کنترول کیفی آزمایشهای کنترول کیفی آزمایشهای سرولوژیسرولوژی

خداوند م خداوند بنا م بنامهربان مهربان بخشنده بخشنده

11 . .Labeled ImmunoassayLabeled Immunoassay

Enzyme Linked Immuno Sorben Assay ( ELISA )Enzyme Linked Immuno Sorben Assay ( ELISA ) Radio Immuno Assay ( RIA )Radio Immuno Assay ( RIA )

Immuno Flurescent Antibody Technique ( IFAT )Immuno Flurescent Antibody Technique ( IFAT ) Electrochemilominsance ( ECL )Electrochemilominsance ( ECL )

22..NonNon Labeled Immunoassay Labeled Immunoassay.. Agglutination testsAgglutination tests

Precipitation testsPrecipitation tests Fluccolation testsFluccolation tests

Agglutination ReactionsAgglutination Reactions

Direct agglutinationDirect agglutinationPassive agglutinationPassive agglutinationAgglutination inhibitionAgglutination inhibition

Ab + particulate Ag Agglutination (clumping)

Direct agglutinationDirect agglutination

Example # 2 – Using Example # 2 – Using bacteria (Ag) looking for Ab bacteria (Ag) looking for Ab

in serumin serum..

Indirect or Passive agglutinationIndirect or Passive agglutination

Results when inert Results when inert particles are coated with particles are coated with

soluble Ags which may soluble Ags which may react with Ab. Particles react with Ab. Particles

include latex, rbc’s, include latex, rbc’s, charcoal, etccharcoal, etc..

Example – Ag attached to Example – Ag attached to latex particle (known) + latex particle (known) +

serum looking for serum looking for (unknown) Ab. If Ab (unknown) Ab. If Ab

present, you get visible present, you get visible agglutinationagglutination..

Reverse passive agglutinationReverse passive agglutination

Involves the adherence of Involves the adherence of Ab to inert particles which Ab to inert particles which

can then be used to detect can then be used to detect the presence of Agthe presence of Ag..

Example – latex particle Example – latex particle coated with Ab (known) + coated with Ab (known) +

serum looking for serum looking for (unknown) Ag. If Ag (unknown) Ag. If Ag

present, then you get present, then you get visible agglutination. (CRP visible agglutination. (CRP

test)test)

Agglutination inhibition - posAgglutination inhibition - pos

Agglutination inhibition - negAgglutination inhibition - neg

عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیونعوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون

PHPH

عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون

Ionic strengthIonic strengthقدرت یونی محیط در حقیقت موالریته نمکهای قدرت یونی محیط در حقیقت موالریته نمکهای محلولی است که آنتی زن و آنتی بادی در آن محلولی است که آنتی زن و آنتی بادی در آن

محلول قرارمیگیرندمحلول قرارمیگیرند

Y

آگلوتیناسیون واکنشهای در موثر عوامل

YY

Y

Y

Y

YY

Y

YY

Y

Y

YY

YY

Y

Am

ount

of

latt

ice

excess antibody excess antigen

LATTICE

Dilution of antibodies

نحوه جلوگیری از منفی کاذب در آزمایش نحوه جلوگیری از منفی کاذب در آزمایش CRPCRP

CRP Serum 10 uL Serum 50 uLCRP Serum 10 uL Serum 50 uL < < 66 mg / Lmg / L _ _ _ _ 66 – – 2020 mg /Lmg /L + _ + _ 2020 – – 200200 mg/Lmg/L + + + + > > 200200 mg/Lmg/L _ + _ +

عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیونعوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون

TemperatureTemperature

Cold agglutinin testCold agglutinin test

عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیونعوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون

Incubation timeIncubation time

Direct Coombs’ TestDirect Coombs’ Test

Differential DiagnosisDifferential Diagnosis

1.1. Anti-IgG Positive + Anti-C3 Negative -Anti-IgG Positive + Anti-C3 Negative - Antibodies to Rh protein, Drug induced warm AIHA (penicillin, Antibodies to Rh protein, Drug induced warm AIHA (penicillin,

methyldopa)methyldopa)

2.2. Anti-IgG Positive + Anti-C3 Positive +Anti-IgG Positive + Anti-C3 Positive + SLE, idiopathic warm AIHA, rarely drug associatedSLE, idiopathic warm AIHA, rarely drug associated

3.3. Anti-IgG Negative - Anti-C3 Positive +Anti-IgG Negative - Anti-C3 Positive + Cold agglutinin disease, Paroxysmal cold hemoglobinuria, rarely Cold agglutinin disease, Paroxysmal cold hemoglobinuria, rarely

warm AIHA if low-affintiy IgGwarm AIHA if low-affintiy IgG

عوامل موثر در تفسير نتايج آزمايشهاي عوامل موثر در تفسير نتايج آزمايشهاي سرولوژيسرولوژي

: ارYابقه قبلي بيمYار :سن و سYابقه قبلي بيمYراد سن و سYتر از افYادي بيشYتي بYتر آنYراد تيYتر از افYادي بيشYتي بYتر آنYتي تازه بيمار شده.تازه بيمار شده.

:تYده اسYينه شYاكنون واكسYار تYا بيمYت:آيYده اسYينه شYاكنون واكسYار تYا بيمYه آيYوط بYاال مربYتر بYه تيYوط بYاال مربYتر بYتي وYاكسYني YكYه تYازهY دريYافتY كYردهY ، اشYتراYك آنYتي Yژن بYا عYامYل وYاكسYني YكYه تYازهY دريYافتY كYردهY ، اشYتراYك آنYتي Yژن بYا عYامYل

بYيمYاريY جYديدY، بهY همYاYن بYيYمارYي كYه وYاكYسينYه گYشتهY اسYت.بYيمYاريY جYديدY، بهY همYاYن بYيYمارYي كYه وYاكYسينYه گYشتهY اسYت.

:طYائي محيYعيت جغرافيYط:وضYائي محيYعيت جغرافيYدميك در اين وضYا آنYايع و يYل شYدميك در اين محYا آنYايع و يYل شYمح منYاطق YحYد نصYاب تYيYتر قYابYل قبYول بYراي Yآن بيمYاري YخYاص منYاطق YحYد نصYاب تYيYتر قYابYل قبYول بYراي Yآن بيمYاري YخYاص

باالتر از ساير مناطق مي باشد.باالتر از ساير مناطق مي باشد.

:ارYبيم بيمYار:شغل بYا شغل آنهYا بYراي قابYل قبYول تيYتر بYا تمYاس مكYرر آنهYا بYراي قابYل قبYول تيYتر تمYاس مكYرر سYاير افYراد متفYاوت اسYت.موقع بيمYاري عالئم+ افYزايش سYاير افYراد متفYاوت اسYت.موقع بيمYاري عالئم+ افYزايش

تيترتيتر

:تي ژنيYابه آنYا تشYتي ژني:قرابت يYابه آنYا تشYادي قرابت يYتي بYول آنYير معمYزايش غYاديافYتي بYول آنYير معمYزايش غYاف

......

: ارYني بيمYتم ايمYار :نقص در سيسYني بيمYتم ايمYاگلوبولين ارثي نقص در سيسYاهش گامYاگلوبولين ارثي كYاهش گامYك YرفتهYپيشYومورYت– _YلوYسYمي ثYاYنويYه يYا YبيمYاري اYكتYسYابYي –تYومورYپيشYرفتهY يYا _YلوYسYمي ثYاYنويYه يYا YبيمYاري اYكتYسYابYي يYا

نتايج آزمايشات منفي نتايج آزمايشات منفي

تي ژنYآن كننYده توليYد آنYتي ژنموسسYه كننYده توليYد فريYز ::موسسYه عYدم و نرمYال فريYز حYد عYدم و نرمYال حYد آنتي ژن ها آنتي ژن ها

:دارو دارو:مصYرف كورتون-پرتYو مصYرف مصYرف موقYع- بي كورتون-پرتYو تجYويز مصYرف موقYع- بي تجYويز درماني درماني

: اريYه بيمYاري :مرحلYه بيمYاهر مرحلYاري ظYه دوم بيمYر هفتYثر در اواخYاهر اكYاري ظYه دوم بيمYر هفتYثر در اواخYاكمي گردندمي گردند

: آزمايشYگاه در :خطYا آزمايشYگاه در – خطYا آلYوده پت –پي آزمYايش – جYواب آلYوده پت –پي آزمYايش جYواب قرائت نتيجه – مواد فاسد و آلودهقرائت نتيجه – مواد فاسد و آلوده

Reported

problemsReported

problems

Sample Equipment Methods

Sample Equipment Methods

Personnel Assay

Personnel Assay

Trouble ShootingTrouble Shooting

بررسی کيفيت کيت هابررسی کيفيت کيت ها

TP Sensitive = ------------- *100

TP+FN TN

Specificity = --------------* 100 TN+FP

TP

Predictive valve of positive= -----------* 100 TP+FP

TNPredictive valve of Negative= ------------* 100

TN+FN

Variables that affect the quality of Variables that affect the quality of resultsresults

The educational background and training of the The educational background and training of the laboratory personnellaboratory personnel

The condition of the specimensThe condition of the specimensThe controls used in the test runsThe controls used in the test runsReagentsReagentsEquipmentEquipmentThe interpretation of the resultsThe interpretation of the resultsThe transcription of resultsThe transcription of resultsThe reporting of resultsThe reporting of results

TEST

Positive

Negative

45 5

5 45

a bc d

Present Absent

DISEASE

Positive predictivevalue a = 45 = 90%a+b 50

Prevalence = 50%

Negative predictivevalue d = 45 = 90%c+d 50

Sens = 45/50i.e. 90%

Spec = 45/50i.e. 90%

The Impact of Prevalence on Predictive Value

Different of Cold AutoantibodiesDifferent of Cold Autoantibodies

Primary cold Primary cold Agglutinin Agglutinin

diseasedisease

Secondary cold Secondary cold autoantibodiesautoantibodies

Paroxysmal cold Paroxysmal cold HemoglobinuriaHemoglobinuria

IgIg

ClonalityClonality

DATDAT

HemolysisHemolysis

Target RBCTarget RBC antigenantigen

IgMIgM

MonoclonalMonoclonal

CC33

Chronic ,mildChronic ,mild

II

IgMIgMMono/polyclonalMono/polyclonal

CC33

Self-limited,mild to Self-limited,mild to severesevere

I,iI,i

IgGIgG

PolyclonalPolyclonal

CC33

Episodic, self-Episodic, self-limtied: mild to limtied: mild to

severesevere

PP

Cold Auto Antibodies (IgM)Cold Auto Antibodies (IgM)

IgM directed against ‘Antigen I’ on red cellsIgM directed against ‘Antigen I’ on red cellsSeen inSeen in

–ElderlyElderly–LymphomasLymphomas–Infections - EBV, mycoplasmaInfections - EBV, mycoplasma

DAT (Coombs) - + for C3, negative for IgGDAT (Coombs) - + for C3, negative for IgGTreat - stay warmTreat - stay warm

Warm AIHA - TreatmentWarm AIHA - Treatment

Folic acid supplementationFolic acid supplementationSteroidsSteroidsSplenectomySplenectomyImmunosuppressivesImmunosuppressives

–CyclophosphamideCyclophosphamide–AzathioprineAzathioprine

Intravenous immune globumin (IVIG)Intravenous immune globumin (IVIG)PlasmapheresisPlasmapheresis

Differential DiagnosisDifferential Diagnosis

.1.1Anti-IgG Positive + Anti-C3 NegativeAnti-IgG Positive + Anti-C3 Negative- - Idiopathic Warm AIHA, Drug induced warm AIHA (penicillin, Idiopathic Warm AIHA, Drug induced warm AIHA (penicillin,

methyldopa)methyldopa)

.2.2Anti-IgG Positive + Anti-C3 PositiveAnti-IgG Positive + Anti-C3 Positive+ + SLE, idiopathic warm AIHA, rarely drug associatedSLE, idiopathic warm AIHA, rarely drug associated

33.. Anti-IgG Negative - Anti-C3 PositiveAnti-IgG Negative - Anti-C3 Positive+ + Cold agglutinin disease, Paroxysmal cold hemoglobinuria, rarely Cold agglutinin disease, Paroxysmal cold hemoglobinuria, rarely

warm AIHA if low-affintiy IgGwarm AIHA if low-affintiy IgG

Y

Antibody and antigen can form a lattice

YY

Y

Y

Y

YY

Y

YY

Y

Y

YY

YY

Y

Am

ount

of

latt

ice

excess antibody excess antigen

LATTICE

Dilution of antibodies

c. Applicationsc. Applications

These include detection of anti-rhesus factor (Rh) antibodies. Antibodies to the Rh These include detection of anti-rhesus factor (Rh) antibodies. Antibodies to the Rh factor generally do not agglutinate red blood cells. Thus, red cells from Rh+ children factor generally do not agglutinate red blood cells. Thus, red cells from Rh+ children

born to Rh- mothers, who have anti-Rh antibodies, may be coated with these born to Rh- mothers, who have anti-Rh antibodies, may be coated with these antibodies. To check for this, a direct Coombs test is performed. To see if the mother antibodies. To check for this, a direct Coombs test is performed. To see if the mother

has anti-Rh antibodies in her serum an Indirect Coombs test is performedhas anti-Rh antibodies in her serum an Indirect Coombs test is performed  .  .

patient red cells + AHG = agglutination

Flocculation testsFlocculation tests

Flocculation tests for Ab detection are based on Flocculation tests for Ab detection are based on the interaction of soluble Ag with Ab, which the interaction of soluble Ag with Ab, which

results in the formation of a precipitate of fine results in the formation of a precipitate of fine particles. (Ag consists of lipid type particles)particles. (Ag consists of lipid type particles)

Examples VDRL & RPR’s. (See syphilis tests – to Examples VDRL & RPR’s. (See syphilis tests – to follow)follow)

Concentration of Ag and Ab also affects agglutination reactions, both the first and second stages.

Affinity = ∑ attractive and repulsive forces

Ab

Ag

High Affinity

Ab

Ag

Low Affinity

Affinity

• Strength of the reaction between a single antigenic determinant and a single Ab combining site

Avidity• The overall strength of binding between an Ag

with many determinants and multivalent Abs

Keq = 104

Affinity106

Avidity1010

Avidity

Cross Reactivity• The ability of an individual Ab combining site to

react with more than one antigenic determinant.• The ability of a population of Ab molecules to

react with more than one Ag

Anti-A Ab

Ag A

Anti-A Ab

Ag B

Shared epitope

Anti-A Ab

Ag C

Similar epitope

Cross reactions

آب مصرفي آزمايشگاه آب مصرفي آزمايشگاه

تريكي ::11نوع نوعYدايت الكYتريكي هYدايت الكY11هoo.. << انتيYر سYروزيمنس بYانتي ميكYر سYروزيمنس بYميك StandardStandardمتر مكعب جهت كشت سلولي تهيه متر مكعب جهت كشت سلولي تهيه

تريكي ::22نوع نوعYدايت الكYتريكي هYدايت الكYانتي >> 11هYر سYروزيمنس بYانتي ميكYر سYروزيمنس بYميك متر مكعب براي آزمايشات متر مكعب براي آزمايشات

تريكي : :33نوع نوعYدايت الكYتريكي هYدايت الكYانتي >> 1010هYر سYروزيمنس بYانتي ميكYر سYروزيمنس بYميك متر مكعب جهت شست وشو و غيره متر مكعب جهت شست وشو و غيره

: ه جهت مقYاومت هYر چYه جهت مقYاومت هYر چYه ConductometerConductometer دستگاه مربوطه :دستگاه مربوطمقYاومت بيشYتر باشYد آب خYالص تYر اسYت يعYني آبي مقYاومت بيشYتر باشYد آب خYالص تYر اسYت يعYني آبي

تYر 1010كYه كYه خYالص باشYد داشYته ، مقYاومت مگYااهم تYر خYالص باشYد داشYته ، مقYاومت مگYااهم اهم يا كمتر اهم يا كمتر55است. از است. از

كنترل آب مقطركنترل آب مقطر

AA :: يك قطره روي الميك قطره روي الم

BB: : ودهYره آب آلYترات نقYر+ كمي نيYخيص كلYوده جهت تشYره آب آلYترات نقYر+ كمي نيYخيص كلYجهت تشبه كلر كدر میشود. به كلر كدر میشود.

CC: : الن ژوژYك بYواد آلي در يYالن ژوژ مYك بYواد آلي در يYتري 500500مYتري ميلي ليY1 ميلي ليCC 1CC ، ، SO4H2SO4H2 ظYظ غليYيم %%33+ + غليYات پتاسYر منگنYول پYيم از محلYات پتاسYر منگنYول پY10/110/1 از محل

سYاعت رنYگ ثYابت مانYد آب د يونYيزه سYاعت رنYگ ثYابت مانYد آب د يونYيزه 11نرمYال اگYز بعYد از نرمYال اگYز بعYد از اسYت ولي اگYر رنYگ پYر منگنYات از بين رفت آب آلYوده اسYت ولي اگYر رنYگ پYر منگنYات از بين رفت آب آلYوده

به مواد آلي است.به مواد آلي است.

يفورژ يفورژسانتر سانتر د مي ::11نوع نوعYا توليYت، عيب گرمYوب افقي اسYطح رسYد مي سYا توليYت، عيب گرمYوب افقي اسYطح رسYس

كند.كند.

ه ::22نوع نوعYزاوي مايYل زاويYه سYطح رسYوب مايYل درجYه سYرعت 2525--4040سYطح رسYوب درجYه سYرعت و زودتر مي ايستد. و زودتر مي ايستد.11زيادتر از نوعزيادتر از نوع

اولترا سانتريفوژ ضمنا¢ اولترا سانتريفوژ ضمنا¢ ::33نوع نوع

تگاه تاكامترهريفوژ با دس يفوژ با دستگاه تاكامترهر سانتر ندارد.ندارد. خطا اشكال خطا اشكال %%55 ماه يكبار چك مي شود و تا ماه يكبار چك مي شود و تا 33سانتر

برنامه هاي اطمينان از كيفيتبرنامه هاي اطمينان از كيفيت

.تست بايد داراي صحت و دقت كافي باشد.تست بايد داراي صحت و دقت كافي باشد

ايش درYه –اهميت و نقش آزمYرعت – هزينYار –سYايش در روش كYه –اهميت و نقش آزمYرعت – هزينYار –سYروش ككارهاي كلينيكي. كارهاي كلينيكي.

كYپزش بYا بايسYتي مطلYوب كيفيت بYه رسYيدن پزشYك جهت بYا بايسYتي مطلYوب كيفيت بYه رسYيدن جهت ارتباط برقرار نمود .ارتباط برقرار نمود .

.آيا نتيجه تست صحيح است.آيا نتيجه تست صحيح است

.آيا وقتي تكرار شود نتيجه مناسبي بدست مي آيد.آيا وقتي تكرار شود نتيجه مناسبي بدست مي آيد

افيYك سYرعت از درمYان در پزشYك اسYتفاده بYراي كYافي آيYا سYرعت از درمYان در پزشYك اسYتفاده بYراي آيYا برخوردار است.برخوردار است.

. تYان منطقي اسYار جهت درمYتفاده بيمYه و اسYا هزينYت .آيYان منطقي اسYار جهت درمYتفاده بيمYه و اسYا هزينYآي

منابع خطا منابع خطا

فردي –تجربه –آموزش – شرايط استخدامي فردي –تجربه –آموزش – شرايط استخدامي

داYا- سروصYدم – تهويYه – نYور – كYار دمYا- سروصYدا عوامYل محيطي فضYاي – تهويYه – نYور – كYار عوامYل محيطي فضYاي زياد- عدم ايمنيزياد- عدم ايمني

ادهYيره-آمYال –ذخYرداري –انتقYه بYان نمونYا روش و زمYه هYاده نمونYيره-آمYال –ذخYرداري –انتقYه بYان نمونYا روش و زمYه هYنمونسازيسازي

حمل ونقلحمل ونقل

ه اي –رنگهاYروف شيشYواد- ظYگاهي –كيفيت مYه اي –رنگهامواد آزمايشYروف شيشYواد- ظYگاهي –كيفيت مYمواد آزمايش

(آسان –سخت) روش انجام تست (آسان –سخت) روش انجام تست

دستگاه : غير استاندارد-نتايج غيرقدستگاه : غير استاندارد-نتايج غيرق

قابل اطمينان مي دهندقابل اطمينان مي دهند

قرائت آزمايش: قرائت عجوالنه قرائت آزمايش: قرائت عجوالنه

گزارش نتيجه : نظم –تكرارگزارش نتيجه : نظم –تكرار

Direct agglutinationDirect agglutination