枸杞 LycE 基因的克隆及功能验证 报告人：刁进进

导 师：季静 教授 王罡 教授

研究背景 类胡萝卜素是动物生长发育过程中得必要物质，植物能自身合成，但动物必须从食物中获取。不同类胡萝卜素的生物学功能也不相同， β- 胡萝卜素与含有 β- 环的胡萝卜素（如 - 胡萝卜素、 - 隐黄质和 - 胡萝卜素）是动物和人体内维生素 A 的合成前体物质，维生素 A 对机体的生长发育和新陈代谢有重要的作用，使机体保持着健康的状态。维生素 A 缺乏（ VAD ）是全球性公共卫生，在很多的非洲国家非常严重，主要是由于主食如玉米、水稻和小麦中的维生素 A 原的含量非常低，目前全球有78 个国家存在着维生素 A 缺乏的公共卫生问题，共计人数超过 2.5 亿人，VAD 病患者免疫系统薄弱，常伴有夜盲症、角膜瘢痕等疾病，大大增加了婴儿的传染病发病率和死亡率，加重病情，每年约有 100 万儿童的死亡是由 VAD 引起，学龄前儿童和孕妇是 VAD 的高危人群。 基于这样的现状，如果我们能克隆类胡萝卜代谢途径中的关键酶基因，并把这些基因转入到玉米或者水稻等作物中，使之在作物中过量表达，从而直接提高类胡萝素含量，使人们远离 VAD 的困扰。

类胡萝卜代谢途径

前沿 类胡萝卜素是 C40 的碳氢化合物，广泛存在于植物、一些光合细菌以及藻类中的脂溶性色素，主要包括胡萝卜素（ carotenes ）和它们的氧化衍生物叶黄素（ xanthophylls ）两大类。类胡萝卜素在植物光合作用中起着至关重要的作用，它们是光合天线和光反应中心复合体不可缺少的结构成分，还可以保护叶绿素免受强光导致的光氧化破坏。类胡萝卜素是维生素 A 的前体，具有增强免疫、抗氧化、增进细胞缝间联接交流、预防、延缓及治疗癌症的功能。 Aluru 等将细菌 crtB （ pds）和 crtI 基因串联在一起，在玉米胚乳中特异性表达，胚乳中类胡萝卜素含量提高 34倍，并积累了大量的维生素 A 的前体： β-胡萝卜素。 番茄红素的环化反应是是植物体内胡萝卜素生物合成途径重要的分支点。番茄红素 ε- 环化酶 (Lycopene ε-cyclase, LycE) ，能催化番茄红素的一端形成 δ- 环，生成 δ- 胡萝卜素。 随着人类对类胡萝卜素药用价值及医疗保健作用的不断发现，对类胡萝卜素的种类和产量的需求也将越来越大，然而，类胡萝卜素很难用化学方法合成。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶的基因被陆续分离鉴定，为通过 DNA 重组技术和遗传工程调控生产类胡萝卜素开辟了道路，特别是通过类胡萝卜素基因工程获得“金色水稻”和“金油菜”，极大地增强了人们开展植物类胡萝卜素基因工程的信心。

类胡萝素代谢途径研究进展上游基因研究进展：

下游基因研究进展 类胡萝卜素合成代谢的下游主要指 - 胡萝卜素和 - 胡萝卜素的代谢，主要的酶是一系列羟化酶和氧化酶。 对下游基因单独研究非常少，基本集中在多基因的研究上。将土豆中bch 基因沉默，发现总的类胡萝卜素含量减少，但 - 胡萝卜素含量却增加。 2010 年， Ji 等将羟化酶基因 CYP97A ， CYP97B ， CYP97C 和AtB1 ，与酮化酶基因 bkt1 基因转入到拟南芥中，设计实验，首先分别单独将 4 个基因转入到拟南芥中，鉴定基因的功能，然后 btk1 基因分别于每个羟化酶基因共同转化到拟南芥中，分析实验结果。他们的研究，证明 CYP97B 是 - 胡萝卜素环的羟化酶，过量表达羟化酶基因和酮化酶基因并不能使植物体内积累含有酮基的类胡萝卜素，而植物体内的 -胡萝卜素衍生物的含量提高，同时 - 胡萝卜素含量减少。这可能是因为酮化酶和羟化酶共同作用时，影响着它们进入不同的代谢途径。

本研究的目的和意义

实验技术路线

实验结果• 枸杞总 RNA 的提取

cDNA 的合成

Box Shadow

Boxshade 分析

进化树

蛋白质三维结构

携带目的基因的克隆载体pMD18-T-LcLYCE 的构建

推测氨基酸序列

LcLYCE 基因编码的蛋白特性• 枸杞 LcLYCE 基因的 cDNA 全长 1847bp ，包含一个 1569bp 的开放阅读框，编码

523 个氨基酸，其基因编码蛋白的分子式为： C2632H4135N699O751S29 。预测蛋白的分子量和等电点分别为 58.52kDa 和 7.783 。氨基酸组成分析表明，该蛋白亮氨酸含量最高， 56 个亮氨酸占总氨基酸的 10.7% 。由 523 个氨基酸组成的多肽链包含58 个强碱性氨基酸， 56 个强酸性氨基酸， 195 个疏水性氨基酸和 125 个极性氨基酸。信号肽预测表明， LcLYCE蛋白的氨基端存在 44 个氨基酸的信号肽。通过细胞定位分析软件可知，该蛋白大部分为膜蛋白，少部分存在于叶绿体中。

• 通过 PredictProtein预测蛋白二级的结构，结果显示，无规则卷曲占 LcLYCE蛋白二级结构的 46.85% ， α-螺旋占 36.9% ，延伸链占 16.25% 。多序列比对显示，该蛋白的大部分氨基酸序列在植物中高度保守• 与 NCBI 数据库中已报道的其它物种 LYCE蛋白序列进行 BLASTP 分析显示，• LcLYCE蛋白的氨基酸序列与烟草 NtLYCE氨基酸有 94% 的同源性，与马铃薯 St

LYCE氨基酸有 93% 的相似性，与番茄 SlLYCE氨基酸有 92% 的相似性，与葡萄VvLYCE氨基酸序列有 77% 的同源性，与拟南芥 AtLYCE氨基酸有 72% 的同源性。由系统发生树可知， LYCE蛋白与烟草，番茄等茄科植物属于公共的发生簇，有最近的进化关系

大肠杆菌表达载体 pET-28a-LcLYCE的构建

SDS-PAGE

颜色互补

烟草表达载体 pCAMBIA2300-LYCE

烟草转基因

转基因烟草的检测

半定量

Southern杂交

在烟草中的表达结果

RT-PCR