Раздел 2. Нуклеиновые кислоты.Занятие 11. Методы молекулярной биологии

План занятия

1. Этапы исследования в молекулярной биологии. Подготовка проб к исследованию.

2. Хроматография.3. Электрофорез.4. Блоттинг.5. Полимеразная цепная реакция6. Секвенирование

Студент должен знать

1) теоретические основы методов пробоподготовки белков и нуклеиновых кислот к исследованию их физико-химических свойств, аминокислотной или нуклеотидной последовательности;

2) методы выделения белков и нуклеиновых кислот из биологического сырья, протеолиза белков и отжига ДНК, амплификации ДНК фрагментов, визуализации белков и нуклеиновых кислот, фиксации, обработки и хранения биологической информации

Студент должен уметь

1) объяснить результаты исследования белков и нуклеиновых кислот методами хроматографии, электрофореза, иммуно-электрофореза, блоттинга, полимеразной цепной реакции, секвенирования

ВведениеПодготовка пробМетоды разрушения клеток (для самостоятельного изучения)Выделение исследуемого материалаХроматографияЭлектрофорезДиализИсследование белковУстановление аминокислотной последовательности (сиквенсбелков)Блоттинг белковИсследование нуклеиновых кислотСиквенс ДНК и РНКБлоттинг ДНКБиотехнологические методы

Методы молекулярной биологии

Анализ последовательности(сиквенс)

Белков РНК ДНК

ПЦР

Перенос ДНК в клеткибактерий и эукариот

Трансформация

Трансфекция

Трансдукция

Конъюгация

Нокаут и нокдаунгенов

РНК интерференция

CRISPR-технологии

Этапы исследования в молекулярной биологии

Пробоподготовка Выделение

Белков

РНК

ДНК

Разрушение бактериальных или

эукариотических клеток Очистка белков: хроматография, электрофорез,

иммунопреципитация, выявление и картирование

эпитопов с помощью моноклональных антител,

ультрафильтрация, избирательное осаждение, обратимая денатурация

Сиквенс

ПЦР

Физическое:РастираниеУльтразвуковоеОсмотический шокКриодеструкцияАзотный взрыв Химическое:

толуолом, бутанолом,

антибиотиками, ферментами

Плазмиди векторов

Трансфекция

Найти в интернете и выписать в конспект технологии

Растирания и протирания клеток через сито …

Ультразвуковой деструкции клеток …

Осмотического шока клеток …

Многократного замораживания-размораживания …

Азотного взрыва клеток …

Деструкции клеток толуолом …

Деструкции клеток бутанолом …

Деструкции клеток антибиотиками …

Деструкции клеток ферментами …Экстракция и осаждение белков …

Методы высаливанияМетоды осаждения

ХРОМАТОГРАФИЯ

Хроматография белков

Хроматография – метод разделения и определения веществ,основанный на разделении компонентов между двумя фазами –подвижной (элюант) и неподвижной (элюат, стационарная фаза).

Метод основан на различии силы взаимодействия разныхвеществ с неподвижной фазой. Менее взаимодействующиевещества движутся быстрее и все вещества движутся вколонке относительно элюата с разной, характерной дляданного вещества скоростью

Неподвижной фазой служит твердое пористое вещество,которое называют сорбентом или пленка жидкости, нанесенная натвердое вещество. Подвижная фаза представляет собойжидкость или газ с растворенными в них анализируемымивеществами, протекающий через неподвижную фазу самотекомили под давлением.

Неподвижная фаза заранее размещается в хроматографическойколонке, либо представляет собой хроматографическую бумагу,либо слой оксида алюминия на алюминиевой фольге.Вещества, покидающие колонку вместе с подвижной фазойназываются неудерживаемыми, а время их удерживанияопределяет т.н. «мертвое время» колонки.На разделяемые вещества можно накладывать различныедополнительные поля (гравитационное, электрическое,магнитное и др.), которые, изменяя условия разделения,расширяют возможности хроматографии.Хроматография позволяет решать задачи

аналитические: разделение, идентификация, определение.

препаративные:очистка,

выделение, концентрирование.

Хроматограмма смеси двух веществ

Время от момента ввода анализируемой пробы до моментарегистрации максимума хроматографического пика называютвременем удерживания и обозначают – tR.Время удерживания складывается из двух составляющих:1) времени пребывания веществ в подвижной фазе – tm,2) времени пребывания в неподвижной фазе – ts.Значение tm фактически равно времени прохождения черезхроматограф несорбируемого компонента.Значение tR не зависит от количества пробы, вводимой вколонку, но зависит от природы вещества и сорбента, а такжеот упаковки сорбента и может меняться от колонки к колонке.Поэтому для характеристики истинной удерживающейспособности колонки следует ввести исправленное времяудерживания – t′R= tR – tm.

Для характеристики удерживания используют понятиеудерживаемый объем – VR (объем подвижной фазы, которыйнужно пропустить через колонку с определенной скоростью,чтобы элюировать вещество):

VR = F×tR,где F – объемная скорость потока подвижной фазы (см3/с) или(мл/мин).

По полученной хроматограмме смеси можно рассчитатьэкспериментальные значения хроматографических параметров:фактор удерживания (емкости) – к, показывает во сколько раздольше вещество пребывает в неподвижной фазе, чем вподвижной, эта величина должна составлять от 1,5 до 4 к;коэффициент селективности – а, мера относительногоудерживания или относительной подвижности двух разделяемыхвеществ;разрешение – RS, разделение двух соседних, является меройполноты разделения двух веществ. Разделение считаетсяполным, если Rs равно или больше 1,5.

Количество исследуемого вещества в пробе может быть оцененометодом абсолютной калибровки хроматографа с помощьюГСО (государственных стандартных образцов) с последующимпостроением калибровочного графика.Либо методом внутренней нормализации, при которомпредполагается, что пики всех возможных компонентов смесизафиксированы на хроматограмме, и сумма их площадей (S)равна 100%.Либо методом внутреннего стандарта, при котором ванализируемый образец вводят известное количество эталонногосоединения.

Ионообменная хроматография (ИОХ) – метод, разделяющийионы и полярные молекулы на основе их заряда.Взаимодействие образца и сорбента основано на обратимомкулоновском взаимодействии. Сорбент имеет на поверхностиионные функциональные группы, которые взаимодействуют сионами аналита противоположного заряда.Катионообменная ИОХ – отрицательно заряженный сорбентсвязывает положительно заряженные молекулы анализируемоговещества (аналит).Аниообменная ИОХ – отрицательно заряженный аналитсвязывает положительно заряженный сорбент.ИОХ используется для разделения практически любыхзаряженных молекул, в том числе крупных белков, небольшихнуклеотидов и аминокислот.

Ионообменная хроматография

Типичная хроматограмма ионообменногоразделения

Аффинная хроматография (АХ) – разделение биологическихмолекул, основанное на селективном взаимодействии междубелком (или белковым компонентом) и специфическимлигандом, связанным с матрицей. Метод позволяет очиститьвещество (увеличить его концентрацию) в несколько тысяч раз.Аффинная хроматография является уникальной технологиейочистки поскольку только она позволяет очистить биомолекулына основе их биологических функций или химическойструктуры.

Этапы аффинного разделения белков

Гидрофобная хроматография (ГХ) основана на гидрофобностибелков. Белки, содержащие гидрофобные аминокислоты наповерхности, могут обратимо связываться с гидрофобнымигруппами сорбента.

Типичная хроматограммагидрофобного разделения

Гель-фильтрация (ГФ) или эксклюзионная хроматография(ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационнаяхроматография) – метод разделения молекул в соответствии с ихразмером. В отличие от ионообменной и аффинной хроматографиимолекулы образца не связываются с сорбентом, но чем меньшемолекулы, тем быстрее они пройдут через слой геля.Важное преимущество ГФ – условия среды могут быть измененыв соответствии с типом образца или требованиями длядальнейших шагов очистки и хранения.ГФ хорошо подходит для биомолекул, чувствительных кизменениям рН, концентрации ионов металлов, кофакторов идругих условий среды.Разделение может быть выполнено в присутствии необходимыхионов, кофакторов, детергентов, мочевины, гуанидингидрохлорида, при высокой или низкой ионной силе, при 37°C илина холоду, в соответствии с требованиями эксперимента.

Гель-фильтрация

Хроматографическая система Bio-Rad BioLogic LP

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Электрофорез – это перемещение частиц дисперсной фазы(коллоидных или белковых растворов) в жидкой илигазообразной среде под действием внешнего электрическогополя. Впервые было открыто профессорами Московскогоуниверситета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.Различают две разновидности электрофореза:катафорез – обрабатываемая поверхность имеетотрицательный электрический заряд (то есть подключена котрицательному контакту источника тока)и анафорез – заряд обрабатываемой поверхностиположительный.

Вертикальный электрофорез – позволяет проводить разделение белков и ДНК с высоким разрешением.Двумерный гель-электрофорез (2D) и изоэлектрическое фокусированиеГоризонтальный электрофорез – позволяет проводить разделение белков и ДНКTGGE гель-электрофорез с температурным градиентомВ настоящее время основная область применения гель-электрофореза с температурным градиентом – скрининг мутаций и анализ микробных популяций, гетеродуплексныйанализ, изучение метилирования ДНК, анализ вторичной структуры РНК, изучение белок-белковых взаимодействий и анализа термостабильности белков.Электрофорез в пульсирующем поле – идеальное решение для разделения высокомолекулярной ДНКИммуноэлектрофорез

Гель-электрофорез – метод пространственного разделенияДНК, белков или макромолекул в целом по их весу (или заряду).

Пульс-электрофорез

Гибридизация нуклеиновых кислот

Гибридизация нуклеиновых кислот

Частичное разрезание ДНК с помощью рестриктаз приводит к появлению серии перекрывающихся фрагментов, имеющих одинаковые липкие концы. Вертикальными стрелками помеяены рестрикционные сайт, горизонтальными –фрагменты ДНК (Им: Russel, 1998, p. 459)

2 е- + 2Н2О →2ОН- + Н2↑

Катод (-) Анод (+)

Н2О →2Н+ + 1/2О2↑ + 2 е-

е-

е- е-

е-

е-

е-→

→ →→

→

→

Базовые сведения о теории электрофореза1. В растворе между электродами ток обусловлен ионами буфера и образца, а в остальной части цепи электронами. 2.Ток в цепи поддерживается за счет электролиза, происходящего на электродах, каждый из которых погружен в большую буферную камеру.

Образец Электрическое поле Буфер Носитель

1. Заряд

2. Размеры

3. Форма

4. Масса

1. Сила тока

2. Напряжение

3. Сопротивление

1. Состав буфера

2. Концентрация

буфера

1. Адсорбция

2. Электроосмос

3. Молекулярное

сито

Факторы, влияющие на подвижность веществ при электрофорезе

Пример проведения электрофореза

Отрицательно заряженные белки движутся в сторону катода.Быстрее движутся белки с меньшей массой. Плотность окрашиванияпятна тем выше, чем больше белка в нем содержится. Размытиепятен обусловлено наличием изоформ одного типа белка, несколькоразличающихся аминокислотным составом и, соответственно,массой, но не функцией.

Определение молекулярной массы белка методом электрофорезаВносятся аликвоты белков с известно массой (стандарт) иотдельно – аликвота белка с неизвестной массой. Посколькускорость движения белков во внешнем электрическом полезависит от их массы, то масса неизвестного белкарассчитывается с помощью прямой пропорции по известнойскорости его движения (расстояние от линиистарта/длительность электрофореза) и скорости движениябелков стандарта с известной массой.

Заряд. Подвижность возрастает с увеличением суммарногозаряда. Величина заряда обычно зависит от pH.

Размеры. Чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность;это связано с возрастанием сил трения и электростатическихвзаимодействий крупных молекул с окружающей средой посравнению с молекулами меньших размеров.

Форма. Молекулы одинакового размера, но различной формы,например фибриллярные и глобулярные белки, обладают разнойподвижностью; это обусловлено различиями в силе трения иэлектростатическом взаимодействии.

Масса. Чем больше масса молекулы, тем она менее подвижна.

ЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ПОЛЕ

Согласно закону Ома, сила тока I (в амперах),напряжение V (в вольтах) и сопротивление R (вомах) связаны следующим соотношением: I = V/R.На разделение ионов в электрическом поле влияютвсе три фактора.

Сила тока. Поскольку ток в растворе междуэлектродами обусловлен исключительно переносомионов буфера и образца, скорость их перемещенияпрямо пропорциональна силе тока. Длина пути,пройденного ионами, будет пропорциональнавремени пропускания тока. Следовательно, длямаксимальной воспроизводимости результатов силатока в процессе электролиза не должна меняться.Само собой разумеется, что ток должен бьггьпостоянным.

ЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ПОЛЕ

Напряжение. Оно связано с силой тока приведеннымвыше соотношением; отсюда следует, что скоростьмиграции пропорциональна падению напряжения вподдерживающей среде, или градиенту напряжения,обычно выражаемому в В/см-1 (приложенноенапряжение, деленое на длину слоя носителя).Используются как низкие (100—500 В), так и высокие(500—10 000 В) напряжения с градиентами до 20 и 200В/см-1 соответственно.

Сопротивление. Скорость миграции обратнопропорциональна сопротивлению, которое в свою очередьзависит от типа и размеров носителя и от ионной силыбуфера. Сопротивление возрастает с увеличением длиныслоя носителя и уменьшается при увеличении егоширины, а также с возрастанием концентрациибуферных ионов.

Буфер создает и стабилизирует pH носителя, а также самымразличным образом влияет на скорость миграции веществ.Состав буфера. Наиболее широко применяемые буферы —формиатный, ацетатный, цитратный, вероналовый, фосфатный,трис, ЭДТА и пиридиновый. Для разделения углеводов частоиспользуют боратные буферы, преимущество которыхзаключается в том, что они образуют с углеводами заряженныекомплексы.

Концентрация буфера. Пo мере увеличения ионной силы буферакомпонент тока, обусловленный переносом ионов буфера, будетвозрастать, а доля, приходящаяся на ток за счет ионов образца,уменьшаться. Таким образом, скорость миграции образцауменьшится. При высокой ионной силе буфера суммарный токувеличивается, а следовательно, возрастает и количествовыделяемого тепла.При низкой ионной силе ток, обусловленный переносом ионовбуфера, уменьшается, а доля, приходящаяся на ток за счет ионовобразца, возрастает. Таким образом, миграция образца ускоряется.В буфере с низкой ионной силой общая сила тока и выделениетепла уменьшаются, но диффузия возрастает, вследствие чегоразрешающая способность хуже, чем при высокой ионной силе.

НОСИТЕЛЬ

В качестве носителей используют относительно инертныевещества, однако их состав все же не безразличен дляподвижности разных веществ, и выбор соответствующейсреды зависит поэтому от природы образца.

Адсорбция. Адсорбция — удерживание молекулобразца носителем, как при адсорбционнойхроматографии. Это приводит к размыванию пятен нахроматограмме, в результате чего образец движется не ввиде четкой полосы, а имеет вид кометы; разрешающаяспособность метода при этом уменьшается. Адсорбцияприводит также к уменьшению скорости миграции.Наибольшей способностью к адсорбции обладает бумага,однако это нежелательное ее свойство удается устранить,если использовать ацетат целлюлозы.

Электроосмос (электроэндосмос), это явлениеобусловлено возникновением относительного зарядамежду молекулами воды буферного раствора иповерхностью носителя. Ионизация групп носителя иповерхностная адсорбция ионов буфера обычно приводитк образованию из молекул воды ионов гидроксония (Н30-).Так как эти ионы заряжены положительно, они движутсяк катоду, захватывая растворенные нейтральныевещества и убыстряя движение катионов; скоростьдвижения анионов при этом падает. Обычно даннымиэффектами можно пренебречь, однако, если определяютизоэлектрическую точку вещества, нужно вводитьсоответствующую поправку. Как правило, это делают,следя за движением электрически нейтральныхсоединений, таких, как мочевина или глюкоза.

Молекулярное сито. Свойствами молекулярного сита обладаетприменяемый в гель-элекгрофорезе пол у жесткий носитель(гель); такие его свойства способствуют разделению смесейзаряженных макромолекул, например белков, которыеразличаются не только по электрофоретической подвижности, нотакже формой и размерами. Гели состоят из беспорядочнопереплетающихся молекулярных цепей, распределенных повсему объему геля и образующих ситоподобную структуру. Всоответствии с конкретными требованиями разделения размерпор гелей можно варьировать в некоторых пределах. Принципдействия молекулярного сита в агаровом, крахмальном иполиакриламидном гелях заключается в том, что крупныемолекулы движутся сквозь него тем медленнее, чем меньшеразмер пор, который определяется числом поперечных сшивок вгеле. При использовании гелей типа сефадекса ситуацияобратная.

Насыщенный буфером носитель, на который нанесен образец,обычно располагают горизонтально (горизонтальныйэлектрофорез) на плоской поверхности изолирующегоматериала, например плексигласа.При горизонтальном электрофорезе разделение можнопроводить на бумаге, ацетате целлюлозы, в гелевых пластинах ив тонком слое, хотя работа с тонкими слоями при более высокихнапряжениях требует применения металлических охлаждающихпластин, как при высоковольтном электрофорезе

Насыщенный буфером носитель, на который нанесен образец,обычно располагают вертикально (вертикальный электрофорез)на вертикальной поверхности изолирующего материала,например плексигласа. При вертикальном электрофорезе разделение как правило

проводят в полиакриламидном геле.

Направление миграци

Неизвестный протеин

Электрофоретическое разделение белков методомизоэлектрического фокусирования происходит под действиемэлектрического поля в градиенте рН в соответствии с ихизоэлектрической точкой (рI). Местоположение каждого белкаопределяется значением его изоэлектрической точки. Придостижении белком изоэлектрической точки в градиенте рН егосуммарный заряд становится равным нулю и он перестаетперемещаться в электрическом поле. В результатеэлектрофоретического разделения исследуемого веществаможет происходить диффузия белковых молекул из зоныфокусирования, но, попадая в более кислую или щелочнуюсреду, молекулы белка будут терять нейтральность и поддействием электрического поля снова возвращаться в зонуизоэлектрической точки.

В трубке формируют градиент рН, разгоняя электролит в электрическом поле

Помещают раствор белков и разгоняют его в электрическом поле

После окрашивания отдельные белки видны в виде полос

При этом методе воздействуют электрическим полем на белки вкрахмальном геле сначала в одном направлении, а послеразгона – во втором, перпендикулярном первому, что позволяетболее полно разделить анализируемые белки в том случае, еслинаблюдается перекрытие белков, близких по аминокислотномусоставу.

Работа системы основана на разделении биомолекул по температурному градиенту всоответствии с их температурой плавления.

При прохождении через температурный градиент ДНК начинает плавиться. Послерасхождения цепей, фрагмент одноцепочечной ДНК существенно замедляетдвижение в геле. Фрагменты двуцепочечной ДНК с более высокой температуройплавления продолжают движение в геле. Чем раньше цепи ДНК разойдутся, темраньше фрагмент остановится в геле.

Так как температура плавления ДНК зависит от состава нуклеотидов, тоэлектрофорез в температурном градиенте позволяет разделять фрагменты ДНКодинаковой длины, но различного нуклеотидного состава.

Гель электрофорез с температурным градиентом (TemperatureGradient GelElectrophoresis, TGGE) основан на разделениибиомолекул по температурному градиенту в соответствии с ихтемпературой плавления. При прохождении черезтемпературный градиент ДНК начинает плавиться. Послерасхождения цепей, фрагмент одноцепочечной ДНКсущественно замедляет движение в геле. Фрагментыдвуцепочечной ДНК с более высокой температурой плавленияпродолжают движение в геле. Чем раньше цепи ДНКразойдутся, тем раньше фрагмент остановится в геле. Так кактемпература плавления ДНК зависит от состава нуклеотидов,то электрофорез в температурном градиенте позволяетразделять фрагменты ДНК одинаковой длины, но различногонуклеотидного состава.

А. Перпедикулярный TGGE: для определения оптимального градиента температур для разделения образца.В. Параллельный TGGE: разделяется множество образцов одновременно. Применяется для рутинного разделения.

В отличие от обычных приборов для PFGE с фиксированнымиэлектродами система снабжена свободными электродамивращения. Таким образом, между периодически меняющимисянаправлениями электрического поля может быть установленлюбой угол. Точность и высокая скорость изменения угловдостигается за счет конструктивных особенностей ротора. Этопреимущество системы особенно важно для разделения оченьбольших молекул ДНК.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) — метод исследования антигенного состава биологических материалов, сочетающий электрофорез и иммунодиффузию. Впервые описан Грабаром и Уильямсом в 1953 году, в 1965 году метод был модифицирован Шейдеггером с целью минимизации (т.н. микромодификацияметода ИЭФ).Образец антигенного материала разделяют электрофорезом в геле (обычно агарозном), в результате чего формируются характерные зоны. Далее параллельно зонам электрофореза вносится преципитирующая антисыворотка, антигены и антисывороткадиффундируют навстречу друг к другу, и в месте встречи антисыворотки с антигеном появляются линии преципитации, имеющие форму дуги. После проведения иммунодиффузии и элюирования непреципитировавших молекул из геля гель окрашивают специальными красителями.

ЭлектрофорезВ ПААГ (полиакриламидном геле) и крахмальном геле

16 - 18 фракцийиммуноэлектрофорез - около 30 фракций

Иммуноэлектрофореграмма белков крови человека (по Генри)

Методы окрашивания после электрофоретического разделения

Вещество Реактив ПримечаниеБелки Нигрозин в уксусной или

трихлоруксусной кислотеБромфеноловый синий – ZnSO4 –уксусная кислотаЛиссамин зеленый в уксусной кислоте

Очень чувствительный

Количественный

Количественный

Гликопротеиды Окисление йодной кислотой с последующей обработкой реактивом Шиффа

Количественный

Липопротеиды Судан черный в 60%-ном этанолеПептиды Хлорирование ClO2 или NaOCl с

последующей обработкой раствором крахмала с KI или бензидинуксусной кислотой

Реагирует со всеми соединениями, содержащими аминныегруппы

Нуклеиновые кислоты Метиловый зеленый – пиронин При связывании с РНК –красный, с ДНК –голубой

Полисахариды ИодКислые мукополисахариды

Толуидин синий в смеси метанол -вода

Капиллярный электрофорезМетод капиллярного электрофореза основан на разделениикомпонентов сложной смеси в кварцевом капилляре поддействием приложенного электрического поля. Микрообъеманализируемого раствора вводят в капилляр, предварительнозаполненный подходящим буфером – электролитом.После подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 30кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру сразной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда имассы (точнее – величины ионного радиуса) и, соответственно, вразное время достигают зоны детектирования.Полученная последовательность пиков называетсяэлектрофореграммой, при этом качественной характеристикойвещества является параметр удерживания (время миграции),а количественной – высота или площадь пика,пропорциональная концентрации вещества.

БЛОТТИНГ

Блоттинг (англ., blott – промокашка, blotting – промакивание) –комплекс методик, включающих этап переноса разделенныхмакромолекул из определенной среды (например, геля) на какой-либо носитель (специальная бумага, нитроцеллюлозные фильтрыи т.п.).

Существует два основных типа блоттинга – капиллярный(например, Саузерн-блоттинг), в основе которого – перемещениемолекул благодаря капиллярному эффекту, и электроблоттинг,при котором перенос молекул обеспечивается путемэлектрофореза.

Саузерн-блоттинг (Southern-blotting) – обнаружениеспецифических нуклеотидных последовательностей, путемпереноса электрофоретически разделенных фрагментов ДНК изагарозного геля на нитроцеллюлозный (бумажный) фильтр засчет капиллярного эффекта (blotting – «промокание») игибридизации с меченым ДНК- или РНК-зондом,комплементарным искомой последовательности. Образованиегибридов обнаруживают методом авторадиографии. Методразработан Э. Саузерном и Р. Дэйвисом в 1975.

Нозерн-блоттинг (Northernblotting) – метод, аналогичный методуСаузерн-блоттинга и применяемый для тестирования фрагментови молекул РНК (вместо нитроцеллюлозного используется фильтриз диазобензилоксиметил-целлюлозы, в качестве зондовиспользуют комплементарные молекулы ДНК. Метод нозерн-блоттинга предложен Дж. Олвайном с сотрудниками в 1977.

БЛОТТИНГ

Истерн-блоттинг (Eastern blotting) – детекцияпосттрансляционных модификаций белков.

Вестерн-блоттинг (белковый иммуноблот, Western blotting) –аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. Вестерн-блоттинг разработан в лаборатории Джорджа Старка (George Stark) в Стэнфорде. Название вестерн-блот было дано технике У. Нейлом Бурнеттом(W. Neal Burnette) и является игрой слов от названия Саузерн-блоттинг, – методики определения ДНК, разработанной ранее Эдвином Саузерном.

БЛОТТИНГ

Метод блот-гибридизации (Саузерн-блот) (Э. Саузерн, 1975 г.)

1. Разделение белков методом SDS-PAGE гель-электрофореза/С помощью гель-электрофореза белки разделяются в полиакриламидном геле. 2. Перенос белков на мембрану3. Блокирование и ДетекцияЗатем их детектируют с использованием антител:сначала белки связываются с первичными(моно- или поликлональными) антителами, которые в свою очередь связываютсясо вторичными антителами, конъюгированными с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой).

Протокол

Вестерн-блоттингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1нг

4. Визуализация.• Высокая степень разрешения

достигается за счет электрофоретического разделения белков и специфичности моноклональных антител.

• Визуализация исследуемого белка достигается путем проведения соответствующей биохимической реакции с образованием продукта, который определяется колориметрическим,хеми-люминесцентным, флюоресцентным методами детекции.

5. Анализ

Количество белка оценивается с помощью денситометрии.

Southern Blotting Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную

часть геном

Геномную ДНК (обычно выделенную из лейкоцитов или клеток плода) расщепляют на короткие фрагменты, разделяют их в агарозном геле, переносят на мембрану, после чего идентифицируют специфические участки с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами.

Nothern Blotting

• Аналог Southern Blotting.• Этот метод позволяет выявить специфическую мРНК и оценить

ее размер.

Eastern Blotting (является продолжением метода Вестерн блоттинг)

Определение метода Вестерн Блоттинг

Метод основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген-антитело».

«Твердая фаза» для иммуноблота

• пористые материалы типа нитроцеллюлозы (PVDF) в виде наполнителей в объеме или в виде плоских листов или полосок стрипов

• (англ. strip); стрипы используют в методиках типа иммуноблота и иммунохроматографии;

• в пористых материалах существенно больше площадь, на которой сорбирован один из участников взаимодействия; другие реагенты диффундируют по порам.

Типы твердой фазы для Вестерн блоттинга

Подготовка образца• Образец может быть взят из цельной ткани

или из клеточной культуры. В большинстве случаев, твёрдые ткани сначала измельчаются механически с использованием блендера (для образцов большого объёма), с использованием гомогенизатора (меньшие объемы), или обработки ультразвуком.

• Различные детергенты детергенты, соли и буферы могут быть применены для улучшения лизиса клеток и растворения белков. Ингибиторы протеаз и фосфатаз часто добавляются для предотвращения расщепления образцов их собственными ферментами. Подготовка тканей часто выполняется при низких температурах, чтобы избежать денатурации белка.

Цельная ткань Клеточная культура

Механическое измельчение

Измельчение гомогенизатором

Обработка ультразвуком

Измельчение в жидком азоте

Детергенты, соли, буферы

Ингибиторы протеаз, фосфатаз

Усло

вия,

улу

чшаю

щие

пр

обоп

одго

товк

у

Низкие температурыпроизводит гомогенизацию образцов за счет их встряхивания в микропробирках или чашах вместе с твердыми шариками

Гель-электрофорез. Наиболее распространенный способ

разделения белков —электрофорез в

полиакриламидном геле в присутствии SDS по Лэмми

Гель-электрофорез

• SDS вызывает денатурацию белков и поддерживает их в денатурированном состоянии, для разрушения вторичных и третичных структур белков используют восстановители дисульфидных связей

Гель -электрофорез

Подлежащие анализу белки в присутствии додецилсульфата натрия приобретают одинаковый отрицательный заряд, что делает возможным их разделение в зависимости только от молекулярной массы.

Принцип электрофореза

Предварительно денатурированные белки вносят в карманы «треков» (дорожек) акриламидного геля с низкой концентрацией (концентрирующий гель), что позволяет их сконцентрировать перед переходом в разделяющий гель (с более высокой концентрацией), где происходит разделение белков в зависимости от молекулярной массы.

Белки мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду, при этом белки меньшего размера двигаются быстрее.

Принцип электрофореза

Отличия в скорости продвижения —электрофоретической подвижности приводит к разделению белков на полосы.

Как правило, одну из «дорожек» оставляют для маркеров молекулярной массы (смеси белков с известными массами).

Окрашивание гелей

• Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание белков в гелях красителем Кумасси или серебром

окрашивание белков в гелях красителем Кумасси

окрашивание белков в гелях серебром

Анализ электрофоретического разделения белков

• В большинстве случаев результаты электрофоретического разделения достаточно получить путем визуальной оценки геля.

• Однако, с целью получения достоверных данных и надлежащего документирования результатов гель сканируют на просвет при помощи высокочувствительного денситометра, что позволяет надежноопределять не только положение белков в геле, но и оптическую плотность белкового пятна.

Окрашивание мембраны более

надежно

БЛОТТИНГОбразцы антигенов

Разделительный гель

Емкость переноса (блот) белки переносятся на

нитроцеллюлозный лист

Меченые антитела

Иммуннокрашенныепятна

Ауторадиграфия

Создание и фиксация

ауторадиографических меток

Визуализация антигенных меток

Анализ электрофоретического разделения белков, Блоттинг

• С помощью специального программного приложения можно определить такие параметры как электрофоретическая подвижность белка, его чистота, количество белка в пятне и др.

• Чаще используют хемилюминесцентную систему детекции белков –использование рентгеновских пленок (Блоттинг)

Используют программное приложение ImageJ

Анализ электрофоретического разделения белков

• Определение молекулярной массы исследуемого белка предполагает необходимость калибровки геля по молекулярным массам. Калибруют гель относительно молекулярных масс белков-маркеров, которые разделяют параллельно с исследуемым образцом.

Выбор % разрешающего геля

• концентрация акриламида определяет разрешающую способность геля — чем выше концентрация акриламида, тем лучше разделение низкомолекулярных белков. Низкая концентрация акриламида улучшает разрешающую способность гель-электрофореза для высокомолекулярных белков.

Размер белка, kDa %AA

36-205 5%

24-205 7.5%

14-205 10%

14-66 12.5%

10-45 15%

Перенос на мембрану Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля

переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или PVDF.

• Мембрана накладывается поверх геля, а поверх неё кладут стопку фильтровальной бумаги.

• Метод переноса белков называется электроблоттингом и использует электрический ток, который переносит белки из геля на мембрану.

• Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. В результате этого «промакивания» (blotting) процесса белки удерживаются на тонком поверхностном слое мембраны для детекции.

• Оба варианта мембран используют из-за их свойства неспецифично связывать белки.

• Связывание белков основано как на гидрофобных взаимодействиях, так и на электростатических взаимодействиях между мембраной и белком.

• Нитроцеллюлозная мембрана дешевле PVDF, но гораздо более хрупкая и хуже выдерживает повторное нанесение меток.

Виды электроблоттинга

• Сухой• Влажный• Полусухой (semidry)

Окрашивание белков на фильтре

Способокраски

Чувствите-льность, количество белка

Нитроцел-люлоза

Нейлон PVDF Окрашивание

Ponceau S 1-2µg + - + обратимое

Amido Black

1.5µg + - + постоянное, низкий фон

Comassie blue

1.5µg + - + постоянное, высокий фон

India ink 100ng + - + постоянное

Biotin-avidin

30ng + + + постоянное, бледнеет со временем

Colloidal gold

3ng + - + постоянное

Единообразие и общая эффективность переноса белков из геля на мембрану может быть проверена окрашиванием мембраны красителями Кумасси (Coomassie blue) или Ponceau S. Кумасси наиболее распространенный из двух красителей.Ponceau S обладает большей чувствительностью и лучше растворим в воде, что упрощает последующую отмывку и нанесение меток на мембрану. Кроме того он обратимо связывается с белком на мембране

Подтверждение переноса белков на фильтр (окраска Ponceus)

Блокирование

• Как только выбрана мембрана, выбраны антитела и целевой белок, должны быть приняты меры по исключению взаимодействия между мембраной и антителом, используемым для детекции целевого белка (ибо антитело само по себе белок).

• Блокирование неспецифичных связываний достигается помещением мембраны в разбавленный раствор белка —обычно это бычий сывороточный альбумин или нежирное сухое молоко или желатин с небольшим процентом детергента типа Tween-20.

Блокирование – один из важных этапов проведения эффективного Вестерн блоттинга

Механизм блокированияБелок из разбавленного раствора прикрепляется к мембране во всех местах, где не прикрепился целевой белок. Поэтому, при добавлении антител, им (антителам) нет свободного места на мембране, куда бы они могли прикрепиться, кроме сайтов связывания на специфичных целевых белках. Этот фоновый «шум» в окончательном продукте вестерн блота приводит к чистым результатам и исключению ложно-положительных.

Детекция. Непрямой и прямой WB

преимущества• необходимость использовать только первичные антитела, что ускоряет процесс• возможность использовать первичные антитела с разными меткамиНедостатки• связывание с ферментативной меткой может снижать иммунореактивность первичного антитела• высокая стоимость первичных антител• проблема выбора антитела и низкий сигнал

преимущества• Вторичное антитело усиливает сигнал (несколько вторичных антител могут связываться с одним первичным)• Имеется широкий выбор вторичных антител• Одно вторичное антитела может быть использовано для детекции различных специфичных антител• связывание с ферментативной меткой вторичного антитела не влияет на иммунореактивность первичного антитела• Замена вторичного антитела может способствовать изменению метода детекциинедостатки• Вторичные антитела способствуют образованию сайтов неспецифичного связывания• Дополнительные этапы работы

Детекция. Следующим этапом является реакция связывания исследуемого белка со специфическим

антителом (первичным)

• Раствор антител и мембрана могут быть вместе закрыты и инкубированы от 30 минут до оставления на ночь. Также они могут быть инкубированы при различных температурах, при повышенной температуре наблюдается лучшее связывание.

• После удаления несвязавшихся первичных антител, мембрану выдерживают со вторичными антителами и в соответствии с их целевыми свойствами, как правило называются по типу «anti-mouse», «anti-goat».

Антитела для вестерн блоттинга. Механизм детекции

• Антитела получают из животного источника и связываются с большинством первичных антител. Вторичные антитела обычно связывают щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена.

• Наиболее распространенные, связанные с пероксидазой хрена вторичные антитела используются для разрезания хемилюминесцентного агента, и продукт реакции производит люминесцентное излучение пропорционально количеству белка.

Лист светочувствительной фотографической пленки помещается напротив мембраны и подвергается действию излучения реакции, создавая изображение полос антител на блоте.

Более дешевый, но менее чувствительный подход с использованием 4-хлорнафтольного окрашивания в смеси с 1 % перекисью водорода, что дает темно-коричневое окрашивание, которое регистрируется без использования специальной фотографической пленки.

Детекция. Другие методы детекции

Другой метод детекции вторичными антителами использует антитела со связанным флюорофором, который излучает в ближней инфракрасной области (NIR). Свет, излучаемый флюоресцентным красителем, постоянен и делает флюоресцентную детекцию более точным и чувствительным способом измерения разницы в сигнале, производимом белками, которые мечены антителами, на вестерн блоте.

Детекция. Другие методы детекции

Третий альтернативный метод использует радиоактивную метку вместо фермента, связанного с вторичным антителом (с радиоактивным изотопом йода). Другие методы безопаснее, быстрее и дешевле, поэтому радиоактивная детекцияиспользуется редко.

Визуализация

Визуализация осуществляется с помощью гель-документирующих систем или цифровой камерой.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Метод ПЦР –это эффективный способ за

небольшой промежуток времени увеличить количество специфической последовательности ДНК в миллионы

раз

103

104

105

Что нужно для осуществления ПЦР ?

• Специфическая последовательность ДНК (ДНК-мишень) длиной от 100 п.н. до 35 т.п.н.;

• Два синтетических олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующих ДНК-мишень и ориентированных в направлении 5'→3' в ее сторону. После отжига праймеры гибридизуются с противоположными нитями ДНК, причем их 3’-гидроксильные концы должны быть ориентированы навстречу друг другу;

• Термостабильная ДНК-полимераза(Tag-полимераза);

• Четыре dNTP

106

Отжиг с праймерами

55-67 °С

Денатурация93-95 °С

Элонгация 72°С

107

108

Стандартная ПЦР осуществляется автоматическив термоциклере

• Смена типа реакции задается изменением температуры

реакционной смеси:• 95 (0,5 мин)• 55 (1,5 мин)• 72°С (I мин)

ПЦР осуществляется в одной пробирке, содержащей:

• около 1 мкг ДНК,• 20 пикомолей каждого праймера, • по 50 мкмолей каждого dNTP; • две единицы термостабильной Taq

ДНК-полимеразы.

109

Как достигается эффект умножения специфической последовательности ДНК ?

Путем многократного повторения трех последовательных реакций:

• Денатурация ДНК-мишениРеакционную смесь, содержащую вышеперечисленные компоненты

выдерживают при температуре 95°С;

• РенатурацияТемпературу смеси медленно понижают до ∼55°С, при этом происходит

связывание праймеров с комплементарными последовательнстями ДНК-мишени;

• Синтез ДНКТемпературу повышают до ∼72°С, начинается синтез комплементарных

цепей ДНК, инициируемый 3’-гидроксильными группами праймеров.

110

Как работает ПЦР в реальном времени?PCR real time

• ПЦР в реальном времени использует TaqMan систему, контролирующую кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции.

• Для детекции используется зонд, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Зонд несет флуорофор и тушитель флуоресценции,

• Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК,

111

PCR real time

• Во время стадии элонгации Tag-полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает расщеплять зонд благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности.

• При этом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения.

• Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение

PCR real time ПЦР в реальном времени

112

113

«Мультиплексные» варианты ПЦР в реальном времени (multiplex Real-Time PCR).

В современных вариантах ПЦР в "реальном времени" используют одновременно несколько флуоресцентных зондов, меченных разными флуоресцентными красителями.

Это позволяет детектировать в одной пробирке одновременно несколько продуктов ПЦР.

Во многих современных приборах для ПЦР в "реальном времени" предусмотрены варианты детекции нескольких флуоресцентных красителей одновременно. Детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходит в определенном для него диапазоне.

114

Нобелевская премия по химии 1993

Получил К.Б. Мюллис

(Kary B. Mullis)За разработку метода

полимеразной цепной реакции

Секвенирование – установление последовательности аминокислот в белке, либо нуклеотидов в нуклеиновых кислотах.

Реакция Сэнгера – не ПЦР, а многократный синтез с одной матрицы

Комплементарные взаимодействияСеквенирование по Сангеру

1 Перед секвенированием по методу Сангера молекулу ДНК разрезают на фрагменты и клонируют в Escherichiacoli. Выделенные из бактериальных клеток фрагменты многократно амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2 ПЦР состоит в следующем. Образец ДНК нагревают до температуры, при которой происходит расхождение цепей. Затем в реакционную смесь добавляют дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) и праймер — короткий олигонуклеотид, комплементарный небольшому сегменту ДНК-матрицы. Он гибридизуется с этим сегментом, и ДНК-полимераза последовательно присоединяет к его концу dNTP, комплементарные нуклеотидам копируемой цепи. Процесс многократно повторяют, пока не получат миллионы копий каждого фрагмента.

3 Раствор с одноце почечными фрагментами и праймерами распределяют по четырем пробиркам, в каждую из которых добавлены четыре разные dNTP и один из флуоресцентно меченных дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). Удлинение гибридизовавшегося с ДНК-фрагментом праймерапроисходит до тех пор, пока в цепь не включится ddNTP. В этом месте синтез останавливается, и в результате в каждой из пробирок образуется уникальный набор отрицательно заряженных фрагментов разной длины, оканчивающихся одним из меченых ddNTP.

4 Фрагменты разделяют по размеру с помощью капиллярного электрофореза. Когда фрагменты определенной длины проходят через окно детектора, освещаемое лазерным лучом, ddNTP начинают флуоресцировать. Длина волны флуоресценции зависит от того, какой именно ddNTP находится у них на конце, так что на выходе получается цветная картинка, которую можно трансформировать в нуклеотидную последовательность.

УДЛИНЕНИЕ ЦЕПИ Одноцепочечный фрагмент ДНК, называемый матрицей, вместе с коротким олигонуклеотидом, комплементарным ее концевому участку, фиксируют на подложке (а). Добавляют флуоресцентно меченные дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) и полимеразу, которая присоединяет к концу праймера dNTP, комплементарныйсоответствующему звену матрицы (б). Несвязавшиеся dNTP и полимеразу удаляют с помощью лазера, возбуждают флуоресценцию присоединенного к праймерунуклеотида и идентифицируют его (в). Удаляют флуорофор и продолжают удлинение цепи.

ЛИГИРОВАНИЕ

К одноцепочечной матрице присоединяют праймер, примыкающий к тому сегменту матричной ДНК, который хотят секвенировать (а). Синтезируют короткие олигонуклеотидные зонды, в которых в заданной позиции содержится один из четырех нуклеотидов — А, Т, G или С (б). После того как один из зондов находит комплементарный нуклеотид в матрице, лигаза сшивает его с праймером (в). Этот момент фиксируют, идентифицируют зонд, удаляют с матрицы комплекс и повторяют всю процедуру.