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微滴式数字 PCR 技术
原理及应用
分析测试中心乔志仙
2020.07.18
报告内容
一、基因组技术平台情况简介
二、微滴式数字PCR技术的原理
三、微滴式数字PCR实验设计
四、微滴式数字PCR技术的应用
报告内容
一、基因组技术平台情况简介
高通量DNA测序仪 Miseq 长片段高通量测序系统
核酸提取--建库--测序--数据分析全流程配套基因组技术服务
生物分析仪DNA剪切仪
Nextseq500高通量测序系统
基因组技术平台情况简介
核酸片段回收仪 脉冲场电泳系统
基因组组装分析仪 Qubit荧光计
微生物多样性检测分析
解析样本中的物种多样性、进化关系、功能多样性及微生物与环境/宿主之间的关系。
测序区域：16S/18S rRNA 及ITS
测序读长:���2x250bp /2x300bp
测序数据量： 15M/25M
C1单细胞自动制备系统 10X Genomics 全基因组解码系统
实现单细胞分选/富集稀有/大量--全长/3’--测序--数据分析
全流程配套单细胞测序技术服务
基因组技术平台情况简介
细胞和组织采集系统
低通量
细胞数量：<100个建库策略：Smart-seq2
中通量
细胞数量：<1000个建库策略：Smart-seq2
高通量
细胞数量：> 1 x 105个建库策略：3’端
Roche定量PCR仪 微滴式数字PCR仪
全自动核酸纯化系统
MassARRAY核酸质谱分析系统
基因组技术平台情况简介
多重基因表达分析系统移液工作站
核酸提取--绝对定量—多重表达—SNP/甲基化完整核酸定量分析技术服务
报告内容
二、微滴式数字PCR技术的原理
PCR技术的发展历史
有限稀释法和阳性微滴数荧光信号和CT值产物大小和浓度
qPCR技术原理
RT-PCR技术因其快速、简易和经济的特点，目前仍被广泛地使用。
影响qPCR扩增效率的因素有很多，导致其定量分析的基础——循环阈值(�Ct)�不是恒定不变的。qPCR 的定量只是“相对定量”。
qPCR在目的序列含量低、表达量差异十分微小、反应体系中含大量背景序列或抑制物等情况下，灵敏度和精确度都受到很大限制。
qPCR技术局限性
数字PCR概念的起源
数字PCR技术原理
数字PCR 是将含有DNA�模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并发生扩增反应，并根据泊松分布和阳性微滴比例来实现核酸分子的绝对定量。
绝对定量与泊松分布
灵敏度高
一个反应分成数万个独立的PCR 反应，精确地检测到很小的目的片段的差异、单拷贝甚至是低浓度混杂样品，且能避免非同源异质双链的形成。
高度重复性
有限稀释 终点PCR 泊松统计
细胞数当量和拷贝数线性关系
y = 67.052x - 4.9764
R² = 0.9998
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 2 4 6 8 10 12
copy
num
ber p
er re
actio
n
Cell Equivalents per Reaction
cell lysate gene copy number detection by ddPCR
数字PCR的优势
简化的绝对定量，无需标准品和标准曲线
（DNA/mRNA/miRNA/LncRNA）
更高的检测灵敏度（提升高丰度野生型背景下的<0.1%突变检出率）
更高的数据精密度（能识别1.1倍以内的浓度变化）
更好的数据重复性（对靶标核酸含量的连续监测、横向比较）
提高对抑制物的耐受度（克服抑制物对定量结果的干扰）
更宽的动态范围，对PCR效率的变化不敏感
报告内容
三、微滴式数字PCR实验设计
微滴式数字PCR系统
微滴读取油
微滴发生油 预混液
反应板和封膜
微滴式数字PCR实验流程
均一的微滴——微流
控技术产生“油包水”微滴
微滴生成
微滴分析-荧光检测
流式技术，逐一检测每个微滴
的荧光信号
自动定量DNA和RNA的浓度
（copies/ul）
无需添加参比染料校正
软件分析结果
样品制备
样品浓度不能太高，一般要求荧光定量cq>23，(1~100000)
20µl反应体系，最大上样量9µl，灵敏度更高
样品为环状质粒，做单酶切成线性。环状质粒有超螺旋结构，微滴体积很少，难以形成完整的微滴
染料法的引物终浓度100-200nM，探针法引物和探针终浓度450nM和250nM
mix比较黏稠，可以涡漩离心混匀，不能用手弹管壁
微滴发生卡中，先加配置的样品体系，再加微滴生成油（微滴生成油比较重，提前加进去，会自动渗透到管路中，影响微滴的生成）
加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°，在转移样品至微滴发生卡中时，要避免气泡产生）
转移微滴时，可以多次转移，保证把生成的微滴全部转移出来（一般<40ul，大约在35-40ul）
在实验时，一般会选择清洗一次管路（第一个孔中不要加样，让仪器读一个空孔，来清洗一次管路；否则第一个孔的读值会变小）
微滴制备
反应条件
探针法扩增程序
染料法扩增程序
常见问题
阳性微滴数与阴性微滴区分度不明显，通过调整
引物的浓度和退火温度优化反应条件，
微滴数量少于10000，需要注意操作细节
数字PCR专用的mix，热封膜和反应板
检测时间：96�sample/3h
没有阴性微滴，考虑样本浓度偏高
报告内容
四、微滴式数字PCR技术的应用
主要应用
拷贝数变异分析
武汉大学病毒学国家重点实验室蓝柯教授团队对医院及公共环境等采样点，进行气溶胶样品采集，并利用微滴式数字PCR技术，定量分析了各采样点样品的新冠病毒气溶胶载量。
当时严格防控的条件下，两所医院和公共环境总体是安全的。医院和公共环境各采样点的新冠病毒载量（拷贝数/立方米空
气）
新冠病毒气溶胶的绝对定量
基因拷贝数变异
发现埃及伊蚊的性别决定因子Nix基因，采用ddPCR确定基因的拷贝数雄性单拷贝，雌性没有。
CNV需要极高的定量精度以区别不同拷贝数之间的微小差异，ddPCR能测量1.2倍基因拷贝数的差异。
采用ddPCR方法，检测Nix基因敲除后雌性分化相关因子dsx和fru的表达水平 。
结果显示：dsx和fru的表达水平分别变化了0.47和1.44倍。
微小基因表达差异分析
稀有突变检测
稀有突变检测使我们能够对肿瘤等疾病的存在、发病过程及愈后作出准确判断。
检测到极其稀少的DNMT3a基因突变，该基因突变导致造血干细胞异常生长，产生白血病前干细胞。
利用微滴式数字PCR技术可以实现低至单个拷贝、含量0.001%的突变分子的检测。
痕量DNA的高灵敏检测
出生时为HIV�阳性，进行抗病毒治疗后，29天后即无法通过常规检测手段检测到HIV，24，26月龄时，采用ddPCR技术对该名婴儿HIV�DNA进行检测，灵敏度高达0.0004%。
单细胞线粒体DNA拷贝数
线粒体DNA（mtDNA）在每个细胞中有数百到数千个拷贝。mtDNA拷贝数在衰老和疾病进程中也会发生明显变化，因此也可以作为生物标志物。
液滴数字线粒体DNA测量（ddMDM），一种高灵敏度的ddPCR方法，不仅可以测量细胞群体的mtDNA拷贝数，而且可以测量单个细胞的mtDNA拷贝数。
BioMarker的筛选及验证
exRNA、miRNA在体液、外泌体中的含量极低，与基因变异与疾病症状相关联，可以作为液体活检的BioMarker。
微滴式数字PCR技术检测单细胞中的mRNA水平，开发了Digital�PLA技术，检测了单细胞中的目标蛋白质的表达水平。
单细胞mRNA和蛋白质检测
miRNA定量差异分析
ddPCR分析miRNA差异变化更灵敏、准确，重复性更好
qPCR线性范围更宽，耗时更短，成本更低，适合初筛；
ddPCR重复性更好，更耐受PCR抑制物以及多重反应的竞争抑制，检测水华样本的准确度和精确度更高。
水华蓝藻检测
微生物检测
检测更准确、快速，且能对病原菌进行动态的定量分析。
生长的不同时期对菌群无明显影响，但不同种植周期的果园有明显差异，时期久的菌更多。
eDNA预测种群状态
中华鲟
0
5000
10000
15000
20000
Total Events Positive Events
1. 所有样品平均微滴数为15214个，所
有反应的微滴生成正常。
2. 样品阳性反应峰与阴性反应峰明显分
开，双峰明显暗示了数字PCR仪有效地
区分了阳性微滴和阴性微滴，表明在目
的江段的所有采样点均可以有效的监测
到濒危物种中华鲟的存在。
eDNA是指在环境样品中所有被发现的不同生物的基因组DNA的混合。
Control
Upper whisker 168.00
3rd quartile 122.00
Median 90.00
1st quartile 64.00
Lower whisker 52.00
Nr. of data points 39.00
Mean 93.85
SD 32.80
单细胞靶基因拷贝数
四膜虫
G1 G2
G1期单细胞和G2期单细胞基因拷贝数。G1期理论值4�copies，G2期理论值 8�copies；检测结果：G1期3.7copies，G2期10�copies
单细胞靶基因拷贝数
斑马鱼基因绝对定量分析
利用斑马鱼scg2突变体作为研究模型，首次揭示了Scg2/SN在脊椎动物生殖及性行为中的重要作用。
微滴式数字PCR对scg2突变和SN腹腔注射后的斑马鱼脑和垂体中生殖调控相关的gnrh3、oxt及avp等基因表达进行绝对定量分析。
https://www.bio‐rad.com/ddPCR/publications?WT.mc_id=180514024366
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