ЛЕКЦИЯ 10

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬСТЕРИЛЬНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

СРЕДСТВ

ГФ РБ т.1 изд-е 2 разделы 2.6.1, 5.1.10.

Стерильность – отсутствиеживых микроорганизмов.

Для стерильных лекарственных формналичие микроорганизмов, даже в маломколичестве, может стать летальным, учитывая беспрепятственное попаданиемикроорганизмов в кровь или наслизистые оболочки организма, приусловии ослабленного иммунитетачеловека.

Впервые тест на определениестерильности лекарственных средств былвнесен в фармакопеи Великобритании иСША в 1932 и 1936 годах соответственно.

Цель испытания на стерильность –подтверждение полного отсутствияжизнеспособных бактерий и грибов виспытуемом объекте (АФИ, ЛС).

Испытание применяется для препаратов, которые должны быть стерильны:•ЛС для парентерального применения(растворы, лиофильно высушенные истерильно расфасованные порошки дляинъекций и инфузий);•Офтальмологические ЛС;•Растворы антисептиков для наружногоприменения;•Мази, гели для наружного применения (длянанесения на раневую поверхность);•АФИ, предназначенные для производства ЛСв форме стерильно расфасованных порошков идр.Однако: удовлетворительный результатиспытания свидетельствует лишь о том, чтов условиях испытания в испытуемом образцене обнаружено микроорганизмов.Для стерильных продуктов обоснованные идокументированные фактическиедоказательства правильного протеканияпроцесса их приготовления дают большуюгарантию по сравнению с испытанием настерильность.

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

Условия для проведения испытания поопределению стерильности:• Испытания на стерильность должныпроводиться в тех же условиях, что и асептическоепроизводство: при использовании ламинар-боксов сламинарным потоком воздуха класса А, расположенной в чистом помещении класса В, или спомощью изолятора.• Подготовка воздуха, подаваемого в чистоепомещение, с помощью НЕРА-фильтров (HEPA - High Efficiency Particulate Absorption - высокоэффективнаязадержка частиц). Эти фильтры служат дляпрактически полной очистки воздуха даже от самыхмельчайших частиц , вплоть до 0.1 мкм.• Доступ к помещению должен быть организованчерез воздушные шлюзы – конструкции соднонаправленными односторонними путямипрохождения. Воздушный шлюз предотвращаетперемещение воздуха между помещениями. Когда вседвери воздушного шлюза закрыты, подаваемый в неговоздух разбавляет загрязнения, поступившие изнаружного коридора через дверь, либо выделяемыеприсутствующим персоналом.

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

• Испытуемая продукция должнаподаваться через передаточные окна.

• Исполнители должны быть переодетыв стерильную одежду.

• Исполнители должны пройтисоответствующую подготовку.

• Меры предосторожности, принимаемые против контаминации, недолжны влиять ни на один измикроорганизмов, которые могут бытьобнаружены в ходе испытания.

• Условия, в которых проводятсяиспытания, должны регулярноконтролироваться путем отбора пробвоздуха и поверхностей рабочей зоны.

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

Методы определения стерильности:• Мембранная фильтрация – наиболее

предпочтительный метод, еслииспытуемый препарат фильтруется;

• Метод прямого посева.Прямой Посев• Преимущества- Быстрый, простой, экономичный- Нефильтруемые образцы• Ограничения- Ограниченный объем образца: низкая

чувствительность- Проблемы с антимикробным действием

Мембранная Фильтрация• Преимущества- Возможность эффективного устранения

антимикробного действия- Высокая надежность выявления нестерильности

антимикробных препаратов из-за отсутствияразбавления, что имеет место при устраненииантимикробного действия.

- Возможность фильтрования большого объема- Статистически более достоверен- Более чувствителен: высокая эффективность

выявления микробной контаминации принизкой концентрации клеток в единицеобразца благодаря возможностиконцентрирования или удержания намембране даже единичных клеток (1 КОЕ наобразец)

• Ограничения- Нефильтруемые образцы, закупоривание

мембраны

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

Питательные среды, используемые дляопределения стерильности:

• Жидкая тиогликолевая среда: снижаетокислительно-восстановительныйпотенциал и способствует ростуанаэробных микроорганизмов

- Выявление анаэробных бактерий- Аэробных бактерий• Жидкая среда на основе гидролизата

казеина и соевых бобов (# среда Сабуро) :- Выявление грибов- Выявление аэробных бактерий.Приготовление питательных сред• Из отдельных ингредиентов в

соответствии с ГФ РБ• Из коммерческой дегидратированной

среды в соответствии с прилагаемойинструкцией (состав дегидратированнойсреды должен соответствовать ГФ РБ).

Проверка пригодности питательных средА. Проверке подлежит каждая партия

приготовленных питательных сред (~ 5% отколичества в партии)

Б. Проверка стерильности: термостатируютобразец каждой партии питательной средыпосле ее стерилизации в течении 14-тисуток при 30-35°С для тиогликолевойсреды и 20-25°С для среды на основегидролизата казеина и соевых бобов (# среды Сабуро).

По истечении заданного срока на (в) питательных средах должны отсутствоватьвизуально определяемые признаки ростамикроорганизмов.

В. Проверка ростовых свойств:1. Используемые микроорганизмы- Жидкая тиогликолевая среда:

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes.

- Жидкая среда на основе гидролизатаказеина и соевых бобов (# средаСабуро): Bacillus subtilis, Candida albicans, Aspergillus brasiliensis.

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

2. Проведение процедуры:- порции питательных сред инокулируютнебольшим количеством каждого измикроорганизмов (не более 100 КОЕ). Способприготовления рабочих суспензий аналогичентаковому при проверке ростовых свойствпитательных сред, используемых дляопределения микробиологической чистоты.- инкубируют: до 3-х дней при температуре 30 -35°С – в случае бактерий и до 5 дней притемпературе 20-25°С – в случае грибов;- отрицательный контроль: контролюподвергается растворитель, используемый дляприготовления исходной и рабочей суспезийтест-микрорганизмов, путем высева напитательные среды. Не должно наблюдатьсяроста микроорганизмов.3. Интерпретация результатов: среды являютсяпригодными при условии наличия четкоговизуально наблюдаемого роста микроорганизмов.Проверка наличия/отсутствия антимикробногодействия ЛС:аналогично тому, как при проверкемикробиологической чистоты с учетом условийпроведения определения стерильности(определение проводится в жидких средах).

Определение стерильности ЛС и АФИ1.Объем выборки для испытания (количество

единиц продукции): - метод определения стерильности –

разрушающий, поэтому отбор для анализабольшого количества единиц продукцииэкономически невыгоден;

- использование для анализа малогоколичества единиц продукции при большомобъеме производственной серии – рискполучения неадекватного ответа.

Объем выборки зависит от количества единицпродукции в серии и назначения препарата.

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

*Минимальное количество единиц продукции для испытания

Количество единиц продукции впроизводственной серии

Минимальное количество единицпродукции для каждой среды (если не

обосновано или не разрешеноиспользование других количеств)

ЛС для парентерального применения- не более 100 контейнеров

- 100 – 500 контейнеров

- более 500 контейнеров

10% или 4 контейнера, в зависимостиот того, что больше10 контейнеров

2% или 20 контейнеров, взависимости от того, что меньше

Офтальмологические и другиенеинъекционные ЛС- не более 200 контейнеров

- более 200 контейнеров

5% или 2 контейнера, в зависимостиот того, что больше

10 контейнеров

*Информация носит ознакомительный характер, не является обязательной

Минимальные количества испытуемого продукта, используемые для каждойпитательной среды

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

Количество препарата вконтейнере

Минимальное количество, которое следуетиспользовать для посева на каждую среду (еслине обосновано или не разрешено использование

других количеств)Жидкости:- менее 1 мл-1-40 мл- более 40 мл, но не более 100 мл- более 100 мл

Все содержимое контейнера½ содержимого каждого контейнера, но не менее 1 мл20 мл10% содержимого контейнера, но не менее 20 мл

Твердые вещества(лиофилизированные и стерильнорасфасованные порошки)Менее 50 мг50 мг – 300 мгОт 300 мг до 5 гБолее 5 г

Все содержимое каждого контейнера½ содержимого каждого контейнера, но не менее 50 мг150 мг500 мг

2. Определение стерильности методомпрямой инокуляции

• Водные растворы:- Определенное количество испытуемого

продукта помещают непосредственно впитательную среду. Объем питательнойсреды должен в 10 раз превышать объемобразца для посева (или объем продуктадолжен составлять не более 10% объемапитательной среды);

- Если испытуемый продукт обладаетантимикробной активностью, испытаниявыполняют после нейтрализацииподходящим нейтрализующим агентомили путем разведения в достаточномколичестве питательной среды;

- При необходимости использованиябольшого объема испытуемого продуктапредпочтительно использоватьконцентрированную питательную среду, приготовленную с учетом последующегоразбавления

• Масляные жидкости:- Используют питательные среды с добавкой

подходящего эмульгатора в концентрации, приемлемость которой была подтвержденапредварительно (например, полисорбат 80 в концентрации 10 г/л)

• Мази и кремы, гели:- Образец для анализа готовят разбавлением

в соотношении ~ 1:10 путемэмульгирования с использованиемвыбранного эмульгатора в стерильномрастворителе (например, в растворемясного или казеинового пептона, концентрацией 1 г/л)

- Приготовленный образец переносят впитательную среду

• Инокулированные питательные средыинкубируют в течение не менее 14 днейпри 30 - 35°С (тиогликолевая среда длявыявления бактерий) и при 20-25°С (средуна основе гидролизата казеина и соевыхбобов (# среда Сабуро) для выявлениягрибов).

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

3. Определение стерильности методоммембранной фильтрацииУстановка мембранной фильтрации:- гребенка из нержавеющей стали (1-, 3-х-, 6-ти-местная) -фильтродержатели с воронками(пластмассовые, нержавстальные, стеклянные)- мембранные фильтры с номинальнымразмером пор – 0,45 мкм- вакуумный насос- стеклянные колбы Бунзена для использованияв качестве приемников фильтрата- аппарат для фильтрации и мембранустерилизуют подходящим образомКонструкция аппарата для фильтрации должнаобеспечивать проведение процесса фильтрациив асептических условиях, возможностьизвлечения мембраны и переноса ее впитательную среду (для аппаратов открытоготипа) или проведение инкубации послепомещения питательной среды в аппарат (дляаппаратов закрытого типа)

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

Трехместная фильтрующая система(открытого типа):

Принцип метода:• Образец фильтруют через

мембранный фильтр, которыйзадерживает присутствующиемикроорганизмы.

• Помещают фильтр с задержаннымина нем микроорганизмами впитательную среду и инкубируют.

• Если все условия проведения анализасоблюдены, то есть правильновыбраны материал, структура иразмер пор фильтра, условияпроведения фильтрования, составпитательной среды, температура ивремя инкубирования, томикроорганизмы быстроразмножаются и образуют визуальнообнаруживаемый рост (помутнениесреды).

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

• Мембраны должны быть стерильно упакованы иготовы к немедленному использованию

Мембранные фильтры, оптимальный выбор:• мембранные фильтры с номинальным размером

пор не более 0,45 мкм, с установленнойспособностью к удерживанию бактерий.

• фильтры изготавливают из инертных материалов: эфир целлюлозы (нитрат или ацетат целлюлозы)

• белые или темные, с нанесенной сеткой дляудобства подсчета колоний (длямикробиологической чистоты)

• стерильно упакованные

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

Мембранные фильтры, требования:• Микроструктура мембраны иразмеры пор должны максимальноспособствовать прорастаниюудержанных на мембранемикроорганизмов.• Высокая пористость, позволяющая быстро фильтроватьобразцы, в том числе и вязкие.• Материал мембраны не долженсодержать токсичных длямикроорганизмов веществ.

Микрофотографиябактерий намембранном фильтре

- Инокулированные питательные средыинкубируют в течение не менее 14 днейпри 30 - 35°С (тиогликолевая среда длявыявления бактерий) и при 20-25°С(среда на основе гидролизата казеина исоевых бобов (# среда Сабуро) длявыявления грибов).Контроль: рост культур микроорганизмовв питательных средах этих же партий(проверка ростовых свойств)Отрицательный контроль: -положительный результат при проверкестерильности питательных сред этих жепартий;- проверка на асептичность посева: черезпростерилизованную установкумембранной фильтрации пропускаютзаведомо стерильную жидкость ипроизводят посев в питательные среды.

• Мембранная фильтрация водныхрастворов- Содержимое контейнера (контейнеров) переносят на мембрану (мембраны) инемедленно фильтруют;- Если раствор обладает антимикробнымдействием, мембрану промывают путемпропускания через нее определенногообъема выбранного стерильногорастворителя. Число циклов промывкидолжно быть не более 5 из расчета по 100 мл/цикл, даже если было показано, чтотакая промывка не полностью исключаетантимикробное действие; - Мембрану целиком переносят впитательную среду или в асептическихусловиях делят ее на две равные части, каждую из которых помещают втиогликолевую среду и среду на основегидролизата казеина и соевых бобов (# среду Сабуро);

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

• Мембранная фильтрация твердыхрастворимых веществ- Требуемое количество продуктарастворяют в походящем растворителе: растворителе, прилагаемом к ЛС, изотоническом растворе натрия хлорида, нейтральном растворе 1 г/л мясного иликазеинового пептона;-Далее испытания продолжают как и длярастворов.Контроль: рост культур микроорганизмовв питательных средах этих же партий(проверка ростовых свойств).Отрицательный контроль: - положительный результат при проверкестерильности питательных сред этих жепартий;

- отсутствие визуального роста припосеве растворителя в питательныесреды (для ЛС в форме стерильныхпорошков, которые предварительнорастворяют в растворителе);- проверка на асептичность посева: черезпростерилизованную установкумембранной фильтрации пропускаютзаведомо стерильную жидкость ипроизводят посев в питательные среды.

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

Прибор Стеритест - это прецизионныйперистальтический насос специальнойконструкции с регулируемой скоростьюработы, позволяющий переносить жидкость(образец, промывочный раствор, среду) изисходной емкости в канистру(фильтроэлемент) Стеритест.

Расходные канистры Стеритестпредставляют собой две пластиковые емкости, в дно каждой из которых впаян мембранныйфильтр с порами 0.45 мкм, а в верхней частинаходятся 0.22 мкм гидрофобныйвентиляционный фильтр и соединение сэластичной ПВХ трубкой, которая на другомконце соединена с одной или несколькимииглами (общими для обеих трубок).

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

Система Стеритест - системамембранной фильтрации закрытоготипа

4. Наблюдение и интерпретация результатов• На протяжении периода инкубации, а также по его завершении оценивают

наличие макроскопических признаков микробного роста в средах• Если признаков микробного роста не обнаруживается, то продукт признают

выдерживающим испытание на стерильность• При наличии признаков микробного роста продукт не выдерживает испытание на

стерильность• Результаты испытания (нестерильность) могут быть признаны недостоверными

лишь при выполнении не менее одного из перечисленных ниже критериев:- данные микробиологического мониторинга зоны проверки стерильности указывают

на произошедшие сбои- проверка методики, используемой для проведения испытания, привела к

обнаружению недочетов- наличие микробного роста в отрицательном контроле- Если результаты испытания признаны недостоверными, испытание повторяют.

При отсутствии признаков микробного роста в ходе повторного испытанияпродукт признают стерильным. При наличии – продукт нестерилен и бракуется.

• Если внесение испытуемого материала приводит к помутнению питательнойсреды, образованию осадка или выпадению хлопьев вследствие чего наличие илиотсутствие микробного роста не может быть легко определено визуально, следуетчерез 14 суток после начала инкубации перенести соответствующую порциюинокулированной среды в свежую аналогичную среду и инкубироватьпервоначальные и повторные посевы еще 4 суток

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств

Схема определения стерильностиПроверка пригодности питательных сред (стерильность, ростовые свойства)

Проверка наличия/отсутствия антимикробного действия продукта

Продукт не обладаетантимикробным действием

Продукт обладаетантимикробным действием

Мембранная Прямой посевфильтрация в жидкие питательные средыи переносфильтров вжидкие пита-тельные среды

Нейтрализация антимикробного действия (длянефильтруемых и плохофильтруемых препаратов –разведение, добавление нейтрализующего агента, комбинированный метод; для фильтруемых -мембранная фильтрация)

Прямой посев в жидкиепитательные среды с учетомрезультатов устраненияантимикробного действия

Мембраннаяфильтрация иперенос фильтров вжидкие питатель-ные среды

Инкубирование, визуальная оценка наличия/отсутствия роста, интерпретация результатов

Лекция 10. Микробиологический контроль стерильностилекарственных средств