ЭПИГЕНЕТИКА

Грин Инга Ростиславовна

Мультимедийный курс для студентов – биологов Китайско-российского института.

Часть 2. Молекулярные основы эпигенетики

1) Метилирование ДНК

Б.Ф. Ванюшин Робин Холидей (Robin Holliday)

Впервые определил природу метилируемых последовательностей ДНК у разных видов организмов (1959 г.)

Обосновал роль метилирования ДНК в регуляции работы гена. Предложил термин

«эпимутация» (1987 г.)

Молекулярные основы эпигенетики

Метилирование ДНК эукариот

5-метилцитозин5mC

2

3 4

1

5

6

CH3N

NH

NH2

OМетилирование ДНК регулируется гормонами:

� у растений - фитогормоны (ауксины и др.),

� у животных - кортикостероидные гормоны

(гидрокортизон) и др.

Метилирование цитозина

� Метилирование ДНК — это модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК (эпигенетическая метка).

� Присоединение метильной группы (Me) к цитозину происходит по позиции С5 цитозинового кольца

� Белки, осуществляющие метилирование ДНК у млекопитающих метилтрансферазы (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b)

5-метилцитозин5mC

цитозин

C

Метилтрансферазы

� Метилирование ДНК происходит в составе CpG-динуклеотида (ДНК).

Полуметилированные

CpG-динуклеотиды метилируются

метилтрансферазой DNMT1

DNMT1

meCGGmeC

meCGGC

CGGCme

+

DNMT3aDNMT3b

meCGGmeC

GCCG

Неметилированные CpG-динуклеотиды метилируются метилтрансферазами DNMT3aи DNMT3b (de novo = вновь)

Метилирование и репликация

� Первое событие метилирования происходит значительно труднее, чем

второе.

� Сайты метилирования являются палиндромными

� За метилирование немодифицированной ДНК и ДНК, уже метилированной

по одной нити, отвечают разные ферменты

� Комплементарная нить будет быстро модифицирована в том же

палиндромном сайте.

Таким образом, метильная метка, имевшаяся на родительской нити ДНК, после репликации может копироваться на дочернюю нить ДНК, и в результате происходит надежная передача метилированного состояния следующему поколению клеток.

Ферменты, осуществляющие метилирование

ДНК – метилтрансферазы (Dnmt)

Ферменты, осуществляющие метилирование ДНК

– метилтрансферазы (Dnmt)

PCNA – домен взаимодействия с PCNA

NLS – сигнал ядерной локализации

RTF – домен, мишенью которого является центр репликации

CXXC – цистеин-богатый домен

BAH – домен, гомологичный бромодомену

PWWP – домен, содержащий высококонсервативный мотив «пролин-триптофан-триптофан-

пролин»

ATRX – ATRX – подобный цистеинбогатый участок, содержащий C2-C2 цинковый палец и

атипичный PHD-домен

Allis C.D., Jenuwein T., 2007

Метилирование ДНК человека

� Метилирование ДНК считается, в основном, присущим эукариотам. У человека метилировано около 1 % геномной ДНК;

� В соматических клетках взрослого организма метилирование ДНК обычно происходит в CpG-динуклеотидах;

� В эмбриональных стволовых клетках встречается метилирование ДНК вне CpG-динуклеотидов;

� Около 60–70% всех CpG-динуклеотидов у млекопитающих метилированы;

� Остальные неметилированные CpG-динуклеотиды сгруппированы в CpG-островки (в 5' регуляторных областях многих генов).

Нормальные клетки

CpG островки генРегионы между генов

Повторяющиеся элементы

Высокометилированые последовательности ДНК:

� Сателлитная ДНК

� Повторяющиеся элементы (в т.ч. транспозоны и их инертные формы)

� Уникальная межгенная ДНК

CpG островки постоянно неметилированны потому что:

� они защищены белками

� постоянная работа деметилаз

� транскрипция в раннем эмбриогенезе требует отсутствия метилирования ДНК в этих местах

CpG островки генРегионы между генов

Повторяющиеся элементы

Раковые клетки

1) Начало: полногеномное деметилирование

2) Окончание:

� CpG островки – гиперметилированы (много)� Регионы между генов и повторяющиеся элементы – гипометилированы

(мало)

Резкое искажение метилирования ДНК:

� отсутствие метильных доноров ���� (рак, гепатома)

� суперметилирование ДНК ���� РАК

� полное выключение (knockout) ДНК-метилазного гена���� остановка

развития, апоптоз, смерть (без метилирования ДНК жизни нет!)

Деметилирование ДНК млекопитающих

Активное деметилирование

(ферменты и белки)

Пассивное деметилирование

(репликация ДНК)

Активное деметилирование ДНК – двустадийный процесс:1) Окисление или дезаминирование 5mC (TET, AID/APOBEC)2) Репарация ДНК (удаление модифицированных остатков цитозина)

�У млекопитающих нет специального фермента (белка)

для удаление метильной группы с 5mC в ДНК

ДНК деметилирование

meCGGmeC

GCCG

N

N

H

NH2

O

O

5fC5-формил-цитозин

HN

N

H

O

O

OH

5hmU5-гидрокси-

метилурацил

N

N

H

NH2

O

O

OH

5caC5-карбокси-

цитозин

N

N

H

NH2

O

OH

5hmC5-гидрокси-

метилцитозин

5hmUT 5caC 5fC

5mC

5hmC

TETAID/APOBEC

AID/APOBEC TET TET

???

дезаминирование гидроксилирование

HN

N

H

O

O

Tтимин

HN

N

H

O

OU

урацил

C

Dnmt1/Dnmt3a

U

AID/APOBEC

C

HN

N

H

O5mC

5-метилцитозин

NH2

Схема активного деметилирования ДНК

цитозин

цитозин

5-гидроксиметилцитозин – гидроксильная форма 5-метилцитозина

может быть промежуточным соединением в процессе активного

деметилирования (Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2010).

5-гидроксиметилцитозин описан у млекопитающих в начале 1970-х (Penn

et al., 1972).

2009 год: 5-гидроксиметилцитозин выявлен

в клетках:

мозга

почки

легкого

сердца

в эмбриональных стволовых клетках мыши

в клетках HeLa

в клетках эмбриональной почки

(Kriaucionis, Heintz, 2009; Tahiliani et al.,

2009).

5-гидроксиметилцитозин – 5-ое основание ДНК

В 2009 году у млекопитающих было идентифицировано семейство

белков TET (Ten-Eleven-Translocation), гомологичных белкам

трипаносомы JBP1 и JBP2 – оксидазам метильной группы тимина

(Tahiliani et al., 2009).

Оказалось, что все три белка семейства TET – TET1, TET2 и TET3 –

могут окислять 5-метилцитозин в 5-гидроксиметилцитозин (Ito et al., 2010).

Белки TET

TET1, TET2, TET3

5mC 5hmC

Комплекс белков AID/APOBEC

Хромосома 12

Хромосома 6

Хромосома 22

APOBECs с одиночным диаминазным доменом

APOBECs с двойным диаминазны

м доменом

Активный сайт APOBEC

Цитозин Урацил

N

N

H

NH2

O

O

5fC5-формил-цитозин

HN

N

H

O

O

OH

5hmU5-гидрокси-

метилурацил

N

N

H

NH2

O

O

OH

5caC5-карбокси-

цитозин

N

N

H

NH2

O

OH

5hmC5-гидрокси-

метилцитозин

5hmUT 5caC 5fC

5mC

5hmC

TETAID/APOBEC

AID/APOBEC TET TET

SMUG1

ЭРО

TDG TDG TDG

MBD4

NEIL1

AП-сайт

MBD4

TDG

дезаминирование гидроксилирование

HN

N

H

O

O

Tтимин

HN

N

H

O

OU

урацил

Репарация

гетеродуплексов

C

Dnmt1/Dnmt3a

U

AID/APOBEC

C

HN

N

H

O5mC

5-метилцитозин

NH2

Схема деметилирования ДНК млекопитающих

цитозин

цитозин

Повреждения ДНК (DNA损伤损伤损伤损伤):

1)Апуринизация;

2)Дезаминирование;

3)Алкилирование;

4)Окисление;

5)Ошибки полимераз (гетеродуплексы);

6)Образование тиминовых димеров;

7)Двуцепочечные разрывы ДНК.

Репарация ДНК

DNA修復修復修復修復

Повреждения ДНК (DNA损伤损伤损伤损伤):

1)Апуринизация;

2)Дезаминирование;

3)Окисление;

4)Алкилирование;

5)Ошибки полимераз (гетеродуплексы);

6)Образование тиминовых димеров;

7)Двуцепочечные разрывы ДНК.

Репарация ДНК и Эпигенетика

гуанин

цитозин урацил

Апуринизация

AП-сайт

гуанин AП-сайт

цитозин урацил

Потеря –NH2 группы Азотистым Основанием

Дезаминирование

Дезаминированный

цитозин (урацил)

Урацил-ДНК-Гликозилаза

АП-сайт

Репарация урацила в ДНК

ЭРО = Эксцизионная Репарация Оснований

Репарация ДНК при апуринизации

1) Апуринизация;

2) АП-сайт;

3) Удаление повреждения (АП-эндонуклеаза);4) Синтез и сшивка ДНК (ДНК-полимераза, ДНК-лигаза).

Эксцизионная репарация оснований (ЭРО)

Репарация гетеродуплексов (MMR)

Iyer, Pluciennik, Burdett, Modrich. 2006 Chem.Rev., 106, 305DNA repair and Mutagenesis. Friedberg, Walker, Siede, Wood, Schultz, Ellenberger. 2005 ASM Press

E.coli метил-направляемая MMR MMR млекопитающих

MSH2-MSH6 (MutSa)

MSH2-MSH3 (MutSb)

MLH1-PMS2 (MutLa)

MLH1-MLH2 (MutLb)

MLH1-MLH3 (MutLg)

nick/gap instead methyl

EXOI

RFC

PCNA

RPA

DNA pol δδδδ

DNA pol εεεε

Неканоническая MMR

U

C

AID/APOBEC

ЭРОЭРО

UNG2

MMRMMR

Репарация гетеродуплексов (MMR =

mismatch repair) также привлекается для

создания мутаций в генах

иммуноглобулинов (SHM/CSR,

hypermutation/class-switch recombination).

Основные свойства MMR:

• Нет зависимости от репликации

• Может быть активированна различными ДНК

повреждениями: урацилом, окислительными

повреждениями (Msh2/6=MutSαααα), алкильными

повреждениями (MLH1/PMS2=MutLαααα)

• Привлекает ошибочную ДНК-полимеразу

• Нет направленности относительно цепей ДНК

Pena-Diaz, Bregenhorn, Ghodgaonkar, Follonier, Artola-Boràn, Castor, Lopes, Sartori and Jiricny. 2012

N

N

H

NH2

O

O

5fC5-формил-цитозин

HN

N

H

O

O

OH

5hmU5-гидрокси-

метилурацил

N

N

H

NH2

O

O

OH

5caC5-карбокси-

цитозин

N

N

H

NH2

O

OH

5hmC5-гидрокси-

метилцитозин

5hmUT 5caC 5fC

5mC

5hmC

TETAID/APOBEC

AID/APOBEC TET TET

SMUG1

ЭРО

TDG TDG TDG

MBD4

NEIL1

AП-сайт

MBD4

TDG

дезаминирование гидроксилирование

HN

N

H

O

O

Tтимин

HN

N

H

O

OU

урацил

Репарация

гетеродуплексов

C

Dnmt1/Dnmt3a

U

AID/APOBEC

C

HN

N

H

O5mC

5-метилцитозин

NH2

Схема деметилирования ДНК млекопитающих

цитозин

цитозин

Взаимодействие ЭРО и MMR

Диаминирование/гидроксилирование ���� образование гетеродуплекса

ЭРО (образование ника)

MMR

Репликация или деметилирование второй цепи

Без ошибок (соматические клетки)

Ошибки и мутации (гены иммуноглобулинов)

Grin I, Ishchenko AA. (2016) Nucleic Acids Res., 44(8):3713-27.

Метилирование промоторной области гена

1. Метильные группы нарушают ДНК-белковые взаимодействия,

выступая в большую бороздку ДНК и препятствуя

связыванию специфических транскрипционных факторов.

2. Метилированные районы ДНК специфически связывают

транскрипционные репрессоры.

3. Метилирование ДНК влияет на структуру хроматина.

Изменение статуса метилирования:

Природное: - репликация ДНК

- выстригание остатков m5C c репарацией цепей

- прямое деметилирование остатков m5C.

Искусственное: - условия недостаточности метильных групп

- ингибиторы ДНК-метилаз (SAH, 5-азацитидин)

Транскрипция +++

Энхансер (TF)

Активация транскрипции посредством

деметилирования ДНК

(5mC)

внутриклеточный уровень

эпигенетических механизмов

Метилирование ДНК и транскрипция

� Белки связывающие ДНК = MBD (methyl-binding-protein) (MeCP-1, MeCP-2, MBD4) могут связывать ДНК и рекрутировать другие белки и факторы для компактизации ДНК и ремоделирования хроматина (внутриклеточный уровень эпигенетических механизмов).

Активация транскрипции Репрессия транскрипции

метиллированный CpG

неметиллированный CpG

Основы передачи информации в клетке

Геном Эпигеном