2014/7/18

1

・一般試験法（生薬の微生物限度試験法）

・参考情報G4 表3（非無菌医薬品の微生物学的品質特性のうち，

「生薬および生薬を配合した製剤の微生物許容基準値」）

変更試案について

日漢協 技術委員会 不純物試験法部会

20140716 大阪説明会 資料1

コンテンツ

20140716 大阪説明会 資料2

�概説

�試験法検討内容と結果

�試験法収載案について

2014/7/18

2

改定要望に至る経緯

20140716 大阪説明会 資料3

� 日漢協では，微生物試験関係日漢協では，微生物試験関係日漢協では，微生物試験関係日漢協では，微生物試験関係のののの現状把握の調査を現状把握の調査を現状把握の調査を現状把握の調査を行った行った行った行った

⇒防菌防黴Vol.38，No.3 pp155～165（2010）

⇒日漢協内アンケート2009年2011年（２回）

試験法改定要望の背景 １

20140716 大阪説明会 資料4

� 試験精度が低い試験精度が低い試験精度が低い試験精度が低い

�特に特定微生物試験は偽陽性，偽陰性が発生する．

� 生薬特有のバイオバーデン生薬特有のバイオバーデン生薬特有のバイオバーデン生薬特有のバイオバーデンを考慮を考慮を考慮を考慮したしたしたした（（（（夾雑菌妨害を受けにくい）方法夾雑菌妨害を受けにくい）方法夾雑菌妨害を受けにくい）方法夾雑菌妨害を受けにくい）方法へへへへ変更できないか？変更できないか？変更できないか？変更できないか？

2014/7/18

3

試験法改定要望の背景 ２

20140716 大阪説明会 資料5

� 国際調和されず国際調和されず国際調和されず国際調和されず，，，，旧態化旧態化旧態化旧態化

� 微生物限度試験法は1995年JP12追補収載

� は2001年JP14に収載

� はJP15追補1にて，国際調和法に改訂

� 現行 は旧 ベースのため，同じ微生物限度試験にもかかわらず，方法などが乖離している．

� 定義や試験内容を国際調和法である，現行定義や試験内容を国際調和法である，現行定義や試験内容を国際調和法である，現行定義や試験内容を国際調和法である，現行にににに対応させられないか？対応させられないか？対応させられないか？対応させられないか？

許容基準値の改定要望の背景

20140716 大阪説明会 資料6

� 新試験法案で実測したところ，生薬の実態と乖離し新試験法案で実測したところ，生薬の実態と乖離し新試験法案で実測したところ，生薬の実態と乖離し新試験法案で実測したところ，生薬の実態と乖離しているものがあるているものがあるているものがあるているものがある

� EPにあわせた数値へ変更できないか？

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4

20140716 大阪説明会 資料7

PIC/S対応，漢方GMP対応：

�微生物管理が必要↓

明確な試験法明確な試験法明確な試験法明確な試験法明確な試験法明確な試験法明確な試験法明確な試験法とととととととと許容基準が必要許容基準が必要許容基準が必要許容基準が必要許容基準が必要許容基準が必要許容基準が必要許容基準が必要

本日の目的

20140716 大阪説明会 資料8

� 試験法変更案をご理解いただきたいこと

� その試験法を各社にて追試等を行って，問題がないかを確認していただきたいこと

� 不具合や疑義があれば，早いうちに抽出したいこと

2014/7/18

5

試験法改定試案のポイント

20140716 大阪説明会 資料9

� 定義や試験条件等を国際調和法であるに合致させる．� 生薬特有の問題解決の為，での不都合箇所を改変．

� 生菌数試験�正確性を上げるため，培養時間を変更（延長）．

�測定に必要な添加剤（試薬）を明示．

� 特定微生物試験

�夾雑菌妨害を防ぐため，培養温度変更や新規培地（酵素基質培地）の採用．�従来，偽陽性により判定に時間を要していたものは試

験期間が短縮される．�培養装置追加設置や新規培地の習熟が必要になる．

試験法の適合性の評価を日漢協 不純物試験法部会にて実施

許容基準値改定試案のポイント

20140716 大阪説明会 資料10

� 生薬の実態に合わせる

� EP8.0 5.8.1の許容基準値へ変更する

日漢協 不純物試験法部会にて生薬菌数実態調査および過去の論文との比較試験を実施

カテゴリーカテゴリーカテゴリーカテゴリー1CFU/g又は又は又は又はCFU/mL

カテゴリーカテゴリーカテゴリーカテゴリー2CFU/g又は又は又は又はCFU/mL

ＴＡＭＣ

（現行 好気性細菌）

許容基準：107最大許容値：50,000,000

許容基準：10５最大許容値：500,000

ＴＹＭＣ（現行 真菌（カビ、酵母））

許容基準：105 （現行10４ ）最大許容値：500, 000

許容基準：10４ （現行103 ）最大許容値：50, 000

胆汁酸抵抗性グラム陰性菌（現行 腸内細菌とその他グラム陰性菌）

- 許容基準：10４（現行103 ）大腸菌 103（現行102 ） 存在しない

サルモネラ 存在しない 存在しない

2014/7/18

6

コンテンツ

20140716 大阪説明会 資料11

�概説

�試験法検討内容と結果

�試験法収載案について

1. 生菌数試験変更の検討

20140716 大阪説明会 資料12

� 培養日数の検討

� 添加剤の検討

� 抗生物質の検討

� 集落算出法の検討

↓

� 製品存在下での微生物回収試験製品存在下での微生物回収試験製品存在下での微生物回収試験製品存在下での微生物回収試験� 日本防菌防黴学会第40回 大会 (2013)

にて発表

法を適用できるか確認↓

不具合箇所の検討

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7

13

②②②②添加剤添加剤添加剤添加剤のののの必要性必要性必要性必要性供試生薬：ダイオウ

C ： クロラムフェニコール抗生物質。真菌用培地に細菌が生えて真菌計測を妨げるのを防ぐ。

RB： ローズベンガル真菌菌糸の遊走を阻止し、集落を独立化させる。特に糸状菌に有効。

TTC： 2,3,5－トリフェニル－2H－テトラゾリウム塩酸塩

集落を赤く着色させ、生薬片などと区別させる。

AB： アムホテリシンBポリエン系抗生物質（抗真菌剤）。糸状菌が細菌集落を覆うのを防ぐ。

生薬では添加剤が無いと，試験が困難になるケースがある生薬では添加剤が無いと，試験が困難になるケースがある生薬では添加剤が無いと，試験が困難になるケースがある生薬では添加剤が無いと，試験が困難になるケースがある生薬では添加剤が無いと，試験が困難になるケースがある生薬では添加剤が無いと，試験が困難になるケースがある生薬では添加剤が無いと，試験が困難になるケースがある生薬では添加剤が無いと，試験が困難になるケースがある

20140716 大阪説明会 資料

③③③③抗生物質添加の必要性

14

CFU/g

供試生薬名

高いバイオバーデンを持つ生薬の場合、高いバイオバーデンを持つ生薬の場合、高いバイオバーデンを持つ生薬の場合、高いバイオバーデンを持つ生薬の場合、TYMC（酵母とかびの総数）試験でも細菌が数多く出現して（酵母とかびの総数）試験でも細菌が数多く出現して（酵母とかびの総数）試験でも細菌が数多く出現して（酵母とかびの総数）試験でも細菌が数多く出現して菌数を大幅に多くしてしまうため、抗生物質の添加は必須である。また、生薬により細菌の抑制結果は菌数を大幅に多くしてしまうため、抗生物質の添加は必須である。また、生薬により細菌の抑制結果は菌数を大幅に多くしてしまうため、抗生物質の添加は必須である。また、生薬により細菌の抑制結果は菌数を大幅に多くしてしまうため、抗生物質の添加は必須である。また、生薬により細菌の抑制結果は一律ではないが、抗菌ｽﾍﾟｸﾄﾙの異なる抗生物質複数の添加は有効な場合が認められた。一律ではないが、抗菌ｽﾍﾟｸﾄﾙの異なる抗生物質複数の添加は有効な場合が認められた。一律ではないが、抗菌ｽﾍﾟｸﾄﾙの異なる抗生物質複数の添加は有効な場合が認められた。一律ではないが、抗菌ｽﾍﾟｸﾄﾙの異なる抗生物質複数の添加は有効な場合が認められた。

生薬の微生物試験では、抗生物質の添加は必須である生薬の微生物試験では、抗生物質の添加は必須である生薬の微生物試験では、抗生物質の添加は必須である生薬の微生物試験では、抗生物質の添加は必須である生薬の微生物試験では、抗生物質の添加は必須である生薬の微生物試験では、抗生物質の添加は必須である生薬の微生物試験では、抗生物質の添加は必須である生薬の微生物試験では、抗生物質の添加は必須である

20140716 大阪説明会 資料

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算出方法・・・4.05版TAMCは250未満、 TYMCは50未満 かつ、最も多い集落数を示す希釈度の培地を選び出す

算出方法・・・5.02版TAMCは300以下、TYMCは100以下の集落数を持つ平板から選び出す

15

④④④④集落数算出方法集落数算出方法集落数算出方法集落数算出方法についてについてについてについて

☆集落数算出方法により検出菌数が変わった検体数☆集落数算出方法により検出菌数が変わった検体数☆集落数算出方法により検出菌数が変わった検体数☆集落数算出方法により検出菌数が変わった検体数ＴＡＭＣＴＡＭＣＴＡＭＣＴＡＭＣ 0検体／検体／検体／検体／32検体中検体中検体中検体中 ＴＹＭＣＴＹＭＣＴＹＭＣＴＹＭＣ 3検体／検体／検体／検体／31検体中検体中検体中検体中

⇒集落数算出方法による菌数の大きな差異は認められなかった。集落数算出方法による菌数の大きな差異は認められなかった。集落数算出方法による菌数の大きな差異は認められなかった。集落数算出方法による菌数の大きな差異は認められなかった。⇒⇒ 4.054.05⇒⇒集落数算出方法は集落数算出方法は集落数算出方法は集落数算出方法は集落数算出方法は集落数算出方法は集落数算出方法は集落数算出方法は4.054.05版に変更しても問題ないと考察した版に変更しても問題ないと考察した版に変更しても問題ないと考察した版に変更しても問題ないと考察した版に変更しても問題ないと考察した版に変更しても問題ないと考察した版に変更しても問題ないと考察した版に変更しても問題ないと考察した

20140716 大阪説明会 資料

16

製品存在下での微生物回収【試験方法】

繁用生薬１８生薬において＜4.05＞記載の方法で標準菌株５菌種の添加回収試験を行った。

ＴＡＭＣＴＡＭＣＴＡＭＣＴＡＭＣ ： Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus

希釈度希釈度希釈度希釈度

供試生薬供試生薬供試生薬供試生薬使用した標準菌：Staphylococcus aureus ，Pseudomonas aeruginosa ，Bacillus subtilis ，Candida albicans ，Aspergillus brasiliensis

20140716 大阪説明会 資料

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製品存在下での微生物回収②

ＴＹＭＣＴＹＭＣＴＹＭＣＴＹＭＣ ： Candida Candida albicansalbicans

希釈度希釈度希釈度希釈度

供試生薬供試生薬供試生薬供試生薬

11 101033CFU/gCFU/g11××××××××101033CFU/gCFU/gの菌数が、今回設定した試験法で測定可能な最低値となっの菌数が、今回設定した試験法で測定可能な最低値となっの菌数が、今回設定した試験法で測定可能な最低値となっの菌数が、今回設定した試験法で測定可能な最低値となっの菌数が、今回設定した試験法で測定可能な最低値となっの菌数が、今回設定した試験法で測定可能な最低値となっの菌数が、今回設定した試験法で測定可能な最低値となっの菌数が、今回設定した試験法で測定可能な最低値となったたたたたたたた

→→1010倍希釈，倍希釈，倍希釈，倍希釈，倍希釈，倍希釈，倍希釈，倍希釈，100100倍希釈で回収率が倍希釈で回収率が倍希釈で回収率が倍希釈で回収率が倍希釈で回収率が倍希釈で回収率が倍希釈で回収率が倍希釈で回収率が50%50%を下回った生薬を複数認めたを下回った生薬を複数認めたを下回った生薬を複数認めたを下回った生薬を複数認めたを下回った生薬を複数認めたを下回った生薬を複数認めたを下回った生薬を複数認めたを下回った生薬を複数認めた→→TAMC/TYMCTAMC/TYMC共に共に共に共に共に共に共に共に10001000倍希釈が抗菌性が無くなる希釈段となった倍希釈が抗菌性が無くなる希釈段となった倍希釈が抗菌性が無くなる希釈段となった倍希釈が抗菌性が無くなる希釈段となった倍希釈が抗菌性が無くなる希釈段となった倍希釈が抗菌性が無くなる希釈段となった倍希釈が抗菌性が無くなる希釈段となった倍希釈が抗菌性が無くなる希釈段となった

20140716 大阪説明会 資料

生菌数試験法の比較

18

微生物限度試験微生物限度試験微生物限度試験微生物限度試験法法法法

生薬生薬生薬生薬のののの微生物微生物微生物微生物限度限度限度限度試験法試験法試験法試験法

試案試案試案試案

項目項目項目項目 培地培地培地培地培養培養培養培養日数日数日数日数

培地培地培地培地培養培養培養培養日数日数日数日数

培地培地培地培地 培養培養培養培養日数日数日数日数

好気性好気性好気性好気性細菌細菌細菌細菌

(TAMC)(TAMC)(TAMC)(TAMC)SCDASCDASCDASCDA 3333----5555日日日日 SCDASCDASCDASCDA

少なくとも少なくとも少なくとも少なくとも5555日間日間日間日間

SCDASCDASCDASCDA 5555～～～～7777日間日間日間日間

真菌真菌真菌真菌(TYMC)(TYMC)(TYMC)(TYMC)

SDASDASDASDA※※※※ 5555----7777日日日日抗生抗生抗生抗生物質物質物質物質

添加添加添加添加SDASDASDASDA

抗生抗生抗生抗生物質物質物質物質添加添加添加添加PDAPDAPDAPDA

抗生抗生抗生抗生物質物質物質物質添加添加添加添加GPAGPAGPAGPA

少なくとも少なくとも少なくとも少なくとも5555日間日間日間日間

抗生物質抗生物質抗生物質抗生物質添加添加添加添加SDASDASDASDA

5555～～～～7777日間日間日間日間

添加剤添加剤添加剤添加剤 なしなしなしなし2,3,52,3,52,3,52,3,5－トリフェニル－－トリフェニル－－トリフェニル－－トリフェニル－2222HHHH－－－－テトラゾリウムテトラゾリウムテトラゾリウムテトラゾリウム塩酸塩（塩酸塩（塩酸塩（塩酸塩（TTCTTCTTCTTC）・）・）・）・アムホテリシンアムホテリシンアムホテリシンアムホテリシンBBBB（（（（ABABABAB））））・・・・ローズベンガルローズベンガルローズベンガルローズベンガル（（（（RBRBRBRB）例示）例示）例示）例示（（（（菌数計測を妨げる場合に添加可能とする菌数計測を妨げる場合に添加可能とする菌数計測を妨げる場合に添加可能とする菌数計測を妨げる場合に添加可能とする））））

集落数算集落数算集落数算集落数算出方法出方法出方法出方法

TAMCTAMCTAMCTAMCはははは250250250250未満未満未満未満TYMCTYMCTYMCTYMCはははは50505050未満未満未満未満

細菌は細菌は細菌は細菌は300300300300以下以下以下以下真菌は真菌は真菌は真菌は100100100100以下以下以下以下

TAMCTAMCTAMCTAMCはははは250250250250未満未満未満未満TYMCTYMCTYMCTYMCはははは50505050未満未満未満未満

※※※※条件付きで抗生物質の添加可条件付きで抗生物質の添加可条件付きで抗生物質の添加可条件付きで抗生物質の添加可20140716 大阪説明会 資料

2014/7/18

10

2. 特定微生物変更の検討

20140716 大阪説明会 資料19

予備試験の結果

� 法では夾雑菌の影響により目的菌が検出できない試験があることを確認．

� EP 2.6.31の試験法でも同様

� 特に偽陰性，偽陽性の問題．

� NIHSJ法などを参考に，培養温度および酵素基質培地の条件を検討．

↓

� 特異性を高める

� 培養温度の変更

� 酵素基質培地の導入

20

NIHSJ(標準試験)法とは（NIHSJ-MMEF: National Institute of Health Sciences Japan- The Methods for the Microbiological Examination of Foods）

• 食品微生物分野の専門家からなる“食品からの微生物標準試験法検討委員会”の議論により整備された，ISO法と科学的根拠のある妥当性確認を行った微生物試験法．

→http://www.nihs.go.jp/fhm/mmef/index.html

20140716 大阪説明会 資料 20

2014/7/18

11

21

酵素基質培地とは？

• 目的菌の集落を，培地に含まれる酵素基質の分解等による着色等で鑑別できる培地．

• 特異性が高いことが特徴．

• 水道水の水質基準，上水試験法， NIHSJ法等に収載されている．

20140716 大阪説明会 資料 21

22

法での夾雑菌による偽陰性の例（大腸菌：生薬カンゾウ ）

20140716 大阪説明会 資料

22

生薬由来の夾雑菌集落に埋もれ，大腸菌の赤レンガ色集落が検出で

きない

大腸菌+生薬 生薬のみ

陽性対照

2014/7/18

12

23

陽性対照

生薬のみサルモネラ+生薬

法での夾雑菌による偽陰性の例（サルモネラ：生薬カンゾウ ）

20140716 大阪説明会 資料

23

生薬由来の夾雑菌集落に埋もれ，サルモネラの黒色集落が検出でき

ない

24

大腸菌試験（案）のフロー（例）

20140716 大阪説明会 資料 24

試料1ｇ（以上）

SCDB

9mL（以上）

10倍希釈液

SCDB

90mL

100倍希釈液

10mL

Mac

10mL

1mL増菌培養30-35℃

選択増菌培養44±0.5℃

（では42-44℃）

マッコンキーカンテン 酵素基質培地or

周囲に赤みがかった沈降線の帯を持つ赤レンガ色の集落が検出された場合陽性と判定し，同定試験により確認する．

2014/7/18

13

25

比較試験結果例

• 試験菌種：大腸菌

• 使用生薬：ニンジン

• 検証方法： 2.4記載 試験法の適合性

20140716 大阪説明会 資料 25

26

MacA 陽性対照 大腸菌＋生薬 生薬のみ＜＜＜＜4.054.054.054.05＞＞＞＞条件条件条件条件

増菌 30～35℃

選択増菌選択増菌選択増菌選択増菌 42424242～～～～44444444℃℃℃℃

試案試案試案試案条件条件条件条件

増菌 30～35℃

選択増菌選択増菌選択増菌選択増菌44444444±±±±0.50.50.50.5℃℃℃℃

偽偽偽偽陽性陽性陽性陽性

偽偽偽偽陽性陽性陽性陽性判別困難判別困難判別困難判別困難

マッコンキー培地では，選択性が低いため，偽陽性が出て，大腸菌の存在の判定が困

難である陽性陽性陽性陽性

20140716 大阪説明会 資料 26

生薬の夾雑菌を含めて赤色発色集落となり，偽陽性となっ

ている

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14

27

EMB 陽性対照 大腸菌＋生薬 生薬のみ

＜＜＜＜4.054.054.054.05＞＞＞＞条件条件条件条件

増菌 30～35℃

選択増菌 42～44℃

試案試案試案試案条件条件条件条件

増菌選択 30～35℃

選択増菌44±0.5℃

光沢なし光沢なし光沢なし光沢なし

光沢あり光沢あり光沢あり光沢あり 陽性陽性陽性陽性

EMB培地では，夾雑菌により偽陰性となってしまう

20140716 大阪説明会 資料 27

大腸菌特有の金属光沢集落

が確認できない

夾雑菌である白色集落が占有夾雑菌

である白色集落が優

勢

28

酵素基質培地例陽性対照 大腸菌＋生薬 生薬のみ

＜＜＜＜4.054.054.054.05＞＞＞＞条件条件条件条件

増菌 30～35℃

選択増菌 42～44℃

試案条件

増菌 30～35℃

選択増菌44±0.5℃

酵素基質培地では，選択性が高いため，夾雑菌の影響もなく判定が

可能である

20140716 大阪説明会 資料 28

夾雑菌である黄色集落が優勢だが，大腸菌の青色集落も確認で

きる

大腸菌の青色集落が優勢

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15

29

＜＜＜＜4.054.054.054.05＞＞＞＞条件条件条件条件

増菌 30～35℃

選択増菌 42～44℃

試案条件試案条件試案条件試案条件

増菌選択 30～35℃

選択増菌44±0.5℃

陽性対照 ECO＋生薬 生薬のみ

陰性・発光陰性・発光陰性・発光陰性・発光なしなしなしなし

酵素基質培地例

20140716 大阪説明会 資料 29

30

スコア化：検体数を分母，判定良好と判定可能区の数の和を分子

20140716 大阪説明会 資料 30

MacAをみると，選択増菌温度が高いほうが良い 酵素基質培地では結果バラつきあり

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

スコ

アス

コア

スコ

アス

コア

培地培地培地培地

判定スコアでの比較判定スコアでの比較判定スコアでの比較判定スコアでの比較

＜4.05＞条件

試案条件選択選択選択選択増菌増菌増菌増菌温度温度温度温度43℃℃℃℃

選択選択選択選択増菌増菌増菌増菌温度温度温度温度44℃℃℃℃

2014/7/18

16

31

サルモネラ試験（案）のフロー

20140716 大阪説明会 資料 31

試料10ｇ

SCDB

90mL

10倍希釈液

ＲＶＳ10mL

1mL

増菌培養30-35℃

選択増菌培養42±0.5℃

（では30-35℃）

ＸＬＤカンテン培地 酵素基質培地or

32

比較試験結果例

• 試験菌種：サルモネラ

• 使用生薬：ニンジン

• 検証方法： 2.4記載 試験法の適合性

20140716 大阪説明会 資料 32

2014/7/18

17

33

XLDA

陽性対照

サルモネラ＋生薬 生薬のみ

＜＜＜＜4.054.054.054.05＞＞＞＞

増菌 30～35℃

選択増菌選択増菌選択増菌選択増菌 30303030～～～～35353535℃℃℃℃

試案条件

増菌 30～35℃

選択増菌選択増菌選択増菌選択増菌 42424242±±±±0.50.50.50.5℃℃℃℃

陰性陰性陰性陰性

陽性陽性陽性陽性

選択性が低いために夾雑菌が増殖し，サルモネラ判定が困難である

選択増菌温度による選択性を高めたため，夾雑菌が少なく，サルモネラ判定が可能である

20140716 大阪説明会 資料 33

サルモネラの黒色集落が確認できる

夾雑菌優勢でサルモネラの黒色集落は確認で

きず

培養温度での抑制により夾雑菌は少

ない

34

陽性対照

酵素基質A

サルモネラ＋生薬 生薬のみ

＜＜＜＜4.054.054.054.05＞＞＞＞

増菌 30～35℃

選択増菌 30～35℃

試案条件

増菌 30～35℃

選択増菌 42±0.5℃

陽性陽性陽性陽性

陰性陰性陰性陰性

選択性が高い酵素基質培地でもため，サルモネラ

判定が困難

温度による選択性向上との相乗効果で，サルモネラ判定が容易

である

20140716 大阪説明会 資料 34

サルモネラの赤色集落が確認できる

2014/7/18

18

35

陽性対照

酵素基質ＢSEN＋生薬 生薬のみ

＜＜＜＜4.054.054.054.05＞＞＞＞

増菌 30～35℃

選択増菌 30～35℃

試案条件試案条件試案条件試案条件

増菌 30～35℃

選択増菌 42±0.5℃

陽性陽性陽性陽性

陽性陽性陽性陽性

20140716 大阪説明会 資料 35

ほぼ，サルモネラの黒色集落の

み

サルモネラの黒色集落と夾雑菌の緑色集落が確認できる

36

コンテンツ

20140716 大阪説明会 資料 36

• 概説

• 試験法検討内容と結果

• 試験法収載案について

2014/7/18

19

37

生菌数試験法（案）のフロー（カンテン平板法にて例示）

20140716 大阪説明会 資料

試料

リン酸緩衝液pH7.2，

ペプトン食塩緩衝液pH7.0又は

使用する液体培地

段階希釈 段階希釈 段階希釈 段階希釈

適切に菌数測定が出来るまで適宜段階希

釈を行う

TAMC

TYMC

TAMCTAMCTAMCTAMC：30～35℃5555----7777日間培養日間培養日間培養日間培養

TTTTＹＹＹＹMCMCMCMC：20～25℃5555----7777日間培養日間培養日間培養日間培養

37

3820140716 大阪説明会 資料

試料

段階希釈

段階希釈

段階希釈

段階希釈

適切に菌数測定が出来るまで適宜段階希釈を行

う

TAMC

TYMC

TAMCTAMCTAMCTAMC：30～35℃5555----7777日間培養日間培養日間培養日間培養

TTTTＹＹＹＹMCMCMCMC：20～25℃5555----7777日間培養日間培養日間培養日間培養

ソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地を使用して測定される集落数を総好気性微生物数（TAMC)とする． この培地上に真菌の集落が検出されても，TAMCとして測定する．

抗生物質添加サブロー・ブドウ糖カンテン培地を使用して測定される集落数を総真菌数（TYMC)とする．この培地上に細菌の集落が検出されても，TYMCとして測定する．TAMCは250未満、 TYMCは50未満 かつ、最も多い集落数を示す希釈度の培地を選び出す

TAMCはソイビーン・カゼイ

ン・ダイジェストカンテン培地15-20mLで混釈する．

TYMCは抗生物質添加ササササ

ブロー・ブドウ糖カンテン培ブロー・ブドウ糖カンテン培ブロー・ブドウ糖カンテン培ブロー・ブドウ糖カンテン培地地地地15-20mLで混釈する．添加剤添加剤添加剤添加剤の使用がの使用がの使用がの使用が可能可能可能可能

ソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地

⇒ＴＴＣ試液、アムホテリシンＢ

抗生物質添加サブロー・ブドウ糖カンテン培地⇒ローズベンガル試液

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１．大腸菌試験案

3920140716 大阪説明会 資料

特徴特徴特徴特徴選択増菌温度に選択増菌温度に選択増菌温度に選択増菌温度にNIHSJ法条件を採用法条件を採用法条件を採用法条件を採用

選択培地に酵素基質培地を併用選択培地に酵素基質培地を併用選択培地に酵素基質培地を併用選択培地に酵素基質培地を併用

増菌増菌増菌増菌

培地 SCDB

温度 (℃) 30-35

時間 (h) 18-24

選択増選択増選択増選択増菌菌菌菌培地 MacB※

温度 (℃) 44±0.5（＜4.05＞では42-44）時間 (h) 24-48

選択培養選択培養選択培養選択培養培地

MacA

酵素基質培地の追加

※※：増菌培養液：増菌培養液1mL1mLををMacB10mLMacB10mLに入れるに入れる

40

大腸菌試験法（案）のフロー

20140716 大阪説明会 資料

試料1ｇ（以上）

SCDB

9mL（以上）

10倍希釈液

SCDB

90mL

100倍希釈液

10mL

Mac

10mL

1mL増菌培養30-35℃

選択増菌培養44±0.5℃

マッコンキーカンテン培地 酵素基質培地or

周囲に赤みがかった沈降線の帯を持つ赤レンガ色の集落が検出された場合陽性と判定し，同定試験により確認する．

18～24時間培養24～48時間培養

30～35℃で18～72時間培養

生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率は一例であるは一例であるは一例であるは一例である

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２．サルモネラ試験案

4120140716 大阪説明会 資料

特徴特徴特徴特徴選択増菌温度に選択増菌温度に選択増菌温度に選択増菌温度にNIHSJ法条件を採用法条件を採用法条件を採用法条件を採用

選択培地に酵素基質培地を併用選択培地に酵素基質培地を併用選択培地に酵素基質培地を併用選択培地に酵素基質培地を併用

増菌増菌増菌増菌

培地 SCDB

温度 (℃) 30-35

時間 (h) 18-24

選択増選択増選択増選択増菌菌菌菌

培地 RVS

温度 (℃) 42±0.5（＜4.05＞では30-35）時間 (h) 18-24

選択培養選択培養選択培養選択培養培地

XLDA

酵素基質培地の追加

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サルモネラ試験法（案）のフロー

20140716 大阪説明会 資料

試料10ｇ

SCDB

90mL

10倍希釈液

ＲＶＳ10mL

0.1mL

増菌培養30-35℃

選択増菌培養42±0.5℃

ＸＬＤカンテン培地 酵素基質培地

or

18～24時間培養

18～24時間培養

18～48時間培養

生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率は一例であるは一例であるは一例であるは一例である

中心部の黒点の有無に関わらず十分に発育した赤色集落が認められた場合，陽性を疑い同定試験により確認する．

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３．大腸菌の定量試験案–大腸菌の定性試験と同じ条件

–現行＜5.02＞法のMPN 3MPN 3本法から，本法から，EP8.0EP8.0のの2.6.312.6.31ののMPN 1MPN 1本法本法に変更．

20140716 大阪説明会 資料 43

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大腸菌定量試験（案）のフロー

20140716 大阪説明会 資料

試料1ｇ（以上）

SCDB

9mL(以上）

10倍希釈液

SCDB

試料0.1ｇ相当

Mac

10mL

1mL

増菌培養30-35℃

選択増菌培養44±0.5℃

マッコンキーカンテン培地

酵素基質培地酵素基質培地酵素基質培地酵素基質培地

or

SCDB

試料0.01ｇ相当

SCDB

試料0.001ｇ相当

Mac

10mL

Mac

10mL

1mL 1mL

周囲に赤みがかった沈降線の帯を持つ赤レンガ色の集落が検出された場合陽性と判定し，同定試験により確認する．

30～35℃で18～72時間培養

生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率は一例であるは一例であるは一例であるは一例である

18～24時間

24～48時間

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最確数表

20140716 大阪説明会 資料 45

製品の各量に対する結果製品の各量に対する結果製品の各量に対する結果製品の各量に対する結果 製品製品製品製品 1 g又は又は又は又は 1 mL当たりの推当たりの推当たりの推当たりの推

定数定数定数定数 0.1 g又は又は又は又は 0.1 mL 0.01 g又は又は又は又は 0.01 mL 0.001 g又は又は又は又は 0.001 mL

+ + + 103より大きいより大きいより大きいより大きい

+ + - 103より小さく、より小さく、より小さく、より小さく、102より大きいより大きいより大きいより大きい

+ - - 102より小さく、より小さく、より小さく、より小さく、10より大きいより大きいより大きいより大きい

- - - 10より小さいより小さいより小さいより小さい

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４．胆汁酸抵抗性グラム陰性菌試験案

–＜4.05＞法に変更．

–現行＜5.02＞法とは試料液調製法，使用培地，試料液調製法，使用培地，培養時間培養時間等が異なる．

–増菌培養前に損傷菌対応のための「蘇生培養「蘇生培養」」が入る．

20140716 大阪説明会 資料 46

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胆汁酸抵抗性グラム陰性菌試験法（案）のフロー

20140716 大阪説明会 資料

試料1ｇ（以上） SCDB

9mL(以上）

10倍希釈液

SCDB

試料0.1ｇ相当

モーゼル

選択増菌培養30-35℃℃℃℃

ＶＲＢカンテン

SCDB

試料0.01ｇ相当

SCDB

試料0.001ｇ相当

モーゼル

モーゼル

SCDB

試料0.0001ｇ

相当

モーゼル

菌を蘇生させるため菌を蘇生させるため菌を蘇生させるため菌を蘇生させるためにににに20～～～～25℃℃℃℃でででで培培培培養養養養．(通例2時間であり，5時間を超えないこと)

連続の三段階を選択

集落の発育が認められた場合は，陽性と判定

30～35℃24～48時間

30～～～～35℃℃℃℃ 18～24時間

生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率生薬量，希釈倍率は一例であるは一例であるは一例であるは一例である

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最確数表

EP8.0＜2.6.31-2＞より引用 各試料溶液における結果

0.1g 0.01g 0.001g 0.0001g

+ + + + 104より大きい

+ + + - 104より小さく，103より大きい

+ + - - 103より小さく， 102より大きい

+ - - - 102より小さく，10より大きい

- - - - 10より小さい

20140716 大阪説明会 資料 48

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現行より増える可能性のあるもの

• 装置の例

–サルモネラ選択増菌培養に使用する培養器

• 恒温水槽（42±0.5℃）

–酵素基質培地培養に使用する培養器

• インキュベーター（35-37℃ 37℃など）

• 培地

–酵素基質培地

20140716 大阪説明会 資料 49

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標準菌株について

• シードロット，培地性能，試験法の検証等を含めて，と同様のスキーム

• 標準菌の使用機会が増えると予測する

• 「標準化された安定な懸濁液」等（ex.BioBall，EZ-CFU等）での対応も可能

20140716 大阪説明会 資料 50

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今後の予定

20140716 大阪説明会 資料 51

• 局方関係

–改訂案のB委員会への上程（6/25）

– B委員会での審議（8月）

– B委員会での決定（10月）

–パブコメ発出（12月）

• 公表予定について

–特定微生物試験検討の報告（防菌防黴学会）

–生菌数試験の報告（生薬学雑誌，生薬学会）

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ご清聴ありがとうございましたご清聴ありがとうございましたご清聴ありがとうございましたご清聴ありがとうございました

20140716 大阪説明会 資料

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生菌数試験（案）のポイント

（カンテン平板法にて例示）

• TAMCはソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地を使用し，30～35℃で5～7日間培養する．

• TYMCは抗生物質添加サブロー・ブドウ糖カンテン培地を使用し，20～25℃で5～7日間培養する．

• 集落数がTAMCでは250未満，TYMCでは50未満で，かつ最も多い集落数を示す希釈度のカンテン培地を選び出し，培地ごとに菌数の算術平均をとり，製品1g又は1mL当たりの集落数を算出する．

• ソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地には試料中に混在する生薬の組織片などへの対応や真菌の増殖をできるだけ抑制する目的から，好気性細菌染色色素TTC試液や抗真菌剤アムホテリシンB試液を培地に添加することができる．TTC試液及びアムホテリシンB試液は，滅菌したカンテン培地へ使用直前に1L当たりTTC試液2.5～5mL，アムホテリシンB試液2mLを添加し，混和する

• 抗生物質添加サブロー・ブドウ糖カンテン培地において，かびがカンテン培地上に拡散する場合は，ローズベンガル試液を培地に添加することができる．ローズベンガル試液は，カンテン培地1L当たり5mLを添加し，混和後，高圧蒸気滅菌する．

• 夾雑菌の妨害などの事象で測定が困難な場合，定められた培養日数以前の計測値を採用してもよい．

20140716 大阪説明会 資料 53

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大腸菌試験法（案）のポイント

• 試料を1g以上採り，調製した10倍希釈液の10mL，あるいは1g又は1mL相当量を適切な量のソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地に接種し，混合後，30～35℃で18～24時間培養する．

• 培養したソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地の1mLをマッコンキー液体培地10mLに接種する．44±0.5℃で24～48時間培養後する．マッコンキーカンテン培地に移植し，30～35℃で18～72時間培養する．

マッコンキーカンテン培地にかえて，適当な酵素基質培地を用いることができる．この際，培養条件はその培地に求められるもので実施する．

• マッコンキーカンテン培地の場合は周囲に赤みがかかった沈降線の帯を持つ赤レンガ色の集落の発育が認められた場合，酵素基質培地では大腸菌に該当する性状を示す集落が認められた場合，陽性を疑い，同定試験により確認する．

20140716 大阪説明会 資料 54

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サルモネラ試験法(案)のポイント

• 試料を10g又は10mL採り，適量のソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地に接種し，混合後，30～35℃で18～24時間培養する．

• ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地0.1mLをラパポート・バシリアジス・サルモネラ増菌液体培地10mLに接種する．

• 42±0.5℃で18～24時間培養後，XLDカンテン培地に移植し，30～35℃で18～48時間培養する．XLDカンテン培地にかえて，適当な酵素基質培地を用いることができる．この際，培養条件はその培地に求められるもので実施する．

• XLDカンテン培地で（中心部の黒点の有無に関わらず）十分に発育した赤色集落

が認められた場合，酵素基質培地ではサルモネラに該当する性状を示す集落が認められた場合は，陽性を疑い同定試験により確認する．

20140716 大阪説明会 資料 55

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大腸菌の定量試験法(案)のポイント

• 調製した10倍希釈液よりそれぞれ被験製品の0.1g，0.01g，0.001g(又は0.1mL，0.01mL，0.001mL)相当量を，適切な量のソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地に接種し，混合後，30～35℃で18～24時間培養する．

• 容器を振り，ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地の1mLをマッコンキー液体培地10mLに接種する．44±0.5℃で24～48時間培養後，マッコンキーカンテン培地に移植し，30～35℃で18～72時間培養する．マッコンキーカンテン培地にかえて，適当な

酵素基質培地を用いることができる．この際培養条件はその培地に求められるもので実施する．

• マッコンキーカンテン培地の場合，周囲に赤みがかかった沈降線の帯を持つ赤レンガ色の集落の発育が認められた場合，酵素基質培地では大腸菌に該当する性状を示す集落が認められた場合は，陽性を疑い同定試験により確認する．

• 最確数表から大腸菌の推定数を求める．

20140716 大阪説明会 資料 56

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胆汁酸抵抗性グラム陰性菌試験法（案）のポイント

• 試料を1g以上採り，その10倍希釈液を調製する．希釈液としてはソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地を用いる．

• 混合後，菌を蘇生させるために20～25℃で培養する．ただし，増菌を促すほどの時間であってはならない(通例2時間であり，5時間を超えないこと)．

• 上記調製液とその希釈液（それぞれ 試料0.1g，0.01g，0.001g,0.0001g)相当量を含む4濃度中，（目標とする許容限度に応じて）連続する3濃度の希釈液を適量のモーゼル腸内細菌増菌ブイヨン培地に接種する．30～35℃で24～48時間培養後，バイオレット・レッド・胆汁酸・ブドウ糖カンテン培地に各培養液を移植し，30～35℃で18～24時間培養する．

• 集落の発育が認められた場合は，陽性と判定する．最確数表から胆汁酸抵抗性グラム陰性菌の推定数を求める．

20140716 大阪説明会 資料 57