11

第三节 聚合酶链反应（第三节 聚合酶链反应（ polymeraspolymerase chain reaction,PCRe chain reaction,PCR ））

PCRPCR 是模拟体内是模拟体内 DNADNA 复制条件，应用复制条件，应用 DDNANA 聚合酶反应，特异性扩增某一聚合酶反应，特异性扩增某一 DNADNA 片片段的技术。段的技术。

体外程序化的体外程序化的 DNADNA 合成技术。合成技术。

22

PCRPCR

33

原 理：原 理：11 ）合成待扩增区域两端已知序列，与模板）合成待扩增区域两端已知序列，与模板 DNADNA 互互

补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；片段的长度；

22 ）反应体系：）反应体系： DNADNA 模板，模板， dNTPdNTP ，， Taq DNATaq DNA 聚聚合酶，合酶， bufferbuffer

33））反应程序：反应程序： 变性变性 94~9594~95ooCC 复性复性 延伸延伸 37~5537~55 o oC 70~72C 70~72 o oC C 7272 o oCC 延伸延伸 10min10min DNADNA 扩增扩增 100100 万倍万倍

44

PCRPCR 扩增扩增

55

PCRPCR 特点及应用：特点及应用：

特点：特点：（（ 11 ）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快 ）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快 速；速； 22 ）微量的模板）微量的模板 DNADNA 即可扩增大量产物即可扩增大量产物 ;;应用：应用：（（ 11 ）基因组）基因组 DNADNA 分析；分析； （（ 22 ）遗传物质的鉴定；）遗传物质的鉴定； （（ 33 ）遗传病的诊断）遗传病的诊断 ;;缺点：缺点：（（ 11 ）需靶）需靶 DNADNA 序列的信息；序列的信息； （（ 22 ）产物短小，）产物短小， DNADNA 复制不精确。复制不精确。

66

PCRPCR 相关技术：相关技术： 1.1. 增效增效 PCRPCR （（ booster PCRbooster PCR ）） 当当扩增少于扩增少于 10001000 拷贝的模板拷贝的模板 DNADNA 时会遇到时会遇到

两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步对于这种情况，可设置二步 PCRPCR ，先用较低浓度，先用较低浓度的引物进行初级的引物进行初级 PCRPCR ，此时由于引物少，形成引，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经增，只是由于引物少产量不高。约经 1515 ～～ 2020 个个循环后补充产物量，以初级循环后补充产物量，以初级 PCRPCR 产物为模板进行产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。扩增，靶序列的产量将相应增加。

77

2. 2. 巢式巢式 PCRPCR （（ nest PCRnest PCR ））

　　　此时也是进行二步　　　此时也是进行二步 PCRPCR ，与上面不同的，与上面不同的是，第二级是，第二级 PCRPCR 需另行设置反应体系，并应需另行设置反应体系，并应用另外的用另外的 PCRPCR 引物，此时引物的位置位于初引物，此时引物的位置位于初级级 PCRPCR 引物的内侧，用初级引物的内侧，用初级 PCRPCR 产物做模产物做模板，进行第二步板，进行第二步 PCRPCR ，这样只有初级，这样只有初级 PCRPCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。

　　　除了达到增效　　　除了达到增效 PCRPCR 同样的目的外，还提同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。高了最终产物的特异性。

88

在同一在同一 PCRPCR 体系中加入数对体系中加入数对 PCRPCR 引物，引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个扩增多个 DNADNA 片段。片段。

多重多重 PCRPCR 常用来检测同一基因的多个外显常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。子的缺失，或在检测缺失设置内对照。

33、多重、多重 PCRPCR

99

4.RT-PCR4.RT-PCR

RT-PCRRT-PCR 是以是以 mRNAmRNA 为模板，经逆转录为模板，经逆转录酶作用合成酶作用合成 cDNAcDNA 。使微量的。使微量的 mRNAmRNA（（ pgpg 水平）迅速扩增（达水平）迅速扩增（达 ngng～～ ugug 水水平），大大提高平），大大提高 mRNAmRNA 的检出灵敏度。的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。应用于基因表达与调控的研究。

1010

RT-PCRRT-PCR

1111

RT-PCRRT-PCR

cDNA

1212

五、单链构象多态性（五、单链构象多态性（ Single Strand ConfSingle Strand Conformation Polymorphism, ormation Polymorphism, SSCPSSCP ））

　是指单链　是指单链 DNADNA 由于碱基序列不同可引起构象由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链 DDNANA电泳迁移率不同。据此，可用于电泳迁移率不同。据此，可用于 DNADNA 中单个中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。

通常与通常与 PCRPCR 技术联合应用，称为技术联合应用，称为 PCR-SSCPPCR-SSCP 技技术。术。

在疑有突变的在疑有突变的 DNADNA 片段附近设计一对引物，进片段附近设计一对引物，进行行 PCRPCR 扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的 DDNANA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。作出判断。

1313

PCR-SSCPPCR-SSCP过程：过程： --------------------------- primer--------------------------- primer ------------------------------------------------------ ↓ ↓ 3232P-dNTPP-dNTP 掺入掺入 PCRPCR 扩增扩增 产物产物 ↓ ↓ 变性变性 ↓ ↓ 单链单链 DNADNA ↓ ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳  ↓   ↓ 1 2 3 4 51 2 3 4 5 自显影自显影 ↓ ↓ 1.1. 为正常为正常 结果分析 结果分析 22 、、 44 、、 55 纯合患者纯合患者 3.3. 为杂合子为杂合子 . .

解链

构像

DAN

原 理过 程

1414

第二节 第二节 DNADNA 多态多态

DNADNA 多态（多态（ DNA PolymorphismDNA Polymorphism ）：）：群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体 DNDN

AA 是不完全相同的，一般每是不完全相同的，一般每 100100 ～～ 500bp500bp 就就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现中，表型并没有改变，这种表现称为称为 DNADNA 多多态态。常用做遗传分析中的标记。。常用做遗传分析中的标记。

除一卵双生子外，没有两个个体的基因组除一卵双生子外，没有两个个体的基因组 DNDNAA 是完全相同的。 是完全相同的。

1515

DNADNA 分析中常用的多态性标记有分析中常用的多态性标记有 33类类：：

11 ）） RFLPRFLP ：：称限制性片段长度多态性，为称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；第一代多态性标记；

22 ））重复序列多态性重复序列多态性：短串联重复序列（：短串联重复序列（ STSTRR ），为第二代多态性标记；），为第二代多态性标记；

33 ））单碱基多态性（单碱基多态性（ SNPSNP ））：： DNADNA 序列的序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。

1616

一、序列多态（或点多态）一、序列多态（或点多态） 　　限制性片段长度多态性（　　限制性片段长度多态性（ Restriction FragmenRestriction Fragmen

t Length Polymorphism t Length Polymorphism ，， RFLP RFLP ）。）。 　　由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或新　　由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或新

的酶切点出现，从而引起不同个体的的酶切点出现，从而引起不同个体的 DNADNA 在用同一在用同一限制酶切割时，产生限制酶切割时，产生 DNADNA 片段长度的差异。这种由片段长度的差异。这种由于酶切位点变化导致的于酶切位点变化导致的 DNADNA 片段长度的差异称为片段长度的差异称为 RFRFLPLP 。。

　　　　 RFLPRFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。用的遗传标记。

1717

Allele II Allele II 产生了新的酶切点产生了新的酶切点 Allele IAllele I Allele II

12Kb

8Kb 4Kb

probe

12Kb

8Kb

RFLP—Southern blot 检测结果

1818

AlleleIIAlleleII酶切位点消失酶切位点消失

1919

二、序列长度多态性（或数目变异串联重复，二、序列长度多态性（或数目变异串联重复，variable number tendom repeats, VNTvariable number tendom repeats, VNT

RR ）） 重复序列以各自的核心序列（重复单元），重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列。首尾相连多次重复，称为串联重复序列。散在地分布于染色体上，以插入散在地分布于染色体上，以插入 // 缺失方式缺失方式形成多态。如图：形成多态。如图：

VNTRVNTR 两侧的酶切位点固定，但两酶切点之两侧的酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。同长度的片段。

2020

VNTR VNTR 酶切，电泳后的检测结果酶切，电泳后的检测结果

大

小

2121

PCR-VNTRPCR-VNTR 检测检测

2222

　　　　通常，重复单位通常，重复单位 1616 ～～ 28bp28bp 长，称为长，称为小卫星小卫星 DNADNA 。。 重复单位２～ 重复单位２～ 6bp6bp 长，如（长，如（ TATA ）） n, (Cn, (CGG)nGG)n 等，称为微卫星等，称为微卫星 DNADNA 。。

　　　　 DNADNA 多态可以通过多态可以通过 PCRPCR 扩增后电泳扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（来检出，称扩增片段长度多态（ amplifieamplified fragment length polymorphism, Amd fragment length polymorphism, Amp-FLPp-FLP ））

2323

PCR-VNTRPCR-VNTR

2424

生物芯片技术生物芯片技术 九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术，九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术，

引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种微引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载体表型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析单元和面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细胞或其他系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。

基因芯片（又称基因芯片（又称 DNADNA芯片，生物芯片，芯片，生物芯片， DNADNA探针微探针微列阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过列阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，实列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测。 现生物基因信息的大规模检测。

2525

基因芯片基因芯片如： 　靶基因 　　基因组如： 　靶基因 　　基因组

特异性片段 探 针 特异性片段 探 针

----AGCTTAGC---- ----AGCTTAGC---- 靶序列靶序列 --------TCGAATCG---- probeTCGAATCG---- probe

  

  

A B

C

1 2 3 4 5

检测

2626

基因芯片的应用：基因芯片的应用：

　一、基因组扫描　一、基因组扫描　二、寻找基因功能　二、寻找基因功能　三、基因型及单碱基多态（　三、基因型及单碱基多态（ SNSN

PP ））　四、突变检测　四、突变检测　五、基因表达　五、基因表达