampurkan 125 ml kalium
dihidrogenfosfat 0,2 M dengan 72,75 ml natrium hidroksida 0,2 N dan
diencerkan dengan air suling bebas karbon dioksida hingga 500 ml.
Dapar yang telah dibuat kemudian dicek pH menggunakan pH meter.
III.4.3 Pembuatan Larutan 20% b/b mukus-dapar Fosfat pH 7
Larutan mukus 20% b/b dalam dapar fosfat dibuat dengan cara 20
gram mukus ditambah 80 gram larutan dapar fosfat pH 7, kemudian
diaduk selama 40 detik agar campuran dapat homogen.
III.4.4 Pembuatan Larutan Blanko/Kontrol Negatif (Larutan mukus
20% b/b dalam tween 80-dapar fosfat pH 7)
Larutan blanko atau kontrol negatif yang digunakan dibuat dengan
cara 0,5% b/b tween 80 (0,075 gram) dicampur dengan larutan 20% b/b
mukus dalam 80% b/b dapar fosfat pH 7 hingga berat total 15 gram.
Kemudian diaduk selama 40 detik agar campuran dapat homogen.
46
III.4.5 Pembuatan Larutan Asetilsistein 1%
Larutan asetilsistein 1% dibuat dengan cara melarutkan dry syrup
Fluimucyl dengan menambahkan sejumlah air sampai tanda (75 ml).
Selanjutnya dipipet sebanyak 0,75 ml yang mengandung 15 mg
asetilsistein dan ditambahkan tween 80 sebanyak 0,5% kedalam
campuran mukus-dapar fosfat pH 7 sampai bobot 15 gram. Kemudian
dihomogenkan.
III.4.6 Pembuatan Larutan Uji
Pembuatan larutan uji dengan cara berikut. Larutan uji 0,25%
dibuat dengan cara 0,25% fraksi ekstrak heksan daun pare (Momordica
charantia L.) dari bobot total ditambah 0,5% tween 80 dari bobot total
atau sebesar 0,075 gram, kemudian ditambah dengan larutan mukus
20% dalam dapar fosfat pH 7 hingga diperoleh bobot total sebesar 15
gram. Larutan kemudian dihomogenkan dengan cara diaduk selama 40
detik. Larutan uji dengan konsentrasi yang lain dibuat dengan cara yang
sama.
III.4.7 Uji Aktivitas Mukolitik
Fraksi heksan yang digunakan adalah konsentrasi 0,25% dan 1%.
Masing-masing konsentrasi ditambahkan dalam larutan mukus-dapar
fosfat pH 7 20% b/b. Larutan uji diinkubasi 37oC selama 1 jam di dalam
inkubator. Larutan uji yang telah diinkubasi diukur viskositasnya.
Pengukuran viskositas dilakukan menggunakan viskometer ostwald.
Waktu yang tercatat merupakan waktu alir larutan uji. Kemudian larutan
47
dimasukkan ke dalam piknometer untuk diukur bobot jenisnya. Dilakukan
pengukuran yang sama untuk kontrol negatif dan kontrol positif.
Viskositas dihitung dengan rumus:
η mukus =
Keterangan :
Bj = bobot jenis η = viskositas
48
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Daun pare (Momordica charantia L.) sebanyak 700 gram
diekstraksi secara remaserasi menggunakan pelarut n-heksan sebanyak 8
L. Dari proses ekstraksi tersebut diperoleh ekstrak kering sebanyak 11,2
gram (%rendemen 1,6%). Selanjutnya ekstrak yang diperoleh difraksinasi
dengan eluen campuran heksan, heksan-etil asetat dan metanol dengan
perbandingan heksan-etil asetat (50:1), (40:1), (30:1), (20:1), (10:1), (5:1),
(1:1), (1:5), (1:25), etil asetat, etil asetat-metanol (1:1) dan metanol. Hasil
fraksinasi kemudian digabung berdasarkan kemiripan profil KLT dan
diperoleh empat fraksi gabungan yaitu fraksi I, II, III, dan IV.
FI FII FIII FIV
Gambar 3. Profil Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Heksan Daun Pare (Momordica charantia L.). Keterangan: FI, FII, FIII, dan FIV adalah fraksi gabungan. (Fase diam silika gel, fase gerak heksan-etilasetat 5:1, visualisasi dengan H2SO4).
49
Selanjutnya fraksi-fraksi tersebut diuji aktivitas mukolitiknya pada
konsentrasi 0,25% b/b dan 1% b/b. Uji aktivitas mukolitik dilakukan secara
in vitro didasarkan pada pengukuran waktu alir larutan uji menggunakan
viskometer kapiler Ostwald. Waktu yang dibutuhkan oleh setiap mukus
untuk mengalir diantara dua tanda pada viskometer tersebut dicatat
sebagai waktu alir mukus. Data waktu alir mukus yang diperoleh
digunakan untuk menghitung viskositas dari masing-masing mukus
(mukus dengan berbagai konsentrasi fraksi heksan dalam mukus-dapar
fosfat pH 7 20%). Viskositas yang diperoleh dibandingkan dengan kontrol
negatif sehingga dapat diketahui penurunan viskositas sebagai aktivitas
pengenceran mukus secara in vitro.
Tabel 1. Data Hasil Pengujian Aktivitas Mukolitik Hasil Fraksinasi Ekstrak Heksan Daun Pare (Momordica charantia L.)
No Larutan Uji Viskositas (cps)
1. Kontrol Positif 0,800
2. Kontrol Negatif 1,459
3. Fraksi I 0,25% 0,872
4. Fraksi I 1% 0,877
5. Fraksi II 0,25% 1,180
6. Fraksi II 1% 1,415
7. Fraksi III 0,25% 1,255
8. Fraksi III 1% 1,248
9. Fraksi IV 0,25% 1,214
10. Fraksi IV 1% 1,149
Berdasarkan hasil pengujian tersebut menunjukkan bahwa fraksi
yang paling aktif adalah fraksi I. Hasil ini sesuai dengan penelitian yang
telah dilakukan sebelumnya yang menunjukkan bahwa fraksi yang aktif
adalah fraksi I. Fraksi I dengan konsentrasi 0,25% b/b dapat menurunkan
50
viskositas mukus-dapar fosfat pH 7 menjadi 0,872 cps dan pada
konsentrasi 1% sebesar 0,877 cps jika dibandingkan dengan viskositas
kontrol negatif yaitu sebesar 1,459 cps.
Analisis statistik dengan uji non parametrik Wilkoxon menunjukkan
signifikansi <0,01. Hal ini berarti perlakuan yang diberikan terhadap
sampel mukus dengan penambahan fraksi I ekstrak heksan pada
konsentrasi 0,25% dan 1% tidak berbeda dengan kontrol positif
sedangkan dengan penambahan fraksi II, III, dan IV hasilnya tidak
berbeda dengan kontrol negatif.
Kontrol positif yang digunakan adalah asetilsistein yang memiliki
mekanisme kerja sebagai mukolitik yaitu memecah struktur mukoprotein
yang terikat satu sama lain oleh rantai disulfide. Ikatannya berupa ikatan
kovalen –S-S- apabila ikatan ini diputuskan oleh aktivitas gugus sulfuhidril
bebas maka mukoprotein akan terurai, mukus akan mengalami lisis
sehingga menurunkan viskositas mukus.
Fraksi I tersebut selanjutnya difraksinasi dengan eluen campuran
heksan, heksan-etil asetat dan metanol dengan perbandingan heksan-etil
asetat (50:1), (40:1), (30:1), (20:1), (10:1), (5:1), (1:1), (1:5) dan etil asetat.
Hasil fraksinasi kemudian digabung berdasarkan kemiripan profil KLT dan
diperoleh empat subfraksi gabungan yaitu subfraksi F-Ia, F-Ib, F-Ic, dan F-
Id. Subfraksi gabungan yang telah diperoleh selanjutnya diuji aktivitas
mukolitiknya.
51
FIa FIb FIc FId
Gambar 4. Profil Kromatografi Lapis Tipis subfraksi I Ekstrak Heksan Daun Pare (Momordica charantia L.). Keterangan: FIa, FIb, FIc dan FId adalah
subfraksi gabungan. Fase diam silika gel, fase gerak heksan-etilasetat 5:1).
Tabel 2. Data Hasil Pengujian Aktivitas Mukolitik Hasil Fraksinasi Fraksi I Ekstrak Heksan Daun Pare (Momordica charantia L.)
No Larutan Uji Viskositas (cps)
1. Kontrol Positif 0,876
2. Kontrol Negatif 1,252
3. Subfraksi Ia 0,25% 0,865
4. Subfraksi Ia 1% 0,864
5. Subfraksi Ib 0,25% 1,099
6. Subfraksi Ib 1% 1,129
7. Subfraksi Ic 0,25% 1,232
8. Subfraksi Ic 1% 1,179
9. Subfraksi Id 0,25% 1,043
10. Subfraksi Id 1% 1,176
Data viskositas bahan uji menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan
nilai viskositas antara subfraksi F-Ia pada konsentrasi 0,25% dan 1%
52
dengan kontrol positif. Subfraksi F-Ia dengan konsentrasi 0,25% b/b dapat
menurunkan viskositas mukus-dapar fosfat pH 7 menjadi 0,865 cps dan
pada konsentrasi 1% sebesar 0,864 cps jika dibandingkan dengan
viskositas kontrol negatif yaitu sebesar 1,252 cps. Viskositas subfraksi F-
Ib, F-Ic dan F-Id menghasilkan viskositas yang tidak terlalu berbeda
dengan kontrol negatif.
Analisis statistik dengan uji one way anova menunjukkan bahwa
perlakuan dengan subfraksi yang diperoleh dari fraksinasi FI menunjukkan
signifikansi <0,01. Hal ini berarti perlakuan yang diberikan menghasilkan
viskositas mukus yang berbeda sangat nyata. Hasil analisis statistik
dengan uji beda nyata jelas (BNJ) menunjukkan bahwa subfraksi F-Ib, F-Ic
dan F-Id menunjukkan perbedaan yang tidak signifikan dengan kontrol
negatif sedangkan subfraksi F-Ia menunjukkan perbedaan yang signifikan.
Subfraksi F-Ia 1% menunjukkan efek mukolitik yang terbaik dengan
viskositas mukus 0,864 cps dibandingkan dengan subfraksi F-Ia 0,25%
dengan viskositas mukus 0,865 cps dan kontrol positif asetilsistein 0,1%
dengan viskositas mukus 0,876 cps. Uji BNJ menunjukkan tidak ada
perbedaan viskositas yang signifikan dari subfraksi FIa 0,25%, FIa 1% dan
asetilsistein 0,1%. Hal ini berarti yang potensial untuk dikembangkan lebih
lanjut sebagai bahan mukolitik adalah subfraksi F-Ia.
Selanjutnya subfraksi F-Ia diidentifikasi senyawanya dengan
menggunakan alat UFLC. Dari pengukuran tersebut diperoleh data
sebagai berikut.
53
Table 3. Data hasil profil kromatogram subfraksi Ia ekstrak heksan Daun Pare (Momordica charantia L.)
Panjang Gelombang
Peak Waktu Retensi (menit)
Area (mAU’s)
Tinggi Peak (mAU)
254 nm
1 2,514 1849 219
2 3,035 11549 1388
3 3,216 28676 4010
4 3,494 5772 557
5 3,788 7235 405
6 4,966 9273 344
7 5,857 19620 892
8 6,384 15735 914
9 7,691 5385 279
10 7,907 5900 427
11 10,896 29654 839
12 13,476 85995 1851
366 nm
1 3,037 7174 1053
2 3,219 17933 2690
3 3,504 3107 411
Keterangan : fase diam oktadesil silica (ODS), fase gerak asetonitril-Air 80:20, kolom
shim-Pack Vp-Ods, suhu kolom 400C, volume injeksi 10 µl, laju 0,5 µl/ menit.
Berdasarkan hasil analisis profil kromatogram UFLC terlihat bahwa
kromatogram pada panjang gelombang 254 nm terdapat 12 puncak
dengan waktu retensi masing-masing 2,514, 3,035, 3,216, 3,494, 3,788,
4,966, 5,857, 6,384, 7,691, 7,907, 10,896, 13,476 menit dengan luas area
1.849, 11.549, 28.676, 5.772, 7.235, 9.273, 19.620, 15.735, 5.385, 5.900,
29.654, 85.995. Puncak pada panjang gelombang 366 nm sejumlah 3
puncak dengan waktu retensi masing-masing 3,037, 3,219, 3,504 menit
dengan luas area 7.174, 17.933, 3.107.
Data profil kromatogram UFLC tersebut menunjukkan adanya satu
peak dengan luas area terbesar yaitu 85.995 pada waktu retensi 13,476
54
menit pada panjang gelombang 254 nm dan menunjukkan adanya satu
peak dengan luas area terbesar yaitu 17.933 pada waktu retensi 3,219
menit pada panjang gelombang 366 nm. Kedua peak tersebut dapat
diusulkan sebagai senyawa utama yang terkandung dalam ekstrak heksan
daun pare (Momordica charantia L.) yang memberikan efek mukolitik.
55
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
V.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan
bahwa :
1. Fraksi I ekstrak heksan daun pare memiliki aktivitas mukolitik yang
paling baik dibandingkan dengan fraksi yang lain.
2. Pemurnian lebih lanjut terhadap Fraksi I menghasilkan empat subfraksi
dan yang paling aktif adalah subfraksi F-Ia dimana pada panjang
gelombang 254 nm terdapat satu peak dengan luas area terbesar yaitu
85.995 pada waktu retensi 13,476 menit dan pada panjang gelombang
366 nm dengan luas area terbesar yaitu 17.933 pada waktu retensi
3,219 menit yang dapat diusulkan sebagai senyawa utama berefek
mukolitik.
V. 2 Saran
Sebaiknya dilakukan pemurnian lebih lanjut pada subfraksi F-Ia dari
ekstrak heksan daun pare (Momordica charantia L.).
56
DAFTAR PUSTAKA
1. Price SA, Lorraine M. Wilson. Patofisiologi Konsep Klinis Proses-proses Penyakit. Ahli bahasa oleh Brahm U. Pendit dkk. Penerbit buku kedokteran EGC. Jakarta. 2006. hal.736.
2. Lubis, HM. Batuk Kronik dan Berulang (BKB) pada Anak:Bagian Ilmu Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. 2005. hal.1.
3. Tan Hoan Tjay. Obat-obat Penting Khasiat, Penggunaan dan Efek-efek Sampingnya Edisi Kelima. PT Elex Media Komputindo Kelompok Gramedia. Jakarta. 2002. hal.620-2.
4. Wijayanti AW. Uji Aktifitas Mukolitik Infusa Daun Pare (Momordica charantia L.) pada Mukus Usus Sapi secara In vitro. 2008:2(1). hal.2-3.
5. Grover, J.K. dan Yadan S.P. Medicinal Plants of India With Antidiabetic Potensial. Journal of Ethnopharmacology. 2002. pp.81-100.
6. Bitter Melon [Online]. 2013 April 23 [cited 2009 Jan 16]. Available from: URL:http://www.wikipedia.com/bitter_melon.html.
7. Syamsuhidayat. Inventarisasi Tanaman Obat Indonesia, edisi kedua, Departemen Kesehatan RI. Jakarta. 1991.
8. Departemen Teknologi Pertanian DKI Jakarta. Tanaman Pare [online]. [cited 2009 Jan 12]; Available from: URL:http://www.pustakadeptan.go.id/agritek/dkij0118.pdf.
9. Tanaman Obat Indonesia [Online]. 2007 Aug 1 [cited 2008 Dec 20]; Available from: URL:http://www.iptek.net.id.
10. Hyeronimus SB. Ragam dan Khasiat Tanaman Obat. 1st ed. Jakarta: Agro Media. 2006.
11. Subahar TS. Khasiat dan Manfaat Pare. Penerbit Agromedia Pustaka. Jakarta. 2004.
12. Bitter Melon [Online]. 2008 July 24 [cited 2009 Jan 16]. Available from: URL:http://www.wikipedia.com/bitter_melon.html.
57
13. Bitter Melon: Ampalaya (bitter melon, kugazi, Balsam pear) (fruit) (Momordica Charantia, Karela) [Online]. 2005 [cited 2008 Dec 19]. Available from: URL:http://lecnaturalhealingsolutions.com/plants/bittermelon.html.
14. Rachmawati S, Adiwinata G, Murdiati T B, Sulistianingsih T. Kandungan Kimia Daun Pare (Momordica charantia L.) dan Efek Antelmintik Terhadap Cacing Lambung (Haemonchus contortus Rudolphi). Fakultas Mipa Institut Sains dan Teknologi Nasional. Jakarta. 2001. hal.5,7.
15. Virdi J, Sivakami S, Shahani S, et al. Antihyperglycemic effects of three extracts from Momordica charantia. J Ethnopharmacol 2003;88(1). pp.07-111.
16. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. Sediaan Galenik. Departemen Kesehatan RI. Jakarta. 1986. hal.4-6, 10-12.
17. Cooke M dan Poole CF. Encyclopedia of Separation Science. USA: Academic Press. 2000. p.2809.
18. Mutschler E.Dinamika Obat: Farmakologi dan Toksikologi Ed. 5. Penerbit ITB. Bandung.1999. hal.519-520.
19. Santoso B, Siswosudarmo R, Suryawati S, Dwiprahasto I, Asdie. Penapisan Farmakologi, Pengujian Fitokimia dan Pengujian Klinik . Jakarta. 1993. hal.63.
20. Noerdin, D. Elusidasi Struktur Senyawa Organik Dengan Cara Spektroskopi Ultralembayung dan Inframerah. Penerbit Angkasa. Bandung. 1986. hal.71-77, 81.
21. Martin A, Swarbrick J, Cammarata A. Farmasi Fisik. Jakarta. 2008. hal.1098.
22. Williams, H. D, Fleming. Spectroscopic Methods In Organic Chemistry. Fourth Edition. Published by McGraw- Hill, Book Company (UK) Limited. England. 1987. pp.29-30.
23. Gandjar I.G., Rohman A. Kimia Analisis Farmasi. Pustaka Pelajar. Yogyakarta. 2007. hal.353,366,378-406.
24. Rohman A. Kromatografi Untuk Analisis Obat. Graham Ilmu. Yogyakarta. 2009. hal.53,112-121.
58
25. Mulja H.M. Teknik Kromatografi (KLT, GC, KCKT, GC-MS, LC-MS, ICP-MS, GC/FT-IR/MS). Pada Ceramah Ilmiah Pelatihan Bidang Narkoba. Pusat Lab. Forensik Mabes Polri. 2006. hal.4,11.
26. Saifuddin A, Rahayu V, dan Teruna H.Y. Standarisasi bahan obat alam. Edisi I. Graha Ilmu. Yogyakarta. 2010. hal.4,22,26-28,45.
27. Adnan M. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Penerbit ANDI. Yogyakarta. 1997. hal.36,38.
59
LAMPIRAN I
Skema Kerja
- Dimaserasi n-heksan 3 x 24 jam
- Diperoleh ekstrak heksan
- Difraksinasi dengan kromatografi vakum
kolom
- Diuji aktivitas mukolitik
- Fraksinasi fraksi I dengan kromatografi
vakum kolom
Analisis hasil
Pembahasan
Kesimpulan
Daun Pare
Fraksi I Fraksi II Fraksi III Fraksi IV
Fraksi aktif (Fraksi I)
Fraksi Ia Fraksi Id Fraksi Ic Fraksi Ib
- Diuji aktivitas mukolitik
Fraksi aktif (Fraksi Ia)
- Kromatografi cair kinerja tinggi
Peak senyawa
60
LAMPIRAN II
Skema Kerja Uji Aktivitas Mukolitik
diukur viskositas
Kontrol negatif
Mukus dalam larutan dapar fosfat 20 : 80 (15 gram)
Ekstrak Heksan Konsentrasi 0,25% dan 1%
(Fraksi I, Fraksi II, Fraksi III, Fraksi IV)
Kontrol positif Asetilsistein 1%
Pembahasan
Analisis data
Kesimpulan
61
LAMPIRAN III
Perhitungan aktivitas mukolitik secara in vitro (viskositas) ekstrak heksan
daun pare (Momordica charantia L.)
Tabel 5. Data waktu alir uji aktivitas mukolitik fraksi Ekstrak heksan
No
Sampel Uji Data Waktu Alir (detik)
1 2 3 Rata-rata
1 Fraksi I 0,25 % 10,17 10,84 10,44 10,48
2 Fraksi I 1 % 10,74 10,92 10,92 10,86
3 Fraksi II 0,25 % 14,23 14,62 13,81 14,22
4 Fraksi II 1 % 15,54 18,34 17,83 17,24
5 Fraksi III 0,25 % 15,72 13,80 16,36 15,29
6 Fraksi III 1 % 14,87 15,48 15,58 15,31
7 Fraksi IV 0,25 % 15,09 15,41 15,81 15,44
8 Fraksi IV 1 % 13,98 14,15 13,89 14,01
9 Kontrol + 10,01 9,70 9,70 9,80
10 Kontrol - 15,35 18,02 20,90 18,09
11 Air Suling 8,35 8,50 8,58 8,48
Tabel 6. Data bobot jenis larutan uji fraksi ekstrak heksan
No
Sampel Uji Bobot Jenis Larutan (gram/ml)
1 2 3 Rata-rata
1 Fraksi I 0,25 % 1,093 1,004 1,095 1,064
2 Fraksi I 1 % 1,000 1,090 1,004 1,031
3 Fraksi II 0,25 % 1,041 1,094 1,043 1,059
4 Fraksi II 1 % 1,050 1,044 1,054 1,049
5 Fraksi III 0,25 % 1,051 1,038 1,054 1,048
6 Fraksi III 1 % 1,052 1,035 1,038 1,042
7 Fraksi IV 0,25 % 1,005 1,005 1,005 1,005
8 Fraksi IV 1 % 1,051 1,038 1,054 1,048
9 Kontrol + 1,040 1,044 1,045 1,043
10 Kontrol - 1,098 1,004 1,007 1,036
11 Air Suling 1,042 1,040 1,045 1,042
62
Perhitungan bobot jenis (BJ) air pada suhu 370C
BJ ( ) ( )
( )
–
Bobot jenis air pada suhu 370C adalah 1,042.
Diketahui bobot piknometer kosong : I = 9,667 g
II = 10,379 g
Volume piknometer kosong : 10 ml
Perhitungan bobot jenis larutanr uji yang mengandung fraksi heksan
Bobot jenis mukus (370C) ( ) ( )
( )
Fraksi I 1%
BJ = ( ) ( )
( )
BJ –
BJ –
BJ –
63
Fraksi I 0,25%
BJ –
BJ –
BJ –
Fraksi II 1%
BJ –
BJ –
BJ –
Fraksi II 0,25%
BJ –
BJ –
BJ –
64
Fraksi III 1%
BJ –
BJ –
BJ –
Fraksi III 0,25%
BJ –
BJ –
BJ –
Fraksi IV 1%
BJ –
BJ –
BJ –
65
Fraksi IV 0,25%
BJ –
BJ –
BJ –
Kontrol Positif
BJ –
BJ –
BJ –
Kontrol Negatif
BJ –
BJ –
BJ –
66
Perhitungan viskositas larutan uji pada suhu 37oC
η mukus =
Diketahui :
η air pada suhu 37oC = 0,692 cps
t air = 8,48 dtk
η Fraksi I 1%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 0,877 cps
η Fraksi I 0,25%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 0,872 cps
67
η Fraksi II 1%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,415 cps
η Fraksi II 0,25%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,180 cps
η Fraksi III 1%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,248 cps
68
η Fraksi III 0,25%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,254 cps
η Fraksi IV 1%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,149 cps
η Fraksi IV 0,25%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,214 cps
69
η Kontrol Positif
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 0,800 cps
η Kontrol Negatif
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,459 cps
Tabel 7. Data waktu alir uji aktivitas mukolitik fraksi I Ekstrak heksan
No
Sampel Uji Data Waktu Alir (detik)
1 2 3 Rata-rata
1 Subfraksi Ia 0,25 % 10,45 10,47 10,41 10,44
2 Subfraksi Ia 1 % 10,77 10,67 10,30 10,58
3 Subfraksi Ib 0,25 % 13,71 13,64 13,62 13,66
4 Subfraksi Ib 1 % 13,66 13,67 13,63 13,65
5 Subfraksi Ic 0,25 % 15,06 15,51 14,65 15,07
6 Subfraksi Ic 1 % 12,74 15,15 15,62 14,50
7 Subfraksi Id 0,25 % 12,68 13,38 13,51 13,19
8 Subfraksi Id 1 % 14,90 14,00 14,61 14,50
9 Kontrol + 10,77 10,52 10,89 10,73
10 Kontrol - 15,47 15,43 15,25 15,38
11 Air Suling 8,34 8,65 8,66 8,55
70
Tabel 8. Data bobot jenis larutan uji fraksi I ekstrak heksan
No
Sampel Uji Bobot Jenis Larutan (gram/ml)
1 2 3 Rata-rata
1 Subfraksi Ia 0,25 % 1,091 1,001 1,092 1,061
2 Subfraksi Ia 1 % 1,003 1,090 1,049 1,047
3 Subfraksi Ib 0,25 % 1,000 1,092 1,004 1,032
4 Subfraksi Ib 1 % 1,091 0,999 1,090 1,060
5 Subfraksi Ic 0,25 % 1,046 1,047 1,051 1,048
6 Subfraksi Ic 1 % 1,041 1,049 1,042 1,044
7 Subfraksi Id 0,25 % 1,044 1,040 0,959 1,014
8 Subfraksi Id 1 % 1,039 1,039 1,039 1,039
9 Kontrol + 1,046 1,051 1,043 1,047
10 Kontrol - 1,001 1,091 1,040 1,044
11 Air Suling 1,041 1,031 1,042 1,038
Perhitungan bobot jenis (BJ) air pada suhu 370C
BJ ( ) ( )
( )
–
Bobot jenis air pada suhu 370C adalah 1,042.
Diketahui bobot piknometer kosong : I = 9,683 g
II = 10,394 g
Volume piknometer kosong : 10 ml
Perhitungan bobot jenis larutanr uji yang mengandung fraksi heksan
Bobot jenis mukus (370C) ( ) ( )
( )
71
Subfraksi Ia 1%
BJ = ( ) ( )
( )
BJ –
BJ –
BJ –
Subfraksi Ia 0,25%
BJ –
BJ –
BJ –
Subfraksi Ib 1%
BJ –
BJ –
BJ –
Subfraksi Ib 0,25%
72
BJ –
BJ –
BJ –
Subfraksi Ic 1%
BJ –
BJ –
BJ –
Subfraksi Ic 0,25%
BJ –
BJ –
BJ –
Subfraksi Id 1%
BJ –
BJ –
73
BJ –
Subfraksi Id 0,25%
BJ –
BJ –
BJ –
Kontrol Positif
BJ –
BJ –
BJ –
Kontrol Negatif
BJ –
BJ –
BJ –
74
Air
BJ –
BJ –
BJ –
Perhitungan viskositas larutan uji pada suhu 37oC
η mukus =
Diketahui :
η air pada suhu 37oC = 0,692 cps
t air = 8,55 dtk
η Subfraksi Ia 1%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 0,864 cps
η Subfraksi Ia 0,25%
η larutan uji
η larutan uji
75
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 0,865 cps
η Subfraksi Ib 1%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,129 cps
η Subfraksi Ib 0,25%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,099 cps
η Subfraksi Ic 1%
η larutan uji
η larutan uji
76
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,179 cps
η Subfraksi Ic 0,25%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,232 cps
η Subfraksi Id 1%
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,176 cps
η Subfraksi Id 0,25%
η larutan uji
η larutan uji
77
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,043 cps
η Kontrol Positif
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 0,876 cps
η Kontrol Negatif
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji
η larutan uji rata-rata = 1,252 cps
78
LAMPIRAN IV
FOTO PENGUJIAN
(a) (b)
(c) (d)
Keterangan: (a) Usus sapi , (b) Pengukuran waktu alir dengan viskometer Ostwald, (c) Sampel uji, (d) Pengukuran bobot jenis.
79
LAMPIRAN V
ANALISIS DATA
Analisis Data Ekstrak Heksan
Tests of Normality
Sampel Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Visko
sitas
Kontrol Positif .304 3 . .907 3 .407
Kontrol Negatif .285 3 . .931 3 .494
F I 1% .355 3 . .820 3 .163
F I 0.25% .375 3 . .773 3 .052
F II 1% .295 3 . .920 3 .451
F II 0.25% .182 3 . .999 3 .937
F III 1% .219 3 . .987 3 .780
F III 0.25% .359 3 . .811 3 .140
F IV 1% .177 3 . 1.000 3 .972
F IV 0.25% .269 3 . .949 3 .567
a. Lilliefors Significance Correction
Test of Homogeneity of Variances
Viskositas
Levene Statistic df1 df2 Sig.
4.812 9 20 .002
Ranks
N Mean Rank Sum of Ranks
Viskositas - Sampel
Negative Ranks 30a 15.50 465.00
Positive Ranks 0b .00 .00
Ties 0c
Total 30
a. Viskositas < Sampel
b. Viskositas > Sampel
c. Viskositas = Sampel
Analisis Data Fraksi I
80
Tests of Normality
Sampel Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Visko
sitas
Kontrol Positif .257 3 . .961 3 .619
Kontrol Negatif .314 3 . .893 3 .363
F I 1 1% .199 3 . .995 3 .864
F I 1 0.25% .227 3 . .983 3 .749
F I 2 1% .228 3 . .982 3 .743
F I 2 0.25% .214 3 . .990 3 .805
F I 3 1% .360 3 . .809 3 .135
F I 3 0.25% .369 3 . .788 3 .086
F I 4 1% .253 3 . .964 3 .637
F I 4 0.25% .274 3 . .945 3 .547
a. Lilliefors Significance Correction
Test of Homogeneity of Variances
Viskositas
Levene Statistic df1 df2 Sig.
1.625 9 20 .175
Viskositas
Tukey HSD
Sampel N Subset for alpha = 0.05
1 2 3
F I 1 1% 3 .86400
F I 1 0.25% 3 .86467
Kontrol Positif 3 .87567
F I 4 0.25% 3 1.04300
F I 2 0.25% 3 1.09933 1.09933
F I 2 1% 3 1.12900 1.12900
F I 4 1% 3 1.17567 1.17567
F I 3 1% 3 1.17933 1.17933
F I 3 0.25% 3 1.23233
Kontrol Negatif 3 1.25200
Sig. 1.000 .149 .076
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
64
(I) Sampel Mean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
Kontrol Positif Kontrol Negatif -.376333* .045831 .000 -.53863 -.21404
F_Ia 1% .011667 .045831 1.000 -.15063 .17396
F_Ia 0.25% .011000 .045831 1.000 -.15129 .17329
F_Ib 1% -.253333* .045831 .001 -.41563 -.09104
F_Ib 0.25% -.223667* .045831 .003 -.38596 -.06137
F_Ic 1% -.303667* .045831 .000 -.46596 -.14137
F_Ic 0.25% -.356667* .045831 .000 -.51896 -.19437
F_Id 1% -.300000* .045831 .000 -.46229 -.13771
F_Id 0.25% -.167333* .045831 .040 -.32963 -.00504
Kontrol Negatif Kontrol Positif .376333* .045831 .000 .21404 .53863
F_Ia 1% .388000* .045831 .000 .22571 .55029
F_Ia 0.25% .387333* .045831 .000 .22504 .54963
F_Ib 1% .123000 .045831 .244 -.03929 .28529
F_Ib 0.25% .152667 .045831 .076 -.00963 .31496
F_Ic 1% .072667 .045831 .840 -.08963 .23496
F_Ic 0.25% .019667 .045831 1.000 -.14263 .18196
F_Id 1% .076333 .045831 .801 -.08596 .23863
F_Id 0.25% .209000* .045831 .006 .04671 .37129
65
F_Ia 1% Kontrol Positif -.011667 .045831 1.000 -.17396 .15063
Kontrol Negatif -.388000* .045831 .000 -.55029 -.22571
F_Ia 0.25% -.000667 .045831 1.000 -.16296 .16163
F_Ib 1% -.265000* .045831 .000 -.42729 -.10271
F_Ib 0.25% -.235333* .045831 .002 -.39763 -.07304
F_Ic 1% -.315333* .045831 .000 -.47763 -.15304
F_Ic 0.25% -.368333* .045831 .000 -.53063 -.20604
F_Id 1% -.311667* .045831 .000 -.47396 -.14937
F_Id 0.25% -.179000* .045831 .023 -.34129 -.01671
F_Ia 0.25% Kontrol Positif -.011000 .045831 1.000 -.17329 .15129
Kontrol Negatif -.387333* .045831 .000 -.54963 -.22504
F_Ia 1% .000667 .045831 1.000 -.16163 .16296
F_Ib 1% -.264333* .045831 .000 -.42663 -.10204
F_Ib 0.25% -.234667* .045831 .002 -.39696 -.07237
F_Ic 1% -.314667* .045831 .000 -.47696 -.15237
F_Ic 0.25% -.367667* .045831 .000 -.52996 -.20537
F_Id 1% -.311000* .045831 .000 -.47329 -.14871
F_Id 0.25% -.178333* .045831 .024 -.34063 -.01604
66
F_Ib 1% Kontrol Positif .253333* .045831 .001 .09104 .41563
Kontrol Negatif -.123000 .045831 .244 -.28529 .03929
F_Ia 1% .265000* .045831 .000 .10271 .42729
F_Ia 0.25% .264333* .045831 .000 .10204 .42663
F_Ib 0.25% .029667 .045831 1.000 -.13263 .19196
F_Ic 1% -.050333 .045831 .979 -.21263 .11196
F_Ic 0.25% -.103333 .045831 .455 -.26563 .05896
F_Id 1% -.046667 .045831 .987 -.20896 .11563
F_Id 0.25% .086000 .045831 .683 -.07629 .24829
F_Ib 0.25% Kontrol Positif .223667* .045831 .003 .06137 .38596
Kontrol Negatif -.152667 .045831 .076 -.31496 .00963
F_Ia 1% .235333* .045831 .002 .07304 .39763
F_Ia 0.25% .234667* .045831 .002 .07237 .39696
F_Ib 1% -.029667 .045831 1.000 -.19196 .13263
F_Ic 1% -.080000 .045831 .759 -.24229 .08229
F_Ic 0.25% -.133000 .045831 .169 -.29529 .02929
F_Id 1% -.076333 .045831 .801 -.23863 .08596
F_Id 0.25% .056333 .045831 .958 -.10596 .21863
67
F_Ic 1% Kontrol Positif .303667* .045831 .000 .14137 .46596
Kontrol Negatif -.072667 .045831 .840 -.23496 .08963
F_Ia 1% .315333* .045831 .000 .15304 .47763
F_Ia 0.25% .314667* .045831 .000 .15237 .47696
F_Ib 1% .050333 .045831 .979 -.11196 .21263
F_Ib 0.25% .080000 .045831 .759 -.08229 .24229
F_Ic 0.25% -.053000 .045831 .971 -.21529 .10929
F_Id 1% .003667 .045831 1.000 -.15863 .16596
F_Id 0.25% .136333 .045831 .149 -.02596 .29863
F_Ic 0.25% Kontrol Positif .356667* .045831 .000 .19437 .51896
Kontrol Negatif -.019667 .045831 1.000 -.18196 .14263
F_Ia 1% .368333* .045831 .000 .20604 .53063
F_Ia 0.25% .367667* .045831 .000 .20537 .52996
F_Ib 1% .103333 .045831 .455 -.05896 .26563
F_Ib 0.25% .133000 .045831 .169 -.02929 .29529
F_Ic 1% .053000 .045831 .971 -.10929 .21529
F_Id 1% .056667 .045831 .957 -.10563 .21896
F_Id 0.25% .189333* .045831 .015 .02704 .35163
68
F_Id 0.25% Kontrol Positif .167333* .045831 .040 .00504 .32963
Kontrol Negatif -.209000* .045831 .006 -.37129 -.04671
F_Ia 1% .179000* .045831 .023 .01671 .34129
F_Ia 0.25% .178333* .045831 .024 .01604 .34063
F_Ib 1% -.086000 .045831 .683 -.24829 .07629
F_Ib 0.25% -.056333 .045831 .958 -.21863 .10596
F_Ic 1% -.136333 .045831 .149 -.29863 .02596
F_Ic 0.25% -.189333* .045831 .015 -.35163 -.02704
F_Id 1% -.132667 .045831 .171 -.29496 .02963
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
F_Id 1% Kontrol Positif .300000* .045831 .000 .13771 .46229
Kontrol Negatif -.076333 .045831 .801 -.23863 .08596
F_Ia 1% .311667* .045831 .000 .14937 .47396
F_Ia 0.25% .311000* .045831 .000 .14871 .47329
F_Ib 1% .046667 .045831 .987 -.11563 .20896
F_Ib 0.25% .076333 .045831 .801 -.08596 .23863
F_Ic 1% -.003667 .045831 1.000 -.16596 .15863
F_Ic 0.25% -.056667 .045831 .957 -.21896 .10563
F_Id 0.25% .132667 .045831 .171 -.02963 .29496
69
LAMPIRAN VI
FI FII FIII FIV
(a)
FI FII FIII FIV
(b)
70
FI FII FIII FIV
(c)
Gambar 5. Profil kromatografi lapis tipis ekstrak heksan daun pare (Momordica charantia
L.) Keterangan: (a) Visualisasi dengan UV 254 nm, (b) visualisasi dengan UV
366 nm, (c) visualisasi setelah penyemprotan H2SO4 10%. Fase diam silika
gel, fase gerak heksan-etilasetat 5 : 1.
71
LAMPIRAN VII
FI-a FI-b FI-c FI-d
(a)
FI-a FI-b FI-c FI-d
(b)
72
FI-a FI-b FI-c FI-d
(c)
Gambar 6. Profil kromatografi lapis tipis fraksi I ekstrak heksan daun pare (Momordica charantia L.). Keterangan: (a) Visualisasi dengan UV 254 nm, (b) visualisasi dengan UV 366 nm, (c) visualisasi setelah penyemprotan H2SO4 10%. Fase diam silika gel, fase gerak heksan-etilasetat 7 : 1.
73
LAMPIRAN VIII
PROFIL KCKT
74
