РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБАПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(51) МПКC07K 7/06 (2006.01)A61K 38/08 (2006.01)A61P 7/10 (2006.01)

(19) RU (11) 2 493 164(13) C1

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21)(22) Заявка: 2012128032/04, 05.07.2012

(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 05.07.2012

Приоритет(ы):(22) Дата подачи заявки: 05.07.2012

(45) Опубликовано: 20.09.2013 Бюл. № 26

(56) Список документов, цитированных в отчете опоиске: RU 2402565 C1, 27.10.2010. US 2008081078

A1, 03.04.2008. Секридова А.В. и др.Пептидные ингибиторы киназы легких цепеймиозина, устойчивые к действию протеиназ. -Биоорганическая химия, 2010, т.36 (4), с.498-504.

Адрес для переписки:121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 15А,ФГБУ "РКНПК" МинздравсоцразвитияРоссии, пат.пов. О.И. Куприяновой

(72) Автор(ы):Абрамов Александр Александрович (RU),Азьмуко Андрей Андреевич (RU),Беспалова Жанна Дмитриевна (RU),Бушуев Валерий Николаевич (RU),Вилиткевич Елена Леонидовна (RU),Казакова Ольга Алексеевна (RU),Капелько Валерий Игнатьевич (RU),Лакомкин Владимир Леонидович (RU),Молокоедов Александр Сергеевич (RU),Самсонов Михаил Васильевич (RU),Сидорова Мария Владимировна (RU),Хапчаев Аскер Юсуфович (RU),Ширинский Владимир Павлович (RU)

(73) Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетноеучреждение "Российский кардиологическийнаучно-производственный комплекс"Министерства здравоохранения исоциального развития РФ (ФГБУ "РКНПК"Минздравсоцразвития России) (RU)

(54) АМИД НОНАПЕПТИДА, ПРЕПЯТСТВУЮЩИЙ ПОВЫШЕНИЮГИПЕРПРОНИЦАЕМОСТИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ(57) Реферат:

Изобретение относится к биологическиактивным пептидам, способнымпредотвращать острое повышениепроницаемости сосудистого эндотелия привведении реципиенту. Предложен пептидформулы H-(N-Me)-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-

Arg-D-Arg-Lys-NH2. Заявленный пептид можетнайти применение в качестве средстваснижения патологической гиперпроницаемостисосудистого эндотелия в различных областяхмедицины (в кардиологии, токсикологии,нейрохирургии, онкологии и др.). 3 н.п. ф-лы, 4ил., 1 табл., 5 пр.

Ñòð.: 1

ru

RU

2493164

C1

1C

46

13

94

2U

R

RUSSIAN FEDERATION

FEDERAL SERVICE FOR INTELLECTUAL PROPERTY

(51) Int. Cl.C07K 7/06 (2006.01)A61K 38/08 (2006.01)A61P 7/10 (2006.01)

(19) RU (11) 2 493 164(13) C1

(12) ABSTRACT OF INVENTION

(21)(22) Application: 2012128032/04, 05.07.2012

(24) Effective date for property rights: 05.07.2012

Priority:(22) Date of filing: 05.07.2012

(45) Date of publication: 20.09.2013 Bull. 26

Mail address:121552, Moskva, ul. 3-ja Cherepkovskaja, 15A,FGBU "RKNPK" Minzdravsotsrazvitija Rossii,pat.pov. O.I. Kuprijanovoj

(72) Inventor(s): Abramov Aleksandr Aleksandrovich (RU),Az'muko Andrej Andreevich (RU),Bespalova Zhanna Dmitrievna (RU),Bushuev Valerij Nikolaevich (RU),Vilitkevich Elena Leonidovna (RU),Kazakova Ol'ga Alekseevna (RU),Kapel'ko Valerij Ignat'evich (RU),Lakomkin Vladimir Leonidovich (RU),Molokoedov Aleksandr Sergeevich (RU),Samsonov Mikhail Vasil'evich (RU),Sidorova Marija Vladimirovna (RU),Khapchaev Asker Jusufovich (RU),Shirinskij Vladimir Pavlovich (RU)

(73) Proprietor(s): Federal'noe gosudarstvennoe bjudzhetnoeuchrezhdenie "Rossijskij kardiologicheskijnauchno-proizvodstvennyj kompleks" Ministerstvazdravookhranenija i sotsial'nogo razvitija RF(FGBU "RKNPK" Minzdravsotsrazvitija Rossii)(RU)

(54) AMIDE OF NONAPEPTIDE PREVENTING INCREASE OF HYPERPERMEABILITY OF VESSELENDOTHELIUM(57) Abstract:

FIELD: biotechnologies.SUBSTANCE: peptide of the formula H-(N-Me)-

Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-D-Arg-Lys-NH2 isproposed. The proposed peptide may find applicationas an agent for reduction of pathological

hyperpermeability of vessel endothelium in variousareas of medicine (in cardiology, toxicology,neurosurgery, oncology, etc.).

EFFECT: prevention of sharp increase of vesselendothelium permeability when injected to arecipient.

3 cl, 4 dwg, 1 tbl, 5 ex

Ñòð.: 2

en

RU

2493164

C1

1C

46

13

94

2U

R

RU 2 493 164 C1

Предлагаемое изобретение относится к лекарственным средствам для лечениянарушений внеклеточной жидкости, а именно к биологически активным пептидам,способным препятствовать повышению проницаемости сосудистого эндотелия.Благодаря этому свойству данный пептид может найти применение в медицине вкачестве противоотечного средства, а также средства лечения и профилактики другихсостояний, связанных с патологическим увеличением проницаемости сосудистогоэндотелия.

Нарушение барьерной функции эндотелия сопровождается повышениемпроницаемости сосудистой стенки и развитием отека ткани, последствия которогомогут варьировать от незначительных до катастрофических в том случае, еслипоражаются легкие, мозг и другие жизненно важные органы. Такая проблема нередконаблюдается при ряде патологических состояний, таких как острая сердечнаянедостаточность, патология клапанов сердца, почечная недостаточность, циррозпечени, онкологические заболевания, воздействие токсических веществ и др., и,несмотря на достижения современной медицины, продолжает оставаться причинойвысокой смертности, даже в условиях стационарного лечения. Для борьбы с отекомиспользуются диуретики, кристаллоиды и стероидные гормоны. Эти соединенияулучшают выведение жидкости из организма, но не воздействуют на молекулярныемеханизмы развития отека - повышение проницаемости эндотелиальной выстилкимикрососудов, возникающей вследствие сократительной активности эндотелиальныхклеток.

Одним из ключевых регуляторов сократительной активности клеток, в том числе иэндотелиальных, является киназа легких цепей миозина (КЛЦМ). Этот ферментактивируется при действии многих эдемагенных факторов и запускает сокращениеэндотелия микрососудов, что приводит к нарушению его барьерной функции иразвитию отека ткани. В связи с этим, очевидно, перспективным подходом кснижению гиперпроницаемости сосудов микроциркулярного русла в стрессовыхситуациях является подавление сократительной реакции эндотелия путемингибирования эндотелиальной КЛЦМ.

Однако большинство существующих ингибиторов КЛЦМ не подходит дляприменения у человека по причине серьезных побочных эффектов. В этой связиактуален поиск ингибиторов КЛЦМ, характеризующихся фармакологическипривилегированной структурой и высокой специфичностью. Одним из такихсоединений является низкомолекулярный ингибитор, созданный на основеаминопиридазина [1. Behanna H.А., Watterson D.M., Ranaivo H.R. Development of a novelbioavailable inhibitor of the calmodulin-regulated protein kinase MLCK: a lead compound thatattenuates vascular leak. Biochim. Biophys. Acta. 1763 (11), 1266-1274, 2006. 2. Rossi J.L.,Velentza A.V., Steinhom D.M., Watterson D.M., Wainwright M.S. MLCK210 gene knockout orkinase inhibition preserves lung function following endotoxin-induced lung injury in mice. Am.J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 292 (6), L1327-1334, 2007. 3. Wainwright M.S., Rossi J.,Schavocky J., Crawford S., Steinhom D., Velentza A.V., Zasadzki M., Shirinsky V., Jia Y.,Haiech J., Van Eldik L.J., Watterson D.M. Protein kinase involved in lung injury susceptibility:evidence from enzyme isoform genetic knockout and in vivo inhibitor treatment. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 100 (10), 6233-6238, 20031-3]. В последние годы в мире разрабатываютсяпептидные ингибиторы КЛЦМ, для которых было показано влияние напроницаемость кишечного эпителия в эксперименте при отсутствии выраженнойтоксичности [Clay burgh D.R., Barrett Т.A., Tang Y., Meddings J.В., Van Eldik L.J.,Watterson D.M., Clarke L. L., Mrsny R.J., Turner J.R. Epithelial myosin light chain kinase-

Ñòð.: 3

DE

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

dependent barrier dysfunction mediates Т cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin.Invest. 115 (10), 2702-2715, 2005.]. Нонапептид H-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH2 (L-ПИК), созданный на основе автоингибиторного участка КЛЦМ [Lukas T.J.,Mirzoeva S., Slomczynska U., Watterson D.M. Identification of Novel Classes of Protein KinaseInhibitors Using Combinatorial Peptide Chemistry Based on Functional Genomics Knowledge. J.Med. Chem. V.42., p.910-919, 1999.], способен проникать через плазматическуюмембрану и влияет на эпителиальную проницаемость in vitro [Clayburgh D.R., BarrettT.A., Tang Y., Meddings J.В., Van Eldik L.J., Watterson D.M., Clarke L.L., Mrsny R.J., TurnerJ.R. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cellactivation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115 (10), 2702-2715, 2005.], однако в силуособенностей его химической структуры чрезвычайно подвержен действиюпротеолитических ферментов [Owens S.E., Graham W.V., Siccardi D., Turmer J.R., MrsnyR.J., A Strategy to Identify Stable Membrane-Permeant Peptide Inhibitors of Myosin Light ChainKinase. Pharm. Res. 22 (5), 703-709, 2005]. Это ставит под сомнение возможность егоприменения в практической медицине. Модификация пептида L-ПИК путем заменывходящих в его состав L-аминокислот на D-конфигурацию, как и следовало ожидать,приводит к повышению устойчивости пептида к протеолитическойдеградации [Clayburgh D.R., Barrett T.A., Tang Y., Meddings J.В., Van Eldik L.J., WattersonD.M., Clarke L.L., Mrsny R.J., Turner J.R. Epithelial myosin light chain kinase-dependentbarrier dysfunction mediates Т cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115(10), 2702-2715, 2005]. Однако ингибиторная активность D-ПИК значительно уступалатаковой L-ПИК, по-видимому, вследствие того, что D-ПИК является полнымэнантиомером L-ПИК и обладает иной пространственной структурой [СекридоваА.В., Сидорова M.В., Азьмуко А.А., Молокоедов А.С., Бушуев В.Н., Марченко А.В.,Щербакова О.В., Ширинский В.П., Беспалова Ж.Д. Пептидные ингибиторы киназылегких цепей миозина, устойчивые к действию протеиназ. Биоорганическая химия 36(4), 498-504, 2010]. Поскольку в ряду пептидных аналогов не существует четкойвзаимосвязи между структурой и биологической активностью, даже небольшиемодификации пептида могут кардинально сказаться на его ингибиторных свойствах.

Наиболее близким к заявляемому пептиду является пептид ПИК1 формулы H-(W-Me)-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH2 (или [NMe-Arg1]-ПИК). При сравнениипептидных ингибиторов КЛЦМ с различными вариантами модификации структурыисходного L-ПИК (D-ПИК, [NMe-Arg1]-ПИК, [εАса1]-ПИК, [Cit1]-ПИК, [Cit1,Orn3-ПИК) было показано, что активностью in vitro, сопоставимой с исходным L-ПИК,обладает только [NMe-Arg1]-ПИК (ПИК1) с модификацией N-концевой аминокислотыисходного пептида L-ПИК [Секридова А.В., Сидорова M.В., Азьмуко А.А.,Молокоедов А.С., Бушуев В.Н., Марченко А.В., Щербакова О.В., Ширинский В.П.,Беспалова Ж.Д. Пептидные ингибиторы киназы легких цепей миозина, устойчивые кдействию протеиназ. Биоорганическая химия 36 (4), 498-504, 2010]. Время жизни ПИК1в плазме крови т vitro почти в 3 раза превышало время жизни L-ПИК, и вконцентрации 100 мкМ ПИК1 снижал индуцированное тромбином повышениепроницаемости монослоя эндотелиальных клеток [Марченко А.В., Степанова Е.О.,Секридова А.В., Сидорова М.В., Бушуев В.Н., Беспалова Ж.Д., Ширинский В.П.Новые пептидные ингибиторы киназы легких цепей миозина подавляютгиперпроницаемость эндотелия сосудов. Биофизика, 55, 1008-1013, 2010]. Однакоэффект ПИК1 наблюдается в относительно высоких диапазонах концентраций(около 100 мкМ), что с фармакологической точки зрения делает его менеепривлекательным для применения in vivo.

Ñòð.: 4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

Задачей изобретения является обеспечение эффективного подавлениягиперпроницаемости сосудистого эндотелия, и создание фармацевтическойкомпозиции для инъекций для борьбы с острым отеком жизненно важных органов.Актуальность этой задачи обусловлена необходимостью обеспечения практическоймедицины эффективными препаратами, подавляющими гиперпроницаемостьсосудистого эндотелия, в частности для борьбы с острым отеком легких в критическихдля пациента ситуациях.

Технический результат заключается в получении пептида, обладающего усиленнойактивностью в отношении подавления гиперпроницаемости эндотелия сосудов иповышенным временем жизни в плазме крови.

Поставленная задача решается путем синтеза метилированного (Me) поаминоконцевой группе амида нонапептида формулы H-(W-Me)-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-D-Arg8-Lys-NH2 (ПИК2) и его фармацевтически приемлемых нетоксичныхсолей. Поставленная задача решается также созданием фармацевтической композициидля инъекций, содержащей терапевтически эффективное количество ПИК2 ифармацевтически приемлемый носитель. А также поставленная задача решаетсяразработкой способа снижения гиперпроницаемости сосудистого эндотелия уреципиента посредством инъекции терапевтически эффективного количествауказанной фармацевтической композиции.

Изобретение поясняется 4 (четырьмя) иллюстрациями, где на Фиг.1 и Фиг.2,соответственно, представлены фрагменты 1N-ЯМР спектров прототипа (ПИК1) изаявляемого пептида (ПИК2) в растворе и в плазме крови человека (за вычетомспектра плазмы крови) с указанием сигналов соответствующих групп свободныхаминокислот. На Фиг.3 представлена динамика фосфорилирования регуляторныхлегких цепей миозина под действием КЛЦМ in vitro в присутствии заявляемогопептида ПИК2 и пептидов-прототипов L-ПИК и ПИК1 в концентрации 100 нМ. НаФиг.4 представлено влияние заявляемого пептида (ПИК 2) и прототипа (ПИК 1) надиффузию альбумина, конъюгированного с флуоресцеинизотиоцианатом черезмонослой эндотелиальных клеток линии EA.hy926. Представлена относительнаяпроницаемость эндотелия через 4 часа после стимуляции 100 нМ тромбином вприсутствии 10 мкМ (белые столбцы), 20 мкМ (черные столбцы) и 100 мкМ(заштрихованные столбцы) заявляемого пептида (справа) и прототипа (слева).Проницаемость контрольных эндотелиальных клеток после стимуляции тромбиномпринята за 100% (показано пунктирной линией).

Заявляемый пептид был получен твердофазным методом пептидного синтеза сиспользованием 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc)-технологии, описанным ниже впримере 1.

Фармацевтически приемлемые соли пептида изобретения включают соли,образованные с неорганическими или карбоновыми кислотами. Примерынеорганических кислот, образующих соли, включают галогенводородные кислоты,такие как соляная, бромистоводородная кислоты, фосфорная кислота, серная кислота.Соли карбоновых кислот образуются с такими кислотами, как уксусная, пропионовая,малоновая, малеиновая, лимонная, янтарная, яблочная, бензойная, фумаровая идругие подобные карбоновые кислоты. Соли с кислотами получают обычнымиметодами, например, с помощью нейтрализации пептида ПИК2 в форме свободногооснования с кислотой. Предпочтительными солями являются сульфат и гидрохлорид.Как указано выше, настоящее изобретение включает сольваты соединений этогоизобретения и их фармацевтически приемлемые соли. Заявляемый пептид ПИК2 или

Ñòð.: 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

его фармацевтически приемлемые соли могут образовывать сольваты с водой илиобычными органическими растворителями. Такие сольваты включаются в областьнастоящего изобретения.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает носитель, совместимый с другимиингредиентами фармакологической композиции и не оказывающий токсического илинеблагоприятного действия на пациентов. Поскольку заявляемый пептид хорошорастворяется в водных растворах, в качестве носителей для ПИК2 могут бытьиспользованы, например, изотонический раствор натрия хлорида 0,25%, стерильнаявода для инъекций, раствор Рингера для инъекций, кровезаменители, раствор глюкозыдля инфузий 5%, растворы других активных препаратов для внутривенного иливнутримышечного введения при условии отсутствия неблагоприятныхмежлекарственных взаимодействий между ПИК2 или его фармацевтическиприемлемыми солями и вторым активным веществом (активными веществами).

Терапевтически эффективное количество ПИК2 в качестве активного началаопределяется как количество, необходимое для достижения желаемогофизиологического ответа у реципиента, и может зависеть от массы тела реципиента,тяжести состояния реципиента, индивидуальных физиологических особенностейреципиента, проводимой сопутствующей терапией и др. Количество ПИК2 вфармакологической композиции будет зависеть от формы его выпуска - лиофилизатдля приготовления раствора для инъекций или раствор для инъекций. Эффективныеразовые дозы ПИК2 для внутривенного введения могут составить от 0,1 до 1,5 мг/кгвеса тела реципиента. При введении препарата внутримышечно доза, необходимая дляэффективного снижения гиперпроницаемости сосудистого эндотелия, будет выше иможет составить до 5 мг/кг веса тела реципиента.

Лекарственные препараты с заявляемым пептидом или его фармацевтическиприемлемьми солями в качестве активного вещества могут быть представлены в виделиофилизата для приготовления раствора для инъекций или в виде готового растворадля инъекций. Предпочтительной является лиофилизованная форма для растворения.

Способы введения лекарственного препарата с заявляемым пептидом или егофармацевтически приемлемыми солями в качестве активного компонента включаютвнутрисосудистое болюсное введение, введение в виде инфузии в составе другихрастворов для введения, с компонентами которых заявляемый пептид ПИК2 или егофармацевтически приемлемые соли не образуют нежелательных взаимодействий,введение внутримышечно. Предпочтительным способом введения является болюснаявнутрисосудистая инъекция, позволяющая быстро достичь терапевтическиэффективных концентраций активного вещества в крови реципиента. Показаниями кприменению заявляемого пептида или его фармацевтически приемлемых солей следуетрассматривать появление клинических симптомов или признаков развитиягиперпроницаемости сосудистого эндотелия, например, при остром отеке легкихтакими симптомами выступают цианоз, бледность, профузный пот, альтернацияпульса, акцент II тона над легочной артерией, протодиастолический ритм галопа.Введение ПИК2 для симптоматического лечения следует осуществлятьнезамедлительно при появлении признаков развития острого отека.

Пример 1. Синтез заявляемого пептида (ПИК2)H-(N-Me)-Arg1-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg7-D-Arg8-Lys-NH2В работе использованы производные аминокислот (АА) и гексафторфосфат

(бензотриазол-1-ил)окси-трис(диметиламино)фосфония (ВОР, NovaBiochem,Швейцария), N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIC), N,N-диизопропилэтиламин (DIPEA),

Ñòð.: 6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

гидроксибензотриазол (HOBt), триизобутилсилан (TIBS) компании Fluka,Швейцария, 4-метилпиперидин (4-MePip, Aldrich, США). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан (DCM), трифторуксусная кислоту (TFA)компании Fluka, Швейцария, для хроматографии - ацетонитрил (Panreac, Испания).Аналитическую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ)проводили на хроматографе (Gilson, Франция), использовали колонку Nucleosil 100С18, 5 мкм, (4.6×250 мм) (Sigma, США) в качестве элюентов использовали буфер А -0.1% TFA, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А, элюция градиентом концентрациибуфера Б в буфере А от 0% до 60% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин, детекцияпри 220 нм. Структура полученных пептидов доказана спектрами 1H-ЯМР и даннымимасс-спектрометрии. 1H-ЯМР-спектры снимали на спектрометре WM-500 (Bruker) 500МГц (ФРГ) в дейтерированном диметилсульфоксиде (DMSO-d6) при 300 К,концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл. Химические сдвиги измерялисьотносительно тетраметилсилана. Масс-спектры регистрировали на приборе PC-Kompact MALDI (Kratos, Англия).

Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензолас 4-(2,4-диметоксифенил)-9-флуоренилметоксикарбонил-аминометилфенокси - якорнойгруппой (Rink-amide-полимер) фирмы Nova BoiChem, Швейцария, предназначенныйдля получения амидов пептидов, содержащий 0.64 ммоль/г аминогрупп. Синтез амиданонапептида проводили с С-конца, ступенчато (присоединяя по одной аминокислоте),исходя из 0.40 г (0.25 ммоль) Rink-amide-полимера. Первые 8 циклов синтеза проводилив автоматическом режиме на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 431 А постандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот.Гуанидиновые группы остатков Arg и Arg блокировали с помощью 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонила (Pmc) (см. протокол твердофазного синтеза). Дляприсоединения N-концевого, N-метилзамещенного остатка Arg1 гуанидиновуюфункцию защищали с помощью 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (Mtr), адля создания амидной связи применяли высокоэффективный реагент Кастро -ВОР [Castro В., Dormoy J.R., Evin G., Selve С. Peptide coupling reaction with benzotriazol-l-yl-tris(dimethylammo)phosphonium hexafluorophosphate. Tetrahedron Lett. V.14. P.1219-1222,1975].

Протокол твердофазного синтеза

№ Операция Реагент Время обработки

Циклы 1-8

1 Промывка 5х N-метилпирролидон (NMP) 3 мин

2 Деблокирование α-аминогрупп 25% 4-MePip/NMP 10 мин

3 Промывка 5×NMP 3 мин

4 Активация 1 ммоль Fmoc-AA+1 ммоль НОВТ+1 ммоль DIC в NMP 20 мин

5 Конденсация 1 ммоль активированного производного Fmoc-AA в NMP 90 мин

6 Промывка 5×NMP 3 мин

Цикл 9

1 Промывка 5×NMP 3 мин

2 Деблокирование α-аминогрупп 25% 4MePip/NMP 10 мин

3 Промывка 5xNMP 3 мин

4 Активация 1 ммоль Fmoc-(N-Me)Arg(Mtr)-OH+1 ммоль ВОР+1 ммольНОВТ+2 ммоль DIPEA в NMP 5 мин

5 Конденсация 1 ммоль активированного производного Fmoc-AA в NMP 90 мин

6 Промывка 5xNMP 3 мин

Заключительное деблокирование и отщепление нонапептида от полимера

Ñòð.: 7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

проводили в одну стадию путем обработки соответствующего нонапептидилполимерасмесью 10 мл TFA, 0.25 мл деионизованной воды и 0.25 мл TIBS в течение 16 ч. Затемполимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтратупаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали,промывали DCM (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. 0.32 гсырого продукта твердофазного синтеза с содержанием основного вещества 76%очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Beckman (США), используяколонку Диасорб С16 13 ОТ (25×250 мм), размер частиц сорбента 10 мкм. В качествеэлюентов использовали буфер А - 0.01 М раствор ацетата аммония и буфер Б - 80%ацетонитрила в воде. Элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б вбуфере А от 100% буфера А со скоростью 10 мл/мин. Пептиды детектировали придлине волны 220 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, ацетонитрилупаривали и лиофилизовали. В итоге получили 0.16 г (47.1% в расчете на стартовуюаминокислоту, присоединенную к полимеру) амида нонапептида ПИК2.Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ,составляет 96.8%. Масс-спектр: 1338.6, вычислено 1338.7.

Времена жизни заявляемого пептида (ПИК2) и пептида-прототипа (ПИК1) вплазме крови сравнивали методом 1H-ЯМР, как описано в примере 2. Результатысравнения заявляемого пептида (I) и прототипа представлены на Фиг.1 и Фиг.2,соответственно.

Пример 2. Время жизни пептидов в плазме крови in vitroВ асептических условиях у здоровых доноров забирали по 100 мл цельной крови

в 50-мл пробирки с 5 мл консерванта (130 мМ цитрат на фосфатно-солевом буфере(ФСБ), рН 7,4). Кровь выдерживали 15-20 мин при комнатной температуре ицентрифугировали при 1500 g в течение 15 мин при 18°С. Надосадочную жидкостьпереносили в новые пробирки и центрифугировали повторно в тех же условиях.Измеряли объем плазмы крови и добавляли сухой NaBr из расчета 280 мг NaBr на 1 млплазмы. После растворения NaBr плазму (приблизительно по 30 мл) разливали поцентрифужным стаканам (для ротора Type 45Ti, Beckman, США) и наслаивали сверхупо 20 мл раствора с плотностью 1,216 г/л следующего состава: 11,42 г NaCl и 100 мгэтилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) растворяли в 1 л дистиллированнойводы, рН 7,4, затем добавляли 281,44 г NaBr. Центрифугировали при 40000 об/мин втечение 48 ч. После центрифугирования отбирали верхний темно-желтый слойжидкости, содержащий липопротеиды, и бесцветный слой буфера, оставляя буфер навысоту приблизительно 1 см до видимой границы плазмы. Плазму, полученную отодного донора, объединяли и диализовали в течение 36 ч против 4 л ФСБ, свободногоот ионов Са2+ и Mg2+ (MP Biomedicals, США) в диализных мешках с размером пор 12-14 кДа (Medicell, Великобритания). Процедуру диализа повторяли два раза по 24 чпротив свежего буфера. После диализа плазму подвергали центрифугированиюпри 25000 об/мин в роторе Type 45Ti (Beckman, США) в течение 15 мин при 4°С.Надосадочную жидкость отбирали и лиофилизовали. Сухой остаток растворяли в D2O(в объеме, равном объему плазмы до внесения NaBr) и снова лиофилизовали. Затемрастворяли в таком же объеме и до использования хранили аликвотами по 1 мл при -20°С.

Спектры 1H-ЯМР были получены на спектрометре WM-500 (Bruker, США) при37°С. Химические сдвиги сигналов в спектрах измеряли относительно внутреннегостандарта - натриевой соли 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфаната. Отнесениесигналов выполняли с помощью метода двойного резонанса. Для выделения сигналов,

Ñòð.: 8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

принадлежащих протонам пептида, применяли разностную спектроскопию: изкаждого спектра, полученного после добавления пептида в плазму крови, вычиталиспектр свободной плазмы. Концентрация пептида в образце составляла 3 мг/мл.

Как видно из Фиг.1, в случае пептида-прототипа ПИК1 через 190 мин инкубации вплазме крови человека in vitro, хорошо выражены сигналы, соответствующие СαN-группам свободного аргинина и лизинамида. Это указывает на деградацию С-концевой части пептида, приводящую к образованию свободных аминокислот. Приэтом время полужизни ПИК1 в плазме крови составляет около 120 мин [СекридоваА.В., Сидорова М.В., Азьмуко А.А., Молокоедов А.С., Бушуев В.Н., Марченко А.В.,Щербакова О.В., Ширинский В.П., Беспалова Ж.Д. Пептидные ингибиторы киназылегких цепей миозина, устойчивые к действию протеиназ. Биоорганическая химия 36(4), 498-504, 2010]. В то же время, в случае пептида ПИК2 (Фиг.2) исходный спектр непретерпевает существенных изменений даже через 420 мин инкубации в плазме крови,указывая на высокую стабильность ПИК2 в плазме крови с временем полужизни >420мин. Таким образом, заявляемый пептид характеризуется повышенным временемжизни в плазме крови. Это позволяет поддерживать его эффективную концентрацию,необходимую для снижения гиперпроницаемости сосудистого эндотелия вкритических состояниях. Повышенное время жизни пептида позволяет такжеиспользовать более низкие, при сравнении с гомологами, концентрации (5-30 мкМ вциркулирующей крови) при сохранении терапевтического эффекта.

Увеличение времени жизни пептида при замене природной L-конфигурации а-углеродного атома остатка Arg8 на D-конфигурацию в структуре заявляемого пептидаПИК2 следовало ожидать, поскольку известно, что пептидные связи, образованные D-аминокислотами более устойчивы, чем связи L-аминокислотных аналогов, так как нераспознаются протеолитическими ферментами [Hruby VJ, Qian X. Approaches to theasymmetric synthesis of unusual amino acids. Methods Mol. Biol. 35, 249-286, 1994]. Однаконаряду с увеличением времени жизни внесение модификаций может отрицательносказаться на ингибиторной активности пептида. Подтверждением этому служитпроведенное нами ранее сравнительное исследование активности пептидныхингибиторов D-ПИК, [NMe-Arg1]-ПИК, [εАса1]-ПИК, [Cit1]-ПИК и [Cit1,Orn3]-ПИК,из которых только [NMe-Arg1]-ПИК, (ПИК1) обладал активностью in vitro,сопоставимой с пептидом L-ПИК [Секридова А. В., Сидорова М.В., Азьмуко А.А.,Молокоедов А.С., Бушуев В.П., Марченко А.В., Щербакова О.В., Ширинский В.П.,Беспалова Ж.Д. Пептидные ингибиторы киназы легких цепей миозина, устойчивые кдействию протеиназ. Биоорганическая химия 36 (4), 498-504, 2010]. Наши последующиеисследования, направленные на решение задач данного изобретения, показали, чтопептиды H-DLys-DArg-DArg-DTyr-DLys-DTyr-DLys-DLys-DArg-NH2 (ретроэнантио-ПИК), H-Arg(NO2)-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH2 (с защитой N-концевой частипептида с помощью введения нитро-группы в гуанидиновую группу остатка Arg1), H-Argψ[CH2NH]-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-DArg-Lys-NH2 (с защитой N-концевой частипептида с помощью введения псевдопептидной связи в первое положение), H-(NαMe)Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Pro-OH (с защитой N-концевойчасти пептида с помощью введения метильной группы и защитой С-концевой части спомощью трипептида Pro-Gly-Pro), и пептида H-Argψ[CH2NH]-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Pro-OH (с защитой N-концевой части пептида с помощью введенияпсевдопептидной связи в первое положение и защитой С-концевой части с помощьютрипептида Pro-Gly-Pro) также значительно уступали заявляемому пептиду ПИК2 по

Ñòð.: 9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

ингибиторной активности in vitro в отношении очищенной КЛЦМ и в моделиподавления проницаемости эндотелиального монослоя in vitro.

Ингибиторную активность заявляемого пептида (ПИК2) и прототипов (ПИК1 и L-ПИК), являющихся наиболее активными из известных пептидов семейства ПИК,сравнивали по их влиянию на фосфорилирование регуляторных легких цепеймиозина in vitro, как описано в примере 3. Результаты анализа представлены на Фиг.3.

Пример 3. Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина in vitroРегуляторные легкие цепи (РЛЦ) миозина в конечной концентрации 20 мкМ

фосфорилировали КЛЦМ из желудков индейки (9 нМ) при 30°С в буфере,содержащем 10 мМ 3-рМ-Морфолино]пропансульфоновая кислота (MOPS), pH 7.0, 100

мМ NaCl, 0.5 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 0.5 мМ Mg-АТФ, 0.3 мкМ кальмодулин, 1 мМдитиотреитол (ДТТ) в присутствии 100 нМ заявляемого пептида или пептидов-прототипов L-ПИК или ПИК1. Реакцию инициировали добавлением КЛЦМ. Черезопределенные промежутки времени (0-40 мин) аликвоты реакционной смеси (5 мкл)отбирали и растворяли буфере для образцов. Полноту прохождения реакциианализировали с помощью электрофореза в присутствии мочевины и глицерина,позволяющем разделять белки на основании величины их заряда. Электрофорезпроводили согласно [Persechini A, Kamm KE, Stull JT. Different phosphorylated forms ofmyosin in contracting tracheal smooth muscle. JBC, 261, 6293-6299, 1986] с модификациями.Белковые препараты растворяли в буфере для образцов (20 мМ трис-HCl, рН 6,8, 9 Ммочевина, 10 мМ ДТТ, 0,05% бромфеноловый синий). Использовали 5,2%концентрирующий гель, приготовленный на 20 мМ трис-HCl буфере рН 6,8,содержащем 16,5% глицерол и 3,25 М мочевину; и 12% разделяющий гель,приготовленный на 20 мМ трис-23 мМ глициновом буфере рН 8,6, содержащем 40%глицерин. Электрофорез проводили в 20 мМ трис-23 мМ глициновом буфере, рН 8,6,содержащем 0,2% β-меркаптоэтанол при 330 В 20 мин и 400 В в течение 180 мин. Гелификсировали и окрашивали Кумасси R-250. Эксперименты повторяли не менее 3 раз.Электрофоретическую подвижность белковых полос, соответствующих РЛЦ и фосфо-РЛЦ, устанавливали по подвижности соответствующих стандартов. Гели сканировалии количественный денситометрический анализ полученных электрофореграммпроводили с помощью программы Image J, версия 1.45. Степень фосфорилированияРЛЦ миозина рассчитывали как отношение фосфорилированных РЛЦ к общемуколичеству РЛЦ. Полученные данные обрабатывали в программе Excel и строилиграфики зависимости степени фосфорилирования РЛЦ миозина (моль фосфата/мольРЛЦ) от времени в присутствии разных концентраций пептида. Данные выражали каксреднее + станд. откл.

Из приведенного примера видно, что в данных условиях протекания реакции вотсутствие ингибитора полное фосфорилирование РЛЦ миозина достигается через 15мин. За то же время в присутствии пептидов-прототипов L-ПИК и ПИК1 реакцияпротекает на 90-95%, при этом в присутствии заявляемого пептида (ПИК2) реакцияпротекает только на 50-60%. Эти данные свидетельствуют о более сильныхингибиторных свойствах заявляемого пептида ПИК2 по сравнению с пептидами-прототипами L-ПИК и ПИК1. Следует отметить, что в данных условиях время жизнипептидов не влияет на их ингибиторную активность, поскольку реакция проводится вотсутствие протеолитических ферментов.

Влияние заявляемого пептида (ПИК2) и прототипа (ПИК1) на проницаемостьэндотелия оценивали по скорости диффузии ФИТЦ-альбумина через монослойэндотелиальных клеток EA.hy926, как описано в примере 4. Результаты сравнения

Ñòð.: 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

заявляемого пептида (ПИК2) и прототипа ПИК1 представлены на Фиг.4.Пример 4. Проницаемость эндотелиального монослоя in vitroВлияние пептидов на проницаемость эндотелия оценивали по скорости диффузии

меченого флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) альбумина через монослойэндотелиальных клеток EA.hy926 (рис.3). На мембраны вкладышей ThinCerts (GreinerBio One, Австрия) с диаметром пор 0,4 мкм и плотностью пор 1×108/см2 высаживали1×105 эндотелиальных клеток линии EA.hy926 в 200 мкл питательной среды Игла вмодификации Дульбекко (ДМЕМ) с высоким содержанием глюкозы в присутствии 20%

эмбриональной телячьей сыворотки. Во внешнюю камеру вносили 800 мкл той жесреды без клеток. Клетки культивировали в течение 4 дней. За это время клеткидостигали монослоя. Среду роста меняли на ДМЕМ без эмбриональной сыворотки ипроводили депривацию клеток в течение 30 минут. После этого в нижнюю и верхнююкамеры добавляли исследуемый пептид в концентрациях 10-100 мкМ иинкубировали 30 минут. Затем в верхнюю камеру добавляли ФИТЦ-альбумин доконечной концентрации 0,5 мг/мл и каждые 30 мин отбирали пробы из нижней камерыдля расчета базальной скорости диффузии ФИТЦ-альбумина через эндотелиальныймонослой (относительные единицы интенсивности флуоресценции/час). Изменениепроницаемости эндотелия индуцировали добавлением 100 нМ тромбина в верхнююкамеру и с интервалами по 30 мин продолжали отбор проб среды из нижней камерыдля анализа содержания в ней ФИТЦ-альбумина. Содержание ФИТЦ-альбумина впробах измеряли с помощью многофункционального планшетногоанализатора Victor X3 (PerkinElmer, США). Результаты представляли каксреднее±стандартное отклонение (Фиг.4). Достоверность отличий определяли по t-критерию Стьюдента.

Из приведенного примера видно, что заявляемый пептид (ПИК2) снижаетиндуцированную тромбином проницаемость монослоя эндотелиальных клеток болееэффективно, чем прототип (ПИК1). Так, после преинкубации клеток с 10 мкМпрототипа ответ эндотелиальных клеток на тромбин снижается всего на 10% исоставляет 90% от ответа клеток в отсутствие ингибиторов. В то же время послепреинкубации с 10 мкМ заявляемым пептидом (ПИК2) ответ на тромбин снижаетсяна 80%, составляя 20% от ответа клеток в отсутствие ингибиторов. В концентрации 20мкМ прототип подавляет ответ на тромбин на 40%, тогда как заявляемый пептид(ПИК2) в той же концентрации полностью отменяет увеличение проницаемостимонослоя. При концентрации прототипа, равной 100 мкМ, достигаетсясущественное (90%) подавление реакции на тромбин. В то же время послепреинкубации с 100 мкМ пептидом (ПИК2) усиливалась барьерная функция монослояи проницаемость становилась на 30% ниже базовой проницаемости контрольныхклеток в отсутствие стимуляции тромбином.

Применимость и эффективность лекарственных препаратов, включающихзаявляемый пептид ПИК2 или его фармацевтически приемлемые соли, для снижениягиперпроницаемости сосудистого эндотелия in vivo демонстрируют эксперименты смоделированием острого отека легких, вызванного бактериальным липосахаридом.Конечным функциональным звеном при развитии отека тканей выступает усилениепара- и трансцеллюлярного транспорта веществ через клетки сосудистого эндотелия.Эти процессы сопряжены с активностью эндотелиальной КЛЦМ. Поэтомуиспользование бактериального липосахарида позволяет смоделировать развитиеострого отека легких различной этиологии.

Пример 5. Модель отека легких in vivo.

Ñòð.: 11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

Самцам крыс линии Wistar весом 300-340 г под кетаминовым наркозом (100 мг/кг)вставляли катетеры в сонную артерию и яремную вену для регистрации среднегоартериального давления (АД), частоты сердечных сокращений (ЧСС) и для введениявеществ. Через 10 мин после регистрации исходных параметров крысам вводилилипополисахарид (ЛПС) S. typhimurium в концентрации 8 мг/кг в физиологическомрастворе. Через 20 мин крысам вводили заявляемый пептид (ПИК2) вконцентрации 1,5 мг/кг внутривенно, болюсно в 0,5 мл физиологического раствора.Через 24 ч после эксперимента крыс забивали передозировкой уретана. Груднуюклетку вскрывали, отсасывали и измеряли количество жидкости из плевральныхполостей, вынимали и взвешивали легкие. Легкие сушили 3 суток при температуре54°С до постоянного веса. Общее содержание воды в легких определяли каксоотношение сырого веса легких плюс плеврального выпота к сухому весу легких. Вконтрольной группе животных определяли эти параметры без введения ЛПС и ПИК2.Результаты представляли как среднее ± ошибка среднего (табл.). Достоверностьотличий определяли по t-критерию Стьюдента.

Влияние заявляемого пептида ПИК2 на выраженность отека легких у крыс

Группа Кол-во животных Вес животных(г)

Соотношение исходной массы исухого в-ва легких

Жидкость в легких (исходная масса -сухое в-во + выпот, г)

контроль 6 320±6 4,64±0,06 1,08±0,05

ЛПС 15 323±11 4,92±0,04 1,61±0,07

ЛПС+ПИК2 17 311±10 4,80±0,04 1,35±0,05

Как видно из табл., введение ЛПС приводит к значительному повышению массылегких, обусловленной поступлением воды и низкомолекулярных веществ, а такжевысокомолекулярных соединений и форменных элементов крови. При введениизаявляемого пептида (ПИЮ) прирост количества жидкости в легких в ответ навоздействие ЛПС снижается в 2 раза. Таким образом, заявляемый пептид (ПИК2),введенный в дозе 1,5 мг/кг (концентрация в циркулирующей крови около 30 мкМ),способен ослаблять острый отек легких, вызванный воздействием бактериальногоэндотоксина.

Поскольку механизмы повышения проницаемости сосудистого эндотелиявовлечены в развитие острого отека легких различной этиологии, ПИК2 при введениивнутривенно в физиологическом растворе или иных фармацевтически приемлемыхносителях может выступать эффективным средством борьбы с острыми критическимисостояниями, связанными с патологическим повышением проницаемости сосудистогоэндотелия. Наиболее актуальной областью применения заявляемой фармацевтическойкомпозиции представляется борьба с острым отеком легких, являющимся причинойвысокой смертности пациентов. Острый отек легких может возникать при проведенииискусственной вентиляции легких при хирургических операциях, при сепсисе,интоксикациях, воспалительных и аллергических реакциях, травмах (ожогах,сдавливании), ишемии-реперфузии, сердечной недостаточности и ряде другихнарушений.

Формула изобретения1. Пептид, обладающий усиленной активностью в отношении подавления

гиперпроницаемости эндотелия сосудов и повышенным временем жизни в плазмекрови, имеющий формулу H-(N-Me)-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-D-Arg-Lys-NH2.

2. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью подавлятьгиперпроницаемость эндотелия сосудов, содержащая терапевтически эффективное

Ñòð.: 12

CL

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

количество пептида по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель для инъекций.3. Способ подавления гиперпроницаемости эндотелия сосудов у реципиента

посредством инъекции терапевтически эффективного количества фармацевтическойкомпозиции по п.2.

Ñòð.: 13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 493 164 C1

Ñòð.: 14

DR

RU 2 493 164 C1

Ñòð.: 15

RU 2 493 164 C1

Ñòð.: 16