第五章 氨基酸发酵机制及菌种的选育技术第五章 氨基酸发酵机制及菌种的选育技术第一节 谷氨酸发酵机制及生产菌的选育第一节 谷氨酸发酵机制及生产菌的选育

一、谷氨酸发酵机制一、谷氨酸发酵机制 生物体内合成谷氨酸的前体物质是生物体内合成谷氨酸的前体物质是 αα-- 酮戊二酸，是三羧酸循环的中间产物，酮戊二酸，是三羧酸循环的中间产物，

因此，由糖质原料生物合成谷氨酸的途径包括糖酵解途径、三羧酸循环、乙醛因此，由糖质原料生物合成谷氨酸的途径包括糖酵解途径、三羧酸循环、乙醛酸循环、酸循环、 CO2CO2 的固定反应等。的固定反应等。

1. 1. 谷氨酸生物合成途径谷氨酸生物合成途径 ① ① 由葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径由葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径 在谷氨酸发酵时，糖酵解经过在谷氨酸发酵时，糖酵解经过 EMPEMP 和和 HMPHMP 两个途径进行，生物素充足菌两个途径进行，生物素充足菌

HMPHMP 所占比例约为所占比例约为 38%38% ，控制生物素亚适量的结果表明在发酵产酸期，，控制生物素亚适量的结果表明在发酵产酸期， EMEMPP 所占比例更大，约为所占比例更大，约为 74%74% 。生成丙酮酸后，一部分氧化脱羧生成乙酰。生成丙酮酸后，一部分氧化脱羧生成乙酰 CoACoA ，，一部分固定一部分固定 CO2CO2 生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰 CoACoA 在柠檬酸合成在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，在经过氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸，酶催化作用下，缩合成柠檬酸，在经过氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸，如图如图 5-15-1 所示。所示。

葡萄糖

EMP为主

HMP约 26%占

2丙酮酸

乙酰CoA

草酰乙酸

苹果酸

ＣＯ２

ＣＯ２

ＣＯ２

柠檬酸 异柠檬酸 α -酮戊二酸

ＣＯ２

ＮＡＤＰ＋ ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋

谷氨酸

ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋ ＮＡＤＰ＋

ＮＨ３

氧化还原共轭的氨基化反应

② ② 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径

2. 2. 谷氨酸生物合成的代谢调节机制谷氨酸生物合成的代谢调节机制 微生物的代谢途径主要有两种，即分解代谢和合成代谢。微生物微生物的代谢途径主要有两种，即分解代谢和合成代谢。微生物

通过分解代谢从环境中摄取营养物质，把它们转化为自身物质，以此通过分解代谢从环境中摄取营养物质，把它们转化为自身物质，以此来提供能源和小分子中间体；通过合成代谢将来提供能源和小分子中间体；通过合成代谢将

分解代谢产生的能量和中间体合成氨基酸、核酸、蛋白质等物质。分解代谢产生的能量和中间体合成氨基酸、核酸、蛋白质等物质。在工业上，通过对微生物代谢途径的控制，来满足生产的需要，提高在工业上，通过对微生物代谢途径的控制，来满足生产的需要，提高生产效益。所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。生产效益。所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。

3. 3. 细胞膜通透性的调节细胞膜通透性的调节 （（ 11 ）控制细胞膜的形成）控制细胞膜的形成 控制细胞膜形成的常用方法有：控制细胞膜形成的常用方法有： ① ① 利用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，限制发酵培养基中生物利用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，限制发酵培养基中生物

素的浓度。素的浓度。 ② ② 利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，添加表面活性剂或利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，添加表面活性剂或

饱和脂肪酸。饱和脂肪酸。 ③ ③ 利用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，限制发酵培养基油酸的浓度。利用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，限制发酵培养基油酸的浓度。 ④ ④ 利用甘油缺陷型进行谷氨酸发酵，限制发酵培养基甘油的浓度。利用甘油缺陷型进行谷氨酸发酵，限制发酵培养基甘油的浓度。 （（ 22 ） 控制细胞壁的形成） 控制细胞壁的形成 细胞壁的骨架结构是肽聚糖，因此，肽聚糖的合成及其调节控制就细胞壁的骨架结构是肽聚糖，因此，肽聚糖的合成及其调节控制就

与细菌细胞膜的通透性密切相关。与细菌细胞膜的通透性密切相关。青霉素青霉素是转肽酶的抑制剂，它与转是转肽酶的抑制剂，它与转肽酶活性部位上的肽酶活性部位上的 SerSer 残基形成了共价键，使转肽酶受到了不可逆的残基形成了共价键，使转肽酶受到了不可逆的抑制。青霉素作为糖肽末端结构（抑制。青霉素作为糖肽末端结构（ D-Ala-D-AlaD-Ala-D-Ala ）的类似物，竞争性）的类似物，竞争性地抑制合成糖肽的底物，而与转肽酶的活性中心结合，使糖肽合成不地抑制合成糖肽的底物，而与转肽酶的活性中心结合，使糖肽合成不能完成，结果形成不完整的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态，易于能完成，结果形成不完整的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态，易于破损，增大谷氨酸的通透性。破损，增大谷氨酸的通透性。

二、谷氨酸生产菌的选育二、谷氨酸生产菌的选育 现在经过鉴定和命名的谷氨酸产生菌很多，其中 现在经过鉴定和命名的谷氨酸产生菌很多，其中主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属和节杆菌属中的细菌和节杆菌属中的细菌（如表（如表 5-15-1 ）。目前，我国企业使用的谷氨酸生产菌主要是北京棒杆）。目前，我国企业使用的谷氨酸生产菌主要是北京棒杆菌菌 AS 1.299AS 1.299 、钝齿棒杆菌、钝齿棒杆菌 AS 1.542AS 1.542 和天津短杆菌和天津短杆菌 T6-13T6-13 以及它们的各种突变株。以及它们的各种突变株。1. 1. 自然选育自然选育 这种方法有利于谷氨酸生产菌保持纯系良种，使谷氨酸生产具有相对稳定性，提高发酵 这种方法有利于谷氨酸生产菌保持纯系良种，使谷氨酸生产具有相对稳定性，提高发酵水平。但是由于菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作用，使得自发突变率极低，导水平。但是由于菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作用，使得自发突变率极低，导致选育耗时长、工作量大、效率低，一般不宜单独采用。致选育耗时长、工作量大、效率低，一般不宜单独采用。22 ．诱变选育．诱变选育 诱变的目的是通过物理因素、化学因素及其它一些因素的单一或复合处理，使谷氨酸生 诱变的目的是通过物理因素、化学因素及其它一些因素的单一或复合处理，使谷氨酸生产菌细胞内的遗传物质发生变化，通过分离筛选，可获得具有优良特性的变异菌株。物理产菌细胞内的遗传物质发生变化，通过分离筛选，可获得具有优良特性的变异菌株。物理因素主要有紫外线、因素主要有紫外线、 Co60Co60 、、 XX 射线、射线、 γ-γ- 射线、快中子、射线、快中子、 α-α- 射线、射线、 β-β- 射线、超声波、射线、超声波、 HHe-Nee-Ne 激光辐照、离子束等。化学因素主要有氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、激光辐照、离子束等。化学因素主要有氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、亚硝基甲基脲、亚硝酸、 5-5- 氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、 5-5- 溴尿嘧啶等。溴尿嘧啶等。 3.3. 杂交育种杂交育种杂交育种包括常规杂交和原生质体融合技术，其中原生质体融合技术近年来发展较为活跃。杂交育种包括常规杂交和原生质体融合技术，其中原生质体融合技术近年来发展较为活跃。4. 4. 代谢控制选育代谢控制选育 （ （ 11 ）选育耐高糖、高谷氨酸的菌株）选育耐高糖、高谷氨酸的菌株 （ （ 22 ）选育能强化谷氨酸合成代谢，削弱或阻断支路代谢的菌株）选育能强化谷氨酸合成代谢，削弱或阻断支路代谢的菌株 （ （ 33 ）选育能提高谷氨酸通透性的菌株）选育能提高谷氨酸通透性的菌株5. 5. 基因工程选育基因工程选育 随着生物工程新技术的发展，体外 随着生物工程新技术的发展，体外 DNADNA 重组的基因工程和固定化细胞技术都已应用于重组的基因工程和固定化细胞技术都已应用于谷氨酸发酵研究。谷氨酸发酵研究。