Upload
penney
View
76
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
בדיקת פיזור רצפי RNAi בגנום של c-elegans. אודי חוזה. יאיר ארנפרוינד. מנחה: ד"ר רון אונגר. RNAi. תופעה שבה שרשראות קטנות של RNA הנקראות siRNA (small interfering RNA) מדכאות התבטאות של חלבון מסוים ע"י דגרדציה של mRNA מתאים. siRNA. גילוי ה RNAi. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
בדיקת פיזור רצפי בדיקת פיזור רצפי RNAiRNAi בגנום של בגנום של c-c-
eleganselegansאודי חוזהאודי חוזה
יאיר ארנפרוינדיאיר ארנפרוינדמנחה: ד"ר רון מנחה: ד"ר רון
אונגראונגר
תופעה שבה שרשראות קטנות תופעה שבה שרשראות קטנות siRNA siRNA הנקראות הנקראות RNARNAשל של
(small interfering RNA)(small interfering RNA) מדכאות התבטאות של חלבון מדכאות התבטאות של חלבון
mRNAmRNAמסוים ע"י דגרדציה של מסוים ע"י דגרדציה של מתאיםמתאים
siRNA
RNAiRNAiגילוי ה גילוי ה
Richלפני יותר מעשור, התגלה ע"י החוקר Jorgensen , שכאשר מנסים להזריק לפטוניות
גן לפיגמנט שיוצר צבע סגול תחת פרומוטור חזק, על מנת להגביר את הצבע הסגול, מתקבל במקום צבע סגול חזק, צבעים
מגוונים ואפילו צבע לבן.י כך הסיקו שהחדרת הגן לפיגמנט סגול " ע
שהומולוגי לגן המקורי גורם לחוסר ביטוי של הגן המוזרק + להשתקה של הגן המקורי.
המנגנון כונה המנגנון כונה RNAiRNAi
פריצת הדרך. התגלה ע"י פריצת הדרך. התגלה ע"י : : 19981998 שהזרקת שהזרקת FIRE &MELLOFIRE &MELLOהחוקרים החוקרים
dsRNAdsRNA גורמת ג"כ לסופרסיה בביטוי גורמת ג"כ לסופרסיה בביטויגנים שמכילים רצפים הומולוגים גנים שמכילים רצפים הומולוגים
. . dsRNAdsRNAלאותם לאותם
הסופרסיה הזו יעילה בהרבה הסופרסיה הזו יעילה בהרבה בודד. בודד. strandstrandי י ""מסופרסיה שנעשית עמסופרסיה שנעשית ע
RNAiRNAiגילוי ה גילוי ה
RISC
AAAGUCUAGAGUCGAUGA
UUUCAGAUCUCAGCUACUAC
G
UGC
CGACAAACGAUUUCAGAUCUCAGCUACUUCCGAACAGUGCAUGGCC
CGAUA
20-25nt
mRNA
RNA- stem-loop-stem
degradation
Free to go
מכניזם הפעולה של RNAi
ACG
UGC
Consists of Two RNA binding
proteins and a nuclease
nicknamed as Slicer
RNAiRNAiמאפייני ה מאפייני ה
ספציפיות לרצף מסויים בגנום שהומולוגי •לו.
interference פוטנטי מאד )כדי לגרום ל • בתא(.dsRNAדרושות רק מעט מול' של
קיים רק באיאוקריוטים • שמפרק RNaseIII)בפרוקריוטים יש
dsRNA.)
המשךהמשך - -RNAiRNAiמאפייני ה מאפייני ה
יכול לגרום לאינאקטיבציה של גנים גם •מחוץ לרקמה שבה הוא נמצא.
יכול לחצות קרומי תא. •
יכול לעבור מדור לדור.•
מטרת מנגנון ההשתקה:מטרת מנגנון ההשתקה:
משמש להתגוננות של האורגניזם מפני • זיהומים או וירוסים.
מונע פעילות של טרנספוזונים.•
מנגנון ההשתקה פועל כאשר מוחדרים •לתא טרנסגנים מסויימים, במעבדה.
מחקרים רבים מרמזים על כך שמרכיבים •שונים במנגנון ההשתקה שפועל באמצעות
RNAi מתפקדים ברגולציה על ביטוי גנים שונים בתאים של אורגניזמים.
בגנום בגנוםRNAiRNAiאיך נחפש איך נחפש
, מורכב מהגן שאותו RNAiמנגנון של • dsRNAמבקשים להשתיק, ומ-
שבעזרתו נשתיק את הגן.
בגנום, יש RNAi ע"מ למצוא הבעיה:למצוא רצף מסוים ולוודא שיש לו רצף
משלים בקרבתו ע"מ שיוכלו ליצור . כיצד hairpinביחד את מבנה ה
נעשה זאת?
בגנום בגנוםRNAiRNAiאיך נחפש איך נחפש
CCGAAAGUCUAGAGUC
ACGGGCUUUCAGAUCUC
AGUGC GCACUGAGAUCUGAAAGC
CUGA…CGA
dsRNA במבנה hairpin
הוא בעצם hairpin הרצף היוצר את ה •פלינדרום ביולוגי
בגנום בגנוםRNAiRNAiאיך נחפש איך נחפש
…GTCTAGAGTCGATGAACGACT….GCTCGTTCATCGACTCTA
GAC…
אותו המקום ב DNA
…CAGATCTCAGCTACTTGCTGA….CGAGCAAGTAGCTGAGATC
TG…sens
e
antisense
זהה בדיוק antisense ניתן לראות שרצף ה • אך הפוך! senseלרצף ה
כלומר, אם נפתח את הדו-גדיל נקבל •את אותו הרצף פעמיים !!
כעת אם נמצא הופעה נוספת של אחד הרצפים בגן ידוע-נוכל להגיד שמצאנו מועמד פוטנציאלי לשמש
RNAi
RNAiRNAiאיך נחפש איך נחפש בגנום-סיכוםבגנום-סיכום
הופעות 3 נחפש DNAלאחר שנפתח את ה •זהות של אותו הרצף.
לפחות אחד ההופעות חייב להיות בגן •(, והשניים האחרים צריכים targetידוע )
אחד מהשני 5-500bpלהיות במרחק של .hairpinכך שיוכלו ליצור מבנה
אין חשיבות למיקומם בגנום-הם יכולים •להופיע גם במקומות חסרי חשיבות
. UTR, כגון אינטרונים או לכאורה
Suffix Suffix חיפוש בעזרת חיפוש בעזרת arrayarray
SS==AATTCCAACCAATTCCAATTCCAAii112233445566778899101011111212AA121244991166111133885510102277
סיבוכיות:
:quick sort במיון suffix arrayבניית ה •O)nlogn( • מיון אלפבתי של האינדקסים נעשה לפי אורך
.20bpמחרוזת של
אינדקסים של מחרוזות זהות בהכרח יופיעו אחד •השני ליד
suffix arraysuffix arrayחיפוש ב חיפוש ב
, נחלק את suffix arrayלאחר בניית ה •המערך לקבוצות של אינדקסים זהים.
ההתאמות עד אורך ננסה להרחיב את •לגודל המקס' האפשרי, ע"מ שלא לאבד
מידע ולמנוע כפילות מידע.
סינון המידעסינון המידעבכל קבוצת אינדקסים זהים נחפש לפחות
stem-loopזוג אחד שיכול ליצור מבנה של .
כלומר שעבור אחד האינדקסים נמצא התאמה בצד הכרומוזום ההפוך, שתהיה
… …5-500bp. …GGCTTTGA….CGAAAGCCבמרחק GGCTTTCG….TCAAAGCC…
Sense
Antisense
קבוצה שאין בה זוג כזה, אינה רלוונטית עבורנו ותסונן!
עיבוד המידעעיבוד המידעלאחר הסינון, נתייג כל רצף שמצאנו לפי
מיקומו בגנום: 5UTR /3UTR /intergenicאקסון/ אינטרון/
יהיו Targetsלכאורה, היינו מצפים שכל ה יהיו באיזורים שלא stem-loopsבאקסונים, וה –
intergenicמקודדים לחלבון כמו אינטרונים או regions.
שכבר נמצאו, מסתבר RNAi ממקרים של -אבל דוקא נמצאים במקרים רבים ב- Targetsשה-
3UTR !
– Targetעבור כל • מתאימים לו.stemsנבדוק אילו
עיבוד המידע מתבצע בשתי גישות:
עיבוד המידעעיבוד המידע
כעת, בעזרת כלים סטטיסטים ננתח את stems וה Targetsהתפלגות מיקומי ה C.elegansבגנום של
- stemעבור כל • מתאימים לו.Targets נבדוק אילו
The endתודה רבה ל:
ד"ר רון אונגר
יאיר חורש
תרצה דוניגר