‘’Docking and Assembly of the Type II Secretion Complex of Vibrio cholerae’’

Journal of Bacteriology (2009)

Lybarger et al

Bressuire Christelle

INTRODUCTION

Le Système de sécrétion de type II

- Mécanisme en 2 étapes

-Translocation MI via Sec ou Tat

- Machinerie complexe similaire machinerie d’assemblage Pili type IV

-Translocation ME de la conformation repliée

-Bacille incurvé Gram –

- Responsable du cholera

- Sécrétion de toxine et de facteurs de virulence par SST2

Vibrio cholerae

INTRODUCTION

Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

INTRODUCTION

Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

INTRODUCTION

Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

INTRODUCTION

Comment s’assemble le SST2 dans la paroi de Vibrio cholerae ?

Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

INTRODUCTION

INTRODUCTION

Interactions protéine-protéine du SST2

C

Assemblage du SST2 ?

Etude interactions protéine-protéine

INTRODUCTION

Interactions protéine-protéine du SST2

GspCGspD

Assemblage du SST2 ?

Etude interactions protéine-protéine

C

INTRODUCTION

Interactions protéine-protéine du SST2

GspCGspD

Gsp C GspM et GspL

Assemblage du SST2 ?

Etude interactions protéine-protéine

C

INTRODUCTION

Interactions protéine-protéine du SST2

Assemblage du SST2 ?

Etude interactions protéine-protéine

GspCGspD

Gsp C GspM et GspL

EpsL EpsM

C

INTRODUCTION

Interactions protéine-protéine du SST2

Etude de l’assemblage du SST2 de Vibrio cholerae

Etude des interactions protéine-protéine de EpsC et EpsM

Suivit des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM in vivo

C

Protéine GFP (Green Fluorescent Protein)

• Directed polar secretion of protease from single cells of Vibrio cholerae via the type II secretion Pathway. Scott et al. PNAS (2001)

• Green fluorescent chimeras indicate nonpolar localization of pullulanase secreton components PulL and PulM. Buddelmeijer et al. J. Bacteriol (2006)

Localisation polaire de GFP-EpsM

GFP-EpsM localisé aux pôles de la bactérie Vibrio cholerae

GFP-PulM non surproduit n’est pas localisé aux pôles de la bactérie Klebsiella Oxytoca

• Directed polar secretion of protease from single cells of Vibrio cholerae via the type II secretion Pathway. Scott et al. PNAS (2001)

• Green fluorescent chimeras indicate nonpolar localization of pullulanase secreton components PulL and PulM. Buddelmeijer et al. J. Bacteriol (2006)

Localisation polaire de GFP-EpsM

GFP-EpsM localisé aux pôles de la bactérie Vibrio cholerae

GFP-PulM non surproduit n’est pas localisé aux pôles de la bactérie Klebsiella Oxytoca

La localisation polaire de GFP-EpsM est-elle due à la surproduction de la protéine?

Localisation de GFP-EpsM ?

Souche Vibrio cholerae ∆epsM + pGfp-EpsM

Localisation de GFP-EpsM ?

• Observation au microscope à fluorescence

Induction à l’IPTG

Localisation des protéines GFP-EpsM aux pôles de la

bactérie

C

Localisation de GFP-EpsM ?

• Observation au microscope à fluorescence

Sans induction à l’IPTG

Localisation des protéines GFP-EpsM à la périphérie

de la membrane

C

Localisation de GFP-EpsM ?

• Observation au microscope à fluorescence

+ IPTG - IPTG

La Localisation polaire de GFP-EpsM est due à l’induction à l’IPTG

Localisation de GFP-EpsM ?

• Observation au microscope à fluorescence

+ IPTG - IPTG

La Localisation polaire de GFP-EpsM est due à la surproduction de la protéine.

Artefact !!!

Surproduction des protéines GFP-EpsM

les protéines GFP-EpsM sont localiseés aux pôles de la

bactérie

Hypothèse 1: la surproduction des protéines

GFP-EpsM

Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont

surproduites alors que les autres protéines du SST2 ne le sont pas

C

Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines?

Hypothèse 1 ou 2?

Souche Vibrio cholerae Gfp-EpsM

Souche Vibrio cholerae Gfp-EpsMSouche Vibrio cholerae ∆epsM + pGfp-EpsM

Promoteur eps=

Protéine GFP-EpsM produite en adéquation avec les autres

protéines Eps

Promoteur Inductible=

Protéine GFP-EpsM peut être produite à un niveau différent de

celui des autres protéine Eps

Hypothèse 1 ou 2?

C C

Localisation protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM

Localisation protéine native EpsC ou EpsM

?

SST2 assure la sécrétion des toxines de Vibrio

cholerae

?C

Protéine GFP-Eps = Protéine native Eps?

Vérification production protéine de fusion par Western-Blot

Détection de protéine GFP-EpsCDétection protéine GFP-EpsM

Protéine GFP –EpsM instable ?

‘’Cross reactive band’’ ?

Le SST2 des souches GFP-EpsC et GFP-EpsM est il toujours fonctionnelle ?

BOCMethylcoumarin

fluorescent

Induction IPTG

protéaseVC1200

Le SST2 des souches GFP-EpsC et GFP-EpsM est il toujours fonctionnelle ?

L’insertion de la fusion GFP n’empêche pas lefonctionnement du SST2

Localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM

Protéine de fusion localisé dans la membrane de Vibrio cholerae et non aux pôles

• Observation au microscope à fluorescence

Surproduction des protéines GFP-EpsM

les protéines GFP-EpsM sont localisés aux pôles de la

bactérie

Hypothèse 1: la surproduction des protéines

GFP-EpsM

Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduit alors que les autres

protéines du SST2 ne le sont pas

C

Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines?

Surproduction des protéines GFP-EpsM

les protéines GFP-EpsM sont localisés aux pôles de la

bactérie

Hypothèse 1: la surproduction des protéines

GFP-EpsM

Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduit alors que les autres

protéines du SST2 ne le sont pas

C

Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines?

La stœchiométrie des protéines de fusion et des autre Eps est nécessaire à la localisation des protéines de fusions

Localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM

Points de fluorescence= SST2 assemblé

?

• Observation au microscope à fluorescence

Point de fluorescence = SST2 assemblé?

Dispersion de la fluorescence

Compétition Protéine native Eps / Protéine GFP-Eps

Point de fluorescence = SST2 assemblé

C

• Observation au microscope à fluorescence

Vérification de l’importance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines

Souche Vibrio cholerae PBAD

Remplacement epsC et epsM par leur version fusionnée

gfp-epsM et gfp-epsC sous le contrôle du promoteur pbad inductible à l’arabinose.

Maintien équilibre des éléments Eps du T2SS

C

Vérification de l’importance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines

Vérification de l’importance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines

Maintien de la stœchiométrie naturelle de chacun des composants du SST2

= Pré requis pour détermination de la localisation cellulaire

• Observation au microscope à fluorescence

Le nombre de point de fluorescence augmente avec le niveau d’induction à l’arabinose

• Observation au microscope à fluorescence

Corrélation Points de fluorescence/Sécrétion protéase du SST2?

Corrélation Points de fluorescence/Sécrétion protéase du SST2?

Les points de fluorescence représentent un SST2 fonctionnelle

• Localisation protéine EpsG par immunofluorescence

Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ?

Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ?

Auto-fluorescencePoints de

fluorescence

Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ?

Points de fluorescence

la localisation des protéines de fusion est représentatif des protéines natives

Auto-fluorescence

Assemblage du Système de sécrétion de type II

Ancrage du système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

Rôle filaments cytosquelette MreB ?

MreB n’est pas nécessaire à l’apparition des points de

fluorescence

Ancrage du système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

Rôle filaments cytosquelette MreB ?

MreB n’est pas nécessaire à l’apparition des points de

fluorescence

L’activité du SST2 ne dépend pas de

MreB

MreB n’intervient pas dans l’arrimage du SST2

Interactions protéine-protéine entre GFP-Eps et les autres Eps

Rôle des autres protéines Eps dans la localisation de EpsC et EpsM?

Délétions des autres gènes Eps

Observation de l’effet de la délétion:

-Sur l’expression des gènes gfp-EpsC et gfp-EpsM

- Sur l’activité du SST2

- Sur la localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GfP-EpsM

C

Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ?

Sur le niveau d’expression?

Sur le niveau d’expression?

La délétion d’epsD espL et epsM entraine une surproduction des autres protéines Eps

Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ?

Sur le niveau d’expression?

• Augmentation de la production des protéines Eps non due à la fusion GFP

• Hypothèse:

Absence Eps D, EpsL ou EpsM

SST2 non fonctionnelle

Suractivation du promoteur eps (facteur σE)

Augmentation de la production des autres protéines Eps

Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ?

C

Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ?

Sur l’activité du SST2?

Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ?

Sur l’activité du SST2?

La Délétion des gènes epsD, espL et epsM empêche la sécrétion de protéase par le SST2

Effet de la délétion des gènes epsD?

Sur la localisation de EpsC?

Dispersion de la

fluorescence

Effet de la délétion des gènes epsD?

Sur la localisation de EpsC?

Dispersion de la

fluorescence

La localisation de EpsC semblerait dépendre d’EpsD

Souche Vibrio cholerae PBAD::gfp-espC

Délétion epsD

gfp-epsC sous le contrôle du promoteur eps inductible à l’arabinose

Empêche la surproduction des protéines EpsC due à la délétion d’epsD

C

Dispersion de fluorescence= Surproduction protéine GFP-EpsC suite à la délétion d’epsD?

Dispersion de la

fluorescence

Dispersion de fluorescence= Surproduction protéine GFP-EpsC suite à la délétion d’epsD?

Dispersion de la

fluorescence

EpsD à un rôle crucial dans la localisation de EpsC

Dispersion de fluorescence= Surproduction protéine GFP-EpsC suite à la délétion d’epsD?

Effet de la délétion des gènes epsL et epsM?

Sur la localisation de EpsC?

Plus de points de fluorescence aux pôles des cellules

Délétions n’empêchent pas la formation des points de fluorescence

Effet de la délétion des gènes epsL et epsM?

Sur la localisation de EpsC?

Délétions n’empêchent pas la formation des points de fluorescence

Plus de points de fluorescence aux pôles des cellules

EpsM et EpsC sembleraient maintenir EpsC au niveau de la membrane latérale

Interactions EpsL et EpsM

Moins de protéine EpsL en absence d’ EpsM et inversementEffet accrue en phase stationnaire due au nombreuses protéases

Interactions EpsL et EpsM

Moins de protéine EpsL en absence d’ EpsM et inversementEffet accrue en phase stationnaire due au nombreuses protéases

Effet de protection mutuelle dans l’interaction EpsL/EpsM

Effet de la phase stationnaire sur la localisation de GFP-EpsC

Cellules plus courtes mais même points de

fluorescenceLocalisation de GFP-EpsC aux pôles de la

cellules et dans le cytoplasme

Effet de la phase stationnaire sur la localisation de GFP-EpsC

Restauration des points de fluorescence après complémentions des gènes epsL et epsM délétés

Hypothèse: EpsC est sujet à la protéolyse en l’absence d’EpsM et EpsL

EpsL-EpsM stabilisent EpsC dans une conformation nécessaire à sa localisation dans la membrane latérale

Effet de la délétion des gènes epsD?

Sur la localisation de EpsM?

Dispersion de la

fluorescence

Effet de la délétion des gènes epsD?

Sur la localisation de EpsM?

Dispersion de la

fluorescence

EpsD est nécessaire à la localisation d’EpsM

Effet de la délétion des gènes epsL et epsC?

Sur la localisation de EpsM?

Dispersion de la

fluorescenceRestauration des

points de fluorescence

par complémentation

Effet de la délétion des gènes epsL et epsC?

Sur la localisation de EpsM?

Dispersion de la

fluorescenceRestauration des

points de fluorescence

par complémentation

EpsC et EpsL sont nécessaire à la localisation d’EpsM

Co-localisation de mCherry-EpsC and GFP-EpsM?

mCherry-EpsC

GFP-EpsM

mCherry-EpsC +

GFP-EpsM

Points jaunes =

SST2 assemblé ?

Conclusion

• Localisation non polaire du SST2 mais tout au long de la membrane = artefact due à la surproduction des protéines Eps.

• Importance du respect de la stœchiométrie naturelle des éléments du SST2 pour l’observation de leur localisation.

• Technique de fusion des protéines Eps au GFP permet l’étude des interactions directement au sein du SST2.

• Relations entre les Eps mise en évidence:-EpsD est nécessaire à la localisation d’EpsC -EpsM/EpsL assurent le maintien d’EpsC à la membrane latérale-EpsD, EpsC et EpsL permettent la localisation d’EpsM

Modèle de l’assemblage du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

Modèle de l’assemblage du SST2

Modèle de l’assemblage du SST2

Modèle de l’assemblage du SST2

Modèle de l’assemblage du SST2

Merci pour votre attention