НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ TA ВІРУСОЛОГІЇ

ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

На правах рукопису

ІГНАТОВА Олена Андріївна

ТАКСОНОМІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ДЕЯКИХ

ПРОМИСЛОВО ВАЖЛИВИХ ВИДІВ ДРІЖДЖІВ

РОДУ CANDIDA BERKHOUT

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ - 1997

5 ^ 3 ЛННБ Ук

Дисертацією є рукопис

раїни ім.В.Стефаника

Illl0 0 7 5 1 8 3 9 (X)

Робота виконана у відділі фізіологи промислових мш рооргатз

мів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного HAH

України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор,член кор. HАНУ Підгорський B.C.

Офіційні опоненти - доктор біологічних наукЖданова Н.М.

доктор технічних наук, професор Маринченко B A

Провідна організація - Інститут ботаніки HAH України ім. М.Г.Холодного

Захист відбудеться 19 березня 1997 року о IO00 годині на засі­

данні Спеціалізованої Вченої Ради Д 01.81.01 при Інституті мікробіо­логії та вірусології ім. Д.К. Заболотного HAH України (252143, Київ 143, вул. Заболотного, 154, Інститут мікробіології та вірусології HAH України, зал засідань).

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці

Інституту мікробіології та вірусології HAH України.

Автореферат розіслано " ___ " _______________ 1997 р.

Вчений секретар Спеціалізованої Вченої Ради кандидат біологічних наук - Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИАктуальність теми: Рід Candida являє собою дуже гетероген­

ну групу недовершених дріжджів, до якої відносяться біля ніж 300 видів. Серед них є види, які широко використовуються в біотехно- логії. Деякі дріжджі роду, що мають виняткові метаболічні шляхи, пропонується використовувати у біотехнологіях майбутнього. У той

же час ряд видів, серед них і промислово важливі, можуть включати в себе штами, що викликають захворювання людини та тварин.

Проте таксономічний стан багатьох практично важливих видів роду Candida залишається неясним, бо систематика роду розробле­

на слабо. Вона базується в основному на фенотипових ознаках - морфології клітин та спор, засвоєнні різних джерел вуглецю, азоту

та інших (Kreger-van Rij, 1984). Ці ознаки нестабільні, бо ріст на вуг­

леводах у дріжджів кодується невеликою частиною геному, іноді

лише одним або двома генами. Критерії і методи ідентифікації, які

існують у наш час, недостатні.У деяких видів роду Candida виявлена статева стадія, що дозво­

лило віднести їх до аскоміцетних чи базідіоміцетних дріжджів. Для

більшості видів цього роду довершені аналоги невідомі. Деякі види

роду, які не утворюють аскоспор, але ідентичні за фенотиповими

ознаками аскоспоровим видам, лише на основі цієї подібності відне­

сені до довершених аналогів.

Для створення природної класифікації p. Candida та удоскона­

лення ідентифікації видів необхідне залучення нових методів дослід­

жень - генетики і молекулярної біології.Дуже важлива точна ідентифікація для дріжджів, які викорис­

товуються у промисловості. Незнання таксономічного стану вико­ристовуваних дріжджів або невірне про це уявлення в умовах вели­комасштабного виробництва може привести до непередбачених

наслідків (Голубев, 1987). A ti УкраЯдв

" 3

Мета та завдання роботи. Метою даної роботи був пошук довершених форм і визначення дійсного таксономічного стану про­

мислово важливих видів С. utilis, С. valida і видів, які близькі їм за

фенотиповими ознаками.Для виконання роботи необхідно було вирішити такі завдання:

- провести порівняльне вивчення фенотипових ознак цих видів,

включаючи типові, музейні та свіжовиділеш штами;

- вивчити життєві цикли й генетичну спорідненість досліджуваних

видів дріжджів на основі гібридизації прототрофних штамів і

ауксотрофних мутантів;

- провести геноіденгифікацію видів на основі методу УП-ПЛР (полі- меразної ланцюгової реакції з універсальними праймерами).

Наукова новизна роботи. Залучення до досліджень великої кількості колекційних та свіжовиділених штамів, використання гене­

тико -популяційного критерію (здатність штамів схрещуватися і да­

вати фертильне потомство) і нового методу УП-ПЛР дозволило впер­

ше віднайти статевий процес у недовершених видів С. valida, С. zeylanoides, С. vini, С. beechii, С. mans, С. silvatica, С. inconspicua, С. insectalens, С. sorboxylosa і С. utilis, встановити їх генетичну спо­

рідненість з аскоспоровими дріжджами роду Pichia та визначити

істинний таксономічний статус промислово важливих видів С. vali­

da, С. zeylanoides і С. utilis. Показано, що недовершені дріжджі С.

valida і С. zeylanoides відносяться до одного біологічного виду Pichia membranaefaciens Hansen. Встановлено, що дріжджі С. utilis і Р.

jadinii являють собою один вид.Практичне значення. Нами переглянута класифікація ряду про­

мислово важливих видів дріжджів роду Candida Berkhout, що вико­ристовуються для виробництва харчового і кормового білків, деяких

метаболітів та біологічно активних речовин.

4

Встановлено істинний таксономічний статус "білкових" дріжд­жів С. valida, дріжджів С. zeylanoides, які застосовуються як проду­

цент лимонної кислоти, а також дріжджів С. utilis, що використову­

ються не тільки для виробництва кормового білка, але й для додаван­

ня у продукти харчування людини.Колекція дріжджових культур, яка є основою для проведення

фундаментальних та прикладних досліджень, була поповнена нови­

ми ізолятами.

Конкретна особиста участь автора в одержаних результатах.

Робота виконана автором особисто під керівництвом д.б.н., професо­

ра, член кор. НАНУ B.C. Підгорського і к.б.н. С.С. Нагорної.

Дослідження, що були виконані в Інституті мікробіології і віру­сології HAH України сумісно: дот- гібридизація ПЛР-паттершв - з

співробітниками відділу генетики мікроорганізмів інженером Заве-

рухою В.Б. та к.б.н. Полеводою Б.В., одержання ауксотрофних му­

тантів - з К.6.Н. Суденко В.І., електронна мікроскопія клітин та асків

- з інженером Канюком М.І.Попередній ПЛР-аналіз був проведений у Санкт-Петербургсь-

кому Інституті ядерної фізики сумісно з к.б.н. Булатом С.А.; вивчен­ня ентомопатогенних властивостей виділених дріжджів p. Candida та

їх патогенність для риб - у Київскому Національному Державному Університеті ім. Т.Г. Шевченка та Інституті зоології HAH України ім.

LI. Шмальгаузена. - сумісно з к.б.н. Поважною Т.М. та к.б.н. Ісаєвою

Н.М.Аттробаттія роботи . Матеріали дисертації доповідалися і обго­

ворювалися на І Всес. нараді: “Хемотаксономическое изучение спо­

ровых растений и грибов" (Київ, 1990 р.), на IX Всес. нараді по

паразитам та хворобам риб (Петрозаводськ, 1991 р.), на конференції

молодих учених IMB НАНУ (1991 р.), щорічній науковій конферен­

5

ції-конкурсі робіт IMB НАНУ (1991, 1994 pp.), на І (Установчому) з'їзді УМО (Одеса, 1994 р.)

Публікація результатів роботи. За матеріалами дисертації опуб­ліковано 8 наукових праць.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини з 4-х розділів власних

досліджень, заключения, висновків і списку цитованої літератури,

який включає 293 найменуваннь. Робота викладена на 170 сторінках

машинописного тексту і містить 22 малюнка та 23 таблиці.

Основні положення, шо виносяться на. захист,1. Для створення природної класифікації деяких промислово важ­

ливих видів p. Candida та удосконалення їх ідентифікації необхід­

не залучення нових підходів - вивчення життєвих циклів і ПЛР-

аналізу.2. Недовершені дріжджі С. valida і С. zeylanoides рекласифіковані у

один біологічний вид Pichia membranaefaciens Hansen.

3. Види С. vini, С. inconspicua, С. beechii, С. insectalens, С. mans, С. silvatica і С. sorboxylosa входять до складу роду Pichia Hansen, але

вони репродуктивно ізольовані.

4. Недовершені дріжджі С. utilis і аскоспорові довершені дріжджі

P. jadinii являють собою один біологічний вид.

них дріжджів роду Candida Berkhout та представлені сучасні уявлен­

ня про цей рід. Розглянуті критерії та методи, що використовуються

у таксономії p. Candida. Наведені дані про використання та розпов­сюдження деяких промислово важливих видів дріжджів цього роду.

ЗМІСТ РОБОТИОгляа літератури. Викладена історія систематики недоверше-

6

Експериментальна частина

Матеріали і метоли.У роботі вивчали музейні та свіжовиділет штамі 25 видів дріж­

джів роду Candida та двох видів роду Pichia (усього 141 штам), виді­

лені з різних природних та виробничих джерел, а також одержані із зарубіжних колекцій мікроорганізмів (ВКМ, АТСС, CBS, NRRL). Но­

ві ізоляти дріжджових культур були виділені нами з комарів та риб.

Виділення та ідентифікацію дріжджів проводили згідно мето­

дам, запропонованим Kreger-van Rij (1984). Схрещування гаплоїдних

штамів здійснювали на 10 спеціальних живильних середовищах за

методом Wickerham and Burton (1954) у модифікації Жарової (1980).

Аналіз випадкової вибірки спор проводили за методом Сибірного та

інш, (1977). Ауксотрофні мутанти одержували за допомогою 0,005-

0,05%-ного розчину N-HiTpo-N1-MeTHA-N'-ттрозогуанідіну. Виділення,

ідентифікацію мутантів та визначення частоти реверсії до прото-

трофності проводили за методом Holliday (1956). Ауксотрофні му­

танти схрещували за методом Сибірного та інш. (1977). Поодинокі зиготи ізольювали за допомогою мікроманіпулятору MM-1,

Клітинні лізати одержували за методикою Булата та інш. (1992). Полімеразну ланцюгову реакцію проводили за методом Saiki et аі.

(1985) на ампліфікаторі ААГ-56 (розробник - Санкт-Петербургський

Інститут ядерної фізики) у режимі: денатурація ДНК - 92°С - 50 с,

відпал праймерів - 56°С - 50 с, синтез ДНК - 70°С - 70 с. Кількість

циклів - ЗО. У роботі використовували праймери і реактиви, отрима­

ні від к.б.н. Булата С.АПродукти ПАР розділяли в 1,5-2%-ному агарозному гелі (Мани-

атис и др., 1984). Гомологію ПЛР-паттернів виявляли дот-гібридіза- цією по Southern (1975). Реакцію нік трансляції проводили за мето­

дикою Rigbi et аі. (1977).

7

Експериментальний цифровий матеріал був опрацьований стандартними статистичними методами (Лакин, 1973) з використан­ням комп’ютерної програми Excel.

Результати та їх обговоренняВиділення та ідентифікація нових ізолятів дріжджів ролу

Candida з деяких природних джерел.Для всебічної характеристики виду дріжджів необхідне залу­

чення до досліджень не тільки типових та музейних культур, але й

якнабільше свіжовиділених штамів, що також надає можливість

знайти перехресні типи гаплоїдних аспорогених штамів.Нові ізоляти досліджуваних видів дріжджів роду Candida були

одержані при вивченні дріжджової флори лососевих риб, які куль­тивувалися у риборозпліднику "Пуща-Водиця”, і кровососучих кома­

рів. Вибір цих еконіш пояснюється не тільки науковим інтересом (про дріжджі у риб та комах відомо дуже мало), але й практичними

завданнями. У процесі розвитку індустріального рибництва виникла

проблема зниження стійкості лососевих риб до захворювань, що

викликаються й дріжджами p. Candida. За даними літератури дріжд­

жі мають і енгомопатогенні властивості.Нами встановлено, що дріжджі р, Candida постійно зустріча­

ються у внутрішній мікрофлорі здорових і хворих личинок й їм аго

комарів у всіх досліджуваних пробах (10 - IO4 клітин/екз.).Всього з личинок й їм аго виділено 18 видів дріжджів, які відне­

сені до 7 родів - Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Metchnikowia,

Trichosporon, Saccharomyces і Wilhopsisl причому недовершений рід

Candida представлений шістьма видами (С. famata, С. insonspicua, С. Iambica, С. lipolytica, С. valida й С. zeylanoides).

Практично у всіх пробах переважали дріжджі С. famata (часто­та зустрічаємості 80%), досить часто виділялися дріжджі С. lipolytica

8

(син. Yarrowia lipolytica) та С. zeylanoides (частота зустрічаємості 44,5% і 41% відповідно). Дріжджі С. valida, С. insonspicua і С. Iambica були виявлені тільки у хворих личинок.

Дріжджі p. Candida постійно виділялись з ікри, мальків й сего- летхів лососю у всі строки взяття проб (10 - IO4 кл./г). Всього з цих об'єктів виділено 10 видів дріжджів, які відносяться до 4 родів. Від­

значено переважання видів недовершених родів - Candida, Rhodoto-

rula і Cryptococcus. Рід Candida представлений найбільш широко (С.

insonspicua, С. valida, С, parapsilosis, С. vini, С. Upolytica і С. zeyla­

noides). Вид С. vini домінував у кишечнику здорових мальків. Дріжд­

жі С. valida виявлялися, в основному, у хворих мальків й на сапро-

легніозній ікрі. На здоровій ікрі переважали дріжджі С. Upolytica, С. zeylanoides і С. parapsilosis.

Дослідження, що проводились у Київському Університеті та

Інституті зоології, показали, що виділені штами дріжджів не мають

ентомопатогенних властивостей та не викликають захворювань риб, тобто є сапрофітами і являють собою складову частину нормальної мікрофлори цих об'єктів.

Штами видів С. vaUda, С. vini, С. zeylanoides і С. insonspicua,

що виділені з організмів риб і комарів, були залучені до таксономіч­

них досліджень.

Дослідження спорідненості вилів Candida vaUda (Leberle) van

Uden et Buckley та Pichia mernbranaefaciens Hansen.

Недовершені дріжджі С. vaUda вважаються анаморфою аско-

спорових дріжджів P. mernbranaefaciens на основі подібності фізіо­

логічних ознак і вмісту Г-f Ц у ДНК (Meyer et аі., 1970). Експеримен­тального підтвердження належності їх до цього виду не було одер­жано.

9

Дослідження м орфолого-культур альних та фізіологічних ознак

всіх перевірених нами колекційних і свіжовиділених штамів показа­ло цілковиту відповідність характеристиці цих видів у визначнику Kreger-van Rij (1984). Всі перевірені штами не утворюють аскоспор

на рутинних і спеціальних середовищах. Кон'югація і аскоспороут- ворення знайдені нами лише при схрещуванні штамів С. valida між собою і з тестерними штамами P. membranaefaciens протилежних TPfrriR спарювання. Кон'югація у більшості вивчених штамів, у тому

числі й типового, спостерігалася на 3-5 добу (мал. 1). Круглі і шля- повидні аскоспори, які утворювалися на 3-5-10 добу, розташовува­

лися у асках по чотири (мал. 2).По типам спарювання досліджувані дріжджі розподілені на дві

групи, при цьому тип спарювання С. valida не залежав від джерела,

часу й місця виділення культури (табл. 1).

Специфічна еконіша дріжджів для того чи іншого типу спарю­вання не виявлена. В одному й тому ж субстраті можуть зустрічати­

ся штами обох протилежних типів спарювання чи штами тільки од­

ного з типів спарювання.Найбільш здатними для прояву сексуальної активності штамів

виявилися середовища з мальтозою, етанолом і ацетатне. На цих

середовищах доля утворювання асків досягала 20-30%. Деякі штами кон'югували й утворювали аскоспори і на сусло-агарі. Схрещуван­

ню гаплоїдних штамів на агаризованих середовищах повинно пере­

дувати попереднє культивування змішуваних штамів у рідкому сус­

лі.Життєздатність аскоспор гібридів С. valida і P. membranae­

faciens в середньому складала 92%. При аналізі випадкової вибірки спор у гібридів відмічене моногенне розщеплення по типу спарю­

вання. Це дозволяє оцінити генетичний обмін, отже спорідненість і таксономічний стан дріжджів. Досліджені штами С. valida, які проя-

10

и

Мал. 2. Аскоспороутворення при схрещуванні штамів С. valida CBS 638 і P. membranaefaciens CBS 5568

Мал. 1. Кон'югація у штамів С. valida CBS 638 і P. membranaefaciens CBS 5568

12

Таблиця IТипи спарювання пггамів С. valida

№ штаму Джерело, місце, час виділення

ТипспарюванняmtA mtB

CBS 638T, IMB 967 вино, Німеччина, 1909 - +IMB 967 силос, Україна, 1964 + -IMB 969, 970, 971, 972, 973, 974

вино, Молдавія, 1967 +

IMB 981 організм людини, Абхазія, 1978

+ “

IMB 982 організм людини, Абхазія, 1978

” +

IMB 993 організм людини, Україна, 1987

+ “

IMB 984, 985, 991, 992 кефір, Україна, 1986 + -IMB 987, 988, 989 кефір, Україна, 1986 - +IMB 1726, 1770 вода, р /р "Пуща-Водиця",

1989“ +

IMB 1661 ікра лососю, р /р "Пуща- Водиця", 1989

“ +

IMB 1761, 1751, 1728, 1731, 1767

кишечник лососю, р /р "Пуща-Водиця", 1989

+ *

IMB 1759 кишечник лососю, р /р "Пуща-Водиця", 1989

“ +

Примітка: T - типовий штам; р /р - риборозплідник

вили сексуальну активність при гібридизації, являють собою гаплоїд­

ні гетероталічні штами аскоспорового виду P. mernbranaefaciens.

Отримані результати були підтверджені генотипуванням шта­мів С. valida і P. mernbranaefaciens за допомогою нового методу ви-

доідентифікації, основаного на полімеразній ланцюговій реакції з використанням універсальних олігонуклеотидних праймерів. За до­

помогою ПАР-аналізу виявляються фрагменти ДНК, розмір і взаємо- розташування яких специфічні для виду (Булат та інш., 1992).

Показано, що більшість вивчених штамів, серед них і типові, практично ідентичні за ПАР-паттернами (мал. 3). Незначні відмін­ності, які ми спостерігали серед подібних ПЛР-паттернів, являють собою ПЛР-поліморфізм. Теоретично такий поліморфізм може бути

зв'язаний з походженям штамів, але ніякої кореляції з екологією чи географією ми не знайшли.

ПЛР-генотипування показало генетичну однорідність виду С. valida, незважаючи на варіабельність засвоєння ряду джерел вугле­

цю і здатність до росту на середовищі без вітамінів. У цю групу

увійшли і 4 штами С. valida, у яких ми не виявили статевий процес. Це ще раз доводить, що C valida і P. membranaefaciens являють

собою один біологічний вид Pichia membranaefaciens Hansen.

Решта штамів P. membranaefaciens, які не росли при 37°С, значно відрізнялися від штамів першої групи за деякими мажорними

паттернами (мал. 4). Ця група штамів, виявлена ПЛР-аналізом, може являти собою види -двійники, які не відрізняються за фенотиповими

ознаками і не знаходяться звичайними методами. Можна також при­пустити, що вид P. membranaefaciens знаходиться у стані диверген­

ції, яка приводить до утворення самостійних підвидів.

Таксономічне вивчення деяких видів ролу Candida, які близькі

за фенотиповими ознаками С. valida і P. membranaefaciens Наявність статевої стадії у С. valida спонукало нас досліджува­

ти життєві цикли інших недовершених видів Candida, які близькі за

морфологічними та фізіологичними властивостями до видів С. valida і P. membranaefaciens. Таких видів у нашій колекції 22, причому

значна частина цих видів представлена лише типовими штамами.

З метою встановлення можливої генетичної спорідненості ми

схрещували типові штами цих видів з тестерними штамами P. mem-

13

14

Мал. 3. ПЛР-генотшгування деяких штамів С. valida (праймер 45). Штами дріжджів: I- P. membranaefaciens CBS 107; 2-14- С. valida CBS 638, IMB 967, 970, 973, 982, 989, 993, 1649, 1728, 1751, 1761, 1770, 1759. M- маркери молекулярних ватів, тпн (‘‘лямбда" ДНК - PstI).

Мал. 4. ПЛР-генотипування деяких штамів P. membranaefaciens (праймер 45). Штами дріжджів: I- С. valida CBS 638; 2-14- P. membranaefaciens CBS 107, IMB 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 852, 968, 975, 976, 980. M- див. мал. 3.Примітка. На мал. 3-6 представлені схеми негативів гелей.

branaefaciens протилежних типів спарювання й виявили кон'ьюгадію ще у восьми видів - С. vini, С. beechii, С. inconspicua, С. insectalens, С. mans, С. silvatica, С. zeylanoides і С. sorboxylosa (табл. 2). У чоти­

рьох з них - С. vini, С. zeylanoides, С. sorboxylosa і С. inconspicua -

виявлено також і аскоспороутворювання.Таблипя 2

Гібридизація типових штамів дріжджів роду Candida з тестерними штамами Pichia mernbranaefaciens

15

Вид Номерштаму

Наявність кон'югації при схрещуванні

CBS 5567 CBS 6668I. С. valida CBS 638 - +2. С. vini CBS 639 + -3. С. zeylanoides CBS 619 + -4. С. sorboxylosa CBS 6378 + -5. С. inconspicua CBS 180 - +6. С. insectalens CBS 6036 - +7. С. maris CBS 5151 - +8, С. beechii CBS 4261 + -9. С. diverse CBS 4074 - -10. С. silvatica CBS 6277 - +11. С. vinaria CBS 4077 - -12. С. silvae CBS 5498 - -13. С. rugopelliculosa CBS 6377 - -14. С. anatomiae CBS 5547 - -15. С. sorbophila CBS 6739 - -16. С. torresii CBS 5152 - -17. С. savonica CBS 6563 - -18. С. pinus CBS 970 - -19. С. cantarellii CBS 4878 - -20. С. castellii CBS 4332 - -21. С. schatavii CBS 6542 - -22. С. cacaoi CBS 2020 - -23. С. norvegensis CBS 1922 - -

Більш докладно були вивчені життєві цикли видів С. vini, С.

zeylanoides і С. inconspicua, тому що ми мали значну кількість штамів цих видів.

У результаті схрещування їх з тестерними штамами P. membra­

naefaciens протилежних типів спарювання виявлена добре видима кон'югація практично у всіх пар. Зрідка спостерігалося аскоспоро- утворення. Форма асків та аскоспор, спосіб їх утворення - ті ж, що

у С. valida і P. membranaefaciens. Музейні та свіжовиділєні штами не відрізнялися між собою у виявленні статевої активності. Спори гіб­

ридів С. Vini і P. membranaefaciens були не життєздатні. Життєздат­

ність інших гібридів не вивчали через дуже рідке спороутворення.

Треба відмітити, що кон'югація виявлена і при схрещуванні штамів С. zeylanoides з іншими дослідженими видами Candida. Сам

факт знаходження кон'югації та аскоспороутворення у С. zeylanoi­

des вартий уваги. Тип коензиму Q9 та склад клітинної стінки харак­

терні для базідіоміцетів. Однак забарвлення діазонієвим синім та не­

здатність до асиміляції інозиту свідчать про належність їх до аско-

мщетних дріжджів. Мабуть, критерії для відокремлення аско- і базі­діоміцетів недостатні.

У кількох видів (С. beechii, С. maris, С. silvatica и С. insectalens) виявлена тільки одна стадія статевого процесу - кон'югація. Це свід­

чить, що або нами не знайдені спеціфічні умови для спороутворен­

ня, або у цих штамів блоковані гени, відповідні за аскоспороутво­

рення. На підставі генетичної концепції роду (Наумов, 1980, 1986), всі види, у яких виявлена кон’югація, відносяться до довершених

дріжджів та входять до складу роду Pichia, але вони репродуктивно ізольовані і являють собою самостійні біологічні види.

Д\я отримання додаткової інформації про спорідненість дослід­жених видів було проведено генотипування типових та деяких

музейних штамів цих видів за допомогою ПЛР. Дослідження показа­ли, що більшість видів значно відрізняются за ПЛР-паттернами між

собою та від P. membranaefaciens. Вони являють собою окремі види. Часткова схожість ПЛР-паттернів спостерігалася у С. silvatica, С.

16

mans і С. sorboxylosa, що, можливо, свідчить про віддалену спорідне­ність цих видів. Типові пггами С. valida, С. zeylanoides і P. membra­naefaciens були практично ідентичні, що доводить іх спорідненість

(мал. 5). Невеликі відмінності у ПАР-паттернах, що спостерігалися

між штамами С. zeylanoides, мабуть, зв'язані з походженням штамів. ПАР-генотипування виявило гетерогенність видів С. Vini і С. іпсоп-

spicua. Цілком ймовірно, що ці види знаходяться у стані дивергенції.Типові штами видів С. valida, С. zeylanoides, С. vini, С. incon-

spicua, С. beechii, С. mans, С. insectalens і С. sorboxylosa ми переві­рили на гомологічність ампліфікованої ДНК за методом дот-гібриді-

зації цієї ДНК з 32P-міченим ампліфікатом типового штама P. mem­

branaefaciens CBS 107. За результатами досліджень типовий штам С.

valida має 98% загальної послідовності з типовим штамом Р, membra-

17

Мал. 5. ПЛР-генотипування деяких штамів С. zeylanoides (праймер 45). Штами дріжджів: I - P. membranaefaciens CBS 107; 2- С. valida CBS 638; 3-10- С. zeylanoides CBS 619, IMB 1000, 1915, 1638, 1662, 1708, 1736, 1771. M- див. мал. 3.

naefaciens, a С. zeylanoides - 89%. Така гомологія достатня для ствер­дження про спорідненість цих видів. Решта типових штамів мала 45-

66% загальної послідовності з типовим штамом CBS 107, що є недо­статнім для достовірної інтерпретації.

Таким чином, дріжджі С. valida, С. zeylanoides і P. membranae- faciens відносяться до одного біологічного виду P. mernbranaefaciens

Hansen. Фізіологічні властивості, за якими диференціюються ці ви­

ди, не є визначальними. Власне до виду P. mernbranaefaciens відно­

сяться всі штами С. valida, С. zeylanoides і штами P. membranaefa-

ciens, які не ростуть при 37°С.

Види С. vini, С. beechii, С. maiis, С. sorboxylosa, С. silvatica, С. inconspicua, С. insectalens також входять до складу роду Pichia1 але

вони є репродуктивно ізольованими.

Дослідження спорідненості видів Caudida utilis (Henneberg)

Lodder et Kreger-van Rij і Pirhia jadinii (A, et R. Sartorv. Weill etMeyer. Wickerham) Китіттпап

До іншої вивченої нами групи відносяться дріжджі С. utilis, які

традиційно використовуються у промисловості. На основі фено

типової схожості та гомології ДНК було припущено, що доверше­

ною формою С. utihs є дріжджі P. jadinii (Wickerham, 1970). За інши­

ми даними, що були одержані при спробі схрестити ауксотрофні

мутанти, С. utihs являє собою вид, відмінний від P. jadinii (Perez-

Bolanos and Herrera, 1981). Тому питання про належність указаних таксонів до одного біологічного виду залишалось відкритим.

Для вирішення цього питання ми провели вивчення життєвого

циклу дріжджів С. utihs на основі гібридизації прототрофних штамів і ауксотрофних мутантів. Проведені дослідження показали, що всі

штами С. utihs, ізольовані з виробничних джерел та одержані із за­рубіжних колекцій, не утворюють аскоспор на рутинних і спеціаль­

18

них середовищах. При схрещуванні штамів С. Utilis між собою нами виявлена одна із стадій статевого процесу - кон'югація, яку відміча­ли через 2-3 доби. Найбільш придатним для виявлення статевої ак­

тивності виявилося середовище з мальтозою. Аскоспороутворення

при схрещуванні обох типів спарювання не було знайдено. Всі штами розподілені на два типи спарювання (табл. 3).

Таблидя ЗТиші спарювання дріжджів С. utilis

19

№ штаму Джерело, місце, час виділення

ТипспарюванняmtA mtB

IMB 1597 (CBS 621) Hennebergl Німеччина, 1926 + -IMB 1598 (ВКМ 75) CBS (О. Verona, Італія) + -IMB 1599 (ВКМ 768) CBS, джерело невідоме + -IMB 1600 (ВКМ 769) CBS (інст. Пастера, Франція) + -IMB 1769, 1805, 1811 біохімзавод, г. Косари, Україна + -IMB 965 (ВСЕ 651) ВНДІсинтезбілок, Москва - +IMB 963 (ВКМ 1015) дріжд. завод, ВКМ, Москва - +IMB 962 (12-1) ВНДІГС, Москва - +IMB 964 (Л-35) УкрНДІСП - +IMB 961 (СХ-5) гідролізний завод - +IMB 995 кишечник карпу, басейн ТЭЦ,

Київ+

Для тдтверження гаплоїдної природи штамів С. utilis та їх

здатності схрещуватися, нами була проведена гібридизація ауксо-

трофних мутантів, одержаних за допомогою нітрозогуанідина.

Частота реверсій до прототрофності у виділених мутантів (1,5x10 5 -

2х10'7) дозволила використати їх для гібридизації методом перехрес­

ту на мінімальному середовищі. При схрещуванні тіамінзалежних

мутантів типового штаму CBS 621 (ІМВ 1597) і ауксотрофів штаму

965, дефіцитних по пантотеновій кислоті, нами були одержані гіб­ридні прототрофи досліджуваних мутантів. При подальшому розсіві гібридів на повному середовищі і реплікації колоній на мінімально­

му середовищі відщеплюються тіамінзалежні мутанти, а також мутанти з подвійною потребою - у тіаміні і панготеновій кислоті.

Ізольовані мутанти відзначаються високою частотою реверсій до прототрофності. Мабуть, це обумовлено їх диплоїдністю та наяв­

ністю у геномі гібридів фрагментів ДНК з обох штамів. Одержання ауксотрофних мутантів С. utilis, їх гібридизація та подальше роз­

щеплення гібридів свідчить про гаплоїдність та гетероталізм цих дріжджів.

У зв'язку з неможливістю одержати у С. utilis аскоспори і

віднайти повний життєвий цикл, нами був використаний метод УП-

ПЛР. Всі штами С. utilis і типовий диплоїдний штам P. Jadrnn (при­

пустимий довершений аналог С. utilis) показали практично ідентичні ПЛР-паттерни, які лише зрідка відрізняються за мінорними фраг­

ментами (мал. 6). Одержані результати однозначно свідчать про

належність всіх штамів С. utilis і виду P. jadinii до одного біологічно­го виду з єдиною структурою геному.

20

Мал, 6. ПЛР-генотипування штамів С. utilis (праймер 45). Штами дріжджів: I- Р, jadinii CBS 1600; 2-13- С. utilis C-BS 621, IMB 961, 962, 963, 964, 965, 995, 1598, 1599, 1600, 1769, 1806. M- див. мал. 3.

21

ВИСНОВКИ1. Показано, що недовершені дріжджі роду Candida домінують

у вивчених еконішах (на личинках й їм аго комарів, на ікрі, мальках та сеголітках лососю), є сапрофітами, та являють собою складову

частину нормальної мікрофлори цих об'єктів. Рід Candida представ лений видами С, famata, С. parapsilosis, С. valida, С. vini, С. inconspi­

cua, С. lipolytica, С. Iambica і С. zeylanoides.2. Залучення до досліджень колекційних та свіжовиділених

штамів, вивчення життєвих циклів дріжджів і застосування деяких молекулярно-біологічних методів дозволило переглянути класифіка­

цію кількох промислово важливих видів роду Candida. Вперше

виявлено статевий процес і встановлено спорідненість видів С.

valida, С. zeylanoides, С. vini, С. beechii, С. maris, С. silvatica, С. inconspicua, С. insectalens, С. sorboxylosa і С. utilis з аскоспоровими

довершеними дріжджами.3. Вперше виявлена статева стадія (кон'югація, аскоспороут-

ворення), визначені типи спарювання і фертильність гібридів у недо-

вершених дріжджів С. valida, що дозволило прямими експеримента­

ми підтвердити їх належність до аскоспорових довершених дріжджів

Pichia mernbranaefaciens Hansen.

4. Генотипування штамів С. valida, С. zeylanoides і P. membra- naefaciens за допомогою ПЛР та визначення ступеня гомологічності

послідовностей ДНК дозволило довести генетичну спорідненість більшої частини досліджених штамів. Показано, що всі штами С.

valida, С. zeylanoides та пггами P. mernbranaefaciens, які не ростуть при 37°С, відносяться до одного біологічного виду Pichia membranae-

faciens Hansen.5. Доведено, що види С. vini, С. inconspicua, С. beechii, С.

insectalens, С. maris, С. silvatica та С. sorboxylosa є репродуктивно

ізольованими і згідно генетичної концепції роду входять до складу роду Pichia Hansen.

6. У промислових недовершених дріжджів С. utihs вивчені життєві цикли та визначені типи спарювання. За допомогою ПЛР-

аналізу показано іх належність до аскоспорових довершених дріжд­жів Pichia jadinii (A et R. Sartory. WeiIl et Meyer, Wlckerham) Kurtzman.

Список робіт, опублікованих за матеріалами дисертації1. Игнатова EA , Нагорная С.С., Жарова В.П. Дрожжевая флора

кровососущих комаров// Микробиол. журн. - 1996. - 58, №2, - С. 12-15.

2. Нагорная С.С., Игнатова EA , Жарова В.П. Половой процесс у

несовершенных дрожжей Candida valida (Leberle) van Uden et Buckley// Микробиол. журн. - 1990. - 52, №5. - С. 26-30.

3. Нагорная С.С., Игнатова EA , Жарова В.П. Гетероталлизм и

половая стадия у несовершенных дрожжей Candida vini (Dez-

mazieres ex Lodder) van Uden et et Buckley// Микробиол. журн.

- 1991.-53, №5. - С. 30-33.4. Нагорная С.С., Игнатова EA , Исаева Н.М., Давыдов О.М.,

Подгорский В,С. Дрожжи, контаминирующие икру лосося//

Микробиол. журн. - 1996. - 58, №2. - С. 8-12.

5. Игнатова EA , Нагорная С.С., Суденко В.И., Жарова В.П.

Таксономическое положение несовершенных дрожжей Candida

u tihs// Микробиол. журн. - 1994. - 56, №4 - С. 62.6. Нагорная С.С., Игнатова EA , Жарова В.П. Конъюгация и

аскоспорообразование у несовершенных дрожжей Candida valida (Leberle) van Uden et Buckley// Хемотаксономическое

изучение споровых растений и грибов. Достижения и перспек­тивы развития: Тез. докл. I Всес. совещ. Киев, 1990 - С. 160-161.

22

7. Нагорная С.С., Исаева Н.М., Игнатова E A Изучение патоген­ной и условно-патогенной микрофлоры икры лосося// Тез. докл., IX Всесоюз. совещ. по паразитам и болезням рыб/

Петрозаводск, 1991. - С. 92-93.8. Nagornaya S.S., Kotlyar AN., Petrenko О.Р., Ignatova Н.А Yeasts

in collection of microorganisms in Institute of Microbiology and

Virology of Ukraine Academy of Science// Abstracts of VI-th

Intern. Congress of Culture Collection, Washington, 1988. - P. 69.

АННОТАЦИЯИгнатова Е.А Таксономическое изучение некоторых промыш­

ленно важных вилов лрожжей рола Candida Berkhout.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологи­ческих наук по специальности 03.00.07 - микробиология. Институт

микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины, Киев, 1997.

Защищается работа, содержащая результаты таксономического

изучения коллекционных и свежевыделенных штаммов промышлен­

но важных видов Candida utilis и С. valida, а также видов, близких

им по фенотипическим свойствам. На основе сравнительного анали­

за фенотипических свойств, скрещивания прототрофных и ауксо- трофных штаммов и нового метода УП-ПЦР (полимеразной цепной

реакции с универсальными праймерами) показана принадлежность

дрожжей С. vahda и С. zeylanoides к аскоспоровому совершенному

виду Picbia membranaefaciens Hansen; установлено, что дрожжи С.

utihs и P. jadinii представляют собой один биологический вид Pichia

jadinii (A et R. Sartory. Weill et Meyer, Wickerham) Kurtzman; дрож­жи С. vini, С. inconspicua, С. beechii, С. insectalens, С. maris, С.

silvatica и С. sorboxylosa реклассифицированы в род Pichia Hansen.

23

24

SUMMARY

Ignatova H.A, Taxonomic Study of_.Some Cmdida Berkbout Yeast

Species of Industrial Importance.A thesis presented for a Master's degree in biological sciences,

speciality 03,00.07 - microbiology. The Zabolotny Institute of Microbio­logy and Virology, NAS of Ukraine, 1997.

Subject for defending is the thesis to present results of the

taxonomic studies accomplished using strains from both fresh isolates

and the Collection, of Candida utihs and C. valida of industrial importance, and other species with similar phenotypic features.

Based on the comparative analyses of the phenotypic features, on

crossing the prototrophic and auxotrophic mutants, and on the new

PCR technique (polymerase chain reaction with universal primers), the following is demonstrated: the C. valida and C. zeylanoides yeasts are

to be classified within the perfect species of Pichia mernbranaefaciens Hansen; the C. utihs and P. jadinii yeasts should be considered the

same biological species Pichia jadinii (A et R. Sartory. Weill et Meyer, Wickerham) Kurtzman; the C. vini, C. inconspicua, C. beechii, C.

insectalens, C. maris, C. silvatica and C. sorboxylosa yeasts are to be

reclassified within the Pichia Hansen genus.

Ключові слова: дріжджі, кон'югація, аскоспори, гібридизація,

ауксотрофи мутанти, полімеразна ланцюгова реакція, ПЛР-

паттерни, гетероталізм, тип спарювання.

Підписано до друку 11.02.97р. Формат 60x84/16. Ум. друк. арк. 1,0. Обл.-вид. арк. 1,0.Наклад 100. Зам. 38.

Відділ оперативної поліграфії Центру Міжнародної освіти

227-41-23, 227-12-75, 227-37-86

Ab 37.022