实验九 动物细胞的原代培养实验九 动物细胞的原代培养

1. 1. 实验目的实验目的

初步掌握细胞的原代培养技术。 初步掌握细胞的原代培养技术。

了解原代培养的意义。 了解原代培养的意义。

学习台盼兰染色检定细胞死活的方法。学习台盼兰染色检定细胞死活的方法。

2. 2. 实验原理 实验原理

原代培养的两种主要方法：原代培养的两种主要方法： 消化法：消化法： 3737 度，度， 0.125%0.125% 胰蛋白酶或胰蛋白酶或 0.0.

02%EDTA02%EDTA 消化消化 20~4020~40 分钟。分钟。组织块培养法：组织块培养法：将组织块培养于平皿中，将组织块培养于平皿中，

待组织边缘开始有单层细胞伸展开来，即待组织边缘开始有单层细胞伸展开来，即从组织培养转为细胞培养。从组织培养转为细胞培养。

3. 3. 实验材料、用品实验材料、用品 实验材料：实验材料：昆明小鼠昆明小鼠 实验用品：实验用品： ①① 仪器及用具仪器及用具

超净工作台；超净工作台； C02C02 培养箱；普通显微镜；倒置显微镜；水浴箱；离心机；培养箱；普通显微镜；倒置显微镜；水浴箱；离心机；高压灭菌锅；电热干燥箱。高压灭菌锅；电热干燥箱。

解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、移液管、血细胞计数板、橡皮吸头、胶塞、酒精灯、试管架、器、吸管、移液管、血细胞计数板、橡皮吸头、胶塞、酒精灯、试管架、棉球、无菌服、口罩、帽子等。棉球、无菌服、口罩、帽子等。

② ② 试剂试剂

75%75% 乙醇、乙醇、 RPMI 1640RPMI 1640 培养液（含小牛血清和青、链霉素）、培养液（含小牛血清和青、链霉素）、 0.25%0.25% 胰胰蛋白酶蛋白酶 +0.02%+0.02% 乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸 (EDTA)(EDTA) 溶液、溶液、 HanksHanks 液、液、 7.4%NaHCO37.4%NaHCO3

溶液。溶液。

4. 4. 实验步骤 实验步骤 小鼠肝细胞的原代培养小鼠肝细胞的原代培养消毒→拉颈或摘眼球放血法处死小鼠→再消毒→逐层消毒解剖→取消毒→拉颈或摘眼球放血法处死小鼠→再消毒→逐层消毒解剖→取肝→清洗→剪碎组织约肝→清洗→剪碎组织约 1mm1mm33→→ 洗涤。洗涤。

一次消化法：一次消化法： 3737 度下，青霉素瓶中加度下，青霉素瓶中加 0.125%0.125% 胰酶消化胰酶消化 3030 分钟，分钟，不时吹打振荡。用加不时吹打振荡。用加 5%5% 血清的血清的 D-HanksD-Hanks 终止消化，过滤离心洗终止消化，过滤离心洗涤后即可镜检。涤后即可镜检。

组织块培养法：组织块培养法：滴少量血清于平皿底部，抹平，将组织块逐个铺展滴少量血清于平皿底部，抹平，将组织块逐个铺展开，开， 3737 度倒置培养度倒置培养 2~3h2~3h ，再翻转加培养基即可。，再翻转加培养基即可。

小鼠脾淋巴细胞的原代培养小鼠脾淋巴细胞的原代培养 取出脾脏后，研磨，过滤，低渗除红细胞，离心收集镜检。取出脾脏后，研磨，过滤，低渗除红细胞，离心收集镜检。

台盼兰染色检定细胞死活：台盼兰染色检定细胞死活：一滴悬液加一滴一滴悬液加一滴 0.5%0.5% 台盼兰液台盼兰液 。 。

5.5. 思考题思考题

胰酶和胰酶和 EDTAEDTA 消化的原理是什么？消化的原理是什么？