第八章基因工程和基因组学 第一节基因工程 一基因工程概述 广义的遗传工程包括：基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程。习惯上所讲的遗传工程多指基因工程。

基因工程是一种操作，它不是通过一般传统的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，成为新的类型。

基因工程的施工程序大致分为四个步骤：1 、为施工准备材料，即“目的”基因、载体和工具酶等。2 、把目的基因与载体结合成重组 DNA分子。

3 、把重组 DNA 分子引入受体细胞，建立分子无性繁系 (Clone) 或称克隆。4 、从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基因在受体细胞中正确表达。

二限制性内切酶

细菌细胞具有防御异源遗传信息进入的手段。异源 DNA 分子进入细菌细胞后，在许多情况下遭到毁灭，这个过程称为限制。限制的能力来源于微生物的一种特殊的酶，称为限制性核酸内切酶。这是一种水解 DNA 的磷酸二脂酶，它是遗传工程上的一种极其重要的工具酶。

在酶解时， DNA 双链不在同一地方断开，因而产生的片段两端都带有数个碱基的单链尾巴，这两个单链尾巴带有互补的碱基配对顺序，可以互相自动接合成为环状 DNA ，因此称为粘性末端。

三载体( 一 ) 质粒

质粒是在细菌中发现的，它是易于取出和引入的小型环状 DNA 。一般有 1 ～ 200Kb 左右 (Kb 为千碱基对 )它的 DNA 分子很小，一般为细菌染色体 DNA 的 0.5 ～ 3% 。

λ 噬菌体 λ噬菌体基因组全长 49kb, 其核酸序列及基因功能和表达调控已研究得十分清楚。 λ噬菌体 DNA 中间约三分之二的序列为中间基因簇 (central gene cluster) ，位于两端的为 DNA 左、右臂。研究表明， λ 基因组的中间基因簇序列可被外源 DNA 片段取代 , 而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。

( 三 ) 柯斯质粒 柯斯质粒 (cosmid) 是利用部分 λ 噬菌体 DNA与部分细菌质粒 DNA 序列组建而成的 ( 图 9－ 5) 。柯斯质粒具有 λ 噬菌体的 cos 序列 (12bp) ，细菌质粒的复制原点。

( 四 ) 穿梭载体 穿梭载体 (shuttle vectors ) 是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌 ) 中复制，又能在真核细胞 (如酵母 ) 中复制的载体。

(五 ) 细菌人工染色体 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 载体就是为了克隆更大的外源 DNA 片段而设计构建的。BAC 载体是基于细菌的性因子 (F 因子 ) 质粒的一些特点构建的。

(七 ) Ti 质粒及其衍生载体 应用基因工程技术改良植物性状时，需要适合于植物的载体系统，才能将重组 DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。由 Ti 质粒衍生的载体，是最早成功地把外源基因导入植物细胞的植物表达载体。

四筛选基因库 ( 一 ) 从基因库中分离基因 基因库 (library) 是一组 DNA 和 cDNA序列克隆的集合体。

从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。

1. 构建基因库 (1) 核基因库

核基因库 (genomic library 或 genomic bank) 是将某一生物的全部基因组 DNA 酶切后与载体连接构建而成的。

通常的方法是，尽量提取大分子量的核 DNA ，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度 ( 大于 15kb) 的 DNA片段，与适宜的载体连接构成重组 DNA分子 ,根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。若载体是质粒，则将连接的重组 DNA 分子转化感受态细胞，收集所有菌落即成为质粒基因库。

(2) 染色体基因库将基因组的一部分如一根染色体用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。例如果蝇 X 染色体上的一个片段，具有 50 多个多线染色体带，利用微切割技术将这一段染色体切割，抽提 DNA用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上构建成染色体片段基因库。

(3) cDNA库cDNA库是以 mRNA 为模板，经反转录酶 (reverse transcriptase) 合成互补 DNA (complementary DNA ，cDNA)构建的基因库。

2. 筛选基因库从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。大多数方法是利用一段核苷酸序列作探针 (probe) ，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，作探针，筛选基因库

3. 阳性克隆的分析与鉴定 从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因。

①限制性酶图谱构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析阳性克隆的第一步。根据同源性分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较。

图 9－ 12 表示一个 15kb DNA 片段的限制性酶图谱构建方法。

这个方法首先是将 DNA用限制性酶酶切，然后将酶切的DNA 进行琼脂糖凝胶电泳，经过变性处理后，将凝胶上的 DNA 转移到膜上，再用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的 DNA探针与膜上的 DNA 片段杂交，洗去膜上非特异性结合的探针后，用 X-光片放射自显影检测杂交信号

②核酸分子杂交

Southern 杂交分析 (Southern blotting) 是基因工程中常用的方法。

③核酸序列测定只有将克隆后的 DNA 片段进行核酸序列测定后，才能最后确定这个 DNA 片段的序列是否正确。大多数核酸序列测定采用由 Sanger 于 1977年发明的双脱氧核糖核酸链终止法。

④核酸序列分析测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进一步分析，才能最后得出结论。

( 二 )聚合酶链式反应 (PCR)扩增基因 聚合酶链式反应 (polymerase chain)

PCR反应包括三个步骤：1.变性：在 94-95℃使模板 DNA 的双链变性成单链。 2.复性：两个引物分别与单链 DNA 互补复性，复性的温度在 50-70℃。 3.延伸：在引物的引导及 Taq 酶的作用下，于 72℃合成模板 DNA 的互补链。

( 三 ) 人工合成基因 根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成 DNA 的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。

第二节基因组学 基因组学 (genomics) 是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要研究生物体全基因组 (genome) 的分子特征。一个物种的单倍体的染色体数目称为该物种的基因组或染色体组，它包含了该物种自身的所有基因。

                                        

1 、基因组图谱的构建

在进行大规模序列测定之前，构建基因组图谱是测定大基因组全部核苷酸序列的重要一环

a 、克隆连续序列法 (clone contig) ，将基因组 DNA 切割长度为 0.1 Mb-1 Mb 的大片段，克隆到 YAC 或 BAC 载体上，分别测定单个克隆的序列，再装配、连接成连续的 DNA 分子。

b 、定向鸟枪射击法 (directed shotgun) ，以基因组图谱中的标记为依据，测序、装配和构建不同 DNA 片段的序列。

( 一 ) 遗传图谱图谱标记 图谱构建中需要可以鉴别的标记 (marker) ，在构建遗传图谱中，可用基因和 DNA 作为标记。

(1) 基因标记基因控制性状的表现，所以也就是利用可以鉴别的形态、生化等表型性状作标记

(2) DNA标记

A 、限制性内切酶多型性

B 、简单序列长度多型性a 、多次重复序列 (variable number of tandem repeats ， VNTRs) ，也称为微随体 (minisatellite) 。这种重复序列长度为几十个核苷酸。

b 、简单重复序列 (simple tandem repeats ， STRs)又称为小随体 (microsatellite) 。

C 、单核苷酸多型性单核苷酸多型性 (simple nucleotide polymorphisms ， SNPs)是基因中的点突变，存在的数量多，其中有些可产生 RFLP，但多数突变不是发生在酶切位点。

遗传图谱的构建(1) 人类基因组遗传图谱的构建

(2) 植物基因组遗传图谱的构建

A 、选择亲本

B 、产生构图群体

C 、遗传标记的染色体定位

D 、标记间的连锁分析

( 二 ) 物理图谱

基因组物理图谱的构建不需要经过减数分裂的世代群体，可以直接利用 DNA 分子分析，主要有以下三种不同途径。1. 限制性酶图谱

A 、用识别较多核苷酸的内切酶

B 、选用其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶。

2. 荧光原位杂交

3. 序列标签位点

(1) 特异 DNA 序列A 、表达的序列标签 (expressed sequence tag ， EST) ，表达的序列来自 cDNA( 图 9－ 10) ，一些 cDNA 的短片段测序后可作为 EST 。

B 、 SSLP也可用于物理图谱的构建。可据遗传图谱中的 SSLP标记，再用于物理图谱构建，进而比较和相互验证。

C 、 DNA随机片段，可随机选择 DNA 片段，测序后经分析比较，如果不是重复序列，也可作为 STS 。

(2) DNA 片段利用 DNA 片段作为图谱标记的又可分为两种不同类型，辐射杂交系及克隆连续序列。

A 、辐射杂交系 B 、克隆的 DNA 片段序列