Электронная коллекция микроорганизмов с маркерными признаками,

перспективных для мониторинга и биотестирования действующих природных и антропогенных факторов

*Бояндин Анатолий Николаевич*Ланкин Юлий Петрович

**Лобова Татьяна Ивановна**Каргатова Татьяна Васильевна

*Могильная Ольга Алексеевна*Попова Людмила Юрьевна

*Институт биофизики СО РАН,**ООО «Территориально-ориентированные информационные системы»

1. Устойчивость к антибиотикам 2. Устойчивость к тяжелым металлам 3. Устойчивость ко ксенобиотикам 4. Устойчивость к действию физико-химических факторов 5. Биолюминесценция 6. Флуоресценция 7. Способность к утилизации различных специфических органических субстратов (алканов, аренов, ПАУ и т.д.) 8. Не экспрессирующие гены, обнаружение которых возможно с помощью метода PCR 9. Специфические маркеры (16S or 23S РНК) PCR/Hyb

РАСПРОСТРАНЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫУ БАКТЕРИЙ

Увеличение в экосистеме клеток микроорганизмов, устойчивыхк антибиотикам, тяжелым металлам, ксенобиотикам, можетсвидетельствовать об усилении влияния соответствующих факторовна экосистему.

Соответственно, динамика проявления в микробных сообществах такихпризнаков, как устойчивость к факторам среды или способностьк деградации поллютантов, как и появление в популяции большого числаклеток с соответствующими генетическими маркерами, можетиспользоваться в мониторинге микробных сообществ для анализадействующих на экосистему природных и антропогенных факторов.

ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙВ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВАХ

НА ПРИМЕРЕ ОЗЕР РАЗНОЙ СТЕПЕНИ МИНЕРАЛИЗАЦИИПресноводные (Баланкуль, Иткуль, Кротовая Ляга, Мылка); Слабосоленые (Шира, Утиное -1); Соленые (Михайловское, Шунет, Соленое, Ханкуль, Утиное - 2); Гиперсоленые (Тус)

В большинстве озер (исключая пресноводные) доминируют среднеи умеренно галотолерантные бактерии.Генетические маркеры устойчивости к антибиотикам, органическимполлютантам и тяжелым металлам были обнаружены в большинстве клетокаллохтонных бактерий (более 10000 изолятов), но у них не проявлялсяфенотип устойчивости к высокой солености или низкой температуре.Это было особенно характерно для литеральной зоны озер с высокойантропогенной нагрузкой (Шира, Баланкуль, Иткуль, Кротовая Ляга, Мылка).В центральной зоне озер, особенно в гиполимнионе доминировалиавтохтонные бактерии, проявляющие способность к утилизацииорганических поллютантов, способных к росту при температурах 3-10оСи устойчивые к изменению уровня минерализации в водной среде.Но автохтонные виды бактерий были чувствительны к антибиотикамразного типа действия.

ПРИМЕРЫ ИЗУЧЕНИЯ РАСПРОСТРАНЕННОСТИСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ У МИКРООРГАНИЗМОВ

ПЛАЗМИДЫ могут быть генетическими маркерами существенного влияния на микробное звенои на экосистему в целом действия естественных или антропогенных факторов.

Увеличение в бактериальной популяции одного вида числа клеток, несущих плазмидные ДНКустойчивости или деградации определенных классов поллютантов, может служить сигналомусиления влияния данного фактора в экосистему.

Например, в бактериях разных видов в озере Шира обнаружены плазмиды, у которых в рядеслучаев установлена функциональная значимость кодируемых ими генов:pSH1 – 2,7 тпн – определяет устойчивость к повышенным концентрациям минеральных солей; pSH2- около 20 тпн – определяет устойчивость к ионам меди в концентрациях выше 250 мг/л;pSH3 – около 50 тпн – предположительно, кодирует гены деградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) (клетки - хозяева данной плазмидыразлагают нафталин в присутствии глюкозы).

Кроме того, выделены плазмиды, размером от 4,4 до 11,5 тпн, а также плазмиды более 20 тпн,но менее 30 тпн, предположительно ответственные за устойчивость к антибиотикам илиза деградацию поллютантов типа ПАУ или нефтепродуктов.Необходимо отметить, что предложенный метод с большой точностью выявляет хромосомные маркеры, однако в ряде случаев, особенно гены устойчивости к антибиотикаммогут кодироваться интегронами, например транспозонами, в которых отсутствуют регуляторные участки связывания с белками репрессорами.

ПЛАЗМИДЫ(ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ) КОДИРУЮТ МНОГИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ

Клонированные или природные маркерные гены должны обеспечиватьКлонированные или природные маркерные гены должны обеспечиватьмониторинг клеток не только в модельных, но и в природных экосистемахмониторинг клеток не только в модельных, но и в природных экосистемах

Трансгенные или природные микроорганизмыТрансгенные или природные микроорганизмы с маркерными генетическими системамис маркерными генетическими системами

ЭкосистемыЭкосистемы

МикроэкосистемыМикроэкосистемы

Хромосомная или плазмидная Хромосомная или плазмидная ДНКДНК с маркерным геном с маркерным геном

БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ -УНИКАЛЬНОЕ ПРИРОДНОЕ ЯВЛЕНИЕ

- характерна для живых организмов различных систематических групп;- чувствительна к воздействию множества факторов;- можно клонировать lux-гены в других организмах (в том числе, конструируя штаммы с избирательной чувствительностью)

Основные области применения:- изучение воздействия различных факторов на клетки;- анализ экспрессии генов;- исследования изменений в популяциях микроорганизмов;- биотест на различные химические соединения

В НАСТОЯЩЕЕ ВРЕМЯ ДЛЯ ЭТИХ ЦЕЛЕЙ ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЮТСЯ

КЛОНИРОВАННЫЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ ОПЕРОНЫ ИЗ МОРСКИХ

СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ (LUX-ОПЕРОНЫ)

FMNH2 + O2 + CH3 (CH2)n CH

OCH3 (CH2)n C

H

OFMN + H2O + + СВЕТ

NAD(P)HFADH2

FMNH2

Метаболизмжирныхкислот

O2Дыхательная

цепьATP

Биосинтез

P O C D EОрганизация lux-оперона

Глюкоза

cAMP

Обозначения

Гены биосинтеза альдегидного фактора

БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВИ ЕЕ ВЗАИМОСВЯЗЬ С ОБЩИМ МЕТАБОЛИЗМОМ

Схема реакции

Гены, кодирующие люциферазу

Регуляторные участки

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ LUX-ОПЕРОНОВИЗ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ

Photobacteriumphosphoreum

Photobacteriumleiognathi

Vibrio fischeri

Vibrio harveyi

Xenorhabdus luminescens

C D A B F E

D A B F E

C D A B E G

C D A BR I E G

C D A B E G H

C D A B E

G

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Kbp

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯКЛОНИРОВАННЫХ LUX-ГЕНОВ

МИКРОБНАЯ ЭКОЛОГИЯ

- мониторинг трансгенных микроорганизмов (ТМ)

- изучение механизмов адаптации ТМ к факторам окружающей среды - оценка влияния интродукции TM на микробное разнообразие

- тестирование наличия и концентраций поллютантов

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ

- мониторинг клонированных вставок ДНК - изучение механизмов миграции гетерологичных вставок ДНК в окружающей среде

1) Экспрессивность анализа

2) Хорошо изучена структурная и молекулярная организация lux-оперонов, а также механизмы люциферазной реакции в светящихся организмах

3) lux-гены могут быть использованы как репортерные в прогнозе поведения ТМ после случайной или целенаправленной интродукции в окружающую среду

4) Возможность контроля экспрессии биолюминесценции факторами окружающей среды при клонировании lux-оперонов под специфичными промоторами (расширение границ биотестирования)

5) Возможность изучения механизмов регуляции при использовании различных промоторов, контролирующих экспрессию lux-генов

6) Возможность клонирования только генов двух субъединиц люциферазы (AB). Это позволяет снизить нагрузку на метаболизм клетки-хозяина и индуцировать биолюминесцентный сигнал добавлением экзогенного альдегида – субстрата люциферазы.

НО: НЕОБХОДИМЫ ОБОБЩЕНИЕ И СИСТЕМАТИЗАЦИЯ СУЩЕСТВУЮЩЕЙ ИНФОРМАЦИИ ПО ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫМСВЕТЯЩИМСЯ МИКРООРГАНИЗМАМ!

ПРЕИМУЩЕСТВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БАКТЕРИЙС КЛОНИРОВАННЫМИ LUX-ГЕНАМИ ДЛЯ АНАЛИЗА

ЗАДАЧИ ПРИ СОЗДАНИИИНФОРМАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ

1) определение перечня объектов, информация о которых должна храниться в ИС, их характеристик и логических отношений между ними;

2) построение логической модели ИС, включающей структуру таблиц, типы содержащихся в них полей и межтабличных связей;

3) физическая реализация табличной структуры и разработка программного обеспечения серверной части ИС;

4) разработка клиентской части, позволяющей администраторам ИС осуществлять ручной и автоматизированный ввод данных;

5) создание Web-интерфейса, дающего доступ к информации через Интернет, включая возможность составления запросов;

6) анализ имеющейся в мире литературы по проблематике создаваемой ИС и ввод соответствующей информации в ИС;

7) организация работы по сбору информации, включая разработку опросных форм для последующего добавления информации в ИС.

СИСТЕМА УПРАВЛЕНИЯ БАЗОЙ ДАННЫХ

Характеристики СУБД

- ПлатформаMicrosoft Windows 9x/NT- СерверSybase Adaptive ServerAnywhere 6.0.2

- Среда проектированияComputer Associates ERwin 4.0- Система программированияBorland C++ Builder 6.0

- Интерфейс доступа к даннымODBCBorland Database Engine (BDE)

ОСНОВНАЯ ФОРМА ОПИСАНИЯ СВОЙСТВ ШТАММОВ

ОПИСАНИЕ СВОЙСТВ СВЕТЯЩИХСЯМИКРООРГАНИЗМОВ И LUX-ОПЕРОНОВ

gene="luxA" 182..1246

/codon_start=1 /transl_table=11 /product="luciferase alpha subunit" /protein_id="CAA30831.1" 1 tcgagcagcc attggcttag acagtgaagt gattgattta gttgatgata ttagtgagcc

ПРИМЕРЫВОЗМОЖНОСТЕЙ СУБД

Контроль случайного удаления записей

Поиск информации

Заключение:

Исследование резистентности доминирующих популяций водных экосистем к различным факторам на селективных средах позволяет определить ключевые действующие на экосистему факторы.

Анализ плазмидного профиля и проявления определенных генетических маркеров в доминирующих популяциях бактерий позволяет определить природные и антропогенные факторы, оказывающие наиболее существенное влияние на микробное сообщество.

Разработанная база данных по клонированным lux-генам позволяет решать задачи по сбору и анализу данных по светящимся трансгенным микроорганизмам и расширению возможностей использования биолюминесцентных маркерных систем.

Разработанный подход систематизации данных по микроорганизмам, несущих маркерные клонированные lux-гены в различных векторах (хромосомы, плазмиды, транспозоны, фаги, вирусы), может облегчить создание базы данных для природных бактерий, несущих маркерные генетические системы, соответственно в хромосомах, плазмидах и интегронах. В свою очередь, создание базы данных по природным микроорганизмам конкретных экосистем, может позволить проводить более целенаправленный анализ состояния каждой экосистемы в сравнении с другими экосистемами с разным уровнем антропогенной нагрузки.