nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học hai loài sao biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGUYỄN ANH HƯNG

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH

HỌC HAI LOÀI SAO BIỂN ANTHENEA SIBOGAE

VÀ ANTHENEA ASPERA CỦA VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGUYỄN ANH HƯNG

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH

HỌC HAI LOÀI SAO BIỂN ANTHENEA SIBOGAE

VÀ ANTHENEA ASPERA CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Mã số: 9.44.01.17

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS. Trần Thị Thu Thủy

2. TSKH. Alla Anatolievna Kicha

HÀ NỘI - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trần Thị Thu Thủy và TSKH. Alla Anatolievna

Kicha. Các kết quả trong Luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ

công trình khoa học nào khác.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Anh Hưng

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên –

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả

đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quí báu của các thầy cô, những nhà khoa học trong và

ngoài nước cũng như các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc nhất tới hai cô hướng dẫn là

PGS.TS. Trần Thị Thu Thủy (Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và TSKH. Alla Anatolievna Kicha (Viện Hóa

sinh Hữu cơ Thái Bình Dương,Viện Hàn lâm Khoa học liên bang Nga). Nhờ sự hướng

dẫn tận tình, sự định hướng nghiên cứu một cách khoa học, cũng như việc tạo mọi

điều kiện thuận lợi nhất của các cô trong quá trình thực thiện luận án, tôi đã tiếp thu

được nhiều kiến thức mới trong lĩnh vực nghiên cứu và hoàn thành tốt các mục tiêu

đề ra trong luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ,

Ban lãnh đạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2

đã tạo điều kiện tốt nhất và những góp ý quý báu trong thời gian làm nghiên cứu sinh.

Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. Phạm Quốc Long cùng các anh, chị phòng

Hóa Sinh Hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và các bạn đồng nghiệp

Khoa Hóa học trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2 đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều

kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Luận án được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ đề tài hợp tác song phương

Việt Nam - Ấn Độ 2012-2013 do PGS.TS. Đoàn Lan Phương làm chủ nhiệm đề tài.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,

bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình

làm nghiên cứu sinh.

Tác giả luận án

Nguyễn Anh Hưng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... iv

MỤC LỤC .............................................................................................................. v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................... viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................... xi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ............................................................................. xii

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .................................................................................. 2

1. 1. Giới thiệu về sao biển ...................................................................................... 2

1.1.1. Cấu tạo của sao biển và phân bố ................................................................... 2

1.1.2. Các loài sao biển ở Việt Nam ......................................................................... 4

1.1.3. Họ sao biển Oreasteridae .............................................................................. 5

1.2. Thành phần hóa học họ sao biển Oreasteridae ................................................... 5

1.2.1. Steroid ........................................................................................................... 6

1.2.2. Các dẫn xuất ceramide ................................................................................ 21

1.3. Hoạt tính sinh học của sao biển ....................................................................... 27

1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào .............................................................................. 27

1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm .............................................................. 31

1.3.3. Hoạt tính tán huyết ...................................................................................... 31

1.3.4. Hoạt tính neuritogenesis (tạo tế bào thần kinh hình sợi) .............................. 32

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 33

2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 33

2.1.1. Sao biển Anthenea sibogae .......................................................................... 33

2.1.2. Sao biển Anthenea aspera ............................................................................ 34

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 35

2.2.1. Phương pháp phân lập các chất ................................................................... 35

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc ................................................................... 35

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học .................................................... 37

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .......................................................................... 40

3.1. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ sao biển Anthenea sibogae ..................... 40

3.1.1. Xử lý mẫu sao biển A. sibogae ..................................................................... 40

3.1.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất phân lập được từ loài sao biển

Anthenea sibogae .................................................................................................. 42

3.2. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ sao biển Anthenea aspera ....................... 44

3.2.1. Xử lý mẫu sao biển Anthenea aspera ........................................................... 45


Anthenea aspera .................................................................................................... 47

CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 49

4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất từ loài sao biển Anthenea sibogae .................. 49

4.1.1. Hợp chất ASB1: cholesterol ......................................................................... 51

4.1.2. Hợp chất ASB2: Thymine ............................................................................. 56

4.1.3. Hợp chất ASB3: L-Tyrosine ......................................................................... 59

4.1.4. Hợp chất ASB4: L-Tryptophan..................................................................... 60

4.1.5. Hợp chất ASB5: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(3-

O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,

7,16-tetraol (anthenoside S1, hợp chất mới)...................................................... 62

4.1.6. Hợp chất ASB6: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(4-

O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,

7,16-tetraol (anthenoside S2, chất mới) ............................................................ 72

4.1.7. Hợp chất (20R)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-methyl-

-D-glucopyranosyl)-5-cholesta-8(14),24-diene-3,6,7,16-tetraol

(anthenoside S3) .................................................................................................... 78


-D-glucopyranosyl)-24-methyl-5-cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,7,16-

tetraol (anthenoside S4) ......................................................................................... 83

4.1.9. Hợp chất (20R,20E)-16-O-(3-O-methyl--D-galactofuranosyl)-5-cholesta-

8(14),22,23-diene-3,6,7,16-tetraol (anthenoside S5, hợp chất mới). ............. 89

4.1.10. Hợp chất ASB10: (20R)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(-D-

galactofuranosyl)-24-methyl-5-cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,7,16-tetraol

(anthenoside S6, hợp chất mới) ............................................................................. 95

4.1.11. Hỗn hợp (ASB11) của anthenoside J ((20R,24R)-7-O-(6-O-methyl-β-D-

galactofuranosyl)-16-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-24-ethyl-5α-cholest-

8(14)-ene-3α,6β,7β, 16α-tetraol) và anthenoside K ((20R,24S)-7-O-(6-O-methyl-β-

D-galactofuranosyl)-16-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-24-ethyl-5α-cholest-

8(14)-ene-3α,6β,7β,16α-tetraol. ........................................................................... 103

4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất từ loài sao biển Anthenea aspera .................. 107

4.2.1. Hợp chất AA1: cholesterol ......................................................................... 109

4.2.2. Hợp chất AA2: Lathosterol (Cholest-7,8-ene-3-ol) .................................. 109

4.2.3. Hợp chất AA3: cholest-4-ene-3,6-diol ................................................... 115

4.2.4. Hợp chất AA4: cholestane 3,5,6,15,16,26-hexol ............................. 118

4.2.5. Hợp chất AA5: cyclo(L-glycine-L-proline) (Hợp chất lần đầu tiên phân lập từ

chi Anthenea ) ..................................................................................................... 123

4.2.6. Hợp chất AA6: L-glycine-L-prolin (Hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi

Anthenea) ............................................................................................................ 128

4.2.7. Hợp chất AA7: cyclo(L-alanyl-4-hydroxyl-L-prolyl) (Hợp chất lần đầu phân

lập từ chi Anthenea) ............................................................................................ 130

4.2.8. Hợp chất AA8: L-Phenylalanine ................................................................ 134

4.2.9. Hợp chất AA9: tyramine ........................................................................... 138

4.2.10. Hợp chất AA10: thymine .......................................................................... 140

4.2.11. Hợp chất AA11: uracil ............................................................................. 141

4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của một số chất mới phân lập từ sao biển A. sibogae

............................................................................................................................ 142

4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ............................................................................ 143

4.3.2. Hoạt tính chống tăng sinh tế bào ............................................................... 143

4.3.3 Khảo sát hoạt tính ức chế sự hình thành khối tế bào ung thư trên thạch mềm

............................................................................................................................ 144

CHƯƠNG V - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 146

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ .............. 146

PHỤ LỤC ........................................................................................................... 157

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

Các phương pháp sắc ký

CC Column Chromatography Sắc kí cột

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

13C-NMR Carbon 13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Cacbon 13

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng

SiO2 Silica gel

Các phương pháp phổ

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton 13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân carbon 13

COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương tác proton

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer

Phổ DEPT

ESI-MS Electron Spray Ionization Mass

Spectrometry

Phổ khối lượng ion hóa phun

mù điện tử

GC-MS Gas chromatography - Mass

spectrometry

Sắc ký khí ghép nối khối phổ

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Correlation

Phổ tương tác dị hạt nhân

qua nhiều liên kết

HR-ESI-MS High Resolution – Electron Spray

Ionization - Mass Spectrometry

Phổ khối phân giải cao ion

hóa phun mù điện tử

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân

qua 1 liên kết

IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại

ROESY Rotating frame Overhauser effect

spectroscopy

Phổ ROESY

J (Hz) Hằng số tương tác tính

bằng Hz

δ(ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học

tính bằng phần triệu

Các dòng tế bào

RPMI-1640

Human malignant melanoma cell

line

Dòng tế bào u sắc tố ác tính

ở người

T-47D

Human breast cancer cell line Dòng tế bào ung thư vú ở

người

Các hóa chất

CHCl3 Chloroform Cloroform

CH2Cl2

(DCM)

Dichloromethane Diclometan

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxit

EtOH Ethanol Cồn

EtOAc Ethyl acetate Etyl axetat

MeOH Methanol Ancol metylic

TMS Tetramethylsilane Tetramethylsilane

Các ký hiệu viết tắt khác

EC50 Effective concentration 50% Nồng độ có hiệu quả 50%

ED50 Effective dose 50% Liều để vật thí nghiệm hiệu

quả ở 50%

FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bê

FFA Free fatty acid Acid béo tự do

M.p. Melting point Điểm chảy

MTS [3-(4,5-dimetylthiazon-2-yl)5-(3-

carboxymetoxyphenyl)-2-(4-

sulfophenyl)-2H-tetrazolium]

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% đối

tượng thử nghiệm

[α]D Độ quay cực riêng

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 154-157 trên một số dòng tế

bào ung thư ở người (giá trị ED50 (g/mL) ............................................................ 28

Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của ASB1 và hợp chất tham khảo .............................. 55








Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của ASB9 và hợp chất tham khảo............................. 94

Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR của ASB10 và hợp chất tham khảo......................... 101

Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR của hỗn hợp ASB11 ............................................... 106

Bảng 4.13. Bảng tổng hợp các chất phân lập được từ sao biển Anthenea aspera . 108

Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của AA2 và hợp chất tham khảo ............................. 114







Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất AA9 và hợp chất tham khảo .............. 140

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1. Cấu tạo của sao biển (nguồn: inforvisual.info) ......................................... 3

Hình 1.2. Các dạng cấu trúc sterol chính từ sao biển (S: mạch nhánh) ..................... 6

Hình 1.3. Các glycone chính của các hợp chất glycoside trong sao biển .................. 8

Hình 1.4. Các nhóm polyhydroxysteroid glycoside (S: mạch nhánh, G: phần đường)

................................................................................................................................ 9

Hình 1.5. Các nhóm cấu trúc của các hợp chất 3β-OH steroid có trong sao biển ...... 9

Hình 1.6. Các nhóm cấu trúc của hợp chất 3β-O-glycosylsteroid B2 ..................... 12

Hình 1.7. Cấu trúc của các dẫn xuất ceramide........................................................ 22

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của Neu5Ac, Neu5Gc và GalNAc ............................... 26

Hình 1.9. Cấu trúc của GM1-GM3 ........................................................................ 26

Hình 2.1. Ảnh mẫu sao biển Anthenea sibogae ...................................................... 34

Hình 2.2. Ảnh mẫu sao biển Anthenea aspera ....................................................... 35

Hình 3.1. Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu sao biển A. sibogae ........... 41

Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB1 ....................................................... 51

Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB1 ...................................................... 52

Hình 4.1.3. Phổ DEPT của hợp chất ASB1 ............................................................ 52

Hình 4.1.4. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất ASB1 ................................................. 53

Hình 4.1.5. Phổ HSQC của hợp chất ASB1 ........................................................... 53

Hình 4.1.6. Phổ HMBC của hợp chất ASB1 .......................................................... 54

Hình 4.1.7. Các tương tác chìa khóa trên phổ COSY và HMBC của ASB1 ........... 54

Hình 4.1.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB1 .................................................. 55

Hình 4.1.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB2 ....................................................... 56

Hình 4.1.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB2 .................................................... 57

Hình 4.1.11. Phổ HSQC của hợp chất ASB2 ......................................................... 57

Hình 4.1.12. Phổ HMBC của hợp chất ASB2 ........................................................ 58

Hình 4.1.13. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC của hợp chất ASB2 ................ 58

Hình 4.1.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB3 ..................................................... 59

Hình 4.1.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB3 ................................................... 59

Hình 4.1.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB3 ................................................ 60


Hinh 4.1.18. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB4 .................................................... 61

Hình 4.1.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB4 ................................................ 62

Hình 4.1.20. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB5............................................ 63


Hình 4.1.22. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB5. ................................................... 64

Hình 4.1.23. Phổ COSY của hợp chất ASB5. ........................................................ 66



Hình 4.1.26. Phổ ROESY của hợp chất ASB5 ....................................................... 68

Hình 4.1.27. Các tương tác COSY, HMBC và ROESY chìa khóa của hợp chất ASB5

.............................................................................................................................. 69

Hình 4.1.28. Phổ 1D TOCSY của hai đơn vị đường............................................... 69

Hình 4.1.29. Cấu trúc hóa học của ASB5 và anthenoside R ................................... 72




Hình 4.1.33. Phổ COSY của hợp chất ASB6 ......................................................... 74




Hình 4.1.37. Các tương tác HMBC, COSY và ROESY chìa khóa của hợp chất ASB6

.............................................................................................................................. 76




Hình 4.1.41.Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB7 và hợp chất tham khảo ASB5 ... 81

Hình 4.1.42. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất ASB8 ................................................ 83







Hình 4.1.49. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chìa khóa của hợp chất ASB8

.............................................................................................................................. 87

Hình 4.1.50. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB8 và hợp chất tham khảo ASB5 .. 87








Hình 4.1.58. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất ASB9 94

Hình 4.1.59. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB9 và anthenoside M .................... 94

Hình 4.1.60. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB10.......................................... 96

Hình 4.1.61. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB10.................................................... 97

Hình 4.1.62. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB10 .................................................. 98

Hình 4.1.63. Phổ COSY của hợp chất ASB10 ....................................................... 98

Hình 4.1.64. Phổ HSQC của hợp chất ASB10 ....................................................... 99

Hình 4.1.65. Phổ HMBC của hợp chất ASB10 ...................................................... 99

Hình 4.1.66.Phổ ROESY của hợp chất ASB10 .................................................... 100

Hình 4.1.67. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY của hợp chất ASB10 ...... 100

Hình 4.1.68. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB10 và hợp chất anthenoside S ... 101

Hình 4.1.69. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB11.................................................. 104

Hình 4.1.70. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB11 ................................................ 104

Hình 4.1.71. Phổ HSQC của hợp chất ASB11 ..................................................... 105

Hình 4.1.72. Phổ HMBC của hợp chất ASB11 .................................................... 105

Hình 4.1.73. Cấu trúc hóa học của AS11 ............................................................. 106

Hình 4.2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA2 ....................................................... 110

Hình 4.2.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA2 ...................................................... 110

Hình 4.2.3. Phổ DEPT của hợp chất AA2 ............................................................ 111

Hình 4.2.4. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất AA2 ................................................. 111

Hình 4.2.5. Phổ HSQC của hợp chất AA2 ........................................................... 112

Hình 4.2.6. Phổ HMBC của hợp chất AA2 .......................................................... 112

Hình 4.2.7. Các tương tác chìa khóa trên phổ COSY và HMBC của AA2 ........... 113

Hình 4.2.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA2 .................................................. 113

Hình 4.2.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA3 ....................................................... 115

Hình 4.2.10. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất AA3 ..................................... 116

Hình 4.2.11. Phổ HMBC của hợp chất AA3 ........................................................ 116

Hình 4.2.12. Các tương tác HMBC chìa khóa của hợp chất AA3 ......................... 117

Hình 4.2.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA3 ................................................ 117

Hình 4.2.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA4 ..................................................... 119


Hình 4.2.16. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất AA4 ............................................... 120

Hình 4.2.17. Phổ HSQC của hợp chất AA4 ......................................................... 120


Hình 4.2.19. Tương tác COSY và HMBC chìa khóa của hợp chất AA4............... 121

Hình 4.2.20. Phổ NOESY của hợp chất AA4 ....................................................... 122


Hình 4.2.22. Phổ 1H-NMR của AA5 .................................................................... 124


Hình 4.2.24. Phổ COSY của hợp chất AA5 ......................................................... 125



Hình 4.2.27. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA5 và L-Gly-L-Pro (AA6) ............ 128

Hinh 4.2.29. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA6 .................................................... 129

Hình 4.2.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất L-Gly-L-Pro ................................... 129








Hình 4.2.39. Phổ C-NMR của hợp chất AA8 ....................................................... 135




Hình 4.2.43. Tương tác COSY và HMBC chìa khóa của hợp chất AA8............... 137


Hình 4.2.45. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA9 .................................................... 139


Hình 4.2.48. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA10 .............................................. 141

Hình 4.2.49. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA11 ................................................... 141

Hình 4.2.50. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA11 .................................................. 142

Hình 4.2.51. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA11 .............................................. 142

Hình 4.3.2. Hiệu quả ức chế sự phát triển tế bào ung thư vú T-47D của các chất ASB5,

ASB6, ASB8 và hỗn hợp ASB11 so sánh với mẫu chứng .................................... 144

1 MỞ ĐẦU

Việt Nam được thiên nhiên ưu đãi với hơn 1 triệu km2 vùng biển, có khí hậu

nhiệt đới gió mùa, mật độ cửa sông dày đặc là những điều kiện lý tưởng cho hệ sinh

vật biển đa dạng về chủng loại và giàu về trữ lượng. Ngay từ những năm 1970 đã có

một vài công trình nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển. Tuy

nhiên, so với nguồn tiềm năng sinh vật biển ở nước ta thì đến nay những công trình

nghiên cứu trong nước vẫn quá ít và tản mát, đặc biệt là những nghiên cứu về ngành

Da gai.

Sao biển là loài động vật không xương sống, thuộc ngành Da gai, đã từ lâu

được biết đến như một loại thực phẩm bổ dưỡng. Theo thống kê, hiện nay, trên thế

giới có khoảng 1800 loài sao biển khác nhau. Tuy nhiên, mới chỉ có khoảng 80 loài

được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Trong đó họ

Oreasteridae gồm có 20 chi : Acheronaster, Anthaster, Anthenea, Astrosarkus,

Bothriaster, Choriaster, Culcita, Goniodiscaster…. Hiện nay trên thế giới chỉ có 9

loài thuộc họ Oreasterdae được nghiên cứu trong đó có 2 loài đã được nghiên cứu ở

Việt Nam đó là Anthenea chinensis và Culcita novaeguineae. Kết quả của những

nghiên cứu đó cho thấy rằng, những chất được phân lập từ sao biển họ Oreasteridae

có khả năng kháng viêm, giảm đau, giảm huyết áp, gây độc tế bào, kháng khuẩn,

kháng nấm và kháng một số dòng tế bào ung thư.

Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của chi Anthenea đăng trên tạp chí quốc tế uy tín còn chưa nhiều. Chính vì thế nhiệm

vụ luận án này tập trung nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc của các hợp chất phân

lập được và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ một số loài

sao biển chi Anthenea ở vùng biển Việt Nam. Đối tượng được tập trung nghiên cứu

là loài sao biển Anthenea sibogae và sao biển Anthenea aspera. Xuất phát từ điểm

đó, đề tài “Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học hai loài sao biển Anthenea

sibogae và Anthenea aspera của Việt Nam” được thực hiện với những nội dung

chính như sau:

Phân lập các hợp chất từ hai loài sao biển Anthenea aspera và Anthenea

sibogae thu thập từ vùng biển Việt Nam.

Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.

Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của một số chất phân lập được.

2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN

1. 1. Giới thiệu về sao biển

1.1.1. Cấu tạo của sao biển và phân bố

Sao biển là động vật không xương sống thuộc lớp Asteroidea, ngành Da gai

(Echinodermata). Có khoảng 1800 loài sao biển sống ở tất cả các đại dương trên thế

giới từ vùng biển nhiệt đới đến vùng biển lạnh, từ bãi triều đến đáy biển sâu. Là một

động vật biển thuần túy, thế nên không có loài sao biển nào sống trong môi trường

nước ngọt và chỉ một số ít sống trong môi trường nước lợ. Tên gọi “sao biển” bắt

nguồn từ hình dạng có 5 cánh của đa số các loài, tuy nhiên cũng có những loài có đến

10, 20 thậm chí 40 cánh [1]. Đặc biệt, sao biển Labidiaster annulatus sống ở Nam

Cực có tới hơn 50 cánh [2].

Sao biển được bao phủ bên ngoài bởi một lớp da gai, bên trong là khung xương

rất cứng giúp bảo vệ chúng khỏi những kẻ săn mồi. Cơ thể sao biển thường có một

đĩa trung tâm và năm cánh, một số ít loài có số lượng cánh tay lớn hơn. Bề mặt phía

trên có thể mịn, dạng hạt hoặc gai, và được phủ bằng các tấm chồng lên nhau. Nhiều

loài có màu sắc rực rỡ với các sắc thái khác nhau của màu đỏ hoặc cam, trong khi có

những loài có màu xanh lam, xám hoặc nâu, có tác dụng ngụy trang hoặc đe dọa kẻ

thù. Sao biển có chân ống được vận hành bởi một hệ thống thủy lực và một miệng ở

trung tâm của bề mặt dưới. Sao biển không có đầu và việc di chuyển được thực hiện

bởi hệ thống chân ống nằm phía dưới mỗi cánh tay. Tốc độ di chuyển rất chậm,

khoảng 5-10 cm/phút.

Thức ăn của chúng đa số là các động vật không xương sống, cá nhỏ ở tầng

đáy, rong biển và cả san hô. Phần lớn sao biển đều có khả năng đặc biệt đó là tiêu hóa

con mồi bên ngoài cơ thể. Chúng sử dụng những ống chân nhỏ xíu để mở vỏ trai hoặc

hàu rồi sau đó đẩy dạ dày ra khỏi miệng và luồn vào bên trong con mồi. Tiếp đó

chúng sẽ tóm lấy và tiêu hóa con mồi, và cuối cùng thu dạ dày trở lại cơ thể. Sao biển

có vòng đời phức tạp và có thể sinh sản cả hữu tính và vô tính. Hầu hết sao biển có

khả năng tái tạo các bộ phận bị hư hỏng hoặc cánh tay bị mất, đặc biệt có một số loài

có thể tái tạo lại toàn bộ cơ thể từ một phần cánh tay bị đứt lìa.

3

Hình 1.1. Cấu tạo của sao biển (nguồn: inforvisual.info)

Lớp Asteroidea đóng vai trò sinh thái quan trọng trong hệ sinh vật biển. Sao

biển màu nâu đất Pisaster ochraceus và sao biển rạn san hô Stichaster australis, đã

được biết đến rộng rãi như là các loài chìa khóa (keystone species) trong hệ sinh thái.

Loài sao biển gai Acanthaster planci là loài tiêu diệt san hô ở khắp vùng Ấn Độ -

Thái Bình Dương và bắc Thái Bình Dương và được coi là một trong 100 loài xâm lấn

tồi tệ nhất thế giới.

Sao biển sản xuất một số lượng lớn các hợp chất thứ cấp ở dạng lipit, bao gồm

các dẫn xuất steroid của cholesterol và amit axit béo của sphingosine. Các steroid chủ

yếu ở dạng saponin, được gọi là asterosaponin, và các dẫn xuất sunfat hóa của chúng.

Các chất này khác nhau tùy theo loài và có thể có đến tối đa sáu phân tử đường

(thường là glucose và galactose). Ngoài ra, một số lượng nhỏ các alkaloid cũng đã

được tìm thấy trong sao biển. Chức năng của các hợp chất này trong sao biển chưa

được nghiên cứu đầy đủ nhưng hầu hết có vai trò trong phòng thủ và liên lạc. Một số

chất được sử dụng bởi sao biển để ngăn chặn những kẻ săn mồi. Các chất chống đông

máu và các peesellariae dạng chân kìm rất nhỏ có tác dụng ngăn chặn các sinh vật

khác định cư trên bề mặt trên của sao biển. Nghiên cứu về tác dụng của các hợp chất

này để sử dụng trong ngành y dược hoặc công nghiệp đang được tiến hành trên toàn

thế giới [3].

Lớp sao biển Asteroidea được chia thành 7 bộ [4]:

- Bộ Brisingida: có 18 chi thuộc 2 họ với khoảng 100 loài, chủ yếu sống dưới

đáy biển sâu, cánh tay mỏng, chiều dài từ 6-16 cm.

- Bộ Forcipulatida: có 68 chi thuộc 6 họ với khoảng 300 loài, có đặc điểm đặc

trưng là cánh tay dạng kìm nhỏ.

4 - Bộ Notomyotida: có 12 chi thuộc 1 họ với khoảng 75 loài, là các loài sao

biển sống dưới biển sâu với cánh tay rất linh hoạt và các sợi cơ dài dọc theo bề mặt

hông bên trong cơ thể.

- Bộ Paxillosida: có 46 chi thuộc 6 họ với khoảng 255 loài, nét đặc trưng là có

cánh tay nhọn và có thể vùi cơ thể dưới các lớp bùn cát.

- Bộ Spinulosida: có 7 chi thuộc 2 họ với khoảng 120 loài. Là các sao biển với

bộ khung tương đối mảnh và chân dạng kìm nhỏ.

- Bộ Valvatida: có 172 chi thuộc 17 họ với khoảng 695 loài. Cấu tạo khá đa

dạng và thường có đặc điểm chung là xương mép nhỏ, 5 cánh với chân ống.

- Bộ Velatida: có 25 chi thuộc 5 họ với khoảng 203 loài. Các loài sao biển

thuộc bộ này thường có thân mỏng với vòng tròn trung tâm lớn và những chỗ lõm với

đường kính lớn.

1.1.2. Các loài sao biển ở Việt Nam

Các nghiên cứu về khu hệ động vật đáy vùng biển Đông trước năm 2003 chỉ

ra có khoảng 56 loài sao biển được ghi nhận ở vùng biển Việt Nam [6]. Báo cáo gần

đây của nhóm các nhà khoa học Nga (Antokhina và cs.) đưa ra danh mục gồm 79 loài

sao biển tìm thấy ở vùng biển Việt Nam [7]. Tuy nhiên số liệu trên còn khá khiêm

tốn so với 236 loài được phát hiện ở vùng biển Đông [8,9]. Do đó cần thiết phải có

thêm các nghiên cứu về đa dạng loài sao biển tại Việt Nam.

Các loài sao biển phân bố dọc bờ biển từ bắc vào nam và ở các độ sâu khác

nhau. Hai vùng biển chứa số lượng sao biển đa dạng và phong phú nhất là vịnh Nha

Trang và Vạn Bội – Cát Bà. Riêng ở vịnh Nha Trang, các nhà khoa học đã phát hiện

được khoảng 20 loài sao biển thuộc 16 chi, 11 họ và 4 bộ khác nhau.

Phần lớn các loài sao biển tìm thấy ở Việt Nam thuộc các bộ và họ sau:

- Bộ Spinulosida: họ Echinasteridae

- Bộ Valvatida: họ Oreasteridae, Ophidiasteridae, Archasteridae.

- Bộ Paxillosida: họ Astropectinidae

- Bộ Forcipulatida: họ Asteridae

Một số loài thường được sử dụng làm thực phẩm, ngâm rượu, làm thuốc hoặc

làm đồ mỹ nghệ. Theo y học cổ truyền phương Đông, sao biển là một vị thuốc có tác

dụng tăng cường miễn dịch, chống ung thư, bổ dương và kháng viêm.

5 1.1.3. Họ sao biển Oreasteridae

Họ Oreasteridae thuộc bộ Valvatida, bao gồm các loài sao biển thường có 5

cánh tay bao quanh phần trung tâm cứng, lồi và có màu sắc sặc sỡ. Chúng được chia

thành 20 chi [5]: Acheronaster, Anthaster, Anthenea, Astrosarkus, Bothriaster ,

Choriaster, Culcita, Goniodiscaster, Gymnanthenea, Halityle, Monachaster,

Nectriaster, Nidorellia, Oreaster, Pentaceraster, Pentaster, Poraster, Protoreaster,

Pseudanthenea và Pseudoreaster.

Trong số đó, chi Anthenea có khoảng 31 loài, phân bố ở tất cả các đại dương,

nhất là ở vùng biển Australia, Đông Thái Bình Dương, Bắc Mỹ và vùng biển nhiệt

đới Ấn độ - Thái Bình Dương.

1.2. Thành phần hóa học họ sao biển Oreasteridae

Các nghiên cứu hóa học về các loài sao biển trên thế giới đã chỉ ra hai nhóm

chất quan trọng nhất có trong sao biển có thể đem lại hoạt tính sinh học đó là các

steroid phân cực (polyhydroxysteroid, steroid glycoside, steroid sulfate) và

glycosphingolipid (ceramide, cerebroside, ganglioside). Các công trình về

glycosphingolipid chủ yếu được công bố bởi các nhà khoa học Nhật Bản. Lớp chất

steroid phân cực từ sao biển thu hút được sự quan tâm đáng kể với hàng trăm công

bố, trong số đó nhiều nhất là của nhóm nghiên cứu của GS. VS. Stonik và TSKH.

Kicha tại Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương tại Vladivostok (PIBOC). Một số

lượng lớn chất mới được phân lập và xác định cấu trúc, trong đó nhiều chất có hoạt

tính sinh học đáng chú ý, đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào trên nhiều dòng tế bào

ung thư ở người. Các hợp chất này có cấu trúc đa dạng, phân biệt bởi số lượng và vị

trí các nhóm hydroxyl và sulfate, vị trí và số lượng của nối đôi trên khung steroid,

cấu trúc mạch nhánh, cấu trúc và số lượng các phân tử đường đính kèm…

Ngoài ra trong sao biển còn có mặt một số lớp chất khác như: dẫn xuất

mycosporin, tetrodotoxin, alkaloid, isoquinoline alcaloid, glycolipid, icosanoid, dẫn

xuất taurine, dipeptide dimer, anthraquinone, xanthosine, dẫn xuất pyrrole và

triterpene.

Hiện tại có khoảng 100 loài sao biển trên thế giới đã được nghiên cứu ở các

mức độ khác nhau với hơn 650 hợp chất steroid (trong đó 400 chất glycoside) và hơn

100 hợp chất chứa ceramide được phân lập. Riêng họ sao biển Oreasteridae mới chỉ

có 9 loài được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Chi Anthenea

6 trước đây mới chỉ có hai loài được nghiên cứu là Anthenea chinensis và Anthenea

aspera.

1.2.1. Steroid

Các hợp chất steroid là các chất chuyển hóa thứ cấp chủ yếu có trong sao biển,

bao gồm các polyhydroxysteroid, steroid glycoside và asterosaponin. Các hợp chất

này có thể ở dạng tự do hoặc dưới dạng muối sulfate.

1.2.1.1. Polyhydroxysteroid

Mặc dù các hợp chất polyhydroxysteroid có thể tìm thấy ở nhiều loại sinh vật

biển khác nhau nhưng trong sao biển, chúng là lớp chất phổ biến nhất với cấu trúc đa

dạng và thường xuyên ở dạng hỗn hợp. Phần lớn các hợp chất này có khung 3β, 6α

(hoặc β),8,15α (hoặc β),16β-pentahydroxycholestane, một số có gắn thêm nhóm OH

ở vị trí 4β, 5α, 7α (hoặc β) hoặc 14α. Chuỗi mạch nhánh thường có cấu hình (25S)-

26-hydroxy. Đôi khi có chuỗi mạch nhánh với với nhóm OH-24 với cấu hình (S). Có

một số ít trường hợp mạch nhánh có nhóm axit ở vị trí 26 dưới dạng amide của taurine.

Polyhydroxysteroid thường xuất hiện dưới dạng muối sulfate, và rất hiếm khi được

tìm thấy ở dạng muối phosphorylate [10].

Có thể xếp các hợp chất sterol thành 4 dạng cơ bản: 3-sterol (A1), 3-O-

sulfonyl sterol (A2), 3-OH,6-OH-sterol (A3) và 3-OH,6-OH-sterol (A4).

Hình 1.2. Các dạng cấu trúc sterol chính từ sao biển (S: mạch nhánh)

Trong họ sao biển Oreasteridae, dạng cấu trúc 3β,6α(β),15α,16β-

hydroxycholestane (dạng A3, A4) được tìm thấy ở sao biển Choriaster granulates (1)

[11] và Protoreaster nodosus (hợp chất 2-7) [12-14].

7 R1 R2 R3

1 H OH H C(22)-C(23)

2 H H H C(22)-C(23)

3 H OH H C(22)-C(23)

4 OH OH H C(22)-C(23)

5 OH H H C(22)-C(23)

6 H H Me C(22)-C(23)

7 OH H Me C(22)=C(23)

Dạng cấu trúc 3β,6α,15β,16β-hydroxy (A3) được tìm thấy trong sao biển

Culcitanovaeguineae (hợp chất 8-12) vùng Okinawa [15], sao biển Halityle regularis

(hợp chất 13, 14) [16], sao biển Oreaster reticulatus (hợp chất 15-20) [17], sao biển

Poraster superbus ( hợp chất 21, 22) [18].

8

1.2.1.2. Steroid glycoside

Lớp chất steroid glycoside là lớp chất được nghiên cứu nhiều nhất trong quá

trình tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sao biển. Phần

lớn các chất thứ cấp có hoạt tính từ sao biển thuộc lớp chất steroid glycoside. Chúng

tồn tại dưới dạng hỗn hợp, tập trung nhiều nhất trong dạ dày. Thành phần glycoside

biến động theo mùa hoặc chu kỳ sinh sản của sao biển. Đa số các glycoside gắn với

các glycosidoprotein hoặc lipoprotein và chỉ có 3% ở dạng tự do. Ở các bộ phận khác

nhau có các glycoside khác nhau. Các glycone của glycoside trong sao biển thường

là đường hexose và pentose.

Hình 1.3. Các glycone chính của các hợp chất glycoside trong sao biển

9 Dựa vào đặc điểm cấu trúc, glycoside từ sao biển được chia thành ba nhóm chính:

polyhydroxysteroid glycoside, asterosaponin và steroid glycoside mạch vòng.

a. Polyhydroxysteroid glycoside: Các hợp chất polyhydroxysteroid glycoside bao

gồm phần aglycon là polyhydroxysteroid và phần carbohydrat chứa một số phân tử

monosaccharide. Vị trí đường hóa thường ở C(24), C(3) và C(26). Ở khung steroid,

các nhóm OH thường gắn ở các vị trí 3β, 6α (hoặc β), 8β, 15α (hoặc β), 16α (hoặc β),

và đôi khi ở vị trí 4β, 5α và 7α. Mạch nhánh thường có nhóm OH gắn ở vị trí C(26)

hoặc C(24). Các nhóm OH có thể ở dạng tự do hoặc dưới dạng muối sulfate. Có thể

chia các hợp chất này thành bốn nhóm cấu trúc B1-4 (Hình 3). Hầu hết chúng đều có

chứa phân tử β-D-hexose trong cấu trúc. Nhóm đầu tiên (B1) là 3β-OH steroid với

mạch nhánh gắn với phần đường. Nhóm thứ hai (B2) là các 3β-O-glycosyl steroid.

Nhóm thứ ba (B3) bao gồm các chất với phần đường gắn vào vị trí 3β và mạch nhánh.

Nhóm thứ tư (B4) là các chất 6β-O-glycosyl steroid [10].

Hình 1.4. Các nhóm polyhydroxysteroid glycoside (S: mạch nhánh, G: phần đường)

+ Nhóm B1: bao gồm 5 dạng: 1) 3β-OH,6α-OH (C1); 2) 3β-OH,6α-OSO3Na (C2); 3)

3β-OH,6β-OH (C3); 4) 3β-OSO3Na (C4) và 5) 3α-OH,6α-OH (C5). Phần lớn các hợp

chất của nhóm này đều ở dạng bão hòa trừ duy nhất một hợp chất được tìm thấy có

nối đôi ∆14.

Hình 1.5. Các nhóm cấu trúc của các hợp chất 3β-OH steroid có trong sao biển

Một số ví dụ về các dạng cấu trúc B1 được tìm thấy ở sao biển họ Oreasteridae:

10 Sao biển Culcita novaeguineae [11, 16, 20]: hợp chất culcitoside C1 (23) (dạng

C1), culcitoside C2-C6 (24-28) và culcitoside C8 (30) (dạng C1), culcitoside C7 (29)

(dạng C2)

Sao biển Halityle regularis [16]: hợp chất halityloside A, B, E và H (31-34) (dạng

C1), halityloside H và I (35-36) (dạng C2).

Sao biển Oreaster reticulatus [17,21]: hợp chất sulfonyl steroid glycoside 37, hợp

chất oreasteroside A–F (38-43 ) và oreasteroside J (44), oreasteroside K (45) (dạng

C1), oreasteroside G – I (46-48) (dạng C2)

Sao biển Pentaceraster alveolatus [22]: hợp chất 6-epinodoside (49) (dạng C1).

Sao biển Poraster superbus [18]: hợp chất nodososide (50) (dạng C3)

Sao biển Protoreaster nodosus [23]: hợp chất nodososide (50) (dạng C3)

R1 R2 R3 R4 R5

23 OH H β-OH H -O-Araf(2←1)[(2-Me),(4-Me)Xyl] C(22)-C(23)

24 OH H β-OH OH -O-Araf(2←1)[(2-Me),(4-Me)Xyl] C(22)-C(23)

25 H H β-OH OH -O-Araf(2←1)[(2-Me),(4-Me)Xyl] C(22)-C(23)

26 OH H β-OH H -O-Araf(2←1)[(4-Me)Xyl] C(22)-C(23)

27 H H β-OH H -O-Araf(2←1)[(2-Me)Xyl] C(22)-C(23)

28 OH H β-OH H -CH2O-Araf(2←1)[(2-Me),(4-Me)Xyl] C(22)-C(23)

31 OH H β-OH OH -CH2CH2O-Xyl(2←1)[(2-Me)Xyl] C(22)-C(23)

32 H H β-OH OH -CH2CH2O-Xyl(2←1)[(2-Me)Xyl C(22)-C(23)

33 OH H β-OH OH -O-Araf(2←1)[(2-Me,4-Me)Xyl C(22)-C(23)

34 OH H β-OH OH -CH2CH2O-Araf(2←1)[(2-Me),(4-Me)Xyl] C(22)-C(23)

37 H H α-OH H -O-[(3-NaO3S)Araf C(22)-C(23)

38 H H α-OH H -O-[(3-Me)Araf C(22)-C(23)

39 H H α-OH H -O-[(3-Me)Araf](2←1)Xyl C(22)-C(23)

40 H H α-OH H -O-Araf(2←1)[(2-Me)Xyl] C(22)-C(23)

1141 H H α-OH H -O-[(3-Me)Araf](2←1)[(2-Me)Xyl] C(22)-C(23)

42 H H β-OH H -O-[(3-Me)Araf](2←1)Xyl C(22)-C(23)

43 H H α-OH OH CH2CH2O-[(5-Me)Galf] C(22)-C(23)

45 H OH β-OH OH -CH2CH2O-[(2-NaO3S,3-Me)Xyl] C(22)-C(23)

+ Nhóm B2 (3β-O-glycosyl steroid): Nhóm thứ hai này bao gồm 4 loại: 1) 3β-O-

glycosyl,6-H steroid (loại D1), 2) 3β-O-glycosyl,6α-OH steroid (loại D2), 3) 3β-O-

glycosyl,6α-sulfonyl steroids (loại D3), và 4) 3β-O-glycosyl,6β-OH steroid (loại D4).

12

Hình 1.6. Các nhóm cấu trúc của hợp chất 3β-O-glycosylsteroid B2

Một số hợp chất thuộc dạng B2 được phân lập từ sao biển họ Oreasteridae:

Sao biển Choriaster granulatus [24, 25]: đã phân lập được các chất thuộc dạng

D4 bao gồm một steroid glycoside mới là granulatoside E (51) và tám polyhydroxy

steroid đã biết là linkckoside L4 (52), echinasteroside C (53), echinasteroside E (54),

desulfat echinasteroside A (55), 22,23-dihydroechinasteroside A (56), desulfat

echinasteroside B (57), linckoside F (58) và laeviuscoloside D (59).

Sao biển Culcita novaeguineae [26]: đã phân lập được 7 chất dạng D4 bao gồm

bốn polyhydroxysteroid glycoside mới là culcinoside A- D (60-62) và ba hợp chất đã

biết là echinasteroside C (63), linckoside F (58) và linckoside L3 (64).

Sao biển Poraster superbus [18]: đã phân lập được 2 chất dạng D2 bao gồm hợp

chất (65, 66) và 1 chất dạng D4 là hợp chất 67.

R1 R2 R3 R4

51 H H

C(4)–C(5)

52 H H C(4)=C(5)

13

53 H H

C(4)–C(5)

54 H H C(4)=C(5)

55 H H

C(4)=C(5)

56 H H

C(4)=C(5)

57 H H

C(4)=C(5)

58 H H C(4)=C(5)

59 H H

C(4)=C(5)

60 H H

C(4)=C(5)

61 H

C(4)=C(5)

62 C(4)=C(5)

63 H C(4)=C(5)

64

C(4)=C(5)

14

+ Nhóm B3 (3β-O-glycosyl steroid và có gắn đường ở mạch nhánh):

Nhóm thứ ba bao gồm các chất 3β-O-glycosyl,6α-OH steroid với phần đường

gắn với mạch nhánh và 3β-O-glycosyl, 6β-OH-steroid với phần đường gắn với mạch

nhánh. Trong số các chất 3β-O-glycosyl,6α-OH-steroid với phần đường gắn vào

mạch nhánh, đa số các phân tử đường là β-D-xylose, và có các nhóm β-OH tại C(8)

và C(15). Trong khi đó, các hợp chất 3β-O-glycosyl,6β-OH-steroid với phần đường

gắn vào mạch nhánh là dẫn xuất của các 4,5-didehydro steroid, các nhóm β-OH là

nhóm thế chủ yếu tại C(4), C(8) và C(16), riêng nhóm thế tại C(15) thường có định

hướng α.

3β-O-Glycosyl,6α-OH steroid với phần đường gắn vào mạch nhánh (B3.1):

Hai hợp chất steroid glycoside thuộc loại B3.1 là granulatoside A (68) và granulatoside

B (69) được phân lập từ sao biển Choriaster granulatus [24, 25].

3β-O-Glycosyl,6β-OH steroid với phần đường gắn vào mạch nhánh (B3.2):

Một số hợp chất dạng B3.2 được phân lập từ loài sao biển Choriaster granulatus là

granulatoside D (70), echinasteroside F (71), linckoside B (72), linckoside E (73), và

granulatoside A (74) [24].

15

+ Nhóm B4 (6β-O-glycosyl steroid): Nhóm thứ tư bao gồm duy nhất một chất là

forbeside E2 (54) với một nhóm sulfate tại vị trí C(4), được phân lập từ sao biển

Asterias forbesi [27]. Đối với các loài sao biển họ Oreasteridae, chưa tìm thấy hợp

chất nào có dạng cấu trúc B4.

+ Nhóm B5 (bao gồm 16-O-glycosyl steroid và 7,16-O-glycosyl steroid): cho

đến nay, nhóm chất này chỉ mới được tìm thấy ở sao biển chi Anthenea (Anthenea

aspera và Anthenea chinensis) thuộc họ Oreasteridae. Có thể chia thành hai phân

nhóm với nhóm OH-C(3) ở vị trí (B5.1)hoặc (B5.2).

Phân nhóm B5.1: 3-OH,16-O-glycosyl và 3-OH,7,16-O-glycosyl steroid.

- Sao biển Anthenea aspera [28, 29]: anthenoside A (75), anthenoside A1 (76),

anthenoside A2 (77), anthenoside L-U (78-87).

- Sao biển Anthenea chinensis [30]: anthenoside E-K (88-93).

16 R1 R2

75 OH

[(2-acetamido,4-Me)Glcp]

76 OH


77 OH


78 OH

(3-Me)Glcp

79 OH

(3-Me)Galf

80 OH

(6-Me)Galf

81 OH

(3-Me)Glcf

82 -O-(6-

Me)Galf

(6-Me)Galf

83 -O-(6-

Me)Galf

(3-Me)Galf

84 -O-(6-

Me)Galf

(3-Me)Galf

1785 -O-(3-

Me)Galf

(6-Me)Galf

86 -O-(6-

Me)Galf

Galf

87 -O-(6-

Me)Galf

Galf

88 OH

(6-Me)Galf(3←1)[(6-Me)Galf]

89 OH

(6-Me)Galf(3←1)[(6-Me)Galf]

90 OH (6-Me)Galf(3←1)[(6-Me)Galf]

91 OH (6-Me)Galf(3←1)[(6-Me)Galf]

92 -O-(6-

Me)Galf

(6-Me)Galf

93 -O-(6-

Me)Galf

(6-Me)Galf

18 Phân nhóm B5.2: 3β-OH,16α-O-glycosyl steroid

- Sao biển Anthenea chinensis [30]: anthenoside A-F (94-98)

R2 R1

94 [(2-acetamido,4-Me)GlcP] H

95 [(6-Me)Galf(3←1)](6-Me)Galf

96 [(6-Me)Galf(3←1)](6-Me)Galf H



b. Asteroaponin

Các hợp chất asterosaponin có mặt trong hầu hết các loài sao biển đã được

nghiên cứu. Trước đây, thuật ngữ asterosaponin chỉ tất cả các hợp chất steroid

glycoside từ sao biển, bao gồm cả các polyhydroxysteroid glycoside và steroid

glycoside mạch vòng. Tuy nhiên, hiện nay asperosaponin chỉ gồm một dạng cấu trúc

được xác định, bao gồm một aglycone với 9,11-didehydro-3β,6α-dihydroxy, một

nhóm sulfat tại C(3), và một mạch nhánh với nhóm 20β-OH và 23-oxo. Chuỗi

oligosaccharide thường có 5 hoặc 6 đơn vị monosaccharide có cấu hình β, và đôi lúc

19cũng có thể chứa 3 hoặc 4 monosaccharide gắn tại C(6). Cấu trúc của các hợp chất

asterosaponin khác nhau do các nhóm thế trên mạch nhánh. Các đơn vị đường thường

có β-D-pyranose, β-D-quinovose hoặc β-D-glucose ở vị trí đơn vị đường đầu tiên; đa

số chuỗi oligosacarit có một nhánh, β-D-quinovose tại C(2) của nhánh.

Độc tính của sao biển đã được biết đến từ lâu, tuy nhiên chỉ mãi đến năm 1960

Hashimoto và Yasumoto mới chỉ ra rằng độc tính này có liên quan đến sự có mặt của

các hợp chất giống với saponin từ thực vật [31]. Hợp chất thornasteroid glycoside A

(99) là đại diện đầu tiên của nhóm asterosaponin, được phân lập lần đầu từ thân sao

biển gai Acanthaster planci bởi Kitakawa và Kobayashi vào năm 1977 [36, 37].

Thornasteroside A (99) cũng được tìm thấy trong nhiều loại sao biển khác, trong đó

có sao biển Halityle regularis [34] thuộc họ Osteridae. Protoreasteroside (99) đã được

tìm thấy trong sao biển Protoreaster nodosus và Pentaceraster alveolatus [11]. Sao

biển Halityle regularis cũng có chứa hai saponin là regularoside A và B (100, 101)

[34]. Regularoside B còn được phân lập từ sao biển Culcita novaeguinea [35]. Sao

biển Goniopecten demonstrans có chứa các saponin goniopectenoside A-C (102-104)

[36].

NaO3SOO

H

HO

GlcQui

Qui

Qui

Fuc

1 4

1 2 1 2

1 3

O

101

X Y Z -R1 -R2 -R3 -R4 -R5

99 Xyl Gal Fuc -H =O -H -CHMe2

100 Xyl Qui Fuc -H -H =CMe2

102 Xyl Fuc Fuc -H =O -H -CHMe2

20

R

103 -C(OH)Me2 C(23)=C(24)

104 -CHMe2 C(23)-C(24)

105 =CMe2 C(23)-C(24)

c. Steroid glycoside mạch vòng (cyclic steroidal glycoside)

Nhóm chất này phân bố ở một số ít loài sao biển. Cấu trúc của chúng khác với

các hợp chất asterosaponin thông thường. Cụ thể là nhóm chất này không có chứa

nhóm sulfate và điện tích âm là do phần axit glucuronic có trong phân tử. Trong số

các chất đã được phát hiện, phần aglycon là 7,8-dehydro-3,6-dihydroxy và điểm

đặc biệt là có vòng trisaccharide, đóng vòng giữa C(3) và C(6) của aglycon. Cho đến

hiện tại, mới chỉ có hai loài sao biển đều thuộc chi Echinaster có chứa nhóm chất này

là E. sepositus [37] và E. luzonicus [38].

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9

106 H H =O H CHMe2 OH H HO-CH2

107 Me Me Me Me OH H HO-CH2

21108 Me Me H CHMe2 OH H HO-CH2

109 Me Me Me Et OH H HO-CH2

110 H H =O H CHMe2 H OH H

1.2.2. Các dẫn xuất ceramide

Cho đến nay có trên 100 dẫn xuất ceramide được phát hiện và xác định cấu

trúc từ 18 loài sao biển có tên Acanthaster planci, Allosticchaster inaequalis,

Anasterias minuta, Asterias amurensis Lutken, A. amurensis versicolor, Asterina

pectinifera, Astropecten latespinosus, Cosmasterias lurida, Culcita novaeguineae,

Distolasterias nipon, Luidia maculate, Linckia laevigata, Narcissia canariensis,

Stellaster equestris, Ophidiaster ophidianus, Oreaster reticulates, Protoreaster

nodosus và Pentaceraster regulus. Trong số đó có 4 loài là Culcita novaeguineae,

Oreaster reticulates Protoreaster nodosus và Pentaceraster regulus thuộc họ

Oreasteridae.

Việc xác định thành phần của hỗn hợp sphingolipid thu hút đáng kể sự quan

tâm của các nhà khoa học bởi cấu trúc độc đáo và hoạt tính sinh học của chúng. Các

dẫn xuất ceramide (ceramide, cerebroside và ganglioside) được nghiên cứu nhiều

nhất. Các hợp chất ganglioside được chỉ ra là có khả năng hỗ trợ sự sống sót của tế

bào thần kinh nuôi cấy, có hoạt tính tạo tế bào thần kinh hình sợi (neuritogenesis) và

ức chế sự sinh trưởng của tế bào ung thư não của chuột.

22

Hình 1.7. Cấu trúc của các dẫn xuất ceramide

1.2.2.1. Ceramide

Phân tử ceramide cấu tạo bởi một sphingosine và một axít béo. Các ceramide

được tìm thấy nhiều trong màng tế bào nhân thật, tạo nên sphingomyelin - một lipid

chính yếu của lớp lipid kép ở màng tế bào. Không chỉ là nhân tố xây dựng cấu trúc tế

bào, các ceramide và sphingolipid còn có thể tham gia vào một số tín hiệu tế bào khác

nhau, ví dụ như điều hòa quá trình biệt hóa, tăng sinh và chết lập trình của tế bào.

Các hợp chất ceramide lần đầu tiên được phân lập từ sao biển Acanthaster

planci, đó là ba dạng phytosphingosine AC1-6 (111), AC1-10 (112) và AC1-11 (113)

[44].

23

Ceramide còn được tìm thấy trong sao biển Distolasterias nipon [40],

Luidiamaculate [41], Asterias amurensis [42]. Riêng đối với sao biển họ Oreasteridae

thì chưa có nghiên cứu nào công bố về việc phân lập được các ceramide.

1.2.2.2. Cerebroside

Cerebroside là các glycosphingolipid - thành phần quan trọng của cơ ở động

vật và màng tế bào thần kinh. Phân tử của chúng cấu tạo bởi một ceramide với 1-2

phân tử đường gắn ở C(1)-O. Phần ceramide có chứa cả axit béo không có nhóm

hydroxyl hoặc có nhóm hydroxyl, và base mạch dài (long chain base, LCB) dạng

sphingosine hoặc phytosphingosine. Phần đường có thể là glucose (gọi là

glucocerebroside hoặc glucosylceramide) hoặc galactose (galactocerebroside,

galactosylceramide). Galactocerebroside được tìm thấy chủ yếu ở mô thần kinh, trong

khi glucocerebroide có trong các loại mô khác. Đa số các cerebroside phân lập được

từ sao biển là các glucocerebroside. Việc phân lập được các galacto-cerebroside từ

động vật da gai là một điều hiếm gặp. Các glycosylcerebroside thường có hoạt tính

gây độc tế bào mạnh hơn so với các galactocerebroside.

Một số ví dụ về các cerebroside phân lập được từ sao biển họ Oreasteridae:

- Sao biển Culcita novaeguineae [43]: galactocerebroside CNC-2 (114).

- Sao biển Oreaster reticulates [44]: oreacerebroside A-I (115-123). Orea-

cerebroside D-I (118-123) thuộc dạng -galactopyranoside, ophidiacerebroside C-E

(124-126).

- Sao biển Pentaceraster regulus [45]: reguloside A-C (127-129).

- Sao biển Protoreaster nodosus [46]: 21 galactocerebroside (130-150).

Cấu trúc hóa học của các hợp chất này đều được xác định bằng GC-MS kết hợp với

NMR.

24

m R

124 19 Me(CH2)6CH=CHC(Me)=CH(CH2)2



127 19 Me(CH2)13

128 20 Me(CH2)13

129 21 Me(CH2)13

m R1 R2

115 19 Glc Me(CH2)6CH=CHCH=CH(CH2)2



118 19 Gal Me(CH2)6CH=CHCH=CH(CH2)2



121 19 Gal Me(CH2)6CH=CHC(Me)=CH(CH2)2



25

1.2.2.3. Ganglioside

Điểm đặc biệt đáng chú ý trong cấu trúc của các hợp chất ganglioside là phần

carbohydrate có chứa axit sialic. Ganglioside cấu tạo nên màng tế bào của động vật

có vú có xương sống, và đặc biệt có nhiều trong hệ thống thần kinh trung tâm và

ngoại biên. Ngoài ra, ganglioside còn được tìm thấy trong các loài sao biển [47]. Phần

ceramide của ganglioside bao gồm axit béo và LCB dạng phytosphingosine. Đơn vị

đường chủ yếu là lactose, và cấu trúc của phần đường được chia làm 2 loại: axit sialic

(axit N-acetylneuraminic, NeuAc) hoặc axit N-glycosylneuraminic (Neu5Gc), và N-

acetyl-galactosamine (GalNAc), gắn với C(3) của galactose của phần lactose.

Ganglioside tự nhiên như monosialoganglioside, disialoganglioside và

trisialoganglioside được phân lập từ sao biển, nhưng có rất ít tetrasialoganglioside và

asialoganglioside.

Gần đây, các ganglioside được cho là các phân tử quan trọng đặc biệt đối với

hệ miễn dịch. Ganglioside tự nhiên và bán tổng hợp được coi là các tác nhân hóa

dược tiềm năng đối với các rối loạn thoái hóa thần kinh [48].

26

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của Neu5Ac, Neu5Gc và GalNAc

Việc phân loại ganglioside dựa trên số lượng axit axit sialic, số đơn vị đường

và vị trí liên kết. Ví dụ về dạng cấu trúc ganglioside có 1 đơn vị axit sialic (GM1-

GM3): axit sialic gắn vào vị trí số 3 của đơn vị đường.

Hình 1.9. Cấu trúc của GM1-GM3

Cho đến nay có hơn 30 hợp chất ganglioside đã được phân lập và xác định cấu

trúc từ các loại sao biển. Từ sao biển Protoreaster nodosus đã phân lập được 3

ganglioside mới dạng GM4 (axit sialic gắn vào vị trí số 3 của đơn vị đường thứ 1)

(151-153) [49].

27

1.3. Hoạt tính sinh học của sao biển

Các hợp chất thứ cấp ở sao biển đóng một vai trò nhất định trong sự phòng thủ

và liên lạc. Tác dụng gây độc và chống đông máu giúp cho sao biển chống lại những

kẻ săn mồi. Theo các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài

sao biển, lớp chất chịu trách nhiệm chính cho các hoạt tính này là các steroid phân

cực và sau đó là các dẫn xuất ceramide.

Các nghiên cứu sinh học trên các hợp chất thứ cấp phân lập được từ sao biển

cho thấy nhiều chất có hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính tan máu, hoạt tính tạo tế

bào thần kinh hình sợi (neurogenensis), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và

kháng viêm.

1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Theo nghiên cứu tư liệu, nhiều hợp chất steroid glycoside từ sao biển thể hiện

hoạt tính gây độc tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư ở người như ung thư biểu mô

KB, ung thư gan Hep-G2, SKHep-1, BEL-7402 ung thư màng tử cung FL, ung thư

phổi A549, ung thư máu HL-60, U937, HL-60, ung thư vú MCF-7 (vú), ung thư

buồng trứng SK-OV-3 (buồng trứng) và U937 (máu), ung thư ruột HCT-116 [50-56].

Một số chất điển hình như sau:

28Trong số các hợp chất mới phân lập được từ sao biển Certonardoa

semiregularis, certonardosterol D2 (154) và certonardosterol C2 (155) thể hiện hoạt

tính mạnh nhất trên các dòng ung thư ở người như ung thư phổi (A549), ung thư

buồng trứng (SK-OV-3), ung thư da (KS-MEL-2), ung thư não XF498 và ung thư đại

tràng (HTC15) [57]. Công bố cũng chỉ ra các sterol tự do thường có hoạt tính tốt hơn

so với dạng saponin tương ứng, trừ trường hợp của certonardosterol P1 (156) và

certonardosterol J3 (157). Saponin thường được coi là thành phần đem lại độc tính

của sao biển. Tuy nhiên nghiên cứu về các thành phần hóa học của sao biển

Certonardosemiregularis lại chỉ ra các sterol tự do cũng đóng một vai trò quan trọng

góp phần vào độc tính chung của sao biển.

Bảng 1.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 154-157 trên một số dòng tế

bào ung thư ở người (giá trị ED50 (g/mL)

Hợp chất A549 SK-OV-3 KS-MEL-2 XF498 HCT15

certonardosterol D2 0,15 0,08 0,09 0,07 0,01

certonardosterol C2 0,15 0,16 <0,10 0,08 0,25

certonardosterol P1 0,87 0,89 0,26 0,35 2,17

certonardosterol J3 0,83 0,74 0,30 0,45 2,76

doxorubicin 0,02 0,17 0,02 0,06 0,06

Sáu hợp chất steroid glycoside 158-161 từ sao biển Anthenea chinensis, họ

Oreasteridae đã được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư

ở người là ung thư máu K-562, ung thư gan BEL-7402, ung thư não U87MG với

camtothecin hoặc nimustine là chất đối chứng dương. Hỗn hợp của 161 thể hiện độc

tính đáng chú ý trên tất cả các dòng tế bào thử nghiệm, trong khi các chất 158, 159

29và hỗn hợp 160 chỉ có hoạt tính trung bình đối với các dòng tế bào K-562 và BEL-

7402. Hơn nữa hỗn hợp 161 còn có tác dụng đáng kể ở nồng độ 10 g/mL trong thử

nghiệm thúc đẩy polimer hóa tubulin và ức chế sự tăng sinh các tế bào này [58-60].

Khi so sánh kết quả thu được và cấu trúc hóa học của các chất, tác giả đã đưa ra giả

thuyết về mối liên quan giữa hoạt tính với bản chất các phân tử đường và vị trí nối

mạch trong cấu trúc phân tử.

Bảng 1.2. Hoạt tính gây độc tế bào của glycoside 158, 159, hỗn hợp 160, hỗn hợp

161 trên 3 dòng tế bào ung thư in vitro (IC50 μM)a

Tế bào 158 159 Hỗn hợp

160 Hỗn hợp 161

Chất đối

chứng

K-562 6,1 1,4 4,6 1,1 2,8 0,9 0,6 0,1 0,16 0,03b

BEL-

7402 8,3 1,9 5,5 1,0 4,9 1,5 3,6 0,9 0,36 0,05

30U87MG > 25,4 > 25,1 > 24,5 3,6 0,9 0,84 0,04c

aGiá trị trung bình IC50 trong các mẫu thử; bChất đối chứng 10-

hydroxycamptothecine (HCP), cChất đối chứng hoạt tính tốt

Hỗn hợp anthenoside J và anthenoside K (161) cũng được phân lập từ một loài

sao biển khác trong cùng chi Anthenea là A. aspera. Hỗn hợp 161 đã được chỉ ra là

có thể làm giảm sự biểu hiện của protein Bcl-XL (một loại protein antiapoptotic) và

làm tăng sự biểu hiện của protein Bax và Bak (protein proapoptotic) dẫn đến kích

hoạt enzyme caspase-9, điều hòa caspase-3 theo cách phụ thuộc liều. Kết quả là, hỗn

hợp 161 ở nồng độ 40 M gây ra sự phân giải protein của caspase-3 và dẫn đến hiện

tượng apoptosis (chết theo lập trình) của tế bào ung thư biểu mô đại trực tràng. Ngoài

ra hỗn hợp của anthenoside J (6) và anthenoside K (7) thể hiện hoạt tính gây độc tế

bào với các dòng tế bào RPMI-7951, T-47D và HT-29 với các giá trị IC50 tương ứng

là 89, 91 và 85 μM [61]. Các hợp chất luzonicoside từ sao biển Echinaster luzonicus

gây ra hiện tượng apoptosis của các tế bào u ác tính ở người [62]. Hợp chất

novaeguinoside II từ sao biển Culcita novaeguineae cũng gây ra apoptosis trong các

tế bào ung thư não ở người (U87MG) bằng cách tăng Cytochrom-C giải phóng từ ty

thể, và bằng cách kích hoạt caspase 3, gây suy thoái DNA [63]. Leviusculoside G từ

sao biển Henricia leviuscula gây ra phụ thuộc p53 apoptosis bằng cách ức chế các

hoạt động AP-1, NF-B và ERK trong tế bào ung thư bạch cầu HL-60 và THP-1 [64].

Các dịch chiết dichloromethane, methanol và dịch chiết nước của sao biển

Protoreaster nodosus có tác dụng ức chế kháng viêm cytokine (IL-12 p40, IL-6 và

TNF-α) với các giá trị IC50 lần lượt: 0,60 ± 0,01 đến 26,19 ± 0,64 μg/mL. Cụ thể hợp

chất (3) và hợp chất (4) ức chế protein IL-12 p40 với IC50 = 0,01 ± 0,00 và 1,02 ±

0,01 μM. Hợp chất (50) ức chế protein IL-12 p40 và IL-6 (IC50 = 3,11 ± 0,08 và 1,35

± 0,03 μM) [12].

Hai hợp chất polyhydroxysteroid glycoside mới là anthenoside A1 (76), A2

(77) và một steroid glycoside là anthenoside A (75) phân lập từ dịch chiết sao biển

Anthenea aspera [28, 29] đều có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư vú ở người T-

47D và không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với các tế bào u sắc tố ác tính

RPMI-7951. Glycoside 76 ức chế 16% dòng tế bào RPMI-7951 trong khi hợp chất

77 ức chế 40% dòng tế bào T-47D với giá trị IC50 lần lượt 158 và 133 μM. Các hợp

31chất này có khung aglycon 24-nor hoặc 24-ethyl-5α-cholest-8(14)/ hoặc 22(23)-ene-

3α,6β,7β,16α-tetraol với hợp chất 161 chỉ khác nhau ở mạch nhánh - các đường

monosaccharide và số lượng các gốc đường. Cụ thể phần glycon của 3 hợp chất này

là một đường glucozo tồn tại dạng vòng 6 cạnh, trong khi hợp chất 161 là hai đường

galactozo tồn tại dạng vòng 5 cạnh.

Hai steroid glycoside là granulatoside D (70) và granulatoside E (51), thuộc

nhóm bi- và monoglycoside được phân lập từ dịch chiết ethanol của sao biển

Choriaster granulatus. Hợp chất 70 đã được nghiên cứu hoạt tính gây độc và miễn

dịch tế bào ở lá lách và đại thực bào của chuột, với nồng độ 0,1 μM tăng 20% ROS

trong đại thực bào và giảm 21% ROS với độc tố lipopolysaccharide từ E. coli (LPS).

Ba hợp chất polyhydroxylsteroid glycoside là culcinoside A-D (42-44) từ sao

biển Culcita novaeguieae đều có hoạt tính trên dòng tế bào ung thư não: U87, U251

và SHG44 ở người.

1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Ba asterosaponin là thornasteroside A, marthasteroside A1 và regularoside A

có thể gây ra những bất thường về hình thái của sợi nấm Pyricularia oryzae.

1.3.3. Hoạt tính tán huyết

Nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não là những căn bệnh nguy hiểm hàng

đầu trên thế giới. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 2,5 triệu người chết do bệnh

nhồi máu cơ tim. Ở Việt Nam, mỗi năm có khoảng 100,000 người chết do tai biến

mạch máu não. Một trong những nguyên nhân chính gây ra nhồi máu cơ tim là do

máu đông hình thành làm tắc động mạch vành, làm ngừng trệ dòng máu dẫn đến nuôi

cơ tim. Nguyên nhân của bệnh tai biến MMN là do tắc mạch dẫn đến việc cung cấp

máu lên một phần bộ não bị đột ngột ngừng trệ. Bởi vậy, việc tìm ra thuốc làm tan

huyết khối đóng vai trò rất quan trọng trong việc điều trị các căn bệnh này.

Trong lớp chất steroid phân cực có mặt nhóm chất asterosaponin. Các hợp chất

saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề

mặt của dung dịch, tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết. Do đó, những nghiên cứu

về hoạt tính tán huyết của các hợp chất steroid phân cực từ sao biển cũng đã được

quan tâm nghiên cứu.

Năm 2010, Levina EV và cộng sự đã phân lập các glycoside steroid mới,

hylodoside A (162) và novaeguinoside Y (163), cùng với 5 polyhydroxysteroid đã

32biết 164-168 từ dịch chiết ethanol của sao biển Leptasterias hylodes reticulata và

Culcita novaeguineae. Hợp chất 164 đã được chứng minh là hoạt tính kháng khuẩn

lên đến 10% ở nồng độ 1 mg/mL. Các steroid 163, 164 và 167 có khả năng làm tan

hồng cầu ở mức độ vừa phải trong xét nghiệm hồng cầu chuột. Ngoài ra, các hợp chất

165, 166 và 168 còn thể hiện khả năng làm tan hồng cầu phụ thuộc pH.

Các hợp chất steroid glycoside mới là anthenoside L- U (78-87) đã được tìm

thấy trong sao biển Anthenea aspera. Hỗn hợp của glycosides 86 và 87 thể hiện hoạt

tính tan máu với EC50 = 8 μM. Hợp chất 81 nồng độ 10 μM thể hiện hoạt động điều

hòa miễn dịch tiềm năng, giảm 24% hàm lượng ROS trong RAW 264,7 đại thực bào

của chuột, gây độc nội tiết tố bởi lipopolysaccharide từ E. coli.

Các thử nghiệm sinh học nêu trên cho thấy, không chỉ các hợp chất thuộc nhóm

asterosaponin có hoạt tính tán huyết mà các hợp chất polyhydroxysteroid,

polyhydroxysteroid glycoside cũng có hoạt tính giá trị này [10].

1.3.4. Hoạt tính neuritogenesis (tạo tế bào thần kinh hình sợi)

Việc phòng ngừa và điều trị các bệnh về thoái hóa thần kinh đã và đang được

các nhà khoa học khắp nơi trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Như đã biết, nhân tố

phát triển thần kinh (Nerve Growth Factor, NGF) được coi là một yếu tố quan trọng

trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh này bởi chúng là các protein rất cần thiết

cho sự tăng trưởng, phát triển hay tồn tại của các tế bào trong hệ thần kinh trung ương

và hệ thống thần kinh ngoại vi. Mặc dù các yếu tố nội sinh được dự đoán có tiềm

năng trong điều trị chấn thương tế bào thần kinh song chúng không ổn định và kích

thước quá lớn để đi qua hàng rào máu não. Do đó, các hợp chất ngoại sinh có trọng

lượng phân tử thấp bắt chước hoạt động của các tế bào thần kinh và có khả năng vượt

qua hàng rào máu não có thể được xem một loại thuốc điều trị các bệnh thoái hóa

thần kinh rất tiềm năng.

Để nghiên cứu tìm ra các hợp chất ngoại sinh này, người ta đã sử dụng dòng

tế bào PC12 trên chuột bởi PC12 dưới tác động của NGF sẽ chuyển từ một

chromaffin- cell kiểu hình giống như tế bào chưa trưởng thành thành một tế bào thần

kinh dạng sợi dài và phân nhánh giống với tự nhiên [65].

Trong nghiên cứu trước đây, các hợp chất glycosid steroid đã được chứng

minh có khả năng bắt chước hoạt tính neuritogenesis của NGF trên dòng tế bào PC12.

Ví dụ như hợp chất linckoside B (4) từ sao biển xanh Linckia laevigata.

33Ngoài ra chúng ta còn biết thêm hợp chất granulatoside A (169), phân lập từ

starfish Choriaster granulates, tuy không gây ra bất kỳ sự phát triển thần kinh nào

trong các tế bào PC12 nhưng nó đã tăng cường mạnh mẽ hoạt động của NGF.

Tác dụng hiệp đồng tác dụng lên tế bào thần kinh PC12 bằng granulatoside A

(169) và NGF được kiểm tra bằng cách thay đổi nồng độ của chúng. Hoạt tính mạnh

lên đáng kể khi tăng nồng độ của 169 và giảm nồng độ của NGF. Nghiên cứu này đã

chỉ ra rằng 169 tăng cường NGF nhưng không ngược lại. Ví dụ: nồng độ hoạt động

tối ưu đạt được bằng cách kết hợp 1 ng/mL của NGF và 40 μM của 169 và có thể so

sánh với hoạt tính của 40 ng/mL của NGF, nghĩa là tăng khoảng 40 lần so với hoạt

tính của NGF.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Sao biển Anthenea sibogae

* Thông tin mẫu:

- Thời gian thu mẫu: 07/2015

34- Địa điểm thu mẫu: đảo Vạn Bội, tỉnh Quảng Ninh, ở độ sâu 5-10 m.

- Chuyên gia giám định: PGS.TS. Đỗ Công Thung - Viện Tài nguyên và Môi trường

biển, Viện HLKHCNVN

- Mẫu tiêu bản: Tiêu bản mã số DG02-BTL-HDD lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp

chất thiên nhiên.

* Hệ thống phân loại:

- Tên khoa học : Anthenea sibogae Döderlein, 1915

- Giới: Động vật (Animalia)

- Ngành: Da Gai (Echinodermata)

- Lớp: Sao biển (Asteroidea)

- Bộ: Valvatida

-Họ: Oreasteridae

- Chi: Anthenea J. E. Gray, 1840

Hình 2.1. Ảnh mẫu sao biển Anthenea sibogae

2.1.2. Sao biển Anthenea aspera

* Thông tin mẫu:

- Thời gian thu mẫu: 06/2012

- Địa điểm thu mẫu: đảo Vạn Bội, tỉnh Quảng Ninh, ở độ sâu 5-10 m.

- Chuyên gia giám định: PGS.TS. Đỗ Công Thung - Viện Tài nguyên và Môi trường

biển, Viện HLKHCNVN

- Mẫu tiêu bản: Tiêu bản mã số SBĐ-12 lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên

nhiên.

* Hệ thống phân loại:

- Tên khoa học : Anthenea aspera Döderlein, 1915

- Giới: Động vật (Animalia)

- Ngành: Da Gai (Echinodermata)

35- Lớp: Sao biển (Asteroidea)

- Bộ: Valvatida

-Họ: Oreasteridae

- Chi: Anthenea J. E. Gray, 1840

Hình 2.2. Ảnh mẫu sao biển Anthenea aspera

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập các chất

Các phương pháp và thiết bị nghiên cứu gồm:

- Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn 60 F254 (20

x 20 cm, Merck) và Sorbfil (4,5 × 6,0 cm, 5÷17 µm, Sorbpolimer, Krasnodar, Nga).

Phát hiện chất dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc

thử là dung dịch H2SO4/EtOH 20% và đốt nóng.

- Sắc kí cột (CC)

Sắc kí cột thường (CC): sử dụng các loại chất hấp phụ Polychrome 1 (Teflon,

0.25−0.50 mm, Biolar, Olaine, Latvia), silica gel KSK (50÷160 µm, Sorbpolimer,

Krasnodar, Nga) và silica gel (Merck, Đức).

- Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC): được tiến hành trên máy Agilent 1100 Series

(Santa Clara, CA, Mỹ), cột Diasorb-130-C16T (250 16 mm, 11 m, Biochemmack,

Moscow, Nga) và Diasfer-110-C18 (250 4.6 mm, 5 m, Biochemmack, Moscow,

Nga) tại Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), phân viện Viễn Đông -

Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là sử dụng

kết hợp giữa các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm:

36- Phổ khối HR-ESI-MS và ESI-MS/MS: được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF

LC/MS tại PIBOC

- Phổ khối ESI-MS: đo trên máy Agilent/HP 1100 LC/MSD của Viện Hóa học, Viện

HL KHCN VN.

- Điểm nóng chảy: được đo trên máy Electrothermal IA-9200 (Anh) tại Viện Hóa

học các Hợp chất thiên nhiên (INPC), Viện HLKHCN VN

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân:

Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker Avance III 500, Bruker

Avance III 700 tại PIBOC và trên máy Bruker AC500 tại INPC.

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 90º,

và DEPT 1350.

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY, TOCSY và

NOESY.

+ Dung môi được sử dụng bao gồm: CD3OD, CDCl3, pyridin-d5 và DMSO-d6.

- Sắc kí khí (GC):

Sắc kí khí được tiến hành trên máy Agilent 6850 Series, khí mang He (1,7

ml/ph), chương trình nhiệt độ 100 0C (5 ph) – 5 0C/1ph – 270 0C (30 ph), cột mao

quản HP-1 MS (30 m × 0,25 mm), nhiệt độ bơm mẫu 250 0C, nhiệt độ detector 270 0C, tại PIBOC.

- Độ quay cực [α]D: được đo trên máy Perkin-Elmer 343 (Waltham, MA, Mỹ) trong

dung môi methanol tại PIBOC.

- Hóa chất, dung môi: Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình nghiên cứu

được mua của các hãng Merck, Sigma-Aldrich, Xilong. Dung môi chạy sắc ký được

làm khan và cất lại trước khi sử dụng.

- Thủy phân, xác định cấu hình tuyệt đối của các gốc đường

Cấu hình tuyệt đối của monosacarit được xác định theo quy trình của Leontein.

Hợp chất glycoside (1,2 mg) cho phản ứng với 0,5 mL axit trifluoroacetic 2M

(TFA) ở điều kiện 100 0C trong 2 giờ, sau đó lớp nước được rửa bằng CHCl3 (3

x 0,5 mL) rồi đem cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch cô chứa hỗn

hợp đường. Hỗn hợp đường thu được tiếp tục cho phản ứng với 0,4 mL (R)-(-)-2-

octanol và 1 giọt TFA đậm đặc ở điều kiện 130 0C trong 6 giờ. Dung dịch sau phản

37ứng đem cất loại dung môi, bổ sung thêm 0,4 mL hỗn hợp pyridine/acetic anhydride

(1:1) và khuấy trong 24h ở nhiệt độ phòng thu được hỗn hợp đường acetyl hóa. Hỗn

hợp này được so sánh với các đường chuẩn, cũng được acetyl hóa theo cách tương

tự, bằng phương pháp sắc ký khí (GC) [66].

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

- Các tác nhân: Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640), fetal bovine

serum (FBS), 3-(4,5-dimethylthiazon-2-yl)-5-(3-carboxymetoxyphenyl)-2-(4-sulfo

phenyl)-2H-tetrazolium (MTS), L-glutamine, và gentamicin được mua của hãng

Biolot (Moscow, Nga). Cisplatin được mua của hãng VeroPharm (Moscow, Nga). Bộ

kit tăng sinh tế bào không phóng xạ CellTiter 96 được mua từ Promega (Madison,

WI, Mỹ).

- Nuôi cấy tế bào: Dòng tế bào ung thư vú ở người T-47D (ATCC # HTB-113) được

nuôi trong môi trường RPMI-1640, bổ sung 10% (v/v) FBS (đã khử hoạt tính bằng

nhiệt), 2 mM L-glutamine và 1% penicillin – streptomycin trong môi trường không

khí ẩm chứa 5% CO2.

- Phương pháp gây độc tế bào: theo phương pháp MTS với một số thay đổi (Fedorov

và cộng sự [67]). Các tế bào T-47D (5 × 104) được nuôi cấy trong phiến 96 giếng

trong 200 μl môi trường RPMI-1640, được bổ sung 10% FBS ở 37 0C trong tủ ấm

CO2 5%. Sau 24 giờ, môi trường cũ được thay thế bằng môi trường mới chứa cisplatin

(ở nồng độ 10, 50, 100, 150 μM) hoặc các hợp chất ASB5, ASB6, ASB8 và hỗn hợp

ASB11 (ở các nồng độ 50, 100, 150 μM) sau đó được ủ thêm 24 giờ ở 37 0C trong tủ

ấm CO2 5%. Sau khi ủ, thêm 10 μl 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-

carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) vào từng giếng và

sau đó các tế bào được ủ trong 4 giờ ở 370C trong 5% CO2. Độ hấp thụ quang đo tại

490/630 nm bằng máy µQuant microplate (Power Wave XS, Mỹ). Các mẫu thử đều

được thực hiện lặp lại 3 lần.

+ Giá trị CS (Cell Survival): là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của

chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD

(optical density) (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm

giá trị CS (%) theo công thức:

38

% =OD mẫu − OD (ngày 0)

OD (DMSO) − OD (ngày 0) 100

+ Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để tìm

ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức

của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ

= (∑( − ̅)^2)/( − 1)

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để

tìm giá trị IC50

+ Cách tính giá trị IC50:

Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo

thang gía trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá

trị IC50. Công thức: 1/y = a + blnX

Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%)

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống tăng sinh tế bào

Các tế bào T-47D (2 × 104) được nuôi cấy trong phiến 96 giếng trong 200 μl

môi trường RPMI-1640, được bổ sung 10% FBS ở 37 0C trong tủ ấm CO2 5%. Sau

24 giờ, môi trường cũ được thay thế bằng môi trường mới chứa cisplatin (nồng độ 15

μM) hoặc các hợp chất ASB5, ASB6, ASB8 và hỗn hợp ASB11 (nồng độ 50 μM) sau

đó được ủ thêm 24, 48 và 72 giờ ở 370C trong tủ ấm CO2 5%. Sau khi ủ, thêm 10μL

tác nhân MTS vào từng giếng và sau đó các tế bào được ủ trong 4 giờ ở 37 0C trong

5% CO2. Hấp thụ quang được đo tại 490/630 nm bằng máy µQuant microplate.

392.2.3.3. Phương pháp khảo sát sự hình thành khối tế bào ung thư

Phương pháp thử nghiệm trên môi trường agar mềm được thực hiện sử dụng

dòng tế bào ung thư vú T-47D. Các tế bào T-47D (8 × 103tế bào/ml) được xử lý với

các hợp chất được nghiên cứu (với nồng độ 50 μM) hoặc được kích hoạt và phát triển

trong 1 ml môi trường agar có chứa 0,3% BME (Basal Medium Eagle) và 10% FBS,

sau đó thêm 3,5 ml môi trường agar có chứa 0,5% BME và 10% FBS [68]. Môi trường

nuôi cấy được giữ ở 37 0C trong tủ ấm chứa CO2 khoảng 2 tuần các khối tế bào ung

thư thu được và được đếm trên kính hiển vi sử dụng phần mềm máy tính ImageJ.

40CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ sao biển Anthenea sibogae

3.1.1. Xử lý mẫu sao biển A. sibogae

Mẫu sao biển tươi (2 kg), được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu tới khi sử dụng,

Sau khi rã đông, mẫu được rửa bằng nước để loại muối và tạp bẩn, để ráo nước, cắt

thành miếng nhỏ rồi ngâm chiết 4 lần với sự hỗ trợ siêu âm trong methanol (5 lít/1

lần) ở nhiệt độ phòng.

Gộp các dịch chiết thu được, lọc qua giấy lọc và cô quay để loại bỏ dung môi

dưới áp suất giảm, thu được cặn tổng (100 g). Cặn tổng này được chiết với

dichloromethane (3x500 mL), cô quay cho cặn chiết dichloromethane (20 g). Phần

không tan còn lại (80 g) được ký hiệu cặn A.

Phần cặn dichloromethane này được tách trên cột sắc ký sử dụng chất hấp phụ

silica gel (0,040-0,063 mm), sử dụng lần lượt hệ dung môi rửa giải là n-hexane/ethyl

acetate (40/1 → 5:1) và ethyl acetate/methanol (30/1 → 10: 1) thu được 4 chất ASB1

(7 mg), ASB2 (5 mg), ASB3 (6 mg) và ASB4 (7 mg).

Cặn A được hòa tan trong nước cất (1,0 L) rồi cho qua cột sắc ký Polychrom-1

(75x260 mm, hạt teflon 0,25 – 0,5 mm), sử dụng nước cất để rửa giải cho đến khi thu

được dịch nước không còn tạo kết tủa với dung dịch AgNO3 1N. Sau đó, rửa giải tiếp

bằng ethanol (3L) và cô quay dưới áp suất giảm để thu được cặn chiết ethanol (10,5

g).

Cặn chiết ethanol này được tách trên cột sắc ký (75x260mm), sử dụng chất hấp

phụ silica gel pha thường (50-160 µm, Sorbpolimer, Krasnodar, Nga), hệ dung môi

rửa giải là dichloromethane/methanol gradient 9:1 1:5 và methanol/nước gradient

tỉ lệ về thể tích 15:1 5:1, thu được 8 phân đoạn kí hiệu F1 - F8.

Phân đoạn F6 (1,58 g) có chứa các polyhydroxysteroid glycosid (chấm khảo sát

trên sắc ký bản mỏng butanol/ethanol/nước 4/1/2, thuốc thử acid sunfuric 20%, Rf

0.35 – 0.7). Phân đoạn này được tách trên cột sắc ký (40x300 mm, silica gel

Sorbpolimer) với hệ dung môi rửa giải là chloroform/ethanol gradient 3:1 2:1, thu

được 6 phân đoạn F6.1-F6.6.

Phân đoạn F6.3 (87 mg) và F6.4 (25 mg) được tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng

cao HPLC (cột Diasorb-130-C16T), chạy đẳng hệ hỗn hợp dung môi ethanol/nước tỉ

41lệ 75%, 2,5 ml/phút. Thu được các phân đoạn F6.31 (6,9 mg), F6.32 (2,3 mg), F6.33

(3,2 mg), F.34 (5,8 mg) và F6.41 (13,5 mg).

Phân đoạn F6.31 (6,9 mg) tiếp tục được tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC (cột Diasfer-110-C18), chạy đẳng hệ dung môi methanol/nước 80%, 0,5

ml/phút, thu được 2 chất là: ASB5(2,4 mg, tR 35,0 phút)và ASB6 (2,1 mg, tR 39,8

phút).

Phân đoạn F6.32 (2,3 mg) được tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (cột

Diasfer-110-C18, chạy đẳng hệ dung môi methanol/nước 83%, 0,5 ml/phút) thu được

hợp chất ASB7 (0,3 mg, tR 31,7 phút).

Phân đoạn F6.33 (3,2 mg), F6.34 (5,8 mg) và F6.41 (13,5 mg) tiếp tục được

tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (cột Diasfer-110-C18, chạy đẳng hệ dung

môi methanol/nước 85%, tốc độ dòng 0,5 ml/phút) thu được hợp chất ASB8 (1,2 mg,

tR 30,2 phút), ASB9(0,6 mg, tR 27,6 phút) và ASB10 (1,0 mg, tR 27,5 phút), ASB11

(1,9 mg, tR 58,2 phút).

Hình 3.1. Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu sao biển A. sibogae


Anthenea sibogae

Hợp chất ASB1: Cholesterol

Tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 144 0C-145 0C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (ppm): xem bảng 4.1 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (ppm): xem bảng 4.1 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất ASB2: Thymine

Tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 316 0C-317 0C. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.2 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.2 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất ASB3: L-Tyrosine

Chất rắn màu trắng, nóng chảy tại 342 0C. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.3 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm):xem bảng 4.3 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất ASB4: Tryptophan

Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy tại 280 0C -282 0C. 1H-NMR(500 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.4 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR(125 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.4 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất ASB5: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-

methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,7,

16-tetraol (Anthenoside S1)

Bột vô định hình màu trắng. []D25 = -51,7 (с = 0,1, MeOH). Rf = 0,45 (toluene/EtOH

9:5). 1H-NMR (700MHz, CD3OD), (ppm):xem bảng 4.5 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (176 MHz, CD3OD), (ppm): xem bảng 4.5 (phần kết quả và thảo luận).

HR-ESI-MS: 793,4346 ([M + Na]+, C40H66O14Na, tính toán 793,4345).

(+)ESI-MS/MS (793): 599 ([(M + Na) - С7H14O6]+), 217 ([С7H14O6+ Na]+).

(-) ESI-MS/MS (769): 653 ([(M - H) - mạch nhánh - H2O]-), 575 ([(M - H)- С7H14O6]-

), 193 ([С7H13O6]-).

43Hợp chất ASB6: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(4-O-

methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,7,


Bột vô định hình màu trắng. []D25 = • 63,4 (с = 0,1, MeOH). Rf = 0,43 (toluene/EtOH

9:5). 1H-NMR (700 MHz, CD3OD), (ppm): xem bảng 4.6 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (176 MHz, CD3OD), (ppm): xem bảng 4.6 (phần kết quả và thảo luận).


(+)ESI-MS/MS (793): 599 ([(M + Na) - С7H14O6]+), 217 ([С7H14O6 + Na]+).

Hợp chất ASB7: (20R)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-

methyl--D-glucopyranosyl)-5-cholesta-8(14),24(25)-diene-3,6,7,16-

tetraol (Anthenoside S3)

Bột vô định hình màu trắng. []D25 = • 66,0 (с = 0,03, MeOH). Rf = 0,43

(toluene/EtOH 9:5). 1H-NMR (700 MHz, CD3OD), (ppm): xem bảng 4.7 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR: không đo do lượng chất quá ít.



(-) ESI-MS/MS (783): 589 ([(M - H) - С7H14O6]-), 193 ([С7H13O6]-).

Hợp chất ASB8: (20R)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-

methyl--D-glucopyranosyl)-24-methyl-5-cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,

7,16-tetraol (Anthenoside S4)





(-)ESI-MS/MS (797): 427 ([(M - H) - С7H12O5]-), 409 ([(M - H) - С7H14O6]-).

Hợp chất ASB9: (20R,22E)-16-O-(3-O-methyl--D-galactofuranosyl)-5-

cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,7,16-tetraol (Anthenoside S5)

44Bột vô định hình màu trắng. []D25 = -18,3 (с = 0,06, MeOH). Rf = 0,45

(toluene/EtOH 9:5). 1H-NMR (700 MHz, CD3OD), (ppm): xem bảng 4.9 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (176 MHz, CD3OD), (ppm): xem bảng 4.9 (phần kết quả và thảo luận).


(+)ESI-MS/MS (631): 613 ([(M + Na) – H2O]+), 217 ([С7H14O6 + Na]+).

(-)ESI-MS/MS (607): 193 ([С7H13O6]-).

Hợp chất ASB10: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(-

D-galactofuranosyl)-24-methyl-5-cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,7,16-

tetraol (Anthenoside S6)





(-)ESI-MS/MS (783): 589 ([(M - H) - С7H14O6]-), 427 ([(M - H) - С7H14O6 - C6H10O5]-

), 193 ([С7H13O6]-).

Hợp chất ASB11: Hỗn hợp Anthenoside J ((20R,24R)-7-O-(6-O-methyl-β-D-


8(14)-ene-3α,6β,7β,16α-tetraol và Anthenoside K (= (20R,24S)-7-O-(6-O-methyl-

β-D-galactofuranosyl)-16-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-24-ethyl-5α-

cholest-8(14)-ene-3α,6β,7β,16α-tetraol.

Bột vô định hình màu trắng, []D25 = -101,4 (с = 0,1, MeOH). Rf = 0,43 (

toluene/EtOH 9:5). 1H-NMR (700 MHz, CD3OD), (ppm):xem bảng 4.11 (phần kết quả và thảo luận) 13C-NMR (176 MHz, CD3OD), (ppm): xem bảng 4.11 (phần kết quả và thảo luận)

HR-ESI-MS: 837,4975 ([M + Na]+, tính toán C43H74O14Na, 837,4971).

3.2. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ sao biển Anthenea aspera

453.2.1. Xử lý mẫu sao biển Anthenea aspera

Các mẫu tươi của sao biển Anthenea aspera (10 kg) được cắt thành miếng nhỏ

và ngâm chiết ba lần (8L/lần) với ethanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 40 ºC. Dịch

tổng thu được được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50ºC thu được

213 g cặn chiết tổng EtOH. Cặn chiết này được chiết phân đoạn lần lượt với hexane

(1L x 3), ethyl acetat (1Lx3) và methanol (1Lx3) thu được các cặn chiết tương ứng:

45 g cặn hexane (SDH), 68 g cặn ethyl acetat (SDE) và 96 g cặn methanol (SDM).

Cặn SDH được tách trên cột silica gel (Merck, 0,04-0,063 mm), hệ dung môi rửa

giải lần lượt là n-hexane/dichloromethane và dichloromethane /methanol (100-0%

→ 0-100% v:v) thu được 9 phân đoạn kí hiệu SDH1- SDH9. Phân đoạn SDH4 được

tiếp tục tách trên cột silica gel (Merck, 0,04-0,063 mm) với hệ dung môi rửa giải

hexane/ ethyl acetat (gradient) thu được 2 hợp chất: AA1 (0,17 g) và AA2 (0,53 g).

Phân đoạn SDH6 được tách trên cột silica gel (0,04-0,063 mm) với hệ rửa giải DCM/

MeOH (5/1) thu được hợp chất AA3 (1,02 g). Phân đoạn SDH9 được tách trên cột

pha đảo RP18 (MeOH/H2O/NH4OH, 70/29/1) thu được hợp chất AA4 (15 mg).

Phần cặn SDE được tách trên cột silica gel, hệ dung môi rửa giải chloroform/

methanol gradient (100/0 - 0/100) thu 9 phân đoạn kí hiệu SDE1-SDE9. Phân đoạn

SDE3 được tách trên cột silica gel với dung môi rửa giải chloroform/methanol /nước

(4/1/0,1) thu được 2 hợp chất: AA5 (48 mg) và AA6 (30 mg). Phân đoạn SDE7 tách

trên cột silica gel với dung môi rửa giải chloroform/ methanol /nước (5/1/0,1) thu

được 2 hợp chất AA7 (17 mg) và AA8 (33 mg).

Cặn SDM được chạy sắc ký trên silica gel rửa giải với dichloromethane/methanol

(10:0-8:2) thu 11 phân đoạn được ký hiệu SDM1-SDM11. Phần SDM7 đã chạy cột

silica gel và tách rửa giải với hệ dichloromethane/metanol (10:0-9:1) thu được hợp

chất AA9 (9 mg). Phần SDM4 đã chạy cột silica gel và tách rửa giải với hệ

dichloromethane/metanol (10:0-9:1) thu được hợp chất AA10 (10 mg) và hợp chất

AA11 (8 mg).

46

Hình 3.2. Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu sao biển A. aspera


Anthenea aspera

Hợp chất AA1: Cholesterol

Tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 144-145 0C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (ppm): xem bảng 4.1 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (ppm): xem bảng 4.1 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất AA2: Lathosterol (Cholest-7,8-ene-3-ol)

Tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy là 126-127 0C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (ppm):xem bảng 4.12 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (ppm):xem bảng 4.12 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất AA3: Cholest-4-ene-3β,6β-diol

Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy ở 243-245 0C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (ppm): bảng 4.13 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR(125 MHz, CDCl3) (ppm):bảng 4.13 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất AA4: Cholestane 3,5,6,15,16,26-hexol

Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy ở 256-258 0C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (ppm):bảng 4.14 (phần kết quả và thảo luận). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) (ppm): bảng 4.14 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất AA5: Cyclo(L-glycine-L-proline)

Tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 220-2220C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (ppm): xem bảng 4.15 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (ppm): xem bảng 4.15 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất AA6: L-glycine-L-prolin

Tinh thể hình kim không màu, tan trong methanol, không tan trong dichloromethane,

Rf = 0,35 (DCM/MeOH: 85:15). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (ppm): xem bảng 4.16 (phần kết quả và thảo luận). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) (ppm): xem bảng 4.16 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất AA7: Cyclo(L-alanine-4-hydroxyl-L-proline)

Tinhthể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 232 0C. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.17 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.17 (phần kết quả và thảo luận).

48Hợp chất AA8: L-Phenylalanine

Chất bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 173 0C. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) (ppm):xem bảng 4.18 (phần kết quả và thảo luận). 13C NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.18 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất AA9: Tyramine

Chấtbột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 1640C -165 0C. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.19 (phần kết quả và thảo luận). 13C NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.19 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất AA10: Thymine

Tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 3160C -317 0C. 1H-NMR và 13C-NMR (500 MHz, CD3OD) (ppm): xem bảng 4.2 của hợp chất

ASB2 (phần kết quả và thảo luận).

Hợp chất AA11: Uracil

Tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 335-336 0C. 1H-NMR (DMSO-d6) (ppm): xem bảng 4.20 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (DMSO-d6) (ppm): xem bảng 4.20 (phần kết quả và thảo luận).

49CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất từ loài sao biển Anthenea sibogae

Từ loài sao biển Anthenea sibogae đã phân lập 11 hợp chất trong đó có 6 chất

steroid glycoside mới, các chất còn lại lần đầu tiên phân lập từ chi Anthenea.

Bảng 4.1. Bảng tổng hợp các chất phân lập được từ sao biển Anthenea sibogae

STT Tên chất Cấu trúc Ghi chú

01 Cholesterol (ASB1)

- Lần đầu

tiên phân

lập từ chi

Anthenea

02 Thymine (ASB2)

03 L-tyrosine (ASB3)

04 Tryptophan (ASB4)

05 Hợp chất (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl-

-D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-

methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-

5-cholesta -8(14),22(23)-diene-

3,6,7,16-tetraol (Anthenoside

S1) (ASB5)

Chất mới

06 Hợp chất (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl-

-D-galactofuranosyl)-16-O-(4-O-

methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-

5-cholesta -8(14),22(23)-diene-

3,6,7,16-tetraol (Anthenoside

S2)(ASB6)

Chất mới

5007 Hợp chất (20R)-7-O-(6-O-methyl--

D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-

methyl--D-glucopyranosyl)-5-

cholesta-8(14),24(25)-diene-3,6,7,

16-tetraol (Anthenoside S3) (ASB7)

Chất mới


D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-

methyl--D-glucopyranosyl)-24-

methyl-5-cholesta-8(14),24(28)-

diene-3,6,7,16-tetraol

(Anthenoside S4) (ASB8)

Chất mới

09 Hợp chất (20R,20E)-16-O-(3-O-

methyl--D-galactofuranosyl)-5-

cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,7,

16-tetraol (Anthenoside S5) (ASB9)

Chất mới


D-galactofuranosyl)-16-O-(-D-

galactofuranosyl)-24-methyl-5-

cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,7,


(ASB10)

Chất mới

11 Hỗn hợp Anthenoside J ((20R,24R)-7-

O-(6-O-methyl-β-D-galactofura

nosyl)-16-O-(6-Omethyl-β-D-galacto

furanosyl)-24-ethyl-5α-cholest-8(14)-

ene-3α,6β,7β,16α-tetraol) và

Anthenoside K ((20R,24S)-7-O-(6-O-

methyl-β-D-galactofuranosyl)-16-O-

(6-O-methyl-β-Dgalactofuranosyl)-

24-ethyl-5α-cholest-8(14)-ene-

3α,6β,7β,16α-tetraol) (ASB11)

- Lần đầu

tiên phân

lập từ chi

Anthenea

514.1.1. Hợp chất ASB1: cholesterol

Hợp chất ASB1 phân lập được dưới dạng các tinh thể hình kim, không màu,

có điểm nóng chảy đo được là 146 0C.

Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB1 cho thấy có tín hiệu của 5 nhóm methyl

trong đó có 2 tín hiệu singlet H 0,67 (3H, s, CH3-18); H 1,00 (3H, s, CH3-19) và 3

tín hiệu doublet H 0,86 (3H, d, J = 6,5 Hz); H 0,87 (3H, d, J = 6,0 Hz); H 0,91 (3H,

d, J = 6,5 Hz), 1 proton olefin (H 5,34 ppm ) và 1 nhóm CH-O (H 3,52 ppm). Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu của 27 nguyên tử cacbon trong đó có 5 nhóm methyl,

11 nhóm CH2, 8 nhóm CH trong đó có 1 CH olefin (C121,7 ppm) và 1 nhóm CH-O

(C 71,7ppm), và 3 cacbon bậc 4 trong đó có 1 cacbon sp2 (C 140,7 ppm). Các dữ

liệu này cho phép dự đoán hợp chất A là một steroid khung cholestane có 1 nối đôi

và có 1 nhóm OH gắn với khung steroid.

Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB1

52

Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB1

Hình 4.1.3. Phổ DEPT của hợp chất ASB1

53

Hình 4.1.4. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất ASB1

Hình 4.1.5. Phổ HSQC của hợp chất ASB1

54

Hình 4.1.6. Phổ HMBC của hợp chất ASB1

Phổ COSY 1H-1H (phụ lục I) cho phép xác định các hệ spin như trong hình

dưới đây (in đậm):

2

3

4

510

1

67

8

914

13

1211

15

16

17

HO

19

20

22

23

24

25

26

27

2118

2

3

4

510

1

67

89

14

13

1211

15

1617

2021

22

23

24

2527

HO

19

18

26

Hình 4.1.7. Các tương tác chìa khóa trên phổ COSY và HMBC của ASB1

Phân tích phổ HSQC (phụ lục I) cho phép gán các tín hiệu proton và cacbon

tương ứng.

Phổ HMBC (phụ lục I) cho thấy có tương tác giữa proton của Me-19 với C-1,

C-9,và C-10; giữa H-4 với C(3)-OH, C-5, H-6 với C-4, C-5, C-10, và C-8; giữa proton

Me-18 với C-12, C-13, C-14 và C-17; giữa H-15 với C-14, C-16; giữa proton Me-21

với C-17, C-20 và C-22; giữa H-24 với C-26,27, H-23 với C-24, H-26, H-27 với C-

24 và C-25. Các tương tác này cho phép liên kết các hệ spin để tạo thành khung

steroid như trong hình 4.1.7. Ngoài ra, tương tác HMBC giữa H-4 với C(OH)-3 (C

71,7 ppm) và C-5 (C 140,7 ppm), H-6 (olefin) với C-4, C-5, C-10 và C-8 cho phép

dự đoán hợp chất ASB1 có nhóm OH ở vị trí C-3 và nối đôi ở vị trí C-5, C-6.

55Khi so sánh các dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASB1 với hợp chất cholesterol

đã được phân lập trước đó [69] thì thấy hoàn toàn trùng khớp (bảng 4.2). Do đó có

thể khẳng định ASB1 là hợp chất cholesterol với cấu trúc như hình 4.1.8.

2

3

4

510

1

67

8914

13

1211

15

16

17

HO

19

20

22

23

2425 26

27

2118

Hình 4.1.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB1

Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của ASB1 và hợp chất tham khảo

Vị

trí

δCa,b

(ppm)

δHa,c

(mult., J =

Hz)

#δC

(ppm) C

δCa,b

(ppm)

δHa,c

(mult., J =

Hz)

#δC

(ppm)

1 37,2 1,83 (m);

1,10 (m) 37,2 15 24,3

1,54 (m);

1,51 (m) 24,2

2 31,6 1,53 (m);

2,09 (m) 31,5 16 28,2

1,85 ( m),

1,23 (m) 28,2

3 71,7 3,52 (1H, m) 71,4 17 56,1 1,12 (m) 56,1

4 42,3 2,26 (m) 42,2 18 11,8 0,67 (s) 11,8

5 140,7 - 140,5 19 19,4 1,00 (3s) 19,2

6 121,7 5,34 (m) 121,3 20 35,8 1,37 (m) 35,7

7 31,9 1,85 (m);

1,52 (m) 31,8 21 18,7 0,91 (d, 6,5) 18,7

8 31,9 1,44 (m) 31,8 22 36,2 1,33 (m);

1,00 (m) 36,1

9 50,1 0,94 (m) 50,0 23 23,8 1,05 (m);

1,11 (m) 23,8

10 36,5 36,4 24 39,5 1,10-1,15 (m) 39,4

11 21,1 1,43-1,51 (m) 21,0 25 28,0 1,49 (m) 27,9

12 39,7 2,00 (m) 39,7 26 22,5 0,87 (d, 6,5) 22,5

13 42,2 - 42,2 27 22,8 0,86 (d, 6,5) 22,7

5614 56,7 1,00 (m) 56,6

aCDCl3, b125 MHz, c500 MHz, #δC số liệu của TLTK [69]

4.1.2. Hợp chất ASB2: Thymine

Hợp chất ASB2 phân lập được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ

nóng chảy 316-317 0C. Phổ 1H-NMR của ASB2 có các tín hiệu của 1 proton thơm

dạng singlet tại δH 7,24 ppm và của nhóm methyl tại δH 1,87 ppm.


Trên phổ 13C-NMR của ASB2 có thể quan sát thấy các tín hiệu cộng hưởng của

5 nguyên tử cacbon trong đó có 2 nguyên tử cacbon của 2 nhóm carbonyl tại C 167,5

(C-1) và 150,4 (C-4), 1 cacbon bậc 4 sp2 (C 110,4; C-2) 1 nhóm CH sp2 (C139,2;

C-3) và 1 nhóm CH3 (C 12,1; C-5).

57Hình 4.1.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB2

Phổ HSQC cho phép xác định các proton và cacbon liên kết trực tiếp như C(3)-

H, C(5)-H3. Phổ HMBC xuất hiện tương tác giữa H-5 với C-2 (δC 110,4 ppm), C-3

(δC 139,2 ppm) và C-1 (δC 167,5 ppm). Ngoài ra còn có các tương tác giữa H-3 với

C-5 (δC 12,1 ppm), C-4 (δC 150,3 ppm), C-2 (δC 110,4 ppm) và C-1 (δC 167,5 ppm).

Các dữ kiện này gợi ý phân tử ASB2 có cấu trúc dạng vòng và có nhóm N-H bên

cạnh CH-3.


58


Khi so sánh các dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASB2 với hợp chất thymine

đã được phân lập trước đó từ sao biển Acanthaster planci [71] thì thấy hoàn toàn

trùng khớp (Bảng 4.3). Do đó có thể khẳng định ASB2 là hợp chất thymine với cấu

trúc như hình 4.1.13. Đây là hợp chất thường tìm thấy trong các loài sao biển.

Hình 4.1.13. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC của hợp chất ASB2


Vị trí #δc Cac H

ab, mult (J = Hz) HMBC (HC)

1 164,9 167,5 -

2 107,7 110,4 -

3 137,7 139,2 7,24 s C-2, C-4, C-5

4 151,5 150,3 -

5 11,8 12,1 1,87 s C-1, C-2, C-3 aCD3OD, b500 MHz, c125 MHz,#δc số liệu của TLTK [70,71].

594.1.3. Hợp chất ASB3: L-Tyrosine

Hợp chất ASB3 phân lập được dưới dạng chất rắn màu trắng, nóng chảy tại

342 0C. Phổ 1H-NMR của ASB3 có các tín hiệu của 4 proton thơm dưới dạng 2

doublet tại H 6,72 (J = 8,0 Hz) và 7,05 (J = 8,0 Hz), 1 nhóm CH gắn với nitơ tại H

4,31 (dd, J = 8,0; 5,0 Hz) và 1 nhóm CH2 tại H 2,84 (dd, J = 8,5 Hz; 13,5 Hz); 3,06

(dd, J = 5,0 Hz; 14,0 Hz).



Phổ 13C-NMR của ASB3 cho thấy phân tử hợp chất này có tín hiệu của 9

nguyên tử cacbon, trong đó có 1 nhóm C=O axit (C 175,5); 6 nguyên tử cacbon thơm

60C 157,2 (C-7), 131,3 (C-6,C-8), 129,2 (C-4), 116,1 (C-5, C-9); 1 nhóm methin gắn

với dị tử nito cộng hưởng ở 56,4 (C-2) và 1 nhóm methylen cộng hưởng ở 37,9 (C-

3). Các tín hiệu 1H và 13C-NMR cho thấy ASB3 có một vòng thơm thế 1,4 gắn với 1

nhóm CH2-CH-COOH. Ngoài ra độ dịch chuyển hóa học của C-7 cho thấy C-7 có

gắn với nhóm OH. Do đó có thể dự đoán ASB3 là L-tyrosine.

So sánh dữ liệu phổ NMR và điểm nóng chảy của ASB3 với dữ liệu công bố

của L-tyrosine [72] thì thấy hoàn toàn trùng khớp. Vậy có thể khẳng định ASB3 là

tyrosine.



C #C Cac H

ab (mult., J = Hz)

1 172,6 175,5 -

2 55,4 56,4 4,31 (dd, 8,0, 5,0)

3 35,9 37,9 2,84 (dd, 8,5, 13,5)

3,06 (dd, 5,0, 14,0)

4 126,8 129,2 -

5 117,2 116,1 7,05 (d, 8,0)

6 132 131,3 6,72(d, 8,0)

7 156,4 157,2 -

8 132 131,3 7,05 (d, 8,0)

9 117,2 116,1 6,72(d, 8,0)

aCD3OD, b125 MHz, c500 MHz,#δc dữ liệu của TLTK [72].

4.1.4. Hợp chất ASB4: L-Tryptophan

ASB4 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 280-282 0C. Phổ1H-NMR của ASB4 có các tín hiệu của 5 proton trong vùng trường thấp bao

gồm 1 doublet tại H 7,59 (J = 8,0 Hz, H-9), 1 doublet tại H 7,34 (J = 8,0 Hz, H-8),

612 triplet tại H 7,10 (tín hiệu chồng chập) và 7,025 (J = 7,5 Hz) (H-9, H-10), 1 singlet

tại H 7,10 (H-5). Ngoài ra còn có tín hiệu cộng hưởng của 1 nhóm methin gắn với dị

tử nito cộng hưởng ở H 4,45 (dd, J = 5,5; 7,0 Hz, H-2) và 1 nhóm CH2 tại H [3,33

(m) và 3,15 (dd, J = 7,5; 14,5 Hz); H-3].


Hinh 4.1.18. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB4

Phổ 13C NMR của ASB4 có tín hiệu cộng hưởng của 11 nguyên tử cacbon,

trong đó có 1 nhóm C=O axit (C 175,9, C-1); 8 cacbon sp2 bao gồm C-7 (138,0), C-

626 (128,9), C-5 (124,4), 122,3, 119,7, 119,3, 112,2, 111,0 (C-4, C-8, C-9, C-10, C-11);

1 nhóm methin gắn với dị tử nito cộng hưởng ở 55,9 (C-2) và 1 nhóm methylen cộng

hưởng ở 28,6 (C-3). Các dữ kiện này gợi ý cấu trúc của ASB4 là một amino acid có

chứa hệ vòng thơm bao gồm 8 nguyên tử cacbon gắn với mạch nhánh có 3 nguyên tử

cacbon.

Khi so sánh các dữ liệu phổ NMR của ASB4 với L-tryptophan [73] thì thấy

hoàn toàn trùng khớp. Do đó ASB4 được xác định là L-tryptophan.



C #C Cac H

ab (mult., J = Hz)

1 175,8 175,9 -

2 56,3 55,9 4,45 (dd, 5,5, 7,0)

3 28,0 28,6 3,33 (m)

3,15 (dd, 7,5, 14,5)

4 122,5 122,3 -

5 125,1 124,5 7,10(s)

6 128,5 128,9 -

7 138,9 138,0

8 120,0 119,7 7,34(d, 8,0)

9 118,9 119,3 7,59 (d, 8,0); 7,10 (t, 8,0)

10 112,0 112,2 7,025 (t, 7,5)

11 109,0 110,0 aCD3OD, b125 MHz, c500 MHz,#δc số liệu của TLTK [73], 100 MHz.

4.1.5. Hợp chất ASB5: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-

(3-O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,

7,16-tetraol (anthenoside S1, hợp chất mới)

Hợp chất ASB5 được phân lập dưới dạng chất rắn, vô định hình, màu trắng,

độ quay cực []D25 = -51,7 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử của ASB5 được xác

63định là C40H66O14 từ kết quả phổ khối phân giải cao (+)HR-ESI-MS với pic [M +

Na+] m/z 793,4346 (tính toán lý thuyết cho công thức C40H66O14Na là 793,4345).

Hình 4.1.20. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB5

Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB5 có các tín hiệu của 5 nhóm methyl trong đó

có 2 tín hiệu singlet của hai nhóm methyl góc tại δH 0,84 (s, H3-19) và 0,91 (s, H3-

18), 3 tín hiệu doublet của 3 nhóm methyl bậc 2 tại δH 0,97 (d, J = 6,7 Hz, H-27), 0,98

(d, J = 6,7 Hz, H-26) và 1,10 (d, J = 7,0 Hz, H-21); 4 nhóm oxymethine tại δH 3,64

(t, J = 2,8 Hz, H-6), 4,08 (m, H-3), 4,23 (d, J = 2,8 Hz, H-7) và 4,63 (td, J = 9,0, 5,0

Hz, H-16); 2 nhóm methoxy tại δH 3,38 (s, OMe-6”) và 3,63 (s, OMe-3’). Tại vùng

trường thấp hơn có 2 tín hiệu proton olefin tại δH 5,30 (dd, J = 15,3, 6,8 Hz, H-23) và

5,74 (ddd, J = 15,3, 8,8, 1,2 Hz, H-22). Ngoài ra có xuất hiện tín hiệu cộng hưởng

của 2 proton anomer của hai gốc đường tại δH 4,33 (d, J = 7,7 Hz, H-1′) và 5,02 (d, J

= 2,0 Hz, H-1′′) cùng với các tín hiệu của 10 nhóm CH-O trong vùng δH 3,09-3,91.

Phổ 13C-NMR của ASB5 cho thấy sự có mặt của 40 nguyên tử carbon trong

phân tử trong đó có 5 carbon methyl cộng hưởng tại δC 15,5 (C-19), 20,3 (C-18), 23,1

(C-27), 23,2 (C-26) và 23,8 (C-21); 2 carbon methoxy tại δC 59,4 (OMe-6”) và 61,0

(OMe-3’); 4 carbon sp2 tại δC 126,6 (C-8), 133,9 (C-22), 137,2 (C-23) và 147,6 (C-

14); 14 tín hiệu carbon oxymethine trong vùng δC 63-87,9 ppm và 2 tín hiệu carbon

anomer tại δC 102,9 (C-1’) và 108,4 (C-1”). Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR tương ứng

186.9952 226.9878 268.9983

301.14091+

385.23491+ 441.2974

1+

617.3659 659.2872

793.43461+

+MS, 2.4min #140

0

1

2

3

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

64với các tín hiệu trên phổ 13C-NMR được xác định dựa trên các tương tác trên phổ

HSQC (kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 4.6).


Hình 4.1.22. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB5.

Kết hợp các dữ liệu phổ (+)-HRMS, 1H-NMR và 13C-NMR cho phép dự đoán

ASB5 là một tetrahydroxysteroid glycoside với phần aglycon có 2 nối đôi và gắn với

652 phân tử đường. Độ rộng của tín hiệu multiple được dự đoán là của H-3 vào khoảng

12 Hz, tương ứng với cấu hình 3-OH (độ rộng của tín hiệu ứng với cấu hình 3-OH

thường lớn hơn 30 Hz) [74]. Mặt khác độ dịch chuyển hóa học proton và cacbon của

các nhóm CH3-18, CH3-19, CH-3, CH-6, CH-7 và CH-16 của ASB5 có giá trị gần

tương tự với dữ liệu công bố của các nhóm tương ứng trong phân tử anthenoside R

với phần cấu trúc aglycon là 8(14)-3,6,7,16-tetrahydroxy-steroid bị glycoside

hóa tại C-7 và C-16 [74] (bảng 4.6).

Các tương tác chìa khóa trên phổ COSY của phần aglycon cho phép xác định

các hệ spin giữa các proton: H-1 (δH1,53; 1,30)/H-2 (δH 1,62)/H-3 (δH 4,08)/H-4

(δH1,96; 1,37)/H-5 (δH 2,12)/H-6 (δH 3,64); H-11 (δH1,65; 1,53)/H-12 (δH1,82; 1,25);

H-15 (δH2,86; 2,64)/H-16 (δH 4,63)/H-17 (δH 1,53)/H-20 (δH 2,40)/H-21 (δH 1,10); H-

20/H-22 (δH 5,74); H-23 (δH 5,30)/H-25 (δH 2,26)/H-26,27 (δH 0,97, 0,98). Từ đó có

thể xác định được vị trí các nhóm OH tại C-3, C-6, C-7, C-16 và có 1 nối đôi tại C-

22/C-23. Đồng thời, giá trị hằng số tương tác JH-22/H-23 = 15,3 Hz cho thấy liên kết đôi

C-22/C-23 có cấu hình trans.

Phổ HMBC của phần aglycon cho thấy các tương tác giữa proton của 2 nhóm

methyl góc với các cacbon lân cận, cụ thể là: H-18/C-12, C-13, C-14, C-17; H-19/C-

1, C-10, C-9. Ngoài ra còn có các tương tác giữa H-6/C-10, C-8 (C 126,6), H-18/C-

14 (C 147,6), H-15/C-8, C-14, C-13. Đồng thời, phổ HSQC cho thấy 2 cacbon sp2 là

tại C 126,6 (C-8) và 147,6 (C-14) là cacbon bậc 4 do không có tương tác với proton

nào. Kết hợp các dữ kiện này có thể khẳng định vị trí của nối đôi trong hệ đa vòng tại

C-8/C-14. Tương tác HMBC của phần mạch nhánh giữa proton H-21 (H 1,10) với

C-22 (C 133,9); H-22 (H 5,74)/C-25 (CH, C 32,3); H-23 (H 5,30)/C-20, C-25, C-

26, C-27, cùng với các dữ liệu phổ NMR và HRMS nói trên cho phép khẳng định

mạch nhánh của ASB5 thiếu 1 cacbon (C-24) so với mạch nhánh của khung

cholestane, và có nối đôi ở vị trí C-22/C-23.

66

Hình 4.1.23. Phổ COSY của hợp chất ASB5.


67


Tương tác trên phổ ROESY giữa H-18/H-20, H-21/H-12 và H-22/H-16 gợi

ý cấu hình tuyệt đối của C-20 là R. Theo các tài liệu công bố [75], độ dịch chuyện

hóa học H của H-21 thuộc khung steroid là 1,10 ppm đối với cấu hình 20R-22

(trường hợp của ASB5) và là 1,00 ppm đối với cấu hình 20S-22. Do đó có thể khẳng

định ASB5 có mạch nhánh với cấu hình 20R.

Các tương tác ROESY chìa khóa giữa H-19/H-2, H-4, H-11; H-18/H-12,

H-15, H-16; H-5/H-1, H-9; H-6/H-4, H-7/H-15, cùng với các giá trị của

hằng số tương tác của H-6, H-7 và H-16 cho phép khẳng định cấu hình tương đối

3,6,7,16 của các nhóm OH và cấu hình 5/9/10/13 của nhân steroid. Tổng

hợp tất cả các dữ liệu phổ đã phân tích, có thể xác định phần cấu trúc aglycon của

ASB5 là (20R,22E)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,7,16-tetraol.

Các tín hiệu cộng hưởng của 2 proton anomer (δH 4,33 và 5,02) có tương tác

trên phổ HSQC tương ứng với 2 carbon lần lượt tại δC 102,9 và 108,4. Phổ (+)-ESI-

MS/MS của pic ion [M+Na]+ tại m/z 793 cho các mảnh pic ion tại m/z 599 ([(M+Na)-

C7H14O6]+) và 217 ([C7H14O6+Na]+). Phổ (-)-ESI-MS/MS của pic ion [M-H]- tại m/z

769 cho các mảnh pic ion tại 575 ([(M-H)-C7H14O6]- và 193 ([C7H13O6]-). Các pic

68này tương ứng với việc mất một gốc O-methyl-hexose. Độ dịch chuyển hóa học và

hằng số tương tác của H-1 đến H-6 của 2 đơn vị đường O-methyl-hexose được xác

định bằng cách chiếu xạ các proton anomer trong thí nghiệm TOCSY 1D. Ngoài ra,

các tín hiệu proton và cacbon của các đơn vị monosaccharide của ASB5 được xác

định nhờ các phổ NMR 2D như COSY, HSQC và HMBC (hình 4.1.27, bảng 4.6).

Các giá trị của độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác của hai đơn vị đường

này hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu công bố về các chất có hai gốc đường cuối mạch

là 3-O-methyl--glucopyranosyl và 6-O-methyl--galactofuranosyl [74].

Hình 4.1.26. Phổ ROESY của hợp chất ASB5

69

Hình 4.1.27. Các tương tác COSY, HMBC và ROESY chìa khóa của hợp chất ASB5

Hình 4.1.28. Phổ 1D TOCSY của hai đơn vị đường

Phản ứng thủy phân ASB5 bằng TFA 2M, sau đó cho các phân tử đường tác

dụng với (R)-(-)-2-octanol và sau đó acetyl hóa, phân tích bằng GC và so sánh với

thời gian lưu với các dẫn xuất acetyl (-)-2-octyl glycoside của các monosaccharide

chuẩn, cho phép xác định cấu hình D của hai đơn vị đường 3-O-methyl--

glucopyranose và 6-O-methyl--galactofuranose trong phân tử ASB5.

Vị trí gắn hai đơn vị đường nói trên với phần aglycon được xác định nhờ phổ

HMBC và ROESY, từ các tương tác giữa H-1’ của 3-OMe-Glcp và C-16 và H-16 của

phần aglycon, giữa H-1” của 6-OMe-Galf với C-7 và H-7 của phần aglycon quan sát

được trên phổ.

Mặt khác các dữ liệu phổ proton và cacbon của ASB5 gần như trùng khớp với

dữ liệu phổ của hợp chất anthenoside R, chỉ khác là ASB5 thiếu mất một nhóm CH2

(C-24) so với anthenoside R dẫn đến các giá trị độ dịch chuyển hóa học của mạch

cacbon từ C-22 đến C-27 thay đổi nhẹ. Dựa trên tất cả các dữ kiện trên, cấu trúc của

ASB5 được xác định là (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofura nosyl)-16-O-

70(3-O-methyl--D-glycopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-

3,6,7,16-tetraol. Đây là hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được

đặt tên là anthenoside S1.


Vị trí #δCa,b δC

a,b #δHa,b(mult., J = Hz) δH

a,c (mult., J = Hz)

1 34,6 34,6 1,53 (m)/1,30 (m) 1,53 (m)/1,30 (m)

2 29,7 29,6 1,61 (m) 1,62 (m)

3 67,5 67,5 4,07 (m) 4,08 (m)

4 33,3 33,3 1,96 (td, 14,0, 3,0)

1,37 (br dd, 14,0, 3,0)

1,96 (td, 14,0, 2,8)

1,37 (br d, 14,0)

5 38,0 38,0 2,12 (dt, 14,0, 3,0) 2,12 (dt, 14,0, 2,8)

6 75,2 75,2 3,62 (m) 3,64 (t, 2,8)

7 78,6 78,5 4,23 (d, 2,6) 4,23 (d, 2,8)

8 126,7 126,6 - -

9 46,0 45,9 2,26 (m) 2,26 (m)

10 38,9 38,8 - -

11 19,5 19,5 1,65 (m)/1,53 (m) 1,65 (m)/1,53 (m)

12 37,2 37,2 1,81 (dt, 12,2, 3,2)

1,25 (m)

1,82 (dt, 12,5, 3,3)

1,25 (m)

13 45,4 45,4 -

14 147,6 147,6 -

15 34,5 34,3 2,86 (ddd, 17,5, 9,0, 3,2)

2,64 (ddd, 17,5, 5,0, 2,1)

2,86 (ddd, 17,0, 9,0,

2,8) 2,64 (ddd, 17,0,

5,0, 2,1)

16 79,6 79,2 4,62 (td, 9,0, 5,0) 4,63 (td, 9,0, 5,0)

17 62,8 62,8 1,53 (m) 1,53 (dd, 9,0, 4,0)

18 20,2 20,3 0,91 (s) 0,91 (s)

19 15,4 15,5 0,84 (s) 0,84 (s)

20 37,3 37,2 2,41 (m) 2,40 (m)

21 24,0 23,8 1,11 (d, 6,9) 1,10 (d, 7,0)

71

22 138,1 133,9 5,79 (dd, 15,3, 9,0) 5,74 (ddd, 15,3, 8,8,

1,2)

23 128,8 137,2 5,34 (dd, 15,3, 7,3) 5,30 (dd, 15,3, 6,8)

24 43,2 1,91 (m) -

25 29,9 32,3 1,59 (m) 2,26 (m)

26 22,9 23,2 0,88 (d, 6,7) 0,98 (d, 6,7)

27 22,9 23,1 0,89 (d, 6,7) 0,97 (d, 6,7)

3-OMe-β-D-Glcp

1′ 103,1 102,9 4,33 (d, 7,9) 4,33 (d, 7,7)

2′ 75,2 75,2 3,23 (dd, 9,2, 7,9) 3,23 (dd, 9,3, 7,7)

3′ 87,9 87,9 3,09 (t, 9,2) 3,09 (t, 9,3)

4′ 71,6 71,5 3,38 (m) 3,36 (t, 9,3)

5′ 77,7 77,8 3,27 (ddd, 10,0, 5,4, 2,6) 3,27 (ddd, 9,3, 5,5,

2,5)

6′ 63,2 63,2 3,88 (dd, 11,7, 2,6)

3,72 (dd, 11,7, 5,4)

3,88 (dd, 11,6, 2,5)/

3,70 (dd, 11,6, 5,5)

3′-

OMe 61,0 61,0 3,63 (s) 3,63 (s)

6-OMe-β-D-Galf

1′′ 108,5 108,4 5,02 (br d, 2,1) 5,02 (d, 2,0)

2′′ 83,3 83,4 3,90 (m) 3,90 (dd, 3,7, 2,0)

3′′ 78,8 78,7 3,94 (dd, 6,0, 3,7) 3,94 (dd, 6,2, 3,7)

4′′ 85,1 85,0 3,91 (m) 3,91 (m)

5′′ 70,8 70,8 3,83 (ddd, 7,1, 4,6, 2,0) 3,82 (ddd, 7,0, 5,2,

3,4)

6′′ 75,5 75,5 3,52 (m) 3,53 (dd, 10,3, 5,2)

3,52 (dd, 10,3, 7,0)

6′′-

OMe 59,4 59,4 3,38 (s) 3,38 (s)

aCD3OD, b176 MHz, c700 MHz, #δC số liệu của anthenoside R

72

Hình 4.1.29. Cấu trúc hóa học của ASB5 và anthenoside R

4.1.6. Hợp chất ASB6: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-

(4-O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,

7,16-tetraol (anthenoside S2, chất mới)

Hợp chất ASB6 phân lập được dưới dạng chất rắn vô định hình, màu trắng, độ

quay cực []D25 = • 63,4 (с = 0,1, MeOH). Công thức phân tử của hợp chất ASB6

được xác định là C40H66O14, từ kết quả phổ khối lượng phân giải cao (+)-HR-ESI-MS

với pic ion [M + Na] + tại m/z 793,4340 (tính toán lí thuyết cho công thức phân tử

C40H66O14Na là 793,4345).


Khi so sánh các dữ liệu phổ 1H, 13C NMR, COSY, HSQC, HMBC, 1D

TOCSY, và ROESY của hợp chất ASB5 và ASB6 chúng tôi nhận thấy các tín hiệu

cộng hưởng proton và cacbon của phần aglycon steroid và monosaccharide gắn với

C-7 của hai hợp chất hoàn toàn giống nhau, trong khi các tín hiệu H và C của

monosaccharide gắn với C-16 của ASB6 không giống như của ASB5 (bảng 4.7). Từ

73đó có thể suy ra phần cấu trúc aglycon của ASB6 là (20R,22E)-24-nor-5-cholesta-

8(14),22(23)-diene-3,6,7,16-tetraol và gốc đường 6-O-methyl--D-

galactofuranosyl được gắn với vị trí C-7 của aglycon.

Các tín hiệu H (H-1’đến H-6’) và C (C-1’ đến C-6’) của đơn vị đường gắn với

C-16 được gán nhờ các tương tác trên phổ COSY, HSQC và HMBC (bảng 4.7). Hằng

số tương tác J giữa H-1’(H 4,29) và H-2’(H 3,17) có giá trị bằng 7,8 Hz, thể hiện

cấu hình của liên kết D-glycoside. Tương tác giữa cacbon của nhóm OMe và H-4’

trên phổ HMBC chỉ ra rằng nhóm OMe ở vị trí C-4’ của gốc O-Me-hexose gắn với

C-16 aglycon. Các tín hiệu H và C và các hằng số tương tác tương ứng của gốc đường

này khác so với gốc đường 3-O-methyl- glucopyranosyl của ASB5 ở độ dịch chuyển

hóa học của H-3’ và H-4’ do ảnh hưởng của sự methyl hóa tại vị trí C-4’của ASB6.

Cùng lúc đó, có sự dịch chuyển về phía trường thấp, từ C 71,5 ppm (ASB5) đến 81,2

ppm (ASB6) của C-4’[75]. Các dữ liệu này cùng với tương tác trên phổ ROESY giữa

H-1’ với H-3’ và H-5’ cho phép chúng ta khẳng định phân tử monosaccharide thứ 2

của ASB6 là 4-OMe--D-glucopyranose.


74


Hình 4.1.33. Phổ COSY của hợp chất ASB6

75


Ngoài ra, các tương tác trên phổ ROESY và HMBC giữa H-1’ của 4-OMe-

Glcp với C-16 và H-16 của phần aglycon, giữa H-1” với C-7 và H-7 của phần aglycon

cho phép khẳng định vị trí gắn kết của hai đơn vị đường này lần lượt tại C-16 và C-

7.


76


Hình 4.1.37. Các tương tác HMBC, COSY và ROESY chìa khóa của hợp chất ASB6

Khi so sánh các dữ liệu phổ phần đường của ASB6 với ASB5 và các

anthenoside đã phân lập trước đó [30, 74], chúng tôi đề xuất cấu hình D cho các

monosaccharide của ASB6.

Do đó, cấu trúc hóa học của ASB6 được xác lập là (20R,22E)-7-O-(6-O-

methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(4-O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-

cholesta-8(14), 22(23)-diene-3,6,7,16-tetraol. Đây là hợp chất mới, lần đầu tiên

được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên là anthenoside S2. Đơn vị đường 4-O-

methyl--D-glucopyranosyl lần đầu tiên cũng được tìm thấy trong phân tử các hợp

chất steroid glycoside từ sao biển.

77Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của ASB6 và hợp chất tham khảo

Vị trí #δCa,b δC

a,b δHa,c (mult, J , Hz)

1 34,6 34,5 1,53 (m)/1,29 (m)

2 29,6 29,6 1,62 (m)

3 67,5 67,5 4,07 (m)

4 33,3 33,3 1,96 (td, 14,0, 2,8); 1,36 (br d, 14,0)

5 38,0 38,0 2,12 (dt, 14,0, 2,8)

6 75,2 75,5 3,63 (t, 2,8)

7 78,5 78,7 4,22 (d, 2,8)

8 126,6 126,6 -

9 45,9 45,9 2,27 (m)

10 38,8 38,8 -

11 19,5 19,5 1,65 (m)/1,53 (m)

12 37,2 37,1 1,81 (dt, 12,4, 3,4)/1,25 (m)

13 45,4 45,4 -

14 147,6 147,6 -

15 34,3 34,5 2,85 (ddd, 17,0, 9,0, 2,8)

2,64 (17,0, 5,0, 2,1)

16 79,2 79,4 4,62 (td, 9,0, 5,0)

17 62,8 62,8 1,54 (dd, 9,0, 4,0)

18 20,3 20,3 0,91 (s)

19 15,5 15,4 0,84 (s)

20 37,2 37,1 2,40 (m)

21 23,8 23,8 1,10 (d, 7,1)

22 133,9 133,8 5,76 (ddd, 15,3, 8,8, 1,2)

23 137,2 137,4 5,31 (dd, 15,3, 6,8)

24 -

25 32,3 32,3 2,28 (m)

26 23,2 23,2 0,98 (d, 6,6)

27 23,1 23,1 0,97 (d, 6,6)

4-OMe-β-D-Glucp

781′ 102,9 103,0 4,29 (d, 7,8)

2′ 75,2 75,2 3,17 (dd, 9,3, 7,8)

3′ 87,9 78,2 3,46 (t, 9,3)

4′ 71,5 81,2 3,10 (t, 9,3)

5′ 77,8 77,2 3,26 (ddd, 9,3, 5,1, 2,2)

6′ 63,2 62,7 3,86 (dd, 11,6, 2,2)/3,71 (d, 11,6, 5,1)

4′-OMe 61,0 60,8 3,56 (s)

6-OMe-β-D-Galf

1′′ 108,4 108,4 5,01 (d, 2,0)

2′′ 83,4 83,4 3,90 (m)

3′′ 78,7 78,7 3,94 (dd, 6,1, 3,6)

4′′ 85,0 85,0 3,90 (m)

5′′ 70,8 70,8 3,82 (ddd, 7,0, 5,2, 3,3)

6′′ 75,5 75,5 3,53 (dd, 10,1, 5,2)/3,52 (dd, 10,1,

7,0)

6′′-OMe 59,4 59,4 3,38 (s) aCD3OD, b176 MHz, c700 MHz, #δC số liệu của ASB5


-D-glucopyranosyl)-5-cholesta-8(14),24-diene-3,6,7,16-tetraol

(anthenoside S3)

Hợp chất ASB7 thu được dưới dạng chất rắn vô định hình màu trắng, độ quay

cực []D25 = • 66,0 (с = 0,03, MeOH). Công thức phân tử của hợp chất ASB7 được

xác định là C41H68O14 từ kết quả phổ khối phân giải cao (+)HR-ESI-MS với pic ion

giả phân tử [M+Na+] tại m/z 807,4499 (tính toán lý thuyết cho công thức phân tử

C41H68O14Na là 807,4501) và số liệu phổ NMR.

Cấu trúc hóa học của ASB7 được làm sáng tỏ bằng cách kết hợp các dữ liệu

phổ khối phân giải cao với phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, COSY, 1D

TOCSY, và ROESY) đồng thời so sánh với dữ liệu của hợp chất ASB5. Do khối

lượng chất ASB7 không đủ nên chúng tôi đã không đo được phổ 13C-NMR, HSQC

và HMBC. Khi so sánh các phổ 1D- và 2D-NMR của ASB7 và ASB5 thì thấy hai

hợp chất glycoside này chỉ khác nhau về độ dịch chuyển hóa học của phần mạch

nhánh của aglycon (bảng 4.8).

79



80


Dựa trên các tương tác 1H-1H trên phổ COSY, chuỗi proton từ H-20 (δH 1,71)

- H-21 (δH 1,03) - H-22 (δH 1,74/1,45) - H-23 (δH 2,10; 1,91) - H-24 (δH 5,14) được

thiết lập. Phổ 1H NMR phần mạch nhánh có các tín hiệu của 1 nhóm methyl bậc 2

tại 1,03 (d, J = 6,8 Hz, H-21) và 2 nhóm methyl bậc 3 tại δH 1,60 (s, H-27) và 1,67

(s, H-26); và 1 proton olefin tại δH 5,14 (br t, J = 7,5 Hz) được gán cho H-24. Các dữ

liệu này, kết hợp với sự chênh lệch về số khối giữa ASB7 và ASB5 là 14 amu, phù

hợp với cấu trúc mạch nhánh dạng 24-cholestane. Do đó, cấu trúc hóa học của ASB7

được xác định là (20R)-7-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-methyl-

β-D-glucopyranosyl)-5α-cholesta-8(14),24(25)-dien-3α,6β,7β,16α-tetraol. Đây là

hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên là anthenoside

S3. Lần đầu tiên dạng cấu trúc mạch nhánh dạng 24- cholestane của ASB7 được tìm

thấy ở các hợp chất steroid glycoside phân lập từ sao biển.

81

Hình 4.1.41.Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB7 và hợp chất tham khảo ASB5


Vị trí δHa,b (mult, J , Hz) #δH

a,b (mult, J , Hz)

1 1,53 (m)/1,30 (m) 1,53 (m)/1,30 (m)

2 1,62 (m) 1,62 (m)

3 4,07 (m) 4,08 (m)

4 1,96 (td, 14,0; 2,8)

1,36 (br d, 14,0) 1,96 (td, 14,0; 2,8) 1,37 (br d, 14,0)

5 2,12 (dt, 14,0; 2,8) 2,12 (dt, 14,0; 2,8)

6 3,64 (t, 2,8) 3,64 (t, 2,8)

7 4,26 (d, 2,8) 4,23 (d, 2,8)

8 - -

9 2,27 (m) 2,26 (m)

10 - -

11 1,64 (m)/1,53 (m) 1,65 (m)/1,53 (m)

12 1,85 (dt, 12,0; 3,3)

1,30 (m)

1,82 (dt, 12,5; 3,3)

1,25 (m)

13 - -

14 - -

15 2,84 (ddd, 17,0; 8,7;3,0)

2,68 (17,0; 4,1; 1,8)

2,86 (ddd, 17,0; 9,0; 2,8)

2,64 (ddd, 17,0; 5,0; 2,1)

16 4,55 (td, 8,7; 4,1) 4,63 (td, 9,0; 5,0)

17 1,50 (m) 1,53 (dd, 9,0; 4,0)

8218 0,94 (s) 0,91 (s)

19 0,85 (s) 0,84 (s)

20 1,71 (m) 2,40 (m)

21 1,03 (d, 6,8) 1,10 (d, 7,0)

22 1,74 (m)/1,45 (m) 5,74 (ddd, 15,3; 8,8; 1,2)

23 2,10 (m)/ 1,90 (m) 5,30 (dd, 15,3; 6,8)

24 5,14 (br t, 7,5) -

25 - 2,26 (m)

26 1,67 (s) 0,98 (d, 6,7)

27 1,60 (s) 0,97 (d, 6,7)

3-OMe--D-Glcp

1′ 4,42 (d, 7,7) 4,33 (d, 7,7)

2′ 3,31 (dd, 9,1; 7,7) 3,23 (dd, 9,3; 7,7)

3′ 3,08 (t, 9,1) 3,09 (t, 9,3)

4′ 3,32 (t, 9,1) 3,36 (t, 9,3)

5′ 3,25 (ddd, 9,1; 5,7; 2,5) 3,27 (ddd, 9,3; 5,5; 2,5)

6′ 3,86 (dd, 11,6; 2,5)

3,65 (d, 11,6; 5,7)

3,88 (dd, 11,6; 2,5)

3,70 (dd, 11,6; 5,5)

4′-OMe 3,62 (s) 3,63 (s)

6-OMe--D-Galf

1′′ 5,05 (d, 2,0) 5,02 (d, 2,0)

2′′ 3,90 (dd, 4,3; 2,0) 3,90 (dd, 3,7; 2,0)

3′′ 3,93 (m) 3,94 (dd, 6,2, 3,7)

4′′ 3,91 (dd, 5,8; 3,4) 3,91 (m)

5′′ 3,82 (ddd, 7,2; 4,8; 3,4) 3,82 (ddd, 7,0; 5,2; 3,4)

6′′ 3,53 (dd, 10,1, 4,8)

3,52 (dd, 10,1; 7,2)

3,53 (dd, 10,3; 5,2)

3,52 (dd, 10,3; 7,0)

6′′-OMe 3,38 (s) 3,38 (s) aCD3OD,b700 MHz, #δH số liệu của ASB5


-D-glucopyranosyl)-24-methyl-5-cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,7,16-

tetraol (anthenoside S4)

Hợp chất ASB8 thu được dưới dạng chất rắn vô định hình, màu trắng, độ quay

cực []D25 = • 42,4 (с = 0,1, MeOH). Kết quả thu được từ phổ khối lượng phân giải

cao (+)-HR-ESI-MS của hợp chất ASB8 với pic ion giả phân tử [M + Na] + tại m/z

821,4656 (tính toán lí thuyết cho công thức phân tử C42H70O14Na là 821,4658), cho

phép xác định công thức phân tử của hợp chất ASB8 là C42H70O14.

Hình 4.1.42. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất ASB8

So sánh các dữ liệu phổ NMR 1D và 2D của hợp chất ASB8 và ASB5 thì thấy

các tín hiệu cộng hưởng của proton và cacbon của khung steroid và hai đơn vị

monosaccharide của hai hợp chất này gần như trùng nhau, chỉ có các tín hiệu H và C

của mạch nhánh là khác nhau (bảng 4.9). Phổ 1H và 13C-NMR phần mạch nhánh của

ASB8 có các tín hiệu của ba nhóm methyl bậc hai là H3-C(21) [H 1,03 (d, J = 6,8),

C 20,8], H3-C(26) [H 1,03 (d, J = 6,9), C 22,6], và H3-C(27) [H 1,03 (d, J = 6,9),

C 22,4], và một liên kết đôi 24,28 [H 4,70 (br s, 4,72 (d, J = 1,3); C 108,6; 158,4].

Các tín hiệu này tương đồng với các tín hiệu của mạch nhánh (20R)-24,28-24-methyl-

cholestane của hợp chất đã biết là anthenoside F, G và S [30, 74].

84



Các tương tác giữa H3-18/H-20, H-20/H-23, H3-21/H-12, H-22 và H-28/H-

23, H3-26, H3-27 trên phổ ROESY, và các tương tác giữa H3-21/C-17; H-22/C-20, H-

23/C-24, C-28; H-25/C-28; H3-26/C-24; H3-27/C-24 và H-28/C-23 trên phổ HMBC

cho phép khẳng định cấu trúc (20R)- 24,28-24-methyl-cholestane của mạch nhánh

ASB8.

85



86



87

Hình 4.1.49. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chìa khóa của hợp chất ASB

Tổng hợp tất cả các dữ liệu phổ HRMS và NMR cho phép xác định cấu trúc

hóa học của hợp chất ASB8 là (20R)-7-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-16-O-

(3-O-methyl-β-D-glucopyranosyl)-24-methyl-5α-cholesta-8(14),24(28)-dien-3α,

6β,7β,16α-tetraol. Đây là hợp chất mới và được đặt tên là anthenoside S4.

Hình 4.1.50. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB8 và hợp chất tham khảo ASB5


Vị trí #δC δCa,c δH

a,b (mult., J, Hz)

1 34,6 34,6 1,53 (m)/1,31 (m)

2 29,6 29,6 1,61 (m)

3 67,5 67,3 4,07 (m)

4 33,3 33,2 1,96 (td, 14,0, 2,8)/1,36 (br d, 14,0)

5 38,0 37,9 2,13 (dt, 14,0, 2,8)

6 75,2 75,5 3,64 (t, 2,8)

7 78,5 78,7 4,27 (d, 2,8)

888 126,6 126,6 -

9 45,9 45,6 2,27 (m)

10 38,8 38,9 -

11 19,5 19,6 1,64 (m)/1,53 (m)

12 37,2 37,6 1,88 (m)/1,32 (m)

13 45,4 45,4 -

14 147,6 148,0 -

15 34,3 34,2 2,85 (ddd, 17,0, 8,6, 2,9)/2,66 (m)

16 79,2 80,1 4,57 (td, 8,6, 4,2)

17 62,8 62,7 1,51 (dd, 8,6, 6,7)

18 20,3 19,7 0,95 (s)

19 15,5 15,5 0,85 (s)

20 37,2 34,1 1,72 (m)

21 23,8 20,8 1,03 (d, 6,8)

22 133,9 34,6 1,87 (m)/1,54 (m)

23 137,2 33,0 2,21 (m)/1,89 (m)

24 - 158,4 -

25 32,3 34.9 2,28 (m)

26 23,2 22.6 1,03 (d, 6,9)

27 23,1 22.4 1,03 (d, 6,9)

28 108.6 4,72 (d, 1,3)/ 4,70(br s)

3-OMe-β-D-Glucp

1′ 103,1 102.6 4,32 (d, 7,8)

2′ 75,2 75.1 3,22 (dd, 9,1, 7,8)

3′ 87,9 87.8 3,08 (t, 9,1)

4′ 71,6 71.7 3,28 (m)

5′ 77,7 77.9 3,26 (m)

6′ 63,2 63.4 3,86 (dd, 11,6, 2,5)/3,63 (dd, 11,6, 5,6)

3′-OMe 61,0 61.0 3.62 (s)

6-OMe-β-D-Galf

1′′ 108,5 108.5 5,04 (d, 2,0)

892′′ 83,3 83.4 3,90 (dd, 3,6, 2,0)

3′′ 78,8 78.7 3,93 (dd, 6,8, 3,6)

4′′ 85,1 85.0 3,92 (dd, 6,8, 3,5)

5′′ 70,8 70.8 3,82 (ddd, 7,1, 4,8, 3,5)

6′′ 75,5 75.5 3,54 (dd, 10,1, 4,8)/3,52 (dd, 10,1, 7,1)

6′′-OMe 59,4 59.4 3,38 (s) aCD3OD, b700 MHz, c176 MHz, #δC số liệu của ASB5

4.1.9. Hợp chất (20R,20E)-16-O-(3-O-methyl--D-galactofuranosyl)-5-cholesta-

8(14),22,23-diene-3,6,7,16-tetraol (anthenoside S5, hợp chất mới).

Hợp chất ASB9 thu được dưới dạng chất rắn vô định hình, màu trắng, độ quay

cực []D25 = • 18,3 (с = 0,06, MeOH). Công thức phân tử của hợp chất ASB9 được

xác định là C34H56O9, dựa trên kết quả phổ khối phân giải cao (+)-HR-ESI-MS với

pic ion giả phân tử [M +Na] + tại m/z 631,3816 (tính toán lí thuyết cho công thức phân

tử C34H56O9Na là 631,3817).


Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB9 xuất hiện các tín hiệu của 5 nhóm methyl

trong đó có 2 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,83 (s, H3-19) và 0,89 (s, H3-18); 3 nhóm

methyl bậc 2 tại δH 0,89 (d, J = 6,5 Hz, H3-26, H3-27) và 1,09 (d, J = 7,3 Hz, H3-21);

1 nhóm methoxy tại δH 3,41 (s, OMe-3′); 2 tín hiệu proton olefin tại δH 5,65 (dd, J =

15,4, 9,2 Hz, H-22) và 5,37 (ddd, J = 15,4, 7,3, H-23); 4 nhóm oxymethine tại δH

3,53 (t, J = 2,8 Hz, H-6), 4,08 (m, H-3), 4,25 (d, J = 2,8 Hz, H-7) và 4,47 (ddd, J =

16,8, 9,0, 3,0 Hz, H-16) và tín hiệu proton anomer của phân tử đường tại δH 4,97 (br

s, H-1′).

90


Phổ 13C-NMR của ASB9 có tín hiệu cộng hưởng của 34 cacbon, trong đó có

các tín hiệu đặc trưng của 8 nguyên tử cacbon gắn với oxi trong khoảng δC 62-89

ppm, 1 cacbon anomer tại δC 108,3 (C-1’), và 4 cacbon sp2 tại δC 128,4, 129,5, 137,2

và 146,8. Điều này gợi ý ASB9 là một tetrahydroxysteroid có chứa 2 nối đôi và có

gắn với một phân tử đường. Các dữ liệu proton và cacbon của ASB9 gần như trùng

hợp với các dữ liệu của hợp chất anthenoside M [74], một steroid khung 8(14)-

3α,6β,7β,16α-tetraol gắn với 1 phân tử đường 3-O-methyl-β-galactofuranosyl ở vị trí

C-16 (bảng 4.10).

91


Các tín hiệu cộng hưởng proton và cacbon của mạch nhánh chỉ ra sự có mặt

của 3 nhóm methyl bậc 2 là H3-C(21) [δH 1,09 (d, J = 7,3 Hz); δC 24,6], H3-C(26) [δH

0,89 (d, J = 6,5 Hz); δC 22,8], H3-C(27) [δH 0,89 (d, J = 6,5 Hz); δC 22,7], và một liên

kết đôi tại C-22/C-23 [H3-C(21) [δH 5,65 (dd, J = 15,4; 9,2 Hz); 5,37 (dd, J = 15,4;

7,3 Hz); δC 137,7; 129,5]. Chuỗi H và C của mạch nhánh được xác lập dựa trên các

tương tác trên phổ COSY 1H-1H và phổ HSQC. Tương tác giữa H-18/H-20; H-21/H-

17 và H-22/H-16 trên phổ ROESY và các tương tác giữa H-21/C-17, C-20, C-22; H-

23/C-20; H-24/C-22, H-26/C-24, C-25 và H-27/C-24, C-25 trên phổ HMBC cho phép

khẳng định cấu trúc của phần mạch nhánh là (20R, 22R)-22- cholestane.

92



93



94

Hình 4.1.58. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất ASB9

Do đó cấu trúc hóa học của hợp chất ASB9 được xác định là (20R,22E)-16-O-

(3-O-methyl--D-galactofuranosyl)-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,7, 16-

tetraol. Đây là hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên

là anthenosideS5.

Hình 4.1.59. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB9 và anthenoside M



a,b (mult., J , Hz)

1 34,5 34,5 1,54 (m)/1,31 (m)

2 29,5 29,5 1,62 (m)

3 67,4 67,4 4,08 (m)

4 33,4 33,4 1,98 (td, 13,7, 2,8)/1,38 (br d, 13,7)

5 37,8 37,7 2,16 (dt, 13,7, 2,8)

6 77,3 77,4 3,53 (t, 2,8)

7 72,1 72,1 4,25 (d, 2,8)

8 128,4 128,4 -

9 45,8 45,8 2,25 (m)

10 38,7 38,7 -

9511 19,3 19,4 1,67 (m)/1,53 (m)

12 36,8 36,9 1,80 (dt, 12,0, 3,4)/1,21 (m)

13 44,9 44,9 -

14 146,7 146,8 -

15 33,6 33,5 2,93 (ddd, 16,8, 9,0, 3,0)/2,39 (m)

16 76,9 76,9 4,47 (ddd, 9,8, 9,0, 6,0)

17 62,6 62,6 1,46 (9,8, 2,7)

18 20,7 20,5 0,89 (s)

19 15,3 15,3 0,83 (s)

20 37,1 37,1 2,45 (m)

21 24,7 24,6 1,09 (d, 7,3)

22 135,6 137,7 5,65 (dd, 15,4, 9,2)

23 135,3 129,5 5,37 (dd, 15,4, 7,3)

24 44,5 43,2 1,92 (br td, 7,3, 3,3)

25 34,6 29,9 1,59 (m)

26 20,6 22,8 0,89 (d, 6,5)

27 20,1 22,7 0,89 (d, 6,5)

28 18,5

3-OMe-β-D-Galf

1′ 108,3 108,2 4,97 (br s)

2′ 80,8 80,9 4,00 (dd, 2,5, 1,1)

3′ 88,8 88,9 3,74 (dd, 5,6, 2,5)

4′ 84,5 84,3 4,08 (dd, 5,6, 3,5)

5′ 73,2 73,2 3,74 (m)

6′ 65,2 65,1 3,65 (br d, 6,1)

3′-OMe 58,1 58,1 3,41 (s) aCD3OD, b700 MHz, c176 MHz, #δC số liệu của anthenoside M [74]

4.1.10. Hợp chất ASB10: (20R)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(-

D- galactofuranosyl)-24-methyl-5-cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,7,16-

tetraol (anthenoside S6, hợp chất mới)

Hợp chất ASB10 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng, vô định hình, độ

quay cực là []D25 = -59,4 (c = 0,1, MeOH). Công thức phân tử của hợp chất ASB10

96được xác định là C41H68O14 dựa trên kết quả phổ khối phân giải cao(+)-HR-ESI-MS

với pic ion phân tử [M + Na]+ tại m/z 807,4499 (tính toán lí thuyết cho công thức

C41H68O14Na là 807,4501) và các dữ liệu của phổ 13C-NMR.

Phân tích các phổ NMR 1D và 2D của ASB10 thì thấy đây là một hợp chất

steroid glycoside với aglycon có khung 8(14)-3,6,7,16-tetrahydroxysteroid gắn

với hai phân tử đường tại vị trí C-7 và C-16, tương tự như các hợp chất ASB5-ASB8.

Trên phổ (+)-ESI-MS/MS của pic ion [M + Na]+ tại m/z 807 có các mảnh ion tại m/z

613[(M + Na) - C7H14O6]+, 217 [C7H14O6 + Na]+; và trên phổ (-)-ESI-MS/MS của pic

ion [M - H]- tại m/z 783 có các mảnh ion tại m/z 589 [(M - H)-C7H14O6]-, 427 [(M –

H) - C7H14O6 – C6H10O5]- và 193 [C7H13O6]- chứng tỏ sự có mặt của một O-methyl-

hexose và một hexose trong phân tử của ASB10.


Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB10 có các tín hiệu của 5 nhóm methyl trong

đó có 2 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,85 (s, H3-19), và 0,93 (s, H3-18); 3 nhóm methyl

bậc 2 tại δH 1,04 (d, J = 6,9 Hz, H-26, H-27), và 1,06 (d, J = 6,8 Hz, H-21); 1 nhóm

methoxy tại δH 3,39 (s, OMe-6′′); 4 nhóm oxymethine tại δH 3,62 (m, H-6), 4,08 (m,

H-3), 4,23 (d, J = 2,8 Hz, H-7) và 4,46 (td, J = 9,0, 5,2 Hz, H-16) và 10 nhóm CH-O

của hai phân tử đường. Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu của 2 proton anomer của hai

gốc đường tại δH 4,95 ( d, J = 2,4 Hz, H-1′) và 4,99 ( d, J = 2,3 Hz, H-1′′) và tín hiệu

của một nhóm methylene olefin tại δH 4,72 (d, J =1,3 Hz, Ha-28)/4,75 (brs, Hb-28).

97


Phổ 13C-NMR và phổ HSQC cho thấy phân tử ASB10 có 41 nguyên tử carbon

trong đó có 5 nhóm methyl cộng hưởng tại δC 15,4, 20,1, 21,4, 22,5 và 22,3; 1 nhóm

methoxy tại δC 59,4; 4 cacbon sp2 tại δC 127,0 (>C=), 147,4 (>C=), 107,2 (CH2=) và

157,7 (>C=), gợi ý sự có mặt của 2 nối đôi; 4 nhóm carbon oxymethine tại δC 67,5,

75,2, 78,4 và 77,7; 2 carbon anomer tại δC 107,6 và 108,4; và 10 nhóm CH-O của hai

phân tử đường.

Các dữ liệu phổ NMR được cho là của chuỗi mạch nhánh cho thấy sự tồn tại

của 3 nhóm methyl bậc 2 là CH3-21 [δH 1,06 (d, J = 6,8 Hz); δC 21,4], CH3-26 [δH

1,04 (d, J = 6,9 Hz); δC 22,5] và CH3-27 [δH 1,04 (d, J = 6,9 Hz); δC 22,3]; và liên kết

đôi tại C-24/28 [δH 4,75 (brs), 4,72 (br d, J = 1,3 Hz); δC 107,2; 157,7] (bảng 4.11).

Tương tác giữa H-18/H-20; H-21/H-17 và H-22/H-16 trên phổ ROESY và các tương

tác giữa H-26 và H-27 (δH 1,04)/ C-25 (δC 34,9), C-24 (δC 157,7); H-21 (δH 1,06)/ C-

22 (δC 33,8), C-20 (δC 32,9), C-17 (δC 62,7); H-22 (δH 1,83/1,45)/ C-24 (δC 157,7); H-

23 (δH 2,23)/ C-20 (δC 32,9), C-25 (δC 34,9), C-26 (δC 22,5), C-27 (δC 22,3) trên phổ

HMBC cho phép xác định cấu trúc của phần mạch nhánh là 24(28)–24-methyl-

cholestane.

98



99



100

Hình 4.1.66.Phổ ROESY của hợp chất ASB10

Hình 4.1.67. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY của hợp chất ASB10

Khi so sánh các dữ liệu phổ 1H và 13C của ASB10 với dữ liệu phổ đã công bố

của hợp chất anthenoside S [74] thì thấy các dữ liệu tương ứng với phần aglycon của

hai hợp chất hoàn toàn trùng khớp (bảng 4.11).

Việc chiếu xạ các proton anomer trong thí nghiệm TOCSY 1D cho phép xác

định độ dịch chuyển hóa học và các hằng số tương tác J của H-1 đến H-6 của mỗi

đơn vị đường (bảng 4.11). Các dữ liệu của đơn vị đường thứ 1 (gắn với C-16) hoàn

toàn trùng khớp với dữ liệu công bố của -galactofuranose trong phân tử anthenoside

T [74], còn đơn vị đường thứ 2 (gắn với C-7) giống với 6-O-methyl--

galactofuranose của anthenoside S (bảng 4.11). Vị trí liên kết của các monosacchride

101 với khung steroid được xác định dựa trên phổ HMBC và ROESY, với các tương tác

giữa H-1’ của Galf và C-16, H-16 của phần aglycon, giữa H-1” của 6-OMe-Galf và C-

7, H-7 của phần aglycon. Do đó cấu trúc hóa học của ASB10 được tìm ra là (20R)-7-O-

(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(-D-galactofuranosyl)-24-methyl-5-

cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,7,16-tetraol, và được đặt tên là anthenoside

S6. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên.

Hình 4.1.68. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB10 và hợp chất anthenoside S


Vị

trí #δC #δH (mult., J, Hz) δC

a,c δHa,b (mult., J, Hz)

1 34,5 1,53 (m)/1,29 (m) 34,5 1,52 (m)/1,29 (m)

2 29,7 1,61 (m) 29,6 1,62 (m)

3 67,5 4,08 (m) 67,5 4,08 (m)

4

33,1

1,96 (td, 13,5, 2,6)

1,37 (m) 33,3

1,96 (td, 14,0, 2,8)

1,37 (br d, 14,0)

5 38,0 2,12 (dt, 13,6, 2,7) 38,0 2,13 (dt, 14,0, 2,8)

6 75,2 3,62 (t, 2,7) 75,2 3,62 (m)

7 78,3 4,22 (d, 2,7) 78,4 4,23 (d, 2,8)

8 127,0 - 127,0 -

9 45,9 2,26 (m) 45,8 2,26 (m)

10 38,8 - 38,9 -

11 19,5 1,65 (m)/1,54 (m) 19,5 1,65 (m)/1,54 (m)

102

12 37,2 1,80 (dt, 12,6, 3,3)

1,24 (m) 37,3

1,82 (dt, 12,3, 3,5)/1,26

(m)

13 44,9 - 45,1 -

14 147,2 - 147,4 -

15 33,3 2,88 (ddd, 17,0, 9,0, 2,8)

2,58 (ddd, 17,0, 6,0, 2,1) 33,8

2,87 (ddd, 17,0, 9,0, 3,1)

2,60 (ddd, 17,0, 5,2, 1,8)

16 76,9 4,45 (td, 9,0, 6,0) 77,7 4,46 (td, 9,0, 5,2)

17 62,8 1,45 (dd, 9,0, 4,0) 62,7 1,48 (dd, 9,0, 4,6)

18 20,1 0,92 (s) 20,1 0,93 (s)

19 15,4 0,85 (s) 15,4 0,85 (s)

20 32,8 1,65 (m) 32,9 1,67 (m)

21 21,4 1,04 (d, 6,9) 21,4 1,06 (d, 6,8)

22 33,5 1,78-1,85 (m)/1,42-1,46

(m) 33,8

1,79-1,86 (m)/1,43-1,47

(m)

23 33,8 2,22 (m)/1,92 (m) 33,3 2,22 (m)/1,92-1,97 (m)

24 157,7 - 157,7 -

25 34,8 2,26 (m) 34,9 2,27 (m)

26 22,5 1,04 (d, 6,9) 22,5 1,04 (d, 6,9)

27 22,3 1,04 (d, 6,9) 22,3 1,04 (d, 6,9)

28 107,2 4,74 (br s)

4,71 (br d, 1,3) 107,2 4,75 (br s)/4,72 (br d, 1,3)

6-OMe-β-D-Galf β-D-Galf

1′ 108,5 4,99 (br d, 1,5) 107,6 4,95 (d, 2,4)

2′ 83,4 3,92 (dd, 3,7, 1,5) 83,7 3,96 (dd, 4,8, 2,4)

3′ 78,8 3,95 (dd, 6,0, 3,7) 78,3 4,04 (dd, 7,2, 4,8)

4′ 85,0 3,87 (dd, 6,0, 3,7) 84,4 3,88 (dd, 7,2, 2,4)

5′ 70,8 3,84 (dd, 5,8, 3,7) 72,4 3,70-3,73 (m)

6′ 75,6 3,53 (d, 5,8) 65,4 3,62 (dd, 11,2, 7,2)

3,59 (dd, 11,2, 4,5)

OMe 59,3 3,39 (s)

3-OMe-β-D-Galf 6-OMe-β-D-Galf

103 1′′ 108,2 4,99 (br s) 108,4 4,99 (d, 2,3)

2′′ 81,2 4,07 (dd, 3,0, 1,7) 83,5 3,91 (dd, 3,8, 2,3)

3′′ 88,6 3,73 (dd, 6,0, 3,0) 78,7 3,95 (dd, 6,2, 3,8)

4′′ 84,0 3,98 (dd, 6,0, 3,0) 85,0 3,88 (dd, 6,2, 3,9)

5′′ 73,1 3,69 (dd, 6,0, 3,0) 70,8 3,83 (m)

6′′ 65,2 3,59 (d, 6,0) 75,5 3,53 (d, 6,0)

OMe 58,2 3,40 (s) 59,4 3,39 (s) aCD3OD, b700 MHz, c176 MHz, #δC số liệu của anthenoside S [74]

4.1.11. Hỗn hợp (ASB11) của anthenoside J ((20R,24R)-7-O-(6-O-methyl-β-D-


8(14)-ene-3α,6β,7β, 16α-tetraol) và anthenoside K ((20R,24S)-7-O-(6-O-methyl-β-

D-galactofuranosyl)-16-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-24-ethyl-5α-

cholest-8(14)-ene-3α,6β,7β,16α-tetraol.

ASB11 được phân lập dưới dạng chất rắn vô định hình màu trắng. Tương tự

như hợp chất ASB10, các dữ liệu phổ 1H và 13C NMR của ASB11 tương ứng với

một polyhydroxysteroid glycoside với khung aglycon là 8(14)-3α,6β,7β,16α-

tetrahydroxysteroid có gắn với một đơn vị 6-OMe-β-galactofuranose ở vị trí C-7.

ASB10 và ASB11 có các tín hiệu khác nhau ở chuỗi mạch nhánh và monosaccharide

gắn với vị trí C-16.

Phổ 1H-NMR của ASB11 có các tín hiệu cộng hưởng của 6 nhóm methyl tại

H 0,86 (s, H-19), 0,86 (d, J = 7,0 Hz, H-27), 0,87 (d, J = 7,0 Hz, H-26), 0,90 (s, H-

29), 0,93 (s, H-18), và 1,05 (d, J = 7,5 Hz, H-21), 2 tín hiệu singlet của 2 nhóm OMe

tại H 3,38 và 3,39, 4 tín hiệu của 4 nhóm oximethin của phần aglycon tại H 3,62 (br

t, J = 2,5 Hz, H-6), 4,08 (m, H-3), 4,22 (d, J = 2,5 Hz, H-7) và 4,48 (td, J = 9,0, 5,5

Hz, H-16), 2 proton anomer tại H 4,95 (d, J = 2,0 Hz, H-1’) và 4,99 (d, J = 1,5 Hz,

H-1”) và 10 nhóm CH thuộc hai đơn vị đường. Trong khi đó phổ 13C-NMR lại cho

tín hiệu của 9 cacbon tương ứng với các nhóm Me. Tương tác HSQC cho phép gán

các tín hiệu cacbon này với proton của nhóm methyl tương ứng: C 15,4 (C-19), 20,2

(C-18), 21,6 và 21,7 (C-21), 20,0 (C-26), 19,4 và 19,5 (C-27), 12,4 và 12,6 (C-29).

Ngoài ra phổ 13C còn có các tín hiệu của 1 nối đôi thế 4 lần tại C 127,0 (C-8) và

147,3 (C-14), 4 nhóm oximethin thuộc khung steroid tại C 67,5 (C-3), 75,2 (C-6),

78,3 (C-7) và 77,4 (C-16), 2 cacbon anomer tại C 107,7 (C-1’) và 108,5 (C-1”), 10

104 cacbon gắn với oxi của hai đơn vị đường trong vùng C 70,1-84,9 và 2 nhóm OMe

tại C 59,3. Khi so sánh với phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất ASB10, phổ NMR của

ASB11 không có các tín hiệu proton và cacbon của nối đôi 24(28), mà có thêm 1

nhóm CH2 (C-28) và 1 nhóm CH3 (C-29) có tương tác với nhau trên phổ COSY. Vị

trí của nhóm ethyl (C-28/C-29) gắn với C-24 được khẳng định bằng tương tác giữa

proton Me-29 với C-25 và C-28 trên phổ HMBC . Sự xuất hiện các cặp tín hiệu

cacbon trên phổ 13C-NMR của ASB11 tại C-21 (21,6, 21,7), C-22 (33,2, 33,3), C-23

(29,6, 29,8), C-24 (47,0, 47,2), C-27 (19,5, 19,4), C-29 (12,4, 12,6), cùng với các dữ

kiện phân tích ở trên, đã gợi ý ASB11 là một hỗn hợp epimer ở vị trí C-24.



105



Kết hợp các phổ NMR 1D và 2D cho phép xác định được tất cả các tín hiệu

tương ứng với proton và cacbon của ASB11. Khi so sánh các dữ liệu phổ của ASB11

với hỗn hợp anthenoside J ((20R,24R)-7-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-16-

O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-24-ethyl-5α-cholest-8(14)-ene-3α,6β,7β,16α-

106 tetraol) và anthenoside K ((20R,24S)-7-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-16-O-

(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-24-ethyl-5α-cholest-8(14)-ene-3α,6β,7β,16α-

tetraol) đã được phân lập trước đó từ sao biển Anthenea chinensis [30] thì thấy hoàn

toàn trùng khớp. Do đó có thể khẳng định ASB11 là hỗn hợp của anthenoside J và

anthenoside K.

Hình 4.1.73. Cấu trúc hóa học của AS11

Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR của hỗn hợp ASB11


a,b (mult., J = Hz)

1 34,5 34,5 -

2 29,6 29,6 -

3 67,5 67,5 4,08 (m)

4 33,3 33,2 1,96 (td, J = 13,5, 2,5)

5 38,0 38,0 2,13 (br d, J = 13,5)

6 75,2 75,2 3,62 (br t, J = 2,5)

7 78,4 78,3 4,22 (d, J = 2,5)

8 127,0 127,0 -

9 45,8 45,9 2,26 (br t, J = 2,5)

10 38,9 38,8 -

11 19,5 19,5 -

12 37,3 37,2 1,80 (br d, J = 12,0)

13 45,1 45,0 -

14 147,4 147,3 -

15 33,8 33,8 2,59 (dd, J = 17,0, 3,0)

2,88 (ddd, J = 17,0, 9,0, 3,0)

107 16 77,7 77,4 4,48 (td, J = 9,0, 5,5)

17 62,7 63,0 -

18 20,1 20,2 0,93 (s)

19 15,4 15,4 0,86 (s)

20 32,9 33,5 -

21 21,4 21,6; 21,7 1,05 (d, J = 7,5)

22 33,8 33,2; 33,3 -

23 33,3 29,6; 29,8 -

24 157,7 47,0; 47,2 -

25 34,9 30,2 -

26 22,5 20,0 0,87 (d, J= 7,0)

27 22,3 19,5; 19,4 0,86 (d, J= 7,0)

28 107,2 24,1 -

29 - 12,4; 12,6 0,90 (t, J= 7,5)

1’ 108,4 107,7 4,95 (d, J= 2,0)

2’ 83,5 83,7 -

3’ 78,7 78,3 -

4’ 85,0 84,9 -

5’ 70,8 70,1 -

6’ 75,5 75,9 3,50 (d, J = 6,5)

1’’ 59,4 108,5 4,99 (d, J = 1,5)

2’’ 83,5 83,4 -

3’’ 78,7 78,7 -

4’’ 85,0 84,3 -

5’’ 70,8 70,7 -

6’’ 75,5 75,5 3,53(d, J= 6,0)

2 x OMe 59,4 59,3 3,38 (s); 3,39 (s) aCD3OD, b700 MHz, c176 MHz, #δC số liệu của ASB10

4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất từ loài sao biển Anthenea aspera

4 hợp chất sterol và 7 hợp chất chứa N lần đầu tiên phân lập từ cặn chiết

hexane, ethyl acetat và metanol của loài sao biển Anthenea aspera thu thập tại vùng

biển Đông Bắc Việt Nam.

108 Bảng 4.13. Bảng tổng hợp các chất phân lập được từ sao biển Anthenea aspera

STT Tên các chất Cấu trúc Ghi chú

1 Cholesterol (AA1)

- Lần đầu

tiên được

phân lập

từ chi

Anthenea

- Lần đầu

tiên được

phân lập

2 Lathosterol (AA2)

3 Cholest-4-ene-3β,6β-

diol (AA3)

4 Cholestan-

3β,5α,6β,15α,16β-26-

hexol (AA4)

5 Cyclo(L-glycine-L-

proline) (AA5)

6 L-glycine-L-propyl

(AA6)

109 7 Cyclo(L-alanine-4-

hydroxyl-L-prolyl)

(AA7)

từ chi

Anthenea

8

L-Phenylalanine (AA8)

9 Tyramine (AA9)

10 Thymine (AA10)

11 Uracil (AA11)

4.2.1. Hợp chất AA1: cholesterol

Hợp chất AA1có điểm nóng chảy, Rf và phổ NMR trùng với hợp chất ASB1

nên xác định là cholesterol.

4.2.2. Hợp chất AA2: Lathosterol (Cholest-7,8-ene-3-ol)

Hợp chất AA2 được phân lập dưới dạng các tinh thể hình kim không màu,

nhiệt độ nóng chảy là 126-127 0C.

Phổ 1H-NMR của AA2 có các tín hiệu đặc trưng của 5 nhóm methyl trong đó

có hai nhóm methyl bậc 3 tại H 0,53 (s, H-18) và 0,79 (s, H-19), 3 nhóm methyl bậc

hai tại H 0,92 (d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,86 (d, J = 7,0 Hz, H-26) và 0,87 (d, J = 7,0

Hz, H-27); 1 nhóm oximethin tại H 3,60 (m, H-3) và 1 nhóm CH olefin tại H 5,15

(m, H-7). Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy trong phân tử AA2 có 5 nhóm CH3, 11

nhóm CH2, 8 nhóm CH trong đó có 1 CH olefin (C117,4, C-7) và 1 nhóm CH-O (C

71,7, C-3), và 3 cacbon bậc 4 trong đó có 1 cacbon sp2 (C 139,6, C-8). Các dữ liệu

này cho phép dự đoán hợp chất AA2 là một steroid khung cholestane có 1 nối đôi và

110 có 1 nhóm OH gắn với khung steroid. Độ rộng của tín hiệu proton của nhóm

oximethin là w1/2 = 22 Hz >20, cho phép dự đoán nhóm OH ở vị trí [69].

Hình 4.2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA2

Hình 4.2.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA2

111

Hình 4.2.3. Phổ DEPT của hợp chất AA2

Hình 4.2.4. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất AA2

112

Hình 4.2.5. Phổ HSQC của hợp chất AA2

Hình 4.2.6. Phổ HMBC của hợp chất AA2

113

Phổ COSY 1H-1H cho phép xác định các hệ spin như trong hình dưới đây (in

đậm):

Hình 4.2.7. Các tương tác chìa khóa trên phổ COSY và HMBC của AA2

Tương tự như hợp chất AA1 (cholesterol), việc kết hợp các phổ COSY, HSQC

(phụ lục) và HMBC cho phép xác định tất cả các tín hiệu proton và carbon của phân

tử hợp chất AA2. Tương tác giữa proton H-7 (H 5,15) với C-9 (C 49,5) và C-5 (C

40,3), H-6 (H 1,76) với C-7 (C 117,4) và C-8 (C 139,3), H-9 (H 1,61) với C-8 (C

139,3) trên phổ HMBC gợi ý vị trí của nối đôi tại C-7, C-8.

Khi so sánh dữ liệu phổ của AA2 với dữ liệu đã công bố của hợp chất

lathosterol (cholest-7,8-ene-3-ol) [69] thì thấy hoàn toàn trùng khớp (bảng 4.14).

Do đó có thể khẳng định hợp chất AA2 phân lập được là lathosterol.

Hình 4.2.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA2

114 Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của AA2 và hợp chất tham khảo

Vị trí #C Ca,c H

a,b(mult., J, Hz)

1 37,1 37,1 1,82 m/ 1,07 m

2 31,3 31,4 1,80 m/ 1,61 m

3 70,7 71,1 3,60 m

4 37,8 38,0 1,27 m/ 1,72 m

5 40,2 40,3 1,40 m

6 29,6 29,7 1,76 m

7 117,2 117,4 5,15 m

8 139,3 139,6 -

9 49,4 49,5 1,61 m

10 34,1 34,2

11 21,5 21,6 1,57 m, 1,45 m

12 39,5 39,5 1,20; 2,02 m

13 43,2 43,4

14 54,9 55,0 1,80 overlap

15 22,9 23,0 1,40m; 1,52 m

16 27,9 27,9 1,88 m; 1,26 m

17 56,1 56,1 1,20 m

18 11,8 11,8 0,53 s

19 12,9 13,0 0,79 s

20 36,1 36,0 1,36 m

21 18,8 18,8 0,92 d (6,5)

22 36,1 36.2 0,99 m; 1;34 m

23 23,9 23,9 1,14 m, 1,34 m

24 39,4 39,6 1,13-1,10 m

25 27,9 28,0 1,52 m

26 22,5 22,6 0,86 d (7,0)

27 22,7 22,8 0,87 d (7,0)

a CD3OD, b500 MHz, c125 MHz, #δC số liệu của TLTK [58]

115 4.2.3. Hợp chất AA3: cholest-4-ene-3,6-diol

Hợp chất AA3 phân lập được dưới dạng chất rắn màu trắng, nóng chảy ở 243-

245 0C. Phổ 1H-NMR của AA3 có các tín hiệu đặc trưng của khung steroid bao gồm

5 nhóm methyl trong đó có 2 nhóm methyl góc tại H 0,75 (s, H-18), 1,08 (s, H-19)

và 3 nhóm methyl gắn với nhóm CH tại H 0,86 (d, J = 6,5 Hz, H-27), 0,89 (d, J =

6,5 Hz, H-26), 0,95 (d, J = 6,5, H-21); 2 nhóm oximethin tại H 4,11-4,16 (m, H-3 và

H-6) và 1 CH olefin tại H 5,67 (d, J = 1,5 Hz, H-4).

Phổ 13C-NMR và DEPT của AA3 cho thấy phân tử AA3 có 27 nguyên tử

cacbon trong đó có 5 nhóm methyl, 10 nhóm CH2, 9 nhóm CH, và 3 cacbon bậc 4.

Độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử cacbon này cho thấy trong số đó có 1 nối

đôi C 121,4 (C-4) - 149,5 (C-5), 2 nhóm oximethin tại C 69,2 (C-3) và 68,6 (C-6).


116

Hình 4.2.10. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất AA3


Các dữ kiện trên kết hợp với việc so sánh với dữ liệu phổ của cholesterol cho

phép suy đoán AA3 là một hợp chất sterol dạng cholestane chứa 1 nối đôi và có 2

nhóm OH trong phân tử. Theo nghiên cứu tư liệu, các hợp sterol từ sao biển thường

có 1 nhóm OH ở vị trí 3, còn các nhóm OH khác nếu có thường ở vị trí 6(, ),

8,15(), 16, đôi khi có thêm ở các vị trí 4(), 5(), 7 (,) và 14() [8, 76]. Do đó

có thể dự đoán AA3 có một nhóm OH ở vị trí C-3. Độ dịch chuyển hóa học của H-3

(H 4,11-4,16) thuộc phân tử AA3 dịch về phía trường thấp hơn so với H-3 của

117 cholesterol (H 3,51) cho phép dự đoán nối đôi dịch về vị trí C-4, C-5. Các dữ liệu

trên phổ HSQC, HMBC và kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của cholesterol cho phép

gán các tín hiệu proton và cacbon của AA3 như trong bảng 4.2.3. Các vị trí C-10 (C

38,9), C-13 (C 43,3), C-9 (C 55,9), C-14 (C 57,4) và C-17 (C 57,6) được xác định

nhờ độ dịch chuyển hóa học đặc trưng và phổ DEPT, đồng thời kết hợp so sánh với

dữ liệu phổ của cholesterol. Nhóm methyl CH3-18 được xác định nhờ tương tác

HMBC giữa H-18 (H 0,75,s) với C-14 và C-13. Nhóm CH3-19 được xác định nhờ

tương tác HMBC giữa H-19 (H 1,08,s) với C-9 và C-10. Nhóm CH3-21 được xác

định nhờ tương tác HMBC giữa H-21 (H 0,95,d) với C-17 và CH-20 (C 37,1). Proton

của 2 nhóm methyl (Me-26, Me-27) còn lại tại [H (0,89; 0,86, d) có tương tác với

CH2-24 (C 40,7), CH-25 (C 29,1), và tương tác với cacbon giữa chúng. Vị trí của

nhóm OH thứ 2 được xác định ở vị trí C-6 nhờ các tương tác HMBC giữa H-7 (H

0,87) với C-6 (C 68,6), C-8 (C 35,8), C-9 (C 55,9); giữa H-9 (H 0,75) với C-7 (C

43,7). Ngoài ra khi so sánh điểm nóng chảy và các dữ liệu phổ 1H-NMR của AA3 với

dữ liệu công bố của hợp chất cholest-4-ene-3,6-diol [77] phân lập từ loài hải tiêu

Styela clava thì thấy hoàn toàn thống nhất. Do đó có thể xác định AA3 chính là

cholest-4-ene-3,6-diol.

Hình 4.2.12. Các tương tác HMBC chìa khóa của hợp chất AA3


Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR của AA3 và hợp chất tham khảo

118 C C

a,c Ha,b(mult., J, Hz) C δC

a,c Ha,b(mult., J, Hz)

1 37,4 1,76 (m); 1,32 (m) 15 25,2 1,64 (m); 1,40 (m)

2 29,6 1.91 (m); 1,49 (m) 16 29,2 1,88 ( m), 1,32 (m)

3 69,2 4,11-4,16 (trùng H-6) 17 57,6 1,14 (m)

4 121,4 5,67 (d, J 1,5 Hz) 18 12,4 0,75 (s)

5 149,5 - 19 19,2 1,08 (s)

6 68,6 4,11-4,16 (trùng H-3) 20 37,1 1,43 (m)

7 43,7 0,87 (m) 21 19,2 0,95 (d, J 6,5)

8 35,8 1,58 (m) 22 37,3 1,39 (m); 1,05 (m)

9 55,9 0,75 (m) 23 24,9 1,14-1,22 (m)

10 38,9 - 24 40,7 1,10-1,21 (m)

11 22,1 1,39; 1,53 (m) 25 29,1 1,55 (m)

12 41,1 2,04-2,06 (m) 26 23,2 0,89 (d, 6,5)

13 43,2 - 27 22,9 0,86 (d, 6,5)

14 57,4 1,07 (m) aCD3OD, b500 MHz, c125 MHz, #δC số liệu của TLTK [77]

4.2.4. Hợp chất AA4: cholestane 3,5,6,15,16,26-hexol

Hợp chất AA4 phân lập được dưới dạng chất rắn màu trắng, tan tốt trong các

dung môi phân cực như MeOH, EtOH.

Phổ 1H-NMR của hợp chất AA4 có các tín hiệu đặc trưng của 4 nhóm CH3 (2

singlet tại H 0,93 và 1,18 ppm; 2 doublet tại H 0,93 và 0,98 ppm) và 6 nhóm CH-O

có độ dịch chuyển hóa học tại vùng trường thấp (H 3,33-4,03 ppm).

Phổ 13C-NMR của AA4 có các tín hiệu của 27 nguyên tử cacbon trong số đó

có 6 cacbon gắn với oxi tại C 68,3; 68,4; 76,4; 76,6; 83,0 và 85,1 ppm. Phổ DEPT

cho biết phân tử hợp chất AA4 có 4 nhóm CH3 (C 15,1; 17,3; 17,4; 18,6 ppm), 10

nhóm CH2, 10 nhóm CH và 2 cacbon bậc 4 (C 39,3; 44,7) và 1 cacbon gắn với nhóm

hydroxyl (C 76,6). Trong số các nhóm CH2, có 1 tín hiệu ở vùng trường thấp (C

68,4) được cho là tương ứng với một nhóm CH2-OH.

119



Các dữ liệu phổ 1H và 13C cho phép xác định hợp chất AA4 là một sterol phân

cực dạng cholestane bão hòa có chứa 6 nhóm OH trong số đó có 1 nhóm CH2-OH (C

68,4), 1 nhóm C-OH (C 76,6) và 4 nhóm CH-OH (C 68,3; 76,4; 83,0; 85,1) với công

thức phân tử dự kiến là C27H48O6.

120 Phổ COSY 1H-1H cho phép thiết lập các hệ spin như trong hình 4.2.19 (liên

kết in đậm). Phổ HSQC cho phép gán các tín hiệu proton và cacbon tương ứng. Các

tương tác chìa khóa trên phổ HMBC được minh họa trong hình 4.2.19.

Hình 4.2.16. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất AA4


121


2

3

4

510

1

67

8

914

13

1211

1516

17 20

2122

23

24

2527

HOOH

OH

OH

19

18

OH26 OH

Hình 4.2.19. Tương tác COSY và HMBC chìa khóa của hợp chất AA4

Trên phổ HMBC có thể quan sát thấy các tương tác giữa proton của Me-19

với C-1, C-9,và C-10; giữa H-4 với C(3)-OH, C(5)-OH, H-6 với C-4, C-5, C-10, và

C-8; giữa proton Me-18 với C-12, C-13, C-14 và C-17; giữa H-15 với C-14, C(OH)-

16; giữa proton Me-21 với C-17, C-20 và C-22; giữa H-24 với C-27, H-23 với C-24,

H-26 với C-24, C-25 và Me-27. Các tương tác này cho phép liên kết các hệ spin để

tạo thành khung steroid như hình 4.2.19.

Tín hiệu của H-3 dưới dạng multiple tại H 4,04 ppm với hình dạng và độ rộng

(W1/2 = 20 Hz) đặc trưng của cấu hình H [78]. Trên phổ NOESY không xuất hiện

tương tác giữa H-6 và H-19, giữa H-15 và H-17 gợi ý cấu hình của H-6 ở dạng , H-

122 15 ở dạng . Tương tác NOESY giữa H-15 và H-18, giữa H-17 và H-16 khẳng định

cấu hình của H-15 và cấu hình của H-16.

Hình 4.2.20. Phổ NOESY của hợp chất AA4

Khi so sánh các dữ liệu phổ NMR của hợp chất AA4 với hợp chất cholestane-

3,5-,6,15,16-hexol đã được phân lập trước đó từ sao biển Luidia maculata [78]

thì thấy hoàn toàn trùng khớp (Bảng 4.16). Do đó có thể khẳng định AA4 là hợp chất

cholestane-3,5,6,15,16-hexol với cấu trúc như hình 4.2.21.

OHHO

OH

12

3

4 67

19

8 1516

2118

9

1112

1314

2625

242223

17

20

10

5

27

OH

OH

OH



C #C Cac H

ab, mult (J = Hz) HMBC (HC) NOESY

1 31,7 31,7 1,79 m; 1,51 m C-5, C-19

2 33,5 33,5 1,62 m; 1,35 m C-10

3 68,4 68,3 4,03 m (5,5)

4 41,6 41,5 2,08 dd (11,5; 13,0) C-3, C-5

5 76,6 76,6 -

123 6 76,6 76,4 3,49 dd (2,5; 3,0) C-4, C-5, C-8,

C-10

H-4, H-7

7 35,4 35,2 1,89 m C-6, C-8, C-9,

C-14

8 32,2 31,1 2,01 m C-7, C-9, C-14

9 46,7 46,6 1,41 m

10 39,5 39,3 -

11 22,0 21,9 1,38 m C-13

12 42,1 42,0 1,98 m; 1,20 m C-9, C-14

13 44,9 44,7 -

14 61,2 60,9 0,98 m C-13, C-16, C-18

15 85,0 85,1 3,76 dd (2,5; 10,0) C-8, C-14, C-16 H-18

16 83,2 83,0 3,99 dd (2,5; 7,5) C-13, C-15 H-17

17 60,1 59,9 1,27 m C-13, C-18, C-20

18 15,2 15,1 0,93 s C-12, C-13,

C-14, C-17

19 17,2 17,3 1,20 s C-1, C-5, C-9,

C-10

20 31,0 31,0 1,89 m C-17

21 18,6 18,6 0,98 d (5,5) C-17, C-20, C-22

22 37,5 37,4 1,08 m C-21

23 24,8 24,8 1,46 m; 1,23 m C-24

24 35,0 34,9 1,43 m; 1,06 m C-27

25 37,0 37,0 1,58 m

26 68,6 68,4 3,45 dd (6,0; 10,5);

3,34 overlapped

C-24, C-25, C-27

27 17,3 17,4 0,93 d (6,5) C-24, C-25, C-26 aCD3OD, b500 MHz, c125 MHz, #δC số liệu của TLTK [78]

4.2.5. Hợp chất AA5: cyclo(L-glycine-L-proline) (Hợp chất lần đầu tiên phân lập

từ chi Anthenea )

Hợp chất AA5 phân lập được có dạng tinh thể hình kim không màu, nóng chảy ở

nhiệt độ 220-222 0C, tan trong dichloromethane, Rf = 0,48 (DCM/MeOH 85:15). Phổ

124 1H-NMR của hợp chất AA5 thể hiện các tín hiệu của 10 proton trong đó có 1 proton

ở vùng trường thấp tại H 7,35ppm (brs, H-N), 5 proton gắn với cacbon liên kết với

dị tử nitơ trong khoảng H 3,5-4,1 ppm và 4 proton trong khoảng H 1,9-2,4 ppm.

Hình 4.2.22. Phổ 1H-NMR của AA5

Phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thấy phân tử AA5 có 7 nguyên tử carbon

trong đó có 2 nhóm cacbonyl (C=O, C-1, C-1’) tại C 170,1 và 163,6 ppm, 4 nhóm

CH2 trong đó có 2 nhóm gắn với dị tử nitơ tại C 46,5 và 45,2 (C-2, C-5’) và 1 nhóm

CH gắn với dị tử nitơ tại C 58,5 (C-2’).

Phổ COSY 1H-1H, HSQC và các hằng số tương tác J cho phép thiết lập được

chuỗi cacbon từ CH-2’ (H 4,10; C 58,5) – CH2-3’ (H 2,06, 2,38; C 28,4) – CH2-

4’ (H 1,92; 2,06; C 22,3) – CH2-5’ (H 3,56, 3,64; C 45,2). Nhóm CH2-2 (H 3,90,

4,10; C 46,5) chỉ có tương tác COSY với với nhóm N-H tại (H 7,35).

125


Hình 4.2.24. Phổ COSY của hợp chất AA5

126



Các tương tác giữa H-2 với C-1 (C 163,6) và C-1’ (C 170,1), H-N với C-1 và

C-2’, H-3’ với C-1’, H-5’ với C-1 trên phổ HMBC, cùng với tất cả các dữ liệu phổ

đã phân tích ở trên cho phép dự đoán AA5 có cấu trúc hóa học là cyclo(L-Glycyl-L-

Prolyl). Khi so sánh các dữ liệu phổ 1H NMR của AA5 với dữ liệu phổ đã công bố

127 của cyclo (L-Glycyl-L-Prolyl) [79] thì thấy hoàn toàn phù hợp. Ngoài ra cũng có sự

khác biệt về độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu 13C của AA5 so với dữ liệu 13C

của hợp chất mạch thẳng L-Gly-L-Pro [80] ở các vị trí C-1, C-1’ và C-5’. Do đó có

thể khẳng định hợp chất AA5 là cyclo(L-Gly-L-Pro) ((8aS)-hexahydropyrrolo[1,2-

a]pyrazine-1,4-dione,CTPT: C7H11N2O2).


Vị

trí

,Ha cδ (mult,

J, Hz)

cyclo(L-

Gly-L-Pro)

[79]

,Ha cδ (mult, J, Hz)

(AA5)

,bCaδ

(AA5)

HMBC

(H→C)

(AA5)

,d eC

δ

L-Gly-L-

Pro [80]

Gly

1 - 163,6 175,6

2

4,10

3,87 (dd)

4,10*

3,90 (dd, 4,5;

16,5)

46,5

C-1, C-1′

46,2

NH 7,15 7,35 (br s) C-1, C-2′

Pro

1′ 170,1 169,3

2′ 4,11 4,10* 58,5 C-3’, C-4’ 59,6

3′ 1,75-2,55 2,38 (m)/2,06*

(2,34-2,41) 28,4

C-1′, C-2′, C-

4′, C-5′ 29,2

4′ 1,75-2,55 1,92 (m)/2,06*

(1,86-2,11) 22,3

C-2′, C-3′, C-

5′ 23,6

5′ 3,58 (m) 3,64 (m)/3,56 (m)

(3,58, m) 45,2

C-1, C-2′, C-

3′, C-4′ 43,0

Đo trong aCDCl3, , b125 MHz, c500 MHz, *Tín hiệu trùng, dD2O, eCD3OD.

128 Hình 4.2.27. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA5 và L-Gly-L-Pro (AA6)

4.2.6. Hợp chất AA6: L-glycine-L-prolin (Hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi

Anthenea)

Hợp chất AA6 phân lập được có dạng tinh thể hình kim không màu, tan trong

methanol, không tan trong chloromethane, Rf = 0,35 (DCM/MeOH 85:15). Phổ 1H

và 13C-NMR của AA6 có đầy đủ các tín hiệu tương tự như của AA5. Tuy nhiên trên

phổ 1H, proton H-2’ và H-2 của AA6 hoàn toàn tách biệt khỏi nhau chứ không trùng

lên nhau như của AA5. Do đó 2 tín hiệu doublet của H-2 được quan sát rõ trên phổ.

Độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu cacbon trên phổ 13C-NMR của AA6 cũng

có sự thay đổi so với AA5, đặc biệt là C-1 và C-1’. Khác với AA5, trên phổ HMBC

của AA6 không xuất hiện tương tác của H-5’ với C-1 nên có thể dự đoán AA6 là

dipeptide L-Gly-L-Pro mạch thẳng. Ngoài ra các tính chất hóa lý của AA6 như độ

phân cực lớn hơn AA5, không tan trong dung môi it phân cực như DCM, chỉ tan tốt

trong MeOH, EtOH, cũng thống nhất với dự đoán này. So sánh các dữ liệu phổ của

AA6 với dữ liệu của L-Gly-L-Pro đã được công bố [80] thì thấy hoàn toàn tương

đồng. Do đó, cấu trúc hóa học của AA6 được xác định là L-Glycyl-L-Prolyl (Hình

4.2.31).

Hinh 4.2.28. Phổ 1H-NMR của hợp AA6

129

Hinh 4.2.29. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA6


3'

2'1' N

H

21

4'

5'NH

OOH

O

Hình 4.2.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất L-Gly-L-Pro


Vị trí #δC [80]

L-Gly-L-Pro ,a b

Cδ (AA6) , a c

Hδ (mult, J.,Hz)

(AA6)

HMBC

(H→C) (AA6)

Gly

1 175,6 172,0

2 46,2 47,0

4,12 (ddd, 17,0;

2,0; 1,0)

3,76 (d, 17,0)

C-1, C-1’

NH

Pro

1′ 169,3 166,5

2′ 59,6 59,9 4,25 (m) C-3’

3′ 29,2 29,3 2,35 (m)

1,99 (m)

4′ 23,6 23,3 2,04 (m)

1,96 (m) C-5’

5′ 46,3 46,3 3,52-3,60 (m) C-4’

aMeOD–d4, #D2O, b125 MHz, c500 MHz.

4.2.7. Hợp chất AA7: cyclo(L-alanyl-4-hydroxyl-L-prolyl) (Hợp chất lần đầu phân

lập từ chi Anthenea)

Hợp chất AA7 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, nhiệt

độ nóng chảy 232-233 0C. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA7 thể hiện tín hiệu của 9

proton trong đó có 1 proton dưới dạng singlet dải rộng (H 4,63 ppm) đặc trưng cho

proton liên kết với nitơ (NH), 2 nhóm CH gắn với nitơ và 1 nhóm oximetin trong

vùng H 4,24-4,56 (H-2, H-2’, H-4’), 1 nhóm CH2 gắn với nitơ tại H [3,69 ppm (1H,

dd, J = 4,5 Hz và 13,0 Hz, H-5’a); 3,45 ppm (1H, d, J = 13,0 Hz, H-5’b)], 1 nhóm

CH2 tại H [2,11 (ddd, J = 4,0 ; 11,0; 13,5 Hz); 2,30 (dd, dd, J = 6,5 và 13,5 Hz) và

1 nhóm methyl dưới dạng doublet tại H 1,40 ppm (3H, d, J = 7,0 Hz, H-3).

Các phổ 13C-NMR và DEPT của AA7 có 8 tín hiệu của nguyên tử cacbon,

trong đó có có 2 nhóm C=O tại C 172,8 ppm (C-1’) và 169,1 ppm (C-1), 2 nhóm

metin liên kết với nitơ tại C 52,1 (C-2), 58,9 (C-2’) và 1 nhóm oximetin tại C 69,1

131 (C-4’); 1 nhóm CH2 gắn với nitơ tại C 55,2 (C-5’), 1 nhóm metylen (CH2) tại C

38,2 (C-3’), 1 nhóm methyl (CH3) tại C 15,7 (C-3).


Kết hợp các phổ COSY 1H-1H và HSQC của AA7 cho phép ta thiết lập được hai

chuỗi cacbon:

1) CH-2 (H 4,26; C 52,1) – CH3-3 (H 1,41; C 15,7)

2) CH-2’ (H 4,54; C 58,9) – CH2-3’(H 2,10 và 2,30; C 38,2) – CH-4’ (H 4,49; C

69,1) – CH2-5’ (H 3,47 và 3,69; C 55,2)

132



133



Phổ HMBC của AA7 thể hiện các tương tác giữa H-2’, H-3’/C-1’ (C 172,8); H-

5’, H-2, H-3/C-1 (C 169,1) cho phép dự đoán AA7 có cấu trúc mạch vòng tương tự

AA5. Do đó cấu trúc hóa học của AA7 được xác định là cyclo(L-alanine-4-hydroxy-

L-proline). Hợp chất này đã được công bố có hoạt tính kháng nấm Plasmopara

viticola trên cây nho [81].

134



C #C Cac H

ab, mult (J = Hz) HMBC (HC)

1 163,6 169,1 -

2 46,5 52,1 4,26 C-1

3 15,7 - C-1

1’ 170,1 172,8 -

2’ 58,5 58,9 4,54 C-1’

3’ 28,4 38,2 2,30 (dd, dd, 6,5; 13,5) C-1’

4’ 22,3

69,1 4,49

2,11 (ddd, 4,0 ; 11,0; 13,5)

-

5’ 45,2

55,2 3,69 (dd,4,5; 13,0)

3,45 (d,13,0)

C-1

N-H - - 4,63 - aCD3OD, b500 MHz, c125 MHz, #δC số liệu của TLTK [81].

4.2.8. Hợp chất AA8: L-Phenylalanine

Hợp chất AA8 là chất bột màu trắng, nóng chảy ở nhiệt độ 173 0C. Phổ 1H-

NMR của hợp chất AA8 cho thấy có tín hiệu của 5 proton vòng thơm (7,38 -7,28

ppm) chứng tỏ vòng thơm bị thế 1 lần, 1 nhóm CH (δH 3,79 ppm, dd, J = 4,5 và 9,0

Hz, H-8) đặc trưng cho dấu hiệu proton của nhóm CH liên kết với nitơ (NH) và 1

nhóm CH2 (δH 3,33 ppm, dd, J = 4,5 và 14,5 Hz, H-7).

Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy phân tử AA8 có tín hiệu của 9 nguyên tử

cacbon, trong đó có có 1 nhóm C=O (C 173,8, C-9), 6 cacbon thuộc vòng thơm trong

đó có 5 nhóm CH [C 128,4 (C-4); 130,0 (C-2, C-6) ;130,4 (C-3, C-5)] và 1 cacbon

bậc 4 (C 137,3; C-1), 1 nhóm CH (δC 57,6; C-8) và 1 nhóm CH2 (δC 38,3; C-7).

Phổ COSY 1H-1H có tương tác của các proton thơm với nhau, và của nhóm

CH (δH 3,80, dd, J = 4,5; 9,0 Hz, C-8) với nhóm CH2 [δH 3,33 (trùng với dung môi)

và 3,01, dd, C-7] cho phép ghép nối các mảnh cấu trúc C-7/ C-8; (Hình 4.2.37).

135



136



137


Phổ HSQC cho phép xác định các cacbon gắn với proton tương ứng. Phổ HMBC

có các tương tác giữa proton H-8 với C-7 (δC 38,3 ppm), C-1 (δC 137,3 ppm), C-9 (δC

173,8 ppm); giữa H-7a với C-8 (δC 57,6 ppm), C-2, C-6 (δC 130,0 ppm), C-1 (δC 137,3

ppm), C-9 (δC 173,9 ppm); giữa H-7b/ C-8 (δC 57,6 ppm), C-2, C-6 (δC 130,0 ppm),

C-1 (δC 137,3 ppm), C-9 (δC 173,9 ppm). Các dữ kiện này cho thấy nhóm CH (C-8)-

CH2 (C-7) gắn với C-9 và C-1.

Hình 4.2.43. Tương tác COSY và HMBC chìa khóa của hợp chất AA8

Khi so sánh các dữ liệu phổ NMR của hợp chất AA8 với hợp chất N-caffeoyl

phenylalanine đã được phân lập trước đó từ cây dương xỉ Athyrium filix-femina [82]

thì thấy hoàn toàn trùng khớp phần amino acid (Bảng 4.20). Do đó có thể khẳng định

AA8 là hợp chất L-phenylalanine với cấu trúc như hình 4.2.43.


C #C Cac H

ab, mult (J = Hz) HMBC

(HC)

1 135,3 137,3 -

2 128,7 130,0 7,28-7,38 (m, 5H, H-Ar);

3 129,7 130,4 7,28-7,38 (m, 5H, H-Ar);

4 130,7 128,4 7,28-7,38 (m, 5H, H-Ar);

5 129,7 130,4 7,28-7,38 (m, 5H, H-Ar);

6 128,7 130,0 7,28-7,38 (m, 5H, H-Ar);

7 37,8 38,3 3,33 (dd, 1H, J = 4,5; 14,5 Hz, H-7),

3,02 (dd, 1H, J = 9,0; 14,5 Hz, H-7).

C-8, C-2, C-6,

C-1, C-9

8 55,5 57,6 3,79 (dd, 1H, J = 4,5; 9,0 Hz, H-8); C-7, C-1, C-9

9 174,2 173,8 - aCD3OD, b500 MHz, c125 MHz, #δH dữ liệu của [82] đo trong CD3OD.

4.2.9. Hợp chất AA9: tyramine

Hợp chất AA9 là chất bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 165 0C. Cũng tương tự

như chất hợp chất AA8, phổ 1H-NMR của hợp chất AA9 cho biết có tín hiệu của 4

proton thuộc vòng thơm độ chuyển dịch hóa học δH 6,79 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H-3, H-

5) và 7,11 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H-2, H-6), gợi ý sự có mặt của 2 nhóm thế ở vị trí para

với nhau. Ngoài ra xuất hiện tín hiệu 2 nhóm metylen CH2 ở δH 2,88 (dd, 2H, J =

8,0; 7,0 Hz, H-7) và 3,13 (dd, 2H, J = 8,0; 7,0 Hz, H-8) trong đó có một nhóm metylen

ở δH 3,13 gắn với N.

Phổ 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của 8 nguyên tử carbon trong

đó 6 nguyên tử carbon vòng thơm tại δC 116,7 ppm (C-3, C-5); δC 128,5 ppm (C-1);

δC 130,8 ppm (C-2, C-6) và δC 157,8 ppm (C-4) trong đó C-4 có gắn với oxi, và 2

nhóm methylen CH2 (δC 34,0 ppm và 42,3 ppm) trong đó có một nhóm gắn với N.

139



Khi so sánh các dữ liệu phổ NMR của hợp chất AA9 với hợp chất N-

acetyltyramine [83] thì thấy nhiều điểm tương đồng (Bảng 4.21). Do đó có thể dự

đoán hợp chất AA9 chính là tyramine.


140 Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất AA9 và hợp chất tham khảo

C #C Cac H

ab, mult (J = Hz)

1 128,3 128,5 -

2 130,5 130,8 7,11 d (8,5)

3 116,2 116,7 6,79 d (8,5)

4 156,6 157,8 -

5 116,2 116,7 6,79 d (8,5)

6 130,5 130,8 7,11 d (8,5)

7 35,1 34,0 2,88 dd (8,0; 7,0)

8 42,3 42,3 3,13 dd (8,0; 7,0)

C=O 177,0 -

CH3 10,5 - aCD3OD, b500 MHz, c125 MHz, #δC dữ liệu [83] đo trong CD3OD.

4.2.10. Hợp chất AA10: thymine

Hợp chất AA10 phân lập được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt

độ nóng chảy 316-317 0C. Phổ 1H-NMR cũng như Rf và điểm nóng chảy của AA10

hoàn toàn đồng nhất với các dữ liệu ASB2. Do đó có thể xác định AA10 chính là

thymine.

Hình 4.2.47. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA10 (đo trong DMSO-d6)

141

2

3 NH

4NH1

O

O

5


4.2.11. Hợp chất AA11: uracil

Hợp chất AA11 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, nóng chảy

ở nhiệt độ 334-335 0C. Phổ 1H-NMR của AA11 xuất hiện 1 tín hiệu singlet dải rộng

tại δH 11,0 ppm (NH) và 2 tín hiệu doublet tại vùng trường thấp δH 5,44 ppm (J = 7,5

Hz, H-2) và 7,38 ppm (J = 7,5Hz, H-3) tương ứng với 1 nối đôi CH=CH. Phổ 13C-

NMR có các tín hiệu cộng hưởng của 4 nguyên tử carbon, trong đó có 2 nhóm

carbonyl C=O tại δC 164,3 (C-1) và δC 151,5 ppm (C-4), và 2 cacbon sp2 tại δC 100,2

(C-2) và δC 142,1 (C-3).

So sánh các dữ liệu phổ 1H và 13C của AA11 với AA10 và dữ liệu phổ của uracil

[84,85] có thể nhận thấy phân tử AA11 không có nhóm methyl -CH3 mà thay vào đó

là 1 nhóm metin –CH so với phân tử AA10, và được xác định là uracil. Đây là

nucleobase thường được tìm thấy ở các loài sao biển.


142


NH

NH

O

O

1

3 42



C #C Cac H

ab, mult (J = Hz)

1 167,5 164,3 -

2 110,4 100,2 5,44 ppm (J =7,5Hz, H-2)

3 139,2 142,1 7,38 ppm (J =7,5Hz, H-3)

4 150,3 151,5 -

5 12,1 - -

N-H 11,8 11,0 aCD3OD, b500 MHz, c125 MHz, #δc số liệu của TLTK [84,85]

4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của một số chất mới phân lập từ sao biển A.

sibogae

Theo nghiên cứu tư liệu, trước đó có 25 hợp chất steroid glycoside mới đã

được phân lập từ 2 loài sao biển thuộc chi Anthenea là A. chinensis và A. aspera. Các

hợp chất này đều có chung đặc điểm chung về mặt cấu trúc bao gồm phần khung

cholestane với nối đôi ở vị trí 8,14 và 1-2 phân tử đường gắn vào vị trí C-7 và/hoặc

C-16, do đó được đặt tên là các anthenoside. Kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học

của lớp chất này cho thấy các chất anthenoside E, G, H, I và hỗn hợp J +K thể hiện

hoạt tính ức chế đối với dòng tế bào ung thư ở người là K-562 và BEL-7402. Hỗn

hợp anthenoside J+K còn thể hiện khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào U87MG

143 và thúc đẩy sự polymer hóa tubulin [30]. Các anthenoside E, G, J, K, V, W, X đều

thể hiện khả năng ức chế sự hình thành khối tế bào ung thư đối với dòng ung thư sắc

tố RPMI-7951, ung thư vú T-47D và đại tràng HT-29 ở liều không gây độc. Hỗn hợp

anthenoside J+K còn thể hiện hoạt tính chống ung thư tương đối mạnh và hoạt tính

gây ra apoptosis trên dòng tế bào HT-29 [28,29].

Trên cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn các hợp chất steroid glycoside được phân

lập từ sao biển Anthene sibogae là ASB5-ASB11 (anthenoside S1-S6, trừ anthenoside

S3 vì khối lượng chất không đủ, và hỗn hợp anthenoside J+K ) cho các thử nghiệm

đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và chống tăng sinh tế bào.

4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Các hợp chất ASB5, ASB6, ASB8-ASB11 được thử nghiệm độ gây độc tế bào

trên dòng tế bào ung thư vú ở người T-47D theo phương pháp MTS. Chất đối chứng

dương được chúng tôi lựa chọn là cisplatin – một tác nhân hóa trị thường được sử

dụng trong điều trị một số bệnh ung thư ở người như ung thư phổi, đầu và cổ, thận,

buồng trứng và tiền liệt tuyến [86,87.88].

Kết quả cho thấy các hợp chất được thử nghiệm và cisplatin đều không gây

độc tế bào đối với dòng tế bào T-47D ở nồng độ lên đến 150 μM.

4.3.2. Hoạt tính chống tăng sinh tế bào

Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng các hợp chất ASB5, ASB6, ASB8 và hỗn hợp

ASB11 lên sự tăng sinh tế bào T-47D theo thời gian. Các hợp chất ASB5, ASB6và

ASB8 không thể hiện hoạt tính ức chế tăng sinh đối với dòng tế bào T-47D ở nồng

độ 50 μM, trong khi hỗn hợp ASB11 ức chế sự tăng sinh của tế bào T-47D sau 24

giờ, 48 giờ và 72 giờ ở cùng nồng độ so với chất đối chứng cisplatin. Sau 24 giờ hỗn

hợp ASB11 làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D 10% trong khi chất đối chứng

cisplatin làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D 20%. Sau 48 giờ hỗn hợp ASB11

làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D khoảng 20% trong khi chất đối chứng

cisplatin làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D khoảng 50%. Hỗn hợp ASB11 (50

μM) làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D sau 72 giờ là 47%, chất đối chứng

cisplatin (15 μM) làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D sau 72 giờ là 67% (Hình

4.3.1).

144

Hình 4.3.1. Hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào T-47 theo thời gian của hỗn hợp

ASB11 và cisplatin

4.3.3 Khảo sát hoạt tính ức chế sự hình thành khối tế bào ung thư trên thạch mềm

Hoạt tính ức chế sự hình thành khối tế bào ung thư (colony formation) của

dòng tế bào T-47D của các hợp chất ASB5, ASB6, ASB8 và hỗn hợp ASB11 được

khảo sát thông qua thử nghiệm trên thạch mềm.

Các tế bào T-47D (8 × 103) được xử lý với các hợp chất ASB5, ASB6, ASB8

và hỗn hợp ASB11 ở nồng độ 50 μM hoặc với cisplatin (1 μM) (chứng dương) trong

chất nền thạch mềm và được ủ ở 370C trong buồng ủ với 5% CO2 trong 2 tuần. Các

khối tế bào (colony) được đếm dưới kính hiển vi với sự trợ giúp của phần mềm

ImageJ.

Hình 4.3.2. Hiệu quả ức chế sự phát triển tế bào ung thư vú T-47D của các chất

ASB5, ASB6, ASB8 và hỗn hợp ASB11 so sánh với mẫu chứng

Kết quả cho thấy ở nồng độ 50 μM các hợp chất ASB5, ASB6 và ASB8 không

có thể hiện sự ức chế số lượng cũng như kích thước các khối tế bào ung thư vú T-

47D khi so sánh với mẫu chứng. Trong khi đó, hỗn hợp ASB11 cũng không ức chế

số lượng các khối tế bào nhưng lại làm giảm hơn một nửa kích thước của khối tế bào

145 T-47D. Cisplatin (1 μM) ức chế sự hình thành khối tế bào ung thư khoảng 48% (Hình

4.3.2.A).

Về mặt cấu trúc, các hợp chất ASB5-10 cũng như các hợp chất anthenoside

khác phân lập được từ sao biển A. chinensis và A. aspera, đều có phần glycon gần

giống với hỗn hợp ASB11 (anthenoside J+K), tuy nhiên ở phần aglycon thì ASB11

có phần mạch nhánh của khung steroid khác với các anthenoside còn lại, cụ thể là

dạng mạch nhánh bão hòa, và có thêm 1 cacbon so với mạch nhánh của khung

cholestane. Các thí nghiệm sinh học trước đó [28-30] cũng chỉ ra hỗn hợp anthenoside

J+K có hoạt tính gây độc tế bào và chống tăng sinh tế bào ung thư mạnh hơn các

anthenoside khác. Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu cơ chế hoạt tính của hỗn hợp này,

cũng như mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính của các anthenoside phân lập từ chi

Anthenea.

146 CHƯƠNG V - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

1. Nghiên cứu về thành phần hóa học

Bằng cách sử dụng kết hợp phương pháp sắc ký và các phương pháp phổ hiện

đại, đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học 22 hợp chất từ hai loài sao biển A.

aspera và A. sibogae, trong đó có 6 hợp chất mới.

Từ sao biển Anthenea sibogae đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học 11

hợp chất (ASB1-ASB11) trong đó có 6 hợp chất mới (ASB5-ASB10) được đặt tên

là: anthenoside S1, anthenoside S2, anthenoside S3, anthenoside S4, anthenoside S5,

anthenoside S6 và 5 hợp chất đã biết là cholesterol (ASB1), thymine (ASB2), L-

tyrosine (ASB3), tryptophan (ASB4) và hỗn hợp của anthenoside J và anthenoside

K (ASB11).

Từ sao biển Anthenea aspera đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học

của 11 hợp chất (AA1-AA11) trong đó 11 hợp chất đều được phân lập lần đầu tiên từ

chi Anthenea : cholesterol (AA1), lathosterol (AA2), cholest-4-ene-3β,6β-diol

(AA3), cholestane 3,5,6,15,16,26-hexol) (AA4), cyclo(L-glycine-L-proline)

(AA5), L-glycine-L-prolin (AA6), cyclo(L-alanine-4-hydroxyl-L-proline) (AA7), L-

phenylalanine (AA8), tyramine (AA9), thymine (AA10) và uracil (AA11).

2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Lần đầu tiên, các hợp chất glycoside steroid mới: anthenoside S1-S6 phân lập

từ sao biển A. sibogae đã được nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào, hoạt động

chống tăng sinh tế bào và khả năng ức chế sự hình thành khuẩn lạc trên đĩa thạch

mềm trên dòng tế bào ung thư vú T-47D.

Các hợp chất ASB5, ASB6 và ASB8 không cho thấy hoạt động ức chế đối với

các dòng tế bào T-47D ở nồng độ 50 μM, trong khi hỗn hợp ASB11 ức chế sự tăng

sinh của các tế bào T-47D sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ ở cùng nồng độ so với chất

đối chứng cisplatin. Hỗn hợp ASB11 (50 μM) làm giảm sự tăng sinh tế bào T-47D

sau 72 giờ là 47%, đối chứng cisplatin (15 μM) làm giảm sự tăng sinh tế bào sau 72

giờ là 67%.

Ở nồng độ 50 μg / ml các steroid glycoside ASB5, ASB6, ASB8, ASB11 ức

chế kích thước các khối tế bào ung thư vú T-47D lần lượt là 23%, 19%, 30%, 52%.

147 5.2. Kiến nghị

1. Đây là nghiên cứu ban đầu về hoạt tính sinh học của một số glycoside steroid được

phân lập từ các loài sao biển A. sibogae và A. aspera. Những thí nghiệm sinh học này

mới chỉ dừng lại ở mức độ thăm dò và cần được nghiên cứu thêm về cơ chế hoạt

động.

2. Cần thử hoạt tính chống ung thư của các hợp chất này trên các dòng tế bào ung thư

khác ở người và một số hoạt tính sinh học khác như hoạt tính kháng viêm, kháng

khuẩn và hoạt tính neuritogenic.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

1. Kicha AA, Ha DT, Ivanchina NV, Malyarenko TV, Kalinovsky Al, Dmitrenok

PS, Ermakova SP, Malyarenko OS, Hung NA, Thuy TTT, Long PQ, Six new

polyhydroxysteroidal glycoside Anthenosides S1 – S6, from the stafish Anthenea

sibogae, Chemistry & Biodiversity, 2018, 15 (3), e1700553.

2. Nguyen Anh Hung, Dinh Thi Ha, Tran Thi Thu Thuy, Pham Quoc Long, Alla.

A.Kicha. Steroidal diglycoside from the starfish Anthenea sibogae, Vietnam Journal

of Science and Technology, 2018, 56 (4A), 121- 126.

3. Nguyen Van Tuyen Anh, Doan Lan Phuong, Nguyen Anh Hung, Pham Minh

Quan, Tran Thi Thu Thuy, Biochemical constituents of some Vietnames starfish,

Vietnam Journal of Science and Technology, 2016, tập 54 (2B), 263-269.

4. Đoàn Lan Phương, Phạm Văn Công, Đinh Thị Hà, Nguyễn Anh Hưng, Nguyễn

Văn Tuyến Anh, Phạm Quốc Long, Trần Thị Thu Thủy, Một số hợp chất chứa nitơ

được phân lập từ loài sao biển Anthenea aspera của Việt Nam, Tạp chí khoa học và

công nghệ, 2014, tập 52 (5A), 89-95.

5. Phuong, D. L., Thuy, T. T. T., Nguyet, N. T., Huong, D. T., Hung, N. A., Bordoloi,

M., & Long, P. Q. First study on chemical constituents of starfish Anthenea aspera

from Vietnamese northeast sea. Успехи наук о жизни, 2013, 7, 66-67.

6. Nguyễn Anh Hưng, Nguyễn Thị Hải Yến, Đặng Thị Thúy Hồng, Trần Thị Thu

Thủy, Phạm Quốc Long. Phân lập các hợp chất từ cặn dichloromethane của loài sao

biển Anthenea sibogae, Tạp chí Khoa học trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, 2020

(Giấy chấp nhận đăng).

148 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. http://www.nationalgeographic.com

2. Prager, E. Sex, Drugs, and Sea Slime: The Oceans' Oddest Creatures and Why

They Matter. The University of Chicago Press, 2012, The United States of

America, ISBN 9780226678726.

3. Zhang, W., Guo, Y., Gu, Y. Secondary metabolites from the South China Sea

invertebrates: chemistry and biological activity, Curr. Med. Chem., 2006, 13(17),

2041-2090.

4. http://www.tolweb.org/Asteroidea, truy cập ngày 1 tháng 3 năm 2019

5. http://www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=149871, truy cập ngày

1 tháng 3 năm 2019.

6. Ngan, N. T. M., Ho, Đ. T., Một số loài sao biển mới ghi nhận ở vùng biển Việt

Nam, Tuyển tập nghiên cứu biển, 2013, 19, 176-181.

7. Antokhina, T. I, Savinkhin, O. V., Britayev, T. A. Asteroidea of Vietnam with some

notes on their symbionts, Benthic fauna of the bay of Nha trang, Southern

Vietnam, Moscow: KMK Scientific Press Ltd., 2012, 2, 428-491.

8. Clark, A. M., Liao, Y. L. The echinoderm of Southern China, Science Press,

Beijing, China, 1995, ISBN 7030040813.

9. Ho, Đ. T., Động vật da gai (Echinodermata) ở vùng biển Khánh hòa, Tạp chí Khoa

học và Công nghệ Biển, 2002, 2 .1: 1-11.

10. Dong, G., Xu, T., Yang, B., Lin, X., Zhou, X., Yang, X., Liu, Y. Chemical

constituents and bioactivities of starfish, Chem. Biodivers., 2011, 8(5), 740-791.

11. Riccio, R., Zollo, F., Finamore, E., Minale, L., Laurent, D., Bargibant, G., Pusset,

J. A novel streoidal glycoside sulfate from the starfish Protoreaster nodosus and

Pentaceraster alveolatus, J. Nat. Prod., 1985, 48(2), 266-272.

12. Thao, N. P., Luyen, B. T. T., Koo, J. E., Kim, S., Koh, Y. S., Cuong, N. X., Van

Minh, C. Anti-inflammatory components of the Vietnamese starfish Protoreaster

nodosus, Biol. Res., 2015, 48(1), 12.

13. Riccio, R., Minale, L., Pagonis, S., Pizza, C., Zollo, F., & Pusset, J. A novel group

of highly Hydroxylated steroids from the Starfish Protoreaster nodosus,

Tetrahedron, 1982, 38(24), 3615-3622.

149 14. Minale, L., Pizza, C., Riccio, R., Sorrentino, C., Zollo, F., Pusset, J., Bargibant,

G.. Minor polyhydroxylated steroids from the starfish Protoreaster nodosus, J.

Nat. Prod., 1984, 47(5), 790-795.

15. Iorizzi, M., Minale, L., Riccio, R., Higa, T., & Tanaka, J. Starfish saponins, part

46. Steroidal glycoside and polyhydroxysteroids from the starfish Culcita

Novaeguineae, J. Nat. Prod., 1991, 54(5), 1254-1264.

16. Iorizzi, M., Minale, L., Riccio, R., Debray, M., & Menou, J. L. Starfish saponins,

part 23 Steroidal glycosides from the starfish Halityle regularis, J. Nat. Prod.,

1986, 49(1), 67-78.

17. Iorizzi, M., Bifulco, G., de Riccardis, F., Minale, L., Riccio, R., Zollo, F. Starfish

saponins, Part 53. A reinvestigation of the polar steroids from the starfish

Oreaster reticulatus: isolation of sixteen steroidal oligoglycosides and six

polyhydroxy steroids, J. Nat. Prod., 1995, 58(1), 10-26.

18. Riccio, R., Iorizzi, M., Squillace Greco, O., Minale, L., Laurent, D., & Barbin, Y.

Starfish saponins. XXVI. Steroidal glycosides from the starfish Poraster

superbus, Gazz. Chim. Ital, 1985, 115, 505-509.

19. Kicha, A. A., Kalinovskii, A. I., Levina, E. V., Andriyashchenko, P. V.

Culcitoside C1 from the starfish Culcita novaeguineae and Linckia guildingi,

Chem. Nat. Compd., 1985, 21(6), 760-762.

20. Kicha, A. A., Kalinovskii, A. I., Andrishchenko, P. V., Lenina, E. V. Culcitoside

C2 and C3 from the starfish Culcita novaeguineae, Chem. Nat. Compd., 1986,

22(5), 557-560.

21. De Correa, R. S., Riccio, R., Minale, L., Duque, C. Starfish saponin part 21

Steroid glycosides from the starfish Oreaster reticulatus, J. Nat. Prod., 1985,

48(5), 751-755.

22. Zollo, F., Finamore, E., Minale, L., Laurent, D., Bargibant, G.. Starfish saponin,

29. A novel steroidal glycoside from the starfish pentaceraster alveolatus, J. Nat.

Prod., 1986, 49(5), 919-921.

23. Riccio, R., Minale, L., Pizza, C., Zollo, F., Pusset, J. Starfish saponin, part 8.

Structure of nodososide, a novel type of steroidal glycoside from the starfish

Protoreaster nodosus, Tetrahedron Lett., 1982, 23(28), 2899-2902.

150 24. Ivanchina, N. V., Kicha, A. A., Malyarenko, T. V., Ermolaeva, S. D., Yurchenko,

E. A., Pislyagin, E. A., Dmitrenok, P. S. Granulatosides D, E and other polar

steroid compounds from the starfish Choriaster granulatus. Their

immunomodulatory activity and cytotoxicity, Nat. Prod. Res., 2019, 33(18), 2623-

2630.

25. Pizza, C., Minale, L., Laurent, D., Menou, J. L. Starfish saponin: 27. Steroidal

glycosides from the starish Choriaster granulatus, Gazz. Chim. Ital., 1985, 115,

585-589.

26. Lu, Y., Li, H., Wang, M., Liu, Y., Feng, Y., Liu, K., & Tang, H. Cytotoxic

polyhydroxysteroidal glycosides from starfish Culcita novaeguineae, Marine

drugs, 2018, 16(3), 92.

27. Findlay, J. A., He, Z. Q. Novel sulfated sterol glycosides from Asterias forbesi, J.

Nat. Prod., 1990, 53(3), 710-712.

28. Malyarenko, T. V., Kharchenko, S. D., Kicha, A. A., Ivanchina, N. V.,

Dmitrenok, P. S., Chingizova, E. A., Stonik, V. A. Anthenosides L-U, Steroidal

glycosides with unusual structural features from the starfish Anthenea aspera, J.

Nat. Prod., 2016, 79(12), 3047-3056.

29. Malyarenko, T. V., Ivanchina, N. V., Malyarenko, O. S., Kalinovsky, A. I.,

Dmitrenok, P. S., Evtushenko, E. V., Kicha, A. A. Two New Steroidal,

Anthenosides A1 and A2, and revision of the structure of known Anthenoside A

with unusual monosaccharide residue from the starfish Anthenea aspera,

Molecules, 2018, 23(5), 1077-1088.

30. Ma, N., Tang, H. F., Qiu, F., Lin, H. W., Tian, X. R., Yao, M. N.

Polyhydroxysteroidal glycosides from the starfish Anthenea chinensis, J. Nat.

Prod., 2010, 73(4), 590-597.

31. Hashimoto, Y. Confirmation of saponin as a toxic principle of starfish, Bull.

Japan. Soc. Sci. Fish., 1960, 26, 1132-1138.

32. Kitagawa, I., Kobayashi, M. On the structure of the major saponin from the

starfish Acanthaster planci, Tetrahedron Lett., 1977, 18(10), 859-862.

33. Kitagawa, I., Kobayashi, M. Saponin and sapogenol. XXVI. Steroidal saponins

from the starfish Acanthaster planci L. (crown of thorn). Structure of the major

saponin thornasteroside A, Chem. Pharm. Bull., 1978, 26(6), 1864-1873.

151 34. Riccio, R., Iorizzi, M., Greco, O. S., Minale, L., Debray, M., Menou, J. L. Starfish

saponin, part 22. Asterosaponin from the starfish Halityle regularis: a novel

22,23-epoxysteroidal glycoside sulfate, J. Nat. Prod., 1985, 48(5), 756-765.

35. Tang, H. F., Yi, Y. H., Li, L., Sun, P., Zhang, S. Q., Zhao, Y. P. Bioactive

asterosaponins from the Starfish Culcita novaeguineae, J. Nat. Prod., 2005,

68(3), 337-341.

36. Marino, S. D., Iorizzi, M., Zollo, F., Amsler, C. D., Greer, S. P., McClintock, J.

B. Three new asterosaponin from the starfish Goniopecten demonstrans, Eur.

JOC., 2000(24), 4093-4098.

37. Riccio, R., De Simone, E., Dini, A., Minale, L., Pizza, C., Senatore, F., Zollo, F.

Starfish saponins VI- unique 22,23-epoxysteroidal cyclic glycosides, minor

constituents from Echinaster sepoeitus, Tetrahedron Lett., 1981, 22(16), 1557-

1560.

38. a) Riccio, R., Dini, A., Minale, L., Pizza, C., Zollo, F., Sevenet, T. Starfish

saponin VII. Structure of luzonicoside, a further steroidal cyclic glycosdie from

the pacific starfish Echinaster luzonicus, Cell. Mol. Life. Sci., 1982, 38(1), 68-

70. b) De Simone, F., Dini, A., Finamore, E., Minale, L., Pizza, C., Riccio, R.,

Zollo, F. Starfish Saponin. Part 5. Structure of Sepositoside A, a Novel Steroidal

Cyclic Glycoside from the Starfish Echinaster seposistus, J. Chem. Soc., Perkin

Trans 1, 1981, 1855-1862.

39. Inagaki, M., Isobe, R., Kawano, Y., Miyamoto, T., Komori, T., Higuchi, R.

Isolation and structure of three new ceramides from the starfish Acanthaster

planci, Eur. J. Org. Chem., 1998, 1998(1), 129-131.

40. Rho, J. R., Kim, Y. H. Isolation and structure determinatiion of three new

ceramides from the starfish Distolasterias nipon, Bull. Korean Chem. Soc., 2005,

26(9), 1457-1460.

41. Inagaki, M., Ikeda, Y., Kawatake, S., Nakamura, K., Tanaka, M., Misawa, E.,

Higuchi, R. Isolation and structure of four new ceramides from the starfish

Luidia maculata, Chem. Pharm. Bull, 2006, 54(12), 1647-1649.

42. Ishii, T., Okino, T., Mino, Y. A ceramide and cerebroside from the starfish

asterias amurensis Lütken and their plant-growth promotion activities, J. Nat.

Prod., 2006, 69(7), 1080-1082.

152 43. Inagaki, M., Nakata, T., Higuchi, R. Isolation and structure of a

galactocerebroside molecular species from the starfish Culcita novaeguineae,

Chem. Pharm. Bull, 2006, 54(2), 260-261.

44. Costantino, V., de Rosa, C., Fattorusso, E., Imperatore, C., Mangoni, A., Irace,

C., Pedone, C. Oreacerebroside: Bioactive cerebrosides with a triunsaturated

sphingoid base from the sea star Oreaster reticulatus, Eur. J. Org. Chem.,

2007(31), 5277-5288.

45. Venkannababu, U., Bhandari, S. P. S., Garg, H. S. Regulosides A–C:

Glycosphingolipids from the Starfish Pentaceraster regulus, Liebigs Ann.

Chem., 1997(6), 1245-1247.

46. Pan, K., Inagaki, M., Ohno, N., Tanaka, C., Higuchi, R., Miyamoto, T.

Identification of sixteen new galactocerebrosides from the starfish Protoreaster

nodosus. Chem. Pharm. Bull., 2010, 58(4), 470-474.

47. Higuchi, R., Harano, Y., Mitsuyuki, M., Isobe, R., Yamada, K., Miyamoto, T.,

Komori, T. Biologicall active glycosides from Asteroidea. 34. Isolation and

structure of cerebrosides from the starfish Stellaster equestris, Liebigs Ann.

Chem., 1996, 4, 593-599.

48. Mocchetti, I. Exogenous gangliosides, neuronal plasticity and repair, and the

neurotrophins, Cell. Mol. Life Sci., 2015, 62, 2283-2294.

49. Pan, K., Tanaka, C., Inagaki, M., Higuchi, R., Miyamoto, T. Isolation and

structure elucidation of GM4-Type gangliosides from the Okinawan starfish

Protoreaster nodosus, Marine Drugs, 2012, 10(11), 2467-2480.

50. Minh, C. V., Cuong, N. X., Dang, N. H., Thao, N. P., Quang, T. H., Tung, N. H.,

Nam, N. H., Hung, N. V., Kiem, P. V. Điểm lại các nghiên cứu hóa học và hoạt

tính sinh học một số loài sinh vật biển Việt Nam trong giai đoạn 2006-2012, Tạp

chí Khoa học và Công nghệ, 2012, 50(6), 825-837.

51. Gomes, A. R., Freitas, A. C., Rocha-Santos, T. A., Duarte, A. C. Bioactive

Compounds Derived from Echinoderms, RSC Adv., 2014, 56(4), 29365-29382.

52. Dembitsky, V. M. Chemistry and Biod iversity of the Biologically Active Natural

Glycosides. Chem. Biodivers., 2004, 1(5), 673-781.

53. Malyarenko, T. V., Malyarenko, O. S., Kicha, A. A., Ivanchina, N. V.,

Kalinovsky, A. I., Dmitrenok, P. S., Stonik, V. A.. In vitro anticancer and

153 proapoptotic activities of steroidal glycosides from the starfish Anthenea aspera,

Mar Drugs, 2018, 16(11), 420.

54. Prokof'eva, N. G., Chaikina, E. L., Kicha, A. A., Ivanchina, N. V. Biological

activities of steroid glycosides from starfish, Comp. Biochem. Physiol. B., 2003,

134(4), 695-701.

55. Andersson, L., Bohlin, L., Iorizzi, M., Riccio, R., Minale, L., Moreno-López, W.

Biological activity of saponins and saponin-like compounds from starfish and

brittle-stars, Tocicon, 1989, 27(2), 179-188.

56. Iorizzi, M., De Marino, S., Minale, L., Zollo, F., Le Bert, V., Roussakis, C.

Investigation of the polar staroids from an Antarctic starfish of the family

Echinasteridae: isolation of twenty seven polyhydroxysteroids and steroidal

oligoglycosides, structures and biological activities. Tetrahedrom, 1996, 52(33),

10997-11012.

57. Wang, W., Hong, J., Lee, C. O., Im, K. S., Choi, J. S., Jung, J. H. Cytotoxic Sterols

and Saponins from the Starfish Certonardoa semiregularis, J. Nat. Prod., 2004,

67(4), 584-591.

58. Zhou, J., Cheng, G., Cheng, G., Tang, H. F., Zhang, X. Novaeguinoside II inhibits

cell proliferation and induces apoptosis of human brain glioblastoma U87MG

cells through the mitochondrial pathway, Brain Res., 2011, 1372, 22-28.

59. Zhao, Y., Zhu, C., Li, X., Zhang, Z., Yuan, Y., Ni, Y., Wang, Y. Asterosaponin

1 induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in A549 human

lung cancer cells, Oncology Reports, 2011, 26(4), 919–924.

60. Fedorov, S. N., Shubina, L. K., Kicha, A. A., Ivanchina, N. V., Kwak, J. Y., Jin,

J. O., Stonik, V. A. Proapoptotic and anticarcinogenic activities of leviusculoside

G from the starfish Henricia leviuscula and probable molecular mechanism,

Natural Product Communications, 2008, 3(10), 1575-1580.

61. Malyarenko, T. V., Malyarenko, O. S., Kicha, A. A., Ivanchina, N. V.,

Kalinovsky, A. I., Dmitrenok, P. S., Stonik, V. A.. In vitro anticancer and

proapoptotic activities of steroidal glycosides from the starfish Anthenea aspera,

Mar Drugs, 2018, 16(11), 420.

62. Malyarenko, O. S., Dyshlovoy, S. A., Kicha, A. A., Ivanchina, N. V., Malyarenko,

T. V., Carsten, B., Ermakova, S. P. The Inhibitory Activity of Luzonicosides from

154 the Starfish Echinaster luzonicus against Human Melanoma Cells, Marine

drugs, 2017, 15(7), 227.

63. Cheng, G., Zhang, X., Tang, H. F., Zhang, Y., Zhang, X. H., Cao, W. D., Jin, B.

Q. Asterosaponin 1, a cytostatic compound from the starfish Culcita

novaeguineae, functions by inducing apoptosis in human glioblastoma U87MG

cells, J. Neuro Oncol., 2006, 79(3), 235–241.

64. Pal'yanova, N. V., Pankova, T. M., Starostina, M. V., Shtark, M. B., Kicha, A.

A., Ivanchina, N. V., Stonik, V. A. Neurotrophic effects of polyhydroxylated

steroids and steroid glycosides in cultured neuroblastoma cells, Bull. Exp. Bio.

Med., 2006, 141(5), 584-587.

65. Qi, J., Ojika, M., & Sakagami, Y. Linckosides A and B, two new neuritogenic

steroid glycosides from the Okinawan starfish Linckia laevigata, Bio. Med.

Chem., 2002, 10(6), 1961-1966.

66. a) Leontein, K., Lindberg, B., Lonngren, J. Assignment of absolute consguration

of sugars by g.l.c. of their acetylated glycosides formed from chiral alcohols,

Carbohydrat Res., 1978, 62(3), 59-62. b) Levina, E. V., Kalinovskii, A. I., Stonik,

V. A., Dmitrenok, P. S. Steroidal polyols from Far Eastern starfish Henricia

sanguinolenta and H. leviuscula leviuscula, Bioorg. Khim., 2003, 52, 1623-

1628.

67. a) Fedorov, S. N., Shubina, L. K., Kicha, A. A., Ivanchina, N. V., Kwak, J. Y.,

Jin, J. O., Stonik, V. A. Proapoptotic and Anticarcinogenic Activities of

Leviusculoside G from the Starfish Henricia leviuscula and Probable Molecular

Mechanism, Nat. Prod. Commun., 2008, 3(10), 1575-1580. b) Barltrop, J. A.,

Owen, T. C., Cory, A. H., Cory, J. G. 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-

Dimethylthiazolyl)-3-(4-Sulfophenyl)tetrazolium, Inner Salt (Mts) And Related

Analogs Of 3-(4,5-Dimethylthiazolyl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (Mtt)

Reducing To Purple Water-Soluble Formazans As Cell-Viability Indicators, Bio.

Med. Chem. Lett., 1991, 1(11), 611-614.

68. Ermakova, S., Men'shova, R., Vishchuk, O., Kim, S. M., Um, B. H., Isakov, V.,

Zvyagintseva, T. Water-soluble polysaccharides from the brown alga Eisenia

bicyclis: Structural characteristics and antitumor activity. Algal Research, 2013,

2(1), 51-58.

155 69. Tsuda, M., Schroepfer Jr, G. J. Carbon-13 nuclear magnetic resonance studies of

C27 sterol precursors of cholesterol, J. Org. Chem., 1979, 44(8), 1290-1293.

70. Tu, V. A., Thao, N. P., Diep, C. N., Dat, L. D., Ngoc, N. T., Nam, N. H., Cuong,

N. X., Nhiem, N. X., Kim, Y. H., Ban, N. K., Minh, C. V. Nucleosisdes from

holothuria atra, Viet. J. Chem., 2012, 50(4A), 284-287.

71. Phuong, Đ. L., Long, P. Q., Ha, Đ. H., Huong, Đ. T., Dung, N. T., Anh, N. V. T.

A., Thuy, T. T. T. Thành phần hóa học của loài sao biển gai Acanthaster planci

từ biển Việt Nam, Tạp chí Hóa học, 2013, 50(4A), 284-287.

72. Anandan, P., Vetrivel, S., Karthikeyan, S., Jayavel, R., Ravi, G. Crystal growth,

spectral and thermal analyses of a semi organic nonlinear optical single crystal:

L-tyrosine hydrochloride, Opto. And. Mat. Rap. Commun., 2012, 6(11-12),

1128-1133.

73. Bradbury, J. H., Norton, R. S. Cacbon-13 NMR spectra of tryptophan, tryptophan

peptide and of native and denatured proteins, Biochim. Biophys. Acta., 1973,

328(1), 10-19.

74. Malyarenko, T. V., Kharchenko, S. D., Kicha, A. A., Ivanchina, N. V.,

Dmitrenok, P. S., Chingizova, E. A., Stonik, V. A. Anthenosides L‒U, steroidal

glycosides with unusual structural features from the starfish Anthenea aspera, J.

Nat. Prod., 2016, 79(12), 3047‒3056.

75. Vanderah, D. J., Djerassi, C. Marine natural products, Synthesis of four naturally

occurring 20--H cholanic acid derivatives, J. Org. Chem., 1978, 43(7), 1442–

1448.

76. Kornprobst, J. M. Echinoderm, Encyclopedia of Marine Natural Products,2014,

1-104. Doi.org/10.1002/9783527335855.marprod026

77. Ju, B., Chen, B., Zhang, X., Han, C., Jiang, A. Purification and characterization

of bioactive compouns from Styela clava, J. Chem., 2014, 2014, 141-151.

78. a) Kicha, A. A., Dinh, T. H., Ivanchina, N. V., Malyarenko, T. V., Kalinovsky,

A. I., Popov, R. S., Doan, L. P. Three new steroid biglycosides, Planciside A, B

and C from the starfish Acanthaster planci, Nat. Prod. Commun., 2014, 9(9)

1269-1274. b) Minale, L., Pizza, C., Riccio, R., Greco, O. S., Zollo, F., Pusset,

J., Menou, J. L. New polyhydroxylated sterols from the starfish Luidia

maculata. Journal of Natural Products, 1984, 47(5), 784-789.

156 79. Vicar, J. Amino acids and peptides. CXIV. Proton magnetic resonance studies on

cyclodipeptides containing pipecolic acid, proline and/or 2-azetidine-carboxylic

acid, Collection Czechoslov, Chem. Commun., 1973, 38, 1940-1956.

80. Chen, Y. H., Sung, P. H., Sung, K. Synthesis of proline-derived dipeptides and

their catalytic enantioselective direct aldol reactions: catalyst, solvent, additive

and temperature effects, Amino Acids, 2010, 38(3), 839-845.

81. Musetti, R., Polizzotto, R., Vecchione, A., Borselli, S., Zulini, L., D’Ambrosio,

M., Pertot, I. Antifungal activity of dikeopiperazines extracted from Alternaria

alternata agains Plasmopara viticola: an ultrastructural study, Micron, 2007,

38(6), 643-650.

82. https://www.drugbank.ca/spectra/nmr_one_d/1177

83. Ivanova, V., Graefe, U., Schlegel, R., Schlegel, B., Gusterova, A., Kolarova, M.,

Aleksieva, K. Isolation and structure elucidation of tyramine and indole

alkaloids from Antarctic strain Microbispora aerate IMBAS-11A, Biotechnol.

Biotec. Eq., 2003, 17(2), 128-133.

84. Goldstein, J. H., Tarpley Jr, A. R. Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance

Spectra of Uracil, Thymine and the 5-Halouracils, J. Am. Chem. Soc, 1971, 93

(15), 3573-3578.

85. http://www.hmdb.ca/spectra/nmr_one_d/1297.

86. Malyarenko, T.V.; Kicha, A.A.; Ivanchina, N.V.; Kalinovsky, A.I.; Popov, R.S.;

Vishchuk, O.S.; Stonik, V.A. Asterosaponins from the Far Eastern starfish

Leptasterias ochotensis and their anticancer activity, Steroids, 2014, 87, 119-

127.

87. Malyarenko, T.V.; Kicha, A.A.; Ivanchina, N.V.; Kalinovsky, A.I.; Dmitrenok,

P.S.; Ermakova, S.P.; Stonik, V.A. Cariniferosides A-F and other steroidal

biglycosides from the starfish Asteropsis carinifera, Steroids 2011, 76, 1280-

1287.

88. Borowicz, S.; Van Scoyk, M.; Avasarala, S.; Rathinam, M.K.K.; Tauler, J.;

Bikkavilli, R.K.; Winn, R.A. The soft agar colony formation assay, J. Vis. Exp.

2014, 92, 51998.

157 PHỤ LỤC

I. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB1: CHOLESTEROL

Hình I.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB1

Hình I.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB1

158

Hình I.3. Phổ DEPT của hợp chất ASB1

Hình I.4. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất ASB1

159

Hình I.5. Phổ HSQC của hợp chất ASB1

Hình I.6. Phổ HMBC của hợp chất ASB1

160 II. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB2: Thymine

Hình II.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB2

Hình II.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB2

161

Hình II.3. Phổ HSQC của hợp chất ASB2

Hình II.4. Phổ HMBC của hợp chất ASB2

162

III. PHỤ LỤC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB3: L-Tyrosine

Hình III.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB3

Hình III.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB3

IV. PHỤ LỤC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB4: L-Tryptophan

163

Hình IV.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB4

Hinh IV.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB4

V. PHỤ LỤC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB5: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-

galactofuranosyl)-16-O-(3-O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-

8(14),22(23)-diene-3,6,7,16-tetraol (anthenoside S1, hợp chất mới)

164

Hình V.1. Phổ (+) HR-ESI-MS của hợp chất ASB5

Hình V.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB5

186.9952 226.9878 268.9983

301.14091+

385.23491+ 441.2974

1+

617.3659 659.2872

793.43461+

+MS, 2.4min #140

0

1

2

3

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

165

Hình V.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB5.

Hình V.4. Phổ COSY của hợp chất ASB5.

166

Hình V.5. Phổ HSQC của hợp chất ASB5

Hình V.6. Phổ HMBC của hợp chất ASB5

167

Hình V.7. Phổ ROESY của hợp chất ASB5

Hình V.8. Phổ 1D TOCSY của hai đơn vị đường

VI. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB6: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--

D-galactofuranosyl)-16-O-(4-O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-

8(14),22(23)-diene-3,6,7,16-tetraol (anthenoside S2, chất mới).

168

Hình VI.1. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB6

Hình VI.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB6

169

Hình VI.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB6

Hình VI.4. Phổ COSY của hợp chất ASB6

170

Hình VI.5. Phổ HSQC của hợp chất ASB6

Hình VI.6. Phổ HMBC của hợp chất ASB6

171

Hình VI.7. Phổ ROESY của hợp chất ASB6

VII. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB7: (20R)-7-O-(6-O-methyl--D-

galactofuranosyl)-16-O-(3-O-methyl--D-glucopyranosyl)-5-cholesta-8(14),24-

diene-3,6,7,16-tetraol (anthenoside S3)

Hình VII.1. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB7

172

Hình VII.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB7

Hình VII.3. Phổ COSY của hợp chất ASB7

VIII. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB8:(20R)-7-O-(6-O-methyl--

D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-methyl-5-

cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,7,16-tetraol (anthenoside S4)

173

Hình VIII.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất ASB8

Hình VIII.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB8

174

Hình VIII.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB8

Hình VIII.4. Phổ COSY của hợp chất ASB8

175

Hình VIII.5. Phổ HSQC của hợp chất ASB8

Hình VIII.6. Phổ HMBC của hợp chất ASB8

176

Hình VIII.7. Phổ ROESY của hợp chất ASB8

IX. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB9:(20R,20E)-16-O-(3-O-methyl-

-D-galactofuranosyl)-5-cholesta-8(14),22,23-diene-3,6,7,16-tetraol

Hình IX.1. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB9

177

Hình IX.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB9

Hình IX.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB9

178

Hình IX.4. Phổ COSY của hợp chất ASB9

Hình IX.5. Phổ HSQC của hợp chất ASB9

179

Hình IX.6. Phổ HMBC của hợp chất ASB9

Hình IX.7. Phổ ROESY của hợp chất ASB9

X. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB10: (20R)-7-O-(6-O-methyl--D-

galactofuranosyl)-16-O-(-D-galactofuranosyl)-24-methyl-5-cholesta-

8(14),24(28)-diene-3,6,7,16-tetraol

180

Hình X.1. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB10

Hình X.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB10

181

Hình X.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB10

Hình X.4. Phổ COSY của hợp chất ASB10

182

Hình X.5. Phổ HSQC của hợp chất ASB10

Hình X.6. Phổ HMBC của hợp chất ASB10

183

Hình X.7.Phổ ROESY của hợp chất ASB10

184 XI. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ASB11: anthenoside J ((20R,24R)-7-

O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-16-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-

24-ethyl-5α-cholest-8(14)-ene-3α,6β,7β,16α-tetraol) và anthenoside K ((20R,24S)-

7-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-16-O-(6-O-methyl-β-D-

galactofuranosyl)-24-ethyl-5α-cholest-8(14)-ene-3α,6β,7β,16α-tetraol.

Hình XI.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB11

Hình X.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB11

185

Hình X.3. Phổ HSQC của hợp chất ASB11

Hình XI.4. Phổ HMBC của hợp chất ASB11

186 XII. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA1: cholesterol

Hình XII. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA1

Hình XII.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA1

187

Hình XII.3. Phổ DEPT của hợp chất AA1

Hình XII.4. Phổ COSY của hợp chất AA1

188

Hình XII.5. Phổ HSQC của hợp chất AA1

Hình XII.6. Phổ HMBC của hợp chất AA1

189 XIII. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA2:Lathosterol (Cholest-7,8-ene-

3-ol)

Hình XIII.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA2

Hình XIII.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA2

190

Hình XIII.3. Phổ DEPT của hợp chất AA2

Hình XIII.4. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất AA2

191

Hình XIII.5. Phổ HSQC của hợp chất AA2

Hình XIII.6. Phổ HMBC của hợp chất AA2

192 XIV. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA3: cholest-4-ene-3,6-diol

Hình XIV.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA3

Hình XIV.2. Phổ DEPT của hợp chất AA3

193

Hình XIV.3. Phổ HMBC của hợp chất AA3

194 XV. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA4: cholestane

3,5,6,15,16,26-hexol

Hình XV.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA4

Hình XV.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA4

Hình XV.3. Phổ DEPT của hợp chất AA4

195

Hình XV.3. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất AA4

Hình XV.4. Phổ HSQC của hợp chất AA4

196

Hình XV.5. Phổ HMBC của hợp chất AA4

Hình XV.6. Phổ NOESY của hợp chất AA4

197 XVI. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA5: cyclo(L-glycine-L-proline)

Hình XVI.1. Phổ1H-NMR của hợp chất AA5

Hình XVI.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA5

198

Hình XVI.3. Phổ DEPT của hợp chất AA5

Hình XVI.4. Phổ COSY của hợp chất AA5

199

Hình XVI.5. Phổ HSQC của hợp chất AA5

Hình XVI.6. Phổ HMBC của hợp chất AA5

200 XVII. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA6: L-glycine-L-prolin

Hinh XVII.1. Phổ 1H-NMR của hợp AA6

Hinh XVII.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA6

201

Hình XVII.3. Phổ HMBC của hợp chất AA6

202 XVIII. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤTAA7: cyclo(L-alanyl-4-hydroxyl-

L-prolyl)

Hình XVIII.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA7

Hình XVIII.2. Phổ DEPT của hợp chất AA7

203

Hình XVIII.3. Phổ COSY của hợp chất AA7

Hình XVIII.4. Phổ HSQC của hợp chất AA7

204

Hình XVIII.5. Phổ HMBC của hợp chất AA7

XIX. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA8: L-Phenylalanine

Hình XIX.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA8

205

Hình XIX.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA8

Hình XIX.3. Phổ COSY của hợp chất AA8

206

Hình XIX.4. Phổ HSQC của hợp chất AA8

Hình XIX.5. Phổ HMBC của hợp chất AA8

207 XX. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA9: tyramine

Hình XX.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA9

Hình XX.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA9

208 XXI. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA10: thymine

Hình XXI.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA10

XXII. PHỤ LỤC CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AA11: uracil

Hình XXII.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA11

209

Hình XXII.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA11

Documents

nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học hai loài sao biển