Study on immunomodulatory properties of nucleoprotein of peste des petits ruminants virus

Université Montpellier II –Université Montpellier I – Agro-M

Master Sciences et Technologies

Mention BGAE – Biologie, Géosciences, Agro-ressources, Environnement

Spécialité BIMP – Biodiversité et Interaction Microbiennes et Parasitaires Parcours SMGE – Systèmes Microbiens : du Gène aux Ecosystèmes

Année 2006 – 2007

Rapport de Stage M2 Soutenance le 11-12 juin 2007

ETUDE des PROPRIETES IMMUNOMODULATRICES DE LA NUCLEOPROTEINE DU VIRUS DE LA PESTE DES PETITS RUMINANTS

Zaheer Ahmed NIZAMANI

Directeur de stage : Geneviève LIBEAU
Laboratoire d’accueil : CIRAD (Centre de coopération Internationale en recherche agronomique pour le développement) Département Systèmes Biologiques Contrôle des Maladies Animales Exotiques et Emergentes (UPR15), Equipe de Virologie Campus International de Baillarguet – Montpellier, France

Abstract : The Peste des petits ruminants (PPR) is a viral disease which affects sheep and goats and even the wild ruminants. About a billion of small ruminants are found in the PPR enzootic areas like Africa, Arabian Peninsula, Middle East, and India. Morbillivirus infections are characterized by immunosuppressive effect which often results in secondary bacterial infections (Griffin et al., 1996). For example, PPR is often associated with secondary pulmonary infections. In case of measles and rinderpest, certain immunological alterations are observed during the natural infections which can also be found after vaccination with attenuated vaccines. The immunosuppression can also be triggered by direct contact of viral proteins with cells of immune system. The nucleocapsid (N) protein is a major viral protein. Due to cytopathic effect of the virus it can have access to the surface receptors of the immune cells thus resulting in not only initiation a specific immune response but also an immune suppression. In our study, the PPRV has been used as a model for analyzing the immunomodulatory role of the N protein of the Morbilliviruses. In this work, we have used live and UV-inactivated PPR viruses, and recombinant N-proteins to demonstrate in vitro inhibition of cell proliferation of immune cells of naïve goats. The deleted mutants of this protein expressed in baculovirus system, allowed us to localize the amino acid sequence of the truncated N-protein of PPRV between 1-420 to be responsible for inducing immune suppression, like N-protein of other Morbilliviruses. Keywords : Peste des petits ruminants, Morbillivirus, nucleoprotein, immunomodulation, lymphoproliferation, baculovirus. Résumé : La peste des petits ruminants (PPR) est une maladie virale qui affecte les moutons et les chèvres ainsi que les ruminants sauvages. Près d’un milliard de petits ruminants se trouvent dans les zones d’enzootie de la PPR qui recouvrent l’Afrique, la péninsule arabe, le Moyen-Orient et l’Inde. Une caractéristique commune aux infections à Morbillivirus est l’effet immunosuppresseur qui peut conduire à l’établissement d’infections opportunistes (Griffin et coll., 1996). Par exemple, la PPR est souvent associée à des infections pulmonaires qui sont suivies d’infections bactériennes secondaires. Dans le cas de MV et de RPV, certaines des altérations immunologiques observées durant les infections naturelles peuvent subvenir aussi après vaccination avec des vaccins atténués. L’immunosuppression peut être déclenchée par contact direct des protéines virales avec les cellules du système immunitaire. La nucléocapside N du virus PPR est la protéine virale majoritaire. Lors de l’effet cytopathique du virus elle peut devenir accessible aux récepteurs de surface des cellules et engendrer de ce fait, non seulement une réponse immune spécifique, mais aussi une immunosuppression. Dans notre étude, le PPRV est utilisé comme modèle pour analyser le rôle immunomodulateur de la protéine N des Morbillivirus. Dans ce travail, nous avons utilisé le virus PPR, vivant ou inactivé par les UV, la protéine recombinante N pour démonter in vitro l’inhibition de la prolifération de cellules naïves de chèvres. Un mutant obtenu par délétion de cette protéine N exprimé dans le système baculovirus nous permis de localiser les acides aminés induisant cette immunosuppression sur la séquence 1-420 de la protéine tronquée N de PPRV comme pour la N des autres Morbillivirus. Mots-clés : Peste des petits ruminants, Morbillivirus, nucléoprotéine, immunomodulation, lymphoprolifération, baculovirus.

SOMMAIRE

I. Introduction ……………………………………………………………………...…1

II. Matériel et Méthodes .…………………………………………………………..…2

1. Production et concentration du virus PPR Nigéria 75/1…………………….....................5

1.1. Culture cellulaire et production de PPR Nig 75/1 sur cellules Véro

1.2. Concentration et inactivation du virus PPR 75/1

2. Clonage et production de la protéine N et des protéines N mutées obtenues par délétion.5

2.1. Clonage des virus recombinants exprimant la protéine N entière et du mutant

obtenu par délétion exprimant la protéine N tronquée

2.2. Sélection des clones par test d’immunofluorescence

2.3. Amplification des clones baculovirus recombinants et expression des protéines

3. Dosage du virus PPR vivant, inactivé et des protéines N recombinantes par

ELISA immunocapture……………………………………………………………..………….7

4. Culture des lymphocytes de chèvres et essai de lymphoprolifération ……………………....8

4.1 - Isolement des lymphocytes du sang périphérique (PBMC)

4.2 – Lymphoprolifération et analyse en cytométrie de flux

III – Résultats…………………………………………………………………………10

1 - Le virus PPR inhibe la prolifération des lymphocytes de chèvres………….…..………....10

2 - Production des protéines N entière et tronquées de PPRV ……………………………….11

3 - La protéine recombinante de PPRV inhibe la prolifération des lymphocytes de chèvres…12

IV– Discussion………………………………………………………………………..15

V – Conclusion et perspectives ……………………………………………..………..16

VI – Références bibliographiques …………..……………………………..…………18

LISTE DES ABREVIATIONS

AA: Acide Aminé

CDV : Canine Distemper Virus (Maladie de Carré)

Con A: Concanavalin A

DMEM Dulbecco Minimum Essential Medium

DO : Densité Optique

ECP : Effet Cytopathique

ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

FSC : Forward Scatter

LL : Lower Left

LR : Lower Right

Mab : Monoclonal Antibody

MEM : Minimum Essential Medium (Milieu Essentiel Minimum de Eagle)

MOI : Multiplicity Of Infection (Multiplicité d’infection)

MV : Measles Virus (Virus Rougeole)

N protein: Nucleoprotein

PBS: Phosphate Buffer Solution

PHA: Phytohémagglutinine

PI: Pourcentage D’Inhibition

PPR : Peste des Petits Ruminants

RPM Rotations par minute

RPV: Rinder Pest Virus (Peste Bovine)

SF21: Spodoptera frugiperda passage 21

SSC: Side Scatter

SVF: Sérum de Veau Fœtal

TCID 50: 50% Tissue Culture Infective Dose

LISTE DES ILLUSTRATIONS

Figures :

Figure 1: Répartition géographique de la peste des petits ruminants dans le monde

Figure 2: Structure d'un virus du genre Morbillivirus et représentation du génome Figure 3: Représentation schématique des différentes délétions obtenues avec la nucléoprotéine de PPRV. Figure 4 : Density Plot présentant les fenêtres R1 et R2 :

Figure 5 : Plot présentant la mise en place du cadran permettant d’obtenir les statistiques

Figure 6 : Pourcentages d’inhibition (PI) obtenus en fonction des MOI de PPRV vivant et de PPRV inactivé. Figure 7 : Examen au microscope à fluorescence des clones de baculovirus recombinants pour la sélection des clones positifs à amplifier. Figure 8 : Pourcentages d’inhibition (PI) obtenus en fonction des quantités de N-PPRV et de delta 420-525N-PPR. Figure 9 : Dosage par ELISA immunocapture des préparations virales de PPR vivant et inactivé à partir de cellules Véro infectées et des préparations protéiques N-PPR et delta 420-525 N-PPR à partir de cellules SF21 infectées par les baculovirus recombinants. Tableaux : Tableau I : Pourcentage de lymphoblastes obtenus après contact avec le virus PPR vivant ou

inactivé en différentes conditions de culture. Tableau II : Pourcentage de lymphoblastes obtenus après contact avec la protéine N-PPR et la

protéine PPR N-del 420-525 en différentes conditions de culture.

Université Montpellier II Master Sciences et Technologie

Zaheer Ahmed Nizamani

I - Introduction

La peste des petits ruminants (PPR) est une maladie virale qui affecte les moutons et les

chèvres ainsi que les ruminants sauvages. Près d’un milliard de petits ruminants se trouvent dans les

zones d’enzootie de la PPR couvrant l’Afrique, la péninsule arabe, le Moyen-Orient et l’Inde

(Figure 1). Elle se caractérise par une hyperthermie élevée, du jetage, des écoulements oculaires,

une stomatite nécrosante et de la diarrhée profuse. La mort de l’animal survient entre 5 et 10 jours

de maladie. Bien qu’il existe un vaccin vivant atténué très efficace contre la PPR conférant une

immunité durable d’au moins 3 ans, ce qui correspond en moyenne à la durée de vie économique de

l’animal à protéger (Diallo et coll., 2003), il n’existe pas actuellement de stratégie vaccinale globale

contre cette maladie. Pour cette maladie, les taux de morbidité et de mortalité peuvent atteindre

100% (Lefèvre and Diallo, 1990). La PPR est due à un virus appartenant à la famille des

Paramyxoviridae et au genre des Morbillivirus. Des membres bien caractérisés de ces virus

enveloppés à génome négatif, sont également le virus de la rougeole (Measles Virus, MV), la

maladie de Carré (Canine Distemper Virus, CDV) et de la peste bovine (RinderPest Virus, RPV).

Figure 1: Répartition géographique de la peste des petits ruminants dans le monde (Diallo et coll., 2003)

1



Le génome des Morbillivirus contient six unités de transcription arrangés en tandem qui

codent pour huit protéines, la nucléoprotéine (N), la phosphoprotéine (P), la protéine de matrice

(M), l’hémagglutinine (H) et la protéine de fusion (F) qui sont les glycoprotéines de surface et la

polymérase (L) qui, en association avec la P, forme l’ARN polymérase ARN dépendante (RdRP)

(Figure 2). L’ordre des gènes est 3’-N-P-M-F-H-L-5’, comme déterminé par mapping

transcriptionnel (Marie et coll., 2001). Les gènes de la N, P et L forment la ribonucleoprotéine

(RNP), complexe qui est essentiel pour la réplication des Morbillivirus (Kuo et coll., 1996). La

nucléoprotéine encapside le génome viral pour former une nucléocapside hélicoïdale et joue un rôle

central dans la transcription et la réplication. Le génome encapsidé est répliqué en antigénomes

négatifs qui servent de matrice pour la synthèse des génomes qui sont ensuite incorporés dans la

progénie virale. Les données de séquences de la protéine N de différents virus de la famille des

Paramyxoviridae a montré que cette protéine consiste en deux domaines ; une partie N-terminale

(aa 1-400) très conservée et une partie variable C-terminale (aa 401-525) (Diallo et coll., 1994). La

partie N-terminale est de forme globulaire et porte des régions requises pour l’auto-assemblage

ainsi que pour reconnaître l’ARN génomique (Bankamp et coll., 1996 ; Curran et coll., 1993; Liston

et coll., 1997). La partie C-terminale est un domaine monomérique qui est exposé à la surface de la

nucléocapside virale ce qui peut favoriser une interaction entre le virus et la cellule.

Figure 2: Structure d'un virus du genre Morbillivirus et représentation du génome (d'après K.B. Fraser et S.J. Martin, 1978).

2



Une caractéristique commune aux infections à Morbillivirus est l’effet immunosuppresseur

qui peut conduire à l’établissement d’infections opportunistes (Griffin et coll., 1996). Par exemple,

la PPR est souvent associée à des infections pulmonaires qui sont suivies d’infections bactériennes

secondaires, puis de diarrhées qui conduisent à la mort dans 50 à 80% des cas (Lefèvre et Diallo,

1990). De façon paradoxale, les infections à Morbillivirus induisent une réponse immunitaire forte

chez leurs hôtes, s’ils survivent à la maladie, ou après vaccination. Dans le cas de MV et de RPV,

certaines des altérations immunologiques observées durant les infections naturelles peuvent aussi

subvenir après vaccination effectuée avec des vaccins atténués (Hussey et coll, 1996 ; Lund et coll.,

2000 ; Heaney et coll, 2005). Seule une faible proportion de leucocytes est infectée lors d’une

infection aiguë par les Morbillivirus (Esolen et coll., 1993), ce qui indique la mise enjeu d’un

mécanisme immunopathologique indirect plutôt qu’une infection et une destruction directe des

cellules lymphoïdes à l’origine de l’immunosuppression. Quelques études récentes corroborent cette

hypothèse et suggèrent que les protéines des Morbillivirus peuvent inhiber la réponse immune en

absence de réplication virale in vitro (Heaney et coll., 2002 ; Ravanel et coll., 1997 ; Schlender et

coll., 1996) aussi bien qu’in vivo (Marie et coll., 2001). L’immunosuppression est déclenchée soit

par contact direct des protéines virales avec les cellules du système immunitaire, soit, par des

facteurs solubles qui ciblent des récepteurs des lymphocytes de l’hôte. En effet, les virus RP et PPR

inactivés inhibent efficacement la prolifération in vitro de lymphocytes du sang périphérique de

caprins et bovins (Heaney et coll., 2002). Ces auteurs ont également montré que le complexe natif

de l’hémagglutinine et de la protéine de fusion du virus est indispensable. Il semble que

l’immunosuppression induite par RP/PPR, est d’origine multifactorielle. Un travail récent a mis en

évidence l’implication de la protéine N dans l’effet immunosuppresseur de MV, CDV, PPRV et

RPV par sa fixation sur des récepteurs cellulaires impliqués dans l’inhibition de la

lymphoprolifération cellulaire (Kerdiles et coll., 2006). Une des conséquences de cet attachement

est l’inhibition également de la production d’anticorps à long terme et de la production de certaines

cytokines dont l’interleukine 12 (Marie et coll., 2001).

Bien que la protéine N (N-PPR) soit présente dans le cytosol, les anticorps les plus

abondants et produits le plus rapidement durant l’infection PPR sont les anticorps anti-N (Libeau et

coll., 1995). Ceci indique que la protéine N est relarguée dans le compartiment extracellulaire et

permet d’être reconnue par les récepteurs antigéniques des cellules B. En effet dans notre

laboratoire des dosages effectués in vitro mais également après infection naturelle ont montré que la

N-PPR se retrouve en très grande quantité dans le compartiment extracellulaire (Diop et coll.,

2005). Par ce mécanisme, la N-PPR peut devenir accessible aux récepteurs de surface des cellules et

3



engendrer de ce fait, non seulement une réponse immune spécifique, mais aussi une

immunosuppression. En mettant en contact des protéines recombinantes N-MV et des cellules non

infectées, deux récepteurs de surface cellulaires ont été décrits : le récepteur FcγR IgG de type II

(FcγRII/CD32) et un récepteur encore non caractérisé appelé récepteur N (NR). Les récepteurs

FcγR sont présents sur les cellules hématopoïétiques et les récepteurs NR sont exprimés sur un large

spectre de cellules normales sauf chez les cellules quiescentes T humaines et murines (Laine et

coll., 2003). La comparaison des séquences en acides nucléiques de la nucléoprotéine de différents

Morbillivirus a montré une forte homologie plus particulièrement du côté N terminal et dans la

partie centrale de la protéine. Bien que conservée, il semble que la petite partie variable de la

protéine N située du côté N-terminal entre aa 122-144, soit la zone d’interaction FcγR. A l’inverse,

bien que la partie C-terminale soit variable, elle contient trois séquences courtes conservées : aa

401-420, aa 489-506 et 517-525 (Diallo et coll., 1994). Il semble que la région de reconnaissance du

récepteur soit la même pour tous les Morbillivirus (Laine et coll., 2003, Kerdiles et coll., 2006) et

on peut supposer qu’une des petites régions conservées au niveau de la position C-ter soit impliquée

dans l’immunosuppression. En effet, très récemment, pour N-MV, en exprimant des protéines

recombinantes, le domaine C-terminal de la N des Morbillivirus reconnaissant le récepteur

cellulaire a pu être localisé plus finement. Il se situe au niveau de la séquence aa 401-420 et agit de

façon prédominante en bloquant la prolifération en phase Go/G1 du cycle cellulaire après fixation

sur le récepteur NR responsable de cette activité immunosuppressive (Laine et coll., 2005).

Dans notre étude, le virus de la PPR est utilisé comme modèle pour analyser le rôle

immunomodulateur de la protéine N des Morbillivirus. Dans ce travail, nous avons utilisé le virus

PPR, vivant ou inactivé par les UV, la protéine recombinante N pour démonter in vitro l’inhibition

de la prolifération de cellules naïves de chèvres. Des mutants de la protéine recombinante N obtenus

par délétion et exprimés dans le système baculovirus nous ont permis de localiser les séquences

induisant cette immunosuppression notamment sur la séquence aa 1-420 de la protéine tronquée N

de PPRV comme ce qui a été observé pour la N des autres Morbillivirus.

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II – Matériel et Méthodes

1 – Production et concentration du virus PPR Nigéria 75/1:

1.1 – Culture cellulaire et production du virus PPR Nig 75/1 sur cellules Véro

Des cellules de reins de singe (Vero) cultivées en Milieu Essentiel Minimum de Eagle (MEM),

supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF), 1% d’antibiotiques (40 µg de gentamincine et

2,5 µg d'amphotéricine B par ml) et 1 % de glutamine, ont été infectées en boites de culture T150 cm2

à une multiplicité d’infection (MOI) de 0.01 avec 1 ml de la souche vaccinale de peste des petits

ruminants Nigéria 75/1 (PPR Nig 75/1), titrant 105 DICT50/ml.

Neuf boites T150 contenant chacune 2 x 107 cellules Véro ont été infectées lorsque les

cellules ont atteint 80% de confluence. Lors de l’infection, une partie du milieu (12,5 ml) a été

éliminé et les boites incubées avec le virus durant ½ h, ce volume a ensuite été remplacé par du

MEM complet fraichement préparé. A cinq jours post-infection, l’effet cytopathique était

clairement visible. Les boites ont été congelées à -80°C. Le virus vaccinal PPR 75/1 a été récolté

après une série de trois cycles de congélation-décongélation de la culture cellulaire et clarification

par centrifugation pendant 20mn à 3000 rpm à 4°C (Centrifugeuse Jouan GR 412)

1.2 – Concentration et inactivation du virus PPR 75/1

Le virus a été ensuite concentré six fois sur une cassette Pellicon munie d'un filtre dont le

seuil de coupure est de 300 kD (Centricon plus-70, Millipore Corp., Bedford, MA). Deux boites de

cellules Véro témoin non infectées ont été traitées de la même façon. La moitié du volume obtenu

après concentration (25 ml) a été transféré dans une boite de Pétri pour être soumise à 30 mn

d’irradiation aux ultra-violets (UV) de 250x100 µJ/cm2 avec un cross-linker UV (Amersham

Biosciences RPN 2500/2501, UK). Les titres viraux ont été estimés par la méthode de Reed et coll.,

1938 et sont exprimés en TCID50/ml. Cependant, après le premier titrage, un ECP résiduel était

encore observé, l’inactivation a donc été répétée et le titre viral est passé de 104.8 à 103.9 DICT50 /ml.

2 – Clonage et production de la protéine N et des protéines mutées obtenues par délétion

2.1 – Clonage des virus recombinants exprimant la protéine N entière et du mutant

obtenu par délétion exprimant la protéine N tronquée

Pour la production de protéines recombinantes en systèmes baculovirus, les cellules

d’insecte Sf21 (Spodoptera frugiperda passage 21) ont été entretues en milieu de Grace contenant

10% de sérum de veau fœtal et 1% d’un mélange d’antibiotiques et cultivées à 27°C. A confluence,

5



les cellules ont été détachées de leur support et passées en boites de culture T150 cm2. Les

baculovirus recombinants exprimant soit la N PPR entière (N-PPR) soit la N tronquée ont été reçus

du laboratoire de la division jointe FAO/AIEA pour la Santé Animale (Vienne, Autriche). Leur

représentation schématique est montrée en Figure 3. Ces différents baculovirus ont été clonés

séparément sue cellules Sf21 par la méthode de plage de lyse sous agarose en boites 6 puits. Des

dilutions de 10 en 10 de chacun des virus exprimant la N-PPR entière ou la protéine N délétée, ont

été effectuées en milieu de Grace jusqu’à la dilution 10-11. A partir de la dilution 10-4, 100µl de

suspension virale a été déposé dans deux boites 6 puits de Sf21 préparées la veille avec 106

cellules/ml et incubées 1 h à 27°C.

Puis, chaque cupule contenant les Sf21 infectées a été recouverte avec 1,5 ml d’une solution

d’agarose préparée à partir d’agarose à 2% mélangé à volume égal avec du milieu de Grace complet

2X et maintenue à 42°C jusqu’à utilisation. Après refroidissement à la température ambiante, les

plaques ont été placées à 27°C jusqu’à l’apparition des plages de lyse. Les plages bien séparées ont

été repérées sous microscope et pour chacun des recombinants 8-10 d’entre elles ont été prélevées

stérilement dans un volume de 30µl pour infecter 5x104 Sf21 en suspension dans une plaque 24

puits. Dans le même temps pour identifier les clones par immunofluorescence, une suspension de

100 µl des puits de plaque 24 puits a été passé en plaque 96 puits.

Figure 3: Représentation schématique des différentes délétions obtenues avec la nucléoprotéine de PPRV.

2.2 – Sélection des clones par test d’immunofluorescence

Lorsque l'effet cytopathique (ECP) devient évident (80%) pour chacun des clones de

baculovirus, les cellules Sf 21 sont fixées par une solution à 80% d'acétone à température ambiante et

sont incubés 1/2 h, puis rincées au PBS. Une incubation avec des anticorps monoclonaux anti-

nucléoprotéine de PPRV au 1/100ème (Mab 38-4, Libeau et coll., 1995) pendant 1/2 h, des rinçages au

PBS, ainsi que l’addition d’un conjugué anti-IgG totales de souris FITC (dilution 1/80ème Biorad) ont

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été réalisés. Après rinçage, les plaques sont examinées sous microscope à fluorescence pour identifier

les clones positifs. Pour chacun des virus, le clone exprimant le plus d’intensité de fluorescence est

choisi pour amplification.

2.3 - Amplification des clones baculovirus recombinants et expression des protéines

Les clones exprimant le plus d’intensité de fluorescence ont été amplifiés. Une infection sur

boite 75 cm2 à une MOI de 10 a été réalisée avec 0.5 ml du premier passage de chaque baculovirus

recombinant exprimant la N entière ou ou la N tronquée obtenue par délétion. Le surnageant viral a

été récolté au jour 4, quand l’ECP était visible puis 1 ml il a servi à infecter des boites 150 cm2 à

une MOI de 10. Un total de 6 boites correspondant à environ 108 cellules a été utilisé pour produire

chaque type de protéine. La nucléoprotéine étant intra cytoplasmique, à 4 jours d’infection, le

surnageant a été éliminé, les cellules détachées de leur support avec un grattoir et le culot cellulaire

lavé avec 20 ml de PBS puis resuspendu dans 30ml de PBS. Comme témoin négatif, deux boites de

cellules SF21 non infectées ont été traitées dans les mêmes conditions.

3 - Dosage du virus PPR vivant, inactivé et des protéines N recombinantes par ELISA

immunocapture

Le test ELISA immunocapture a été développé pour le diagnostic différentiel de RPV et

PPRV à partir d’échantillons de tissus d’animaux infectés (Libeau et coll., 1994). Il met en jeu des

anticorps monoclonaux (Mabs) spécifiques de la N d’un des deux virus et reconnaissent chacun un

épitope différent. Le Mab de capture réagit avec les deux virus et les Mabs de détection biotinylés

chacun spécifique d’un virus, donnent lieu à une réaction colorée avec la streptavidine peroxydase.

Pour titrer la protéine N de PPRV vivant ou inactivé et les protéines N produites par les

baculovirus recombinants (N entière ou N tronquée), des plaques ELISA 96 puits (Nunc Maxisorp)

ont été sensibilisées avec le Mab de capture dilué dans du tampon physiologique (PBS, pH 7.5) et

incubées pendant une heure à 37°C sur agitateur. Les cupules ont ensuite été lavées trois fois avec

le tampon de lavage (PBS 1/5 contenant 0.05% Tween 20). Puis les réactifs suivants ont été ajoutés

en une seule étape et incubés une heure en constante agitation : 50µl/cupule en doublet de chacun

des échantillons à tester dilués de deux en deux à partir du 1/100ème (les virus PPR et les protéines

recombinantes), deuxièmement, 25 µl de Mab biotinylé anti-PPR à la dilution de 1/300.

Troisièmement, 25µl de peroxydase-streptavidine à la dilution de 1/100 en tampon de blocage; le

tampon utilisé pour diluer les Mabs et le conjugué est du PBS contenant 0.5% sérum d’agneau et

0.05% de Tween20. Après trois lavages en tampon, le substrat, l’ortho-phénylènediamine (100µl)

est ajouté à chaque cupule et incubé 10 minutes à température ambiante. La réaction enzymatique

7



est stoppée par addition de 100µl d’acide sulfurique 1N et les densités optiques des échantillons

sont mesurées à 492 nm avec un lecteur ELISA asservi à un logiciel de lecture. Des contrôles

positifs consistant en du vaccin RPV et PPRV ont été inclus sur la plaque. Les densités optiques

(DO), sont proportionnelles à la concentration de la protéine N. Ce test nous a permis de comparer

les quantités de protéines recombinantes ajoutées aux MOI du virus PPR.

4 - Culture des lymphocytes de chèvres et essai de lymphoprolifération

4.1 - Isolement des lymphocytes du sang périphérique

Les lymphocytes du sang périphérique de chèvres naïves ont été isolés sur gradient de Ficoll

(Histopaque 1077, Sigma, USA) à partir de 20 ml d’une solution sang diluée au ½ dans du PBS

sans Ca++ ni Mg ++ (D-PBS). Le gradient a été centrifugé à 3000 rpm à 20°C (Centrifugeuse Jouan

GR-412) et les cellules formant l’anneau ont été récoltées et reprises avec du D-PBS, QSP 40 ml.

Les cellules ont été lavées deux fois dans le même volume par centrifugation à 1200 rpm pendant

10 mn à 4°C et le culot repris dans 5 ml de milieu peut être dénombrées. Les milieux de culture ont

été supplémentés avec de la gentamycine à 0.5%, de la glutamine à 1 %, du mercaptoéthanol à 0.1%

et du SVF à 10%,

4.2 – Lymphoprolifération et analyse en cytométrie de flux

Pour l’essai de lymphoprolifération, les cellules ont été aliquotées en doublet sous un

volume de 400µl dans des plaques de culture 24 puits et ensemencées avec deux densités

cellulaires: soit 106 soit 4 x 106 cellules par puits et incubées à 37°C en 5% CO2 soit, dans du

RPMI-1640-Glutamine pour la stimulation à la Concanavaline A (ConA) soit, du DMEM Glutamax

pour la stimulation à la phytohémagglutinine (PHA). Puis elles ont été mises en contact avec de la

ConA, à la concentration de 7 µg/ puits ou de la PHA à 3.5 µg/ puits et des Multiplicité d’infection

(MOI) croissantes de virus PPR ou des quantités croissantes de protéines recombinantes N-PPR ou

parties de celle-ci ainsi que des antigènes contrôle (Vero et Sf21). Des puits de contrôle ont reçu des

lymphocytes stimulés ou non stimulés par les mitogènes sans addition d’antigène. Après 72h de

traitement, les cellules non colorées ont été analysées en cytométrie de flux, avec le logiciel

CellQuest 3.01 (Becton Dickinson, San Jose, USA). Les données ont été collectées à

respectivement 3000 et 1000 évènements correspondant à 4.106 et 106 cellules. Pour caractériser les

populations correspondantes, des acquisitions en nuages de points FSC (Forward scatter) (lumière

diffusée à 0°) et SSC (Side Scatter) (lumière diffusée à 90°) ont été réalisées avec un profil

d’analyse donnant respectivement des informations relatives à la taille et à la granulosité. Les

cellules ont été triées sur les fenêtres R1 représentant les débris et R2 représentant les lymphocytes

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stimulés comme présenté Figure 4. Les contrôles négatifs non stimulés par les mitogènes, ont été

utilisés pour définir la fenêtre R1. Puis le nuage de points est analysé statistiquement par un cadran

qui définit les parties LL (Lower Left) et LR (Lower Right) comme indiqué Figure 5. Le

pourcentage de lymphoblastes situés dans la partie LR sert à calculer le pourcentage d’inhibition

grâce à la formule suivante : [ 1- Test/control x 100 ].

Figure 4 : Density Plot présentant les fenêtres R1 et R2

9



Figure 5 : Plot présentant la mise en place du cadran permettant d’obtenir les statistiques

10



III – Résultats

1 - Le virus PPR inhibe la prolifération des lymphocytes du sang périphérique de

chèvres

Pour déterminer si le virus PPR inhibait la prolifération des cellules lymphoïdes de chèvres,

un test in vitro de lymphoprolifération a été développé comme décrit précédemment par Esteves et

coll., 2004. Différentes quantités de virus vivant ou de virus inactivé par les UV correspondant à

des multiplicités d’infection (MOI) de 0.00016 à 0.15 ont été mises en présence avec des

lymphocytes de chèvres naïves. Le virus PPR cultivé et titré sur cellules Vero a été récolté à 90%

d’effet cytopathique. La suspension virale provenait de cultures cellulaires ayant subit des cycles de

congélation et de décongélation et centrifugées pour éliminer les débris cellulaires. Le virus a

ensuite été concentré six fois sur membrane Millipore. Le virus vivant et irradié aux UV provenait

de la même préparation qui a été divisée en deux au moment de l’irradiation. Le pouvoir pathogène

résiduel du virus irradié a été évalué par observation microscopique sur culture de cellules Vero

après une semaine d’infection. Malgré cette irradiation, il a été constaté un titre de 103.9DICT50/ml.

Les lymphocytes caprins ont été isolés et purifiés sur gradient de Ficoll et stimulés avec de la

phytohémagglutinine (PHA) ou de la concanavaline A (ConA) et mélangés au virus. L’effet du

virus vivant et du virus inactivé sur la lymphoblastogénèse en fonction des mitogènes utilisés et les

différentes conditions de culture des lymphocytes est présenté dans le Tableau I ci-contre. Pour le

virus vivant, les MOI varient entre 0.00016 et 0.15 et pour le virus irradié, elles varient entre

0.00016 à 0.06. Les MOI les plus fortes ont été obtenues en lyophilisant le virus et en le

reconstituant avec un volume 10 fois moindre et en réduisant le nombre de cellules de 4x106 à 106

cellules par puits.

On observe que lorsque la multiplicité d’infection du virus vivant et du virus irradié

augmente, le pourcentage de blastes est réduit et passe à des valeurs approximatives de 95% à 2%.

Il n’y a pas de différence significative entre les stimulations ConA et PHA Comme contrôle négatif,

les lymphocytes stimulés ou non ont aussi été mis en contact avec une préparation de cellules Vero

non infectées qui a subi le même traitement que les cellules infectées. Comme on peut le voir, il n’y

a pas d’effet significatif sur la lymphoblastogénèse de cette préparation. La réduction du

pourcentage de blaste engendrée par le virus PPR est donc un phénomène spécifique des cellules

d’origine lymphoïdes qui n’est pas lié à la présence de cellules Vero. Pour plus de clarté la

réduction de la blastogenèse a été exprimée en pourcentage d’inhibition en utilisant la formule

décrite en Matériel et Méthodes. L’inhibition de la lymphoprolifération en présence de PHA induite

par le virus vivant et irradié suit une loi dose effet (Figure 6). A une MOI de 0.15, le virus vivant

11



montre une immunosuppression très importante de 96% et à une MOI mille fois moindre,

l’immunosuppression est réduite donnant des valeurs allant de 5 à 15 %, valeurs équivalentes à

celles obtenues avec l’homogénat de cellules Vero utilisé comme contrôle. Lorsque le virus PPR est

vivant, l’effet immunosuppresseur est supérieur à celui observé lorsque le virus a été inactivé aux

UV, bien qu’un titre infectieux persiste. Le maximum d’immunosuppression observé dans ce

dernier cas est de l’ordre de 52% avec une MOI de 0.15. Il perd son pouvoir inhibiteur après avoir

été dilué 100 fois. Les résultats montrés en Figure 6 expriment également la moyenne et l’écart type

obtenu sur deux expériences indépendantes conduites en stimulation avec la PHA et avec des

conditions de culture correspondant à 4x106 lymphocytes par puits.

0102030405060708090

100

0,15

0,063 0,0

40,0

160,0

15

0,006

30,0

04

0,001

6

0,001

5

0,000

6

0,000

4

0,000

2

Multiplicité d'infection

Inhi

bitio

n de

la p

rolif

érat

ion

cellu

laire

%

PPRV vivant

PPRV inactivé

Figure 6 : Pourcentages d’inhibition (PI) obtenus en fonction des MOI de PPRV vivant et de PPRV inactivé. Pour les MOI 0,04 ; 0,016 ; 0,004 ; 0,0016 et 0,0004, les PI obtenus représentent la moyenne +/- l’écart type obtenu sur deux expériences indépendantes conduites en PHA et avec des conditions de culture à 4x106 lymphocytes par puits

2 - Production des protéines N entière et tronquées de PPRV

Il a été démontré que les nucléocapsides des Morbillivirus se fixent sur les lymphocytes des leurs

hôtes naturels et induisent une immunosuppression (Kerdiles et coll., 2006). On peut supposer que

les caractéristiques biochimiques et antigéniques des nucléocapsides de PPRV recombinantes ou

virales sont identiques comme l’ont montré Ravanel et coll. (1997). La protéine recombinante N de

PPRV et des protéines tronquées correspondant à des virus recombinants « mutants » obtenus par

délétion ont donc été exprimées dans le système baculovirus. Afin de localiser plus finement la

12



séquence de la protéine N impliquée dans l’inhibition, différents baculovirus recombinants

comprenant différentes délétions du gène N ont été utilisés pour produire les protéines tronquées en

cultures Sf21. Sept délétions ont été ainsi introduites dans le gène de la N- PPR dans un travail

préalable entrepris par C. Bodjo (non publié). La représentation schématique des différentes

délétions introduites en position 3’ ou 5’ terminales est montré dans la Figure 3 (Matériel et

Méthodes). Les protéines présentant un intérêt pour cette étude sont principalement la protéine

entière et les 02 protéines tronquées delta 420-525N-PPR et delta 1-420N-PPR. Au préalable les

virus recombinants baculovirus respectifs ont été clonés par plage de lyse. Plusieurs clones ont été

sélectionnés et testés en immunofluorescence comme le montre la Figure 7. Un clone a été

sélectionné pour chaque recombinant parmi les clones positifs, pour la production de protéines en

cellules Sf21. Seules la protéine N entière et la protéine tronquée delta 420-525N-PPR ont pu être

étudiées pour des raisons de temps limité.

Figure 7 : Examen au microscope à fluorescence des clones de baculovirus recombinants pour la sélection des clones positifs à amplifier.

3 - La protéine recombinante de PPRV inhibe la prolifération des lymphocytes de chèvres

Des protéines recombinantes, soit entière de la N de PPRV , soit tronquées obtenues par

délétion de certaines parties du gène N ont donc été exprimées dans le système baculovirus et ont

été utilisées pour déterminer la séquence à l’origine de l’inhibition de la prolifération des

lymphocytes de l’animal hôte. Il a été démontré en effet, que la partie C-terminale de la N se lie au

récepteur NR et supprime la lymphoprolifération et qu’au moins trois membres des Morbillivirus

13



partagent cette capacité (Laine et coll., 2003). La protéine N ayant une localisation

intracytoplasmique, les protéines ont été préparées à partir des culots cellulaires Sf21 infectées avec

les virus recombinants baculovirus de la N entière de PPRV, N-PPR ou la N tronquée, delta 420-

525N-PPR. Après lavage au PBS, les cellules infectées ont subi des cycles de congélation et de

décongélation et ont été resuspendues dans du PBS. L’effet des protéines N-PPR et delta 420-525N-

PPR sur la lymphoblastogénèse en fonction des différentes concentrations de lymphocytes est

résumé dans le Tableau II ci-contre. On observe que lorsque la quantité de protéine augmente, le

pourcentage de blastes est réduit et passe à des valeurs approximatives allant de 72% à 50%.

Comme contrôle négatif, les lymphocytes stimulés ou non ont aussi été mis en contact avec une

préparation de cellules Sf21 non infectées ayant subi le même traitement que les cellules infectées.

Comme on peut le voir, il n’y a pas d’effet significatif sur la lymphoblastogénèse de cette

préparation et la réduction de la multiplication cellulaire provient bien de la protéine N-PPR.

La protéine recombinante N-PPR et la protéine recombinante tronquée delta 420-525N-PPR

affectent la prolifération lymphocytaire selon une loi dose effet (Figure 8). On peut en déduire que

l’activité anti-proliférative est présente sur la séquence aa 1-420 de la protéine tronquée N de PPRV

comme pour les protéines N des autres Morbillivirus. Dans les conditions de culture de 106 cellules

par puits et à la concentration protéique la plus élevée, la N-PPR montre une immunosuppression

d’environ 10% contre 20% pour la protéine délétée. L’activité immunosuppressive de delta 420-

525N-PPR est apparemment supérieure à celle observée avec la protéine entière.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

99 9 0,9 99 9 0,9

Quantité (µl par puit)

Inhi

bitio

n de

la p

rolif

érat

ion

cellu

laire

%

4xmillions

1xmillion

N-PPR delta 420-525N-PPR

Figure 8 : Pourcentages d’inhibition (PI) obtenus en fonction des quantités de N-PPRV et de delta 420-525N-PPR. Deux expériences indépendantes en PHA et avec des conditions de culture à 4x106 lymphocytes par puits ont été conduites avec N-PPR.

14



Le dosage par ELISA immunocapture nous montre que la densité optique lue à 492 nm

obtenue avec la protéine délétée est plus intense qu’avec la N entière, certainement dû à des

conditions de culture utilisées correspondant à une concentration plus faible (Figure 9). La charge

protéique utilisée dans les tests de lymphoprolifération pour delta 420-525N-PPR correspond

approximativement à une MOI de 0,0016. Elle est 4 à 8 fois moindre pour la N-PPR. Une meilleure

efficacité de l’immunosuppression pourrait également provenir de la différence de quantités

molaires des récepteurs engagés. Comme la masse moléculaire de la protéine tronquée est d’environ

45 kDa et celle de la protéine entière de 60kDa, une quantité 1/4 fois supérieure de N doit être

ajoutée pour engendrer un effet similaire. Les résultats en Figure 8 expriment pour N-PPR, la

moyenne et l’écart type obtenue sur deux expériences indépendantes conduites en PHA et avec des

conditions de culture à 4x106 lymphocytes par puits.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

100 200 400 800 1600 3200 6400

Dilution

Den

sité

s op

tique

s à

492

nm

PPRV vivantPPRV inactivéN-PPRdelta 420-525N-PPR

Figure 9 : Dosage par ELISA immunocapture des préparations virales de PPR vivant et inactivé à partir de cellules Véro infectées et des préparations protéiques N-PPR et delta 420-525 N-PPR à partir de cellules SF21 infectées par les baculovirus recombinants respectifs.

15



IV - Discussion

Plusieurs facteurs semblent contribuer à l’effet immunosuppresseur des Morbillivirus. Les

différentes protéines du virus jouent un rôle important dans l’immunopathogénicité.

L’immunosuppression est déclenchée soit, par contact direct des protéines virales avec les cellules

du système immunitaire qu’elles soient infectées ou non infectées soit, par des facteurs solubles via

des récepteurs des lymphocytes de l’hôte. Heaney et coll. (2002) ont montré que le complexe F-H

de RPV et de PPRV pouvait inhiber la prolifération de lymphocytes fraîchement isolés du sang

périphérique de bovins et de caprins et que la souche vaccinale PPRV se montrait plus efficace sur

les cellules de caprins que RPV. Dans notre étude, nous avons utilisé le virus PPR comme modèle

pour étudier les caractéristiques immunosuppressives de la nucléoprotéine. Le virus PPR vivant ou

inactivé aux UV, la protéine entière de PPRV et exprimées dans le système baculovirus a été utilisé

pour démonter in vitro l’inhibition de la prolifération de cellules naïves de chèvres. Des mutants de

délétion ont aussi été testés pour pouvoir localiser la région qui induit cette inhibition.

Nos résultats montrent que l’inhibition de la prolifération des lymphocytes de chèvre

augmente avec la multiplicité d’infection du virus vivant ou du virus inactivé, mais dans une

moindre mesure avec ce dernier. La littérature montre que la partie C-terminale de la N inhibe aussi

bien la prolifération des cellules B que T. Cependant dans notre cas, les sous-populations n’ont pas

été étudiées car l’objectif est la localisation de la séquence activement immunosuppressive. Les

virus vaccinaux et de type sauvage inhibent également ces deux types de cellules infectées ou non

infectées (Naniche et coll., 1999 ; Schlender et coll., 1996). Ces éléments d’information forment un

faisceau d’évidence suggérant que l’arrêt de la multiplication cellulaire ne peut simplement être due

à l’infection cellulaire ou à des cytokines conventionnelles. Bien que l’apoptose décrite pour MV,

CDV et PPRV soit décrite comme découlant principalement d’un effet direct cytopathogène, nous

pouvons formuler l’hypothèse d’une interaction de la N de PPRV et des cellules B et T.

Récemment l’existence d’un récepteur de MV-N appelé NR, différent de FcγR a été

suggérée (Laine et coll., 2003). NR est un récepteur ubiquitaire et la détection de ce récepteur sur

différentes espèces de cellules favorise une expression conservée. Nous sommes partis du principe

que les lymphocytes de chèvres portaient ces récepteurs et pouvaient mettre en évidence la

suppression de la lymphoprolifération de ces cellules naïves stimulées par un mitogène. MV semble

se fixer à ce récepteur via sa partie C-terminale pour moduler la prolifération cellulaire in vitro

comme le suggère Laine et coll. (2005).

Nous avons considéré que les protéines recombinantes exprimées par le baculovirus sont dans

la plupart des cas antigéniquement, immunologiquement et fonctionnellement identiques aux protéines

16



natives. La protéine recombinante de la N de PPRV et les protéines tronquées obtenues par des

délétions du gène N ont donc été exprimées en culture de cellules d'insecte. Ce système d'expression

fournit un environnement eucaryote propice aux repliements de chaînes, à la formation de ponts

disulfides, à l'oligomérisation et/ou à des modifications post-traductionnelles requises pour la fonction

biologique de quelques-unes des protéines eucaryotes. L’expression de la protéine N et de la protéine

tronquée delta N 420-525 a été mesuré par ELISA immunocapture, montrant que cette dernière était

bien mieux exprimée et dans des concentrations comparables au virus PPR après concentration.

Ainsi exprimées, nous avons recherché si la protéine N et la protéine tronquée delta N 420-525 de

PPRV avaient des caractéristiques similaires aux propriétés immunosuppressives de la N-MV.

Notre étude montre qu’effectivement cet effet est observé confirmant l’hypothèse que la région de

reconnaissance du récepteur est la même pour tous les Morbillivirus. La région variable C-terminale

décrite par Diallo et coll., (1994) comporte des sites très immunogènes, aa 520-525 pour RPV et aa

457-472 pour PPRV (Choi et coll., 2003, 2004; Dechamma et coll., 2006) qui permettent la

différentiation des deux virus par ELISA indirect et Western blot. La protéine recombinante

tronquée delta N 420-525 conserve sa capacité immunosuppressive. Ceci suggère que les épitopes

N des Morbillivirus impliqués dans l’activation immunitaire sont différents de ceux reconnaissant

les récepteurs cellulaires de surface et donc impliqués dans l’immunosuppression. Ceci pourrait

expliquer que les deux mécanismes coexistent lors des infections aiguës à Morbillivirus. Lorsque

l’immunité prend le pas sur l’immunosuppression, l’organisme est protégé à vie contre une

réinfection.

17



V – Conclusion et perspectives

Bien que la zone immunosuppressive ait pu être également localisée pour PPRV comme

pour MV entre les aa 401-420, la délétion de cette zone doit pouvoir montrer la perte des

caractéristiques immunosuppressives. La protéine delta 1-420 N-PPR dont la délétion recouvre

toute la partie théoriquement active est en cours de production pour des essais de

lymphoprolifération. En mettant en jeu certaines des autres délétions, une localisation plus fine

pourra être réalisée. L’objectif plus lointain de ce travail consisterait à déléter la région

correspondant sur la N-PPR, ou une partie de celle-ci, dans l’objectif d’améliorer le vaccin PPR

Nigéria 75/1 couramment utilisé. Ceci réduirait ses caractéristiques immunosuppressives. La partie

C-terminale de la protéine N des Morbillivirus en s’associant à la protéine P est requise dans la

transcription virale (Harty et coll., 1995 ; Bankamp et coll., 1996 ; Liston et coll., 1997). Il faudra

donc s’assurer avant d’introduire le gène de la N modifiée par génétique inverse dans le génome

complet de virus PPR, que celui-ci est fonctionnel à l’aide d’un minigénome ayant un gène

rapporteur tel que eGFP ou CAT afin de déterminer les effets de la délétion.

Remerciements : Je tiens particulièrement à remercier Catherine Cêtre-Sossah et Philippe Totté qui

m’ont aidé à mettre en place les tests de lymphoprolifération et à l’analyse en cytométrie de flux.

18



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22

Université Montpellier II Master Sciences et Technologie Tableau I : Pourcentage de lymphoblastes obtenus après contact avec le virus PPR vivant ou inactivé en différentes conditions de culture. Conditions de culture Mitogène T- T+ Surnageant

des cellules Vero PPR Vivant PPR inactivé

µl MOI MOI

998 99 09 0,04 0,016 0,004 0,0016 0,0004 0,00016 0,016 0,0016 0,00016

PHA 5,79 66,76 65,65 74,97 72,29 24,27 55,14 64,45 58,06 67,01 60,53 47,31 73,38 68,59

PHA 6,73

68,41 66,4 68,81 64,73 11,19 85,45 72,2 76 58,11 76 97,8 83,49 94,12 I*

ConA 4,79 61,73 24,82

69,99

68.01 43,34 24,61 60,78 60,48 66,55 64.66 20,45 65,34 69,6

MOI MOI

0,15 0,063 0,015 0,0063 0,0015 0,00063 0,063 0,0063 0,00063

II** PHA 21,4 59,35 60 65,05 60,85 2,02

44,9

52,47 55,61 51,85 54,97 28,72 52,55 56,35

* 04 x 106 cellules/ puits ** 106 cellules/ puits

Zaheer Ahmed Nizamani 23

Université Montpellier II Master Sciences et Technologie Tableau II : Pourcentage de lymphoblastes obtenus après contact avec la protéine N-PPR et la protéine PPR N-del 420-525

en différentes conditions de culture.

Surnagent SF-21 Cellules N-PPR

PPR N-del 420-525 Conditions de

culture Mitogène

T- T+ 99 µl 09 µl 0,9 µl

99 µl 09 µl 0,9 µl

99 µl 09 µl 0,9 µl

PHA

5,79

66,76

78,04

71,8

69,61

73,33

67,65

72,24

I*

PHA

6,73

68,41

71,46

67,06

68,69

66,64

69,26

65,66

60,9

65,83

68,14

II**

PHA

21,4

59,35

63,24

64,7

66,6

56,23

58,32

61,86

50,45

61,87

68,38

* 04 x 106 cellules/ puits ** 106 cellules/ puits

Zaheer Ahmed Nizamani 24

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Study on immunomodulatory properties of nucleoprotein of peste des petits ruminants virus