с использованием светящихся бактерий и выделенной из них люминесцентной системы

Биолюминесцентный анализ

Содержание

1. Общие принципы

2. Бактериальная люминесценция in vivo в аналитике

3. Применение выделенной люминесцентной системы in vitro

4. Иммобилизованные ферменты в биолюминесцентном анализе

5. Биолюминесцентные иммунометоды

6. Перспективы использования биолюминесцентного анализа

Общие принципы

Обстоятельства, определяющие перспективность

применения биолюминесценции для анализа веществ:

- Хорошо разработанные методы и чувствительность

- Высокая специфичность

- Подача энергии через общие метаболические пути

- Малая стоимость измерений

- Неиссякаемые источники люциферазыфото с сайта www.zin.ru

Общие принципы

Из истории, основополагающие работы:

Метод определения АТФ с помощью люциферазы насекомых (Мак Элрой, 1947г.)

Биолюминесцентное определение кислорода, показавшее активность хлоропластов, изолированных из растительной клетки

(Бееринк, 1902г.)

Использовали светящиеся бактерии для измерения кислорода при парциальном давлении его 0,853 мм рт. ст.

(Гарней и Морисон, 1923г.)

Бактериальная люминесценция IN VIVO в аналитике

Методы с использованием выделенных

фермент-субстратных систем

Бактериальная люминесценция IN VIVO в аналитике

Использование светящихся бактерий для индикации субстратов:

- изучение оксигенирования миоглобина из миокарда лошади

- изучение активности цитохромоксидазы в митохондриях

- изучение фотосинтеза и для контроля за загрязнением окружающей среды

- анализ гербицидов, ингибирующих фотосинтез

- для тестирования длинноцепочечных алифатических альдегидов

Бактериальная люминесценция IN VIVO в аналитике

В промышленности :

1. контроль присутствия следов кислорода в бескислородных технологических средах

2. при сварке и других процессах

3. контроль за утечкой газов в баллонах

4. анализ кислорода во взрывоопасных условиях

фото с сайта supercomputers.ru

Бактериальная люминесценция IN VIVO в аналитике

Биолюминесцентный анализ с использованием мутантных штаммов светящихся бактерий:

- измерение активности любых гидролитических ферментов

- анализ липополисахаридов

- анализ антилипогенных веществ

- тест для ингибиторов синтеза ДНК и мутагенных веществ

подробнее в статье Hoshino Nature Methods 2007, 4:637 и Loening Nature Methods 2007, 4:641

Бактериальная люминесценция IN VIVO в аналитике

Определение ингибиторов биолюминесценции in vivo:

- влияние многих анестетиков, наркотиков, промышленных ядов, исектицидов, отравляющих и лекарственных веществ

- биотесты для оценки токсичности водной и воздушной среды, скрининга новых соединений

Анализ путем сравнения свечения бактерий в присутствии и отсутствии

ингибитора, время 10-20 сек.

Бактериальная люминесценция IN VIVO в аналитике

обнаружение утечки компонента ракетного топлива – несимметричного диметилгидразина

фото с сайта www.forum.chrysler-dodge.ru

фото с сайта festival.1september.ru

Бактериальная люминесценция IN VIVO в аналитике

Биотест для анализа фенольных соединений и продуктов их деструкции

источник картинки www.wwf.ru

Бактериальная люминесценция IN VIVO в аналитике

Биолюминесцентный метод дает количественную меру токсичности ипревосходит известные биотесты по быстродействию, точности и

чувствительности.

Чувствительность светящихся

бактерий зависит от:

- штамма- условий культивирования

Прибор экологического контроля "Биотокс-10М" предназначен для быстрого количественного контроля степени интегральной токсичности проб воды и водных

вытяжек (www.biotox.ru)

Бактериальная люминесценция IN VIVO в аналитике

Применение анализа ингибиторов свечения бактерий:

1) для обнаружения острой токсичности сточных вод производств синтеза фреонов, каучука и др.

2) для оперативного контроля за состоянием атмосферы в горных выработках при взрывных работах и при работе дизельных двигателей

3) для обнаружения отравляющих веществ и анализа качества лекарственных препаратов

фото с сайта www.lapumed.ru

Бактериальная люминесценция IN VITRO

Методы с использованием выделенных фермент-субстратных систем

Применение выделенной бактериальной люминесцентной системы IN VITRO

Группы методов:

измерение субстратов реакции биолюминесценции

измерение активности ферментов и концентраций субстратов сопряженных с биолюминесценцией ферментативных реакций

анализ ингибиторов биолюминесценции

источник картинки www.luminometr.ru

Применение выделенной бактериальной люминесцентной системы IN VITRO

Описание методов:

1) анализ ФМН возможен при восстановлении ФМН дитионитом натрия

2) анализ активности ферментов осуществляется добавлением восстановленного пиридинового нуклеотида в инкубационную смесь

источник картинки www.himlib.ru

Иммобилизованные ферменты в биолюминесцентном анализе

возможность многократного использования фермента в измерениях

увеличить устойчивость ферментов при хранении и при тепловом воздействии

Преимущество иммобилизованных ферментов - повышение каталитической эффективности реакций

Перспективы использования биолюминесцентного анализа

Клиническая биохимия:

определение уровня восстановленных пиридиновых нуклеотидов в биопсийном материале поджелудочной железы, печени

анализ клеток плода при амниоцентезе.

получение картины распределения метаболитов в срезах тканей мозг

определение чувствительности бактерий

к антибиотикам и др.

фото с сайта www.meddialab.ru

Перспективы использования биолюминесцентного анализа

Биохимические исследования:

анализ активности ферментов в

процессе очистки

локализация активности ферментов

при электрофорезе и

изоэлектрофокуссировании в

полиакриламидном геле

Охрана окружающей среды:

определение токсичности водной и

воздушной среды

источник картинки www.ektor.ru