はじめようはじめようはじめようはじめようsiRNA実験実験実験実験

オフオフオフオフターゲットターゲットターゲットターゲット効果効果効果効果をををを抑抑抑抑えたえたえたえた

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オフオフオフオフターゲットターゲットターゲットターゲット効果効果効果効果をををを抑抑抑抑えたえたえたえた正確正確正確正確なななな機能解析機能解析機能解析機能解析でででで、、、、RNAi実験実験実験実験をををを成功成功成功成功させるさせるさせるさせる

2014年11月14日（金）

ライフテクノロジーズジャパン株式会社

サーモフィッシャーサイエンティフィック グループ

本日の内容�siRNAの基礎

siRNAのワークフロー

RNAiの原理

オフターゲット効果

�siRNA実験の成功の秘訣

siRNAを低濃度で使う

化学修飾siRNAを使う

3

化学修飾siRNAを使う

高効率なトランスフェクションを行う

複数のsiRNAを個別に使う

Single siRNAs vs. siRNA Pools

� Silencer Select siRNA

Silencer Select siRNAの特徴

Silencer Select siRNA Library

� まとめ

RNAi実験のワークフロー

siRNAのののの設計設計設計設計・・・・合成合成合成合成 siRNAのののの導入導入導入導入 ノックダウンのノックダウンのノックダウンのノックダウンの評価評価評価評価・・・・解析解析解析解析

•設計済みsiRNAを検索・合成または•アクセッション番号等をもとに設計

•最適な導入方法を検討•Negative control•Positive control(GAPDH等)•蛍光修飾siRNA•目的のsiRNA

•導入後の培養時間•mRNAレベル：24～48時間•タンパク質レベル：24～72時間

•mRNAの解析(qPCR等)•タンパク質解析（ウエスタンブロット等）•表現系解析（顕微鏡解析等）

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•

18s neg1

surv

Protein Knockdown

GAPDH

Survivin

mRNA Knockdown

トランスフェクション試薬siRNA

細胞専用Webサイトにて検索

RNAiのメカニズムのメカニズムのメカニズムのメカニズム

細胞内細胞内細胞内細胞内ではではではでは内在性内在性内在性内在性ののののmiRNAとととと同様同様同様同様のののの経路経路経路経路でででで作用作用作用作用するするするする

siRNA：：：：mRNAと100%の相同性を持ち、mRNAを分解することで

標的遺伝子をノックダウンする。

RNA interference ：：：： RNA干渉干渉干渉干渉

2本鎖RNA分子(dsRNA)を細胞や生体に導入し、導入したdsRNAとホモロジーを持つmRNAを特異的に分解することで発現が抑制される現象

dsRNA

5

標的遺伝子をノックダウンする。

miRNA ：一般にmRNA配列と一部ミスマッチがあり、mRNAの分

解ではなく翻訳を抑制することで遺伝子をノックダウンする。

siRNA miRNA

siRNAとshRNAの違い

siRNAs• 合成オリゴ

• デザインの自由度が高くノックダウン効率が高い

• 標的以外のノックダウンを最小限にする化学修飾が可能

shRNA(short hairpin

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shRNA(short hairpin RNA)

• ウイルスまたはプラスミドから作られる

• デザインの自由度が低い

• 長期間のノックダウン

• 発現量を制御できず標的以外のノックダウンが多い

siRNA の一般的な構造

・二本鎖の核酸

・19 塩基の RNA + TT (DNA) = 21 塩基

・2 塩基 (TT) だけ末端が突出

・アンチセンス鎖は標的 mRNA と完全に相補的

TT GCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGG

CGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCCTT

←センス鎖

←アンチセンス鎖

siRNA

7

-------UGCGUA GCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGCUGAUU-------標的 mRNA

TT GCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGG ←センス鎖

CGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCC TT ←アンチセンス鎖

RISC

標的mRNAの分解

siRNA

オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果とはとはとはとは

標的遺伝子以外の遺伝子に対して非特異的にRNAi効果を示してしまう現象

オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果

目的目的目的目的ののののRNAi

アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖鎖鎖鎖

目的遺伝子のノックダウン

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siRNA導入導入導入導入によるによるによるによる非特異的非特異的非特異的非特異的なななな免疫応答免疫応答免疫応答免疫応答やややや細胞毒性細胞毒性細胞毒性細胞毒性

センスセンスセンスセンス鎖鎖鎖鎖によるによるによるによる非特異的非特異的非特異的非特異的なななな抑制抑制抑制抑制アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖鎖鎖鎖とととと相補性相補性相補性相補性をををを有有有有するするするする遺伝子遺伝子遺伝子遺伝子をををを非特異的非特異的非特異的非特異的にににに抑制抑制抑制抑制

センスセンスセンスセンス鎖鎖鎖鎖

アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖鎖鎖鎖

目的遺伝子のノックダウン

siRNA実験の成功の秘訣

siRNA をををを低濃度低濃度低濃度低濃度でででで使使使使うううう

化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾siRNAをををを使使使使うううう

標的遺伝子標的遺伝子標的遺伝子標的遺伝子のノックダウンをのノックダウンをのノックダウンをのノックダウンを最大化最大化最大化最大化しししし、、、、オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果をををを最小化最小化最小化最小化すべしすべしすべしすべし

そのための実験のポイント

9

化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾siRNAをををを使使使使うううう

高効率高効率高効率高効率なトランスフェクションをなトランスフェクションをなトランスフェクションをなトランスフェクションを行行行行うううう

二種以上二種以上二種以上二種以上のののの siRNA でででで個別個別個別個別にににに実験実験実験実験をををを行行行行うううう

ポイント① siRNA を低濃度で使用する

siRNAをををを低濃度低濃度低濃度低濃度でででで用用用用いることでいることでいることでいることで、、、、オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果をををを抑制抑制抑制抑制

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CLTC(クラスリン重鎖）に対するsiRNA

センス鎖

アンチセンス鎖

RISC

化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾

ポイント② 化学修飾siRNAを使用する

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アンチセンス鎖

標的miRNAをノックダウン

RISCセンス鎖

標的以外のmiRNAをノックダウンオフターゲットの主要因となる

RISC

センスセンスセンスセンス鎖鎖鎖鎖をををを化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾によりによりによりにより非活性化非活性化非活性化非活性化することですることですることですることで、、、、センスセンスセンスセンス鎖鎖鎖鎖ががががRISCにににに取取取取りりりり込込込込まれるのをまれるのをまれるのをまれるのを防防防防ぐことがぐことがぐことがぐことが可能可能可能可能

80% reduction

ポイント② 化学修飾siRNAを使用する

化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾によりによりによりにより、、、、オフターゲットはオフターゲットはオフターゲットはオフターゲットは大大大大きくきくきくきく減少減少減少減少するするするする。。。。

BaseO

OO

O

LNA®

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2-fold changesp<0.001

化学修飾なし化学修飾あり（LNA）

LNA修飾したsiRNA（Silencer ® Select）とLNA修飾なしのsiRNAのオフターゲットの比較。siRNA導入後に増加もしくは減少したmRNAの数をマイクロアレイ（Affymetrix U133 2.0 Plus genechip）で解析した。

ポイント③ 高効率なトランスフェクションを行う

接着系細胞株幹細胞初代細胞

浮遊系細胞

エレクトロポレーションNeon® Transfection System

細胞に合わせた最適なトランスフェクション手法を選択する

•試薬での導入が困難だった細胞に使用•浮遊系細胞に適している

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siRNA専用トランスフェクション試薬Lipofectamine ® RNAiMAX

プラスミド、siRNA共通トランスフェクション試薬Lipofectamine ® 3000

•siRNA導入の第一選択肢としておすすめ•簡便かつ低コスト

•siRNAとプラスミドのコトランスフェクションが可能

正確正確正確正確なななな導入効率導入効率導入効率導入効率のののの確認方法確認方法確認方法確認方法

Positive control siRNA（例：GAPDH）を導入し、mRNAレベルでの抑制効果を確認する→高精度なTaqManがおすすめ

70%以上のノックダウン

蛍光標識したsiRNAを導入して、導入された細胞をカウントする

ポイント③ 高効率なトランスフェクションを行う

= 80%以上の導入効率

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Alexa555蛍光修飾siRNAの導入BLOCK-iT™ Alexa Fluor® RedFluorescentControl

生存率生存率生存率生存率のののの確認方法確認方法確認方法確認方法

• 未処理細胞

• Negative control siRNA 導入細胞

• 導入試薬のみ

生存率生存率生存率生存率がががが最低最低最低最低でもでもでもでも７０７０７０７０％％％％以上以上以上以上であるかをチェックであるかをチェックであるかをチェックであるかをチェック

ポイント③ 高効率なトランスフェクションを行う

トリパンブルー染色により生存率のチェック

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生存率生存率生存率生存率がががが最低最低最低最低でもでもでもでも７０７０７０７０％％％％以上以上以上以上であるかをチェックであるかをチェックであるかをチェックであるかをチェック

トリパンブルー

ポイント④ 複数の siRNA で実験する

AAAAAAAAAAAAAターゲットmRNA

siRNA #1 siRNA #2

RISC RISC

mRNA の異異異異なるなるなるなる位置位置位置位置にににに設定設定設定設定されたされたされたされた siRNA を用いて個別個別個別個別ににににノックダウン実験を行い、

複数の siRNA で同じ結果が得られることを確認する

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論文では同一遺伝子に対する複数の siRNA での確認を要求されることがある。

→二つ以上の siRNA でオフターゲット効果のフェノタイプが一致する可能性は非常に

低いため、複数の siRNA で同一のフェノタイプが得られた場合はターゲットの

ノックダウンによる効果と考えられる。

Single siRNAs vs. siRNA Pools

検証方法 mRNAレベルでの抑制結果

siRNAは1種類ずつ単独で導入(Single法) すべきか、複数のsiRNAをミックスした状態で導入(Pool法)すべきか

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アポトーシスアッセイ

Pool法は標的mRNAのノックダウンに効果的だが、大きな問題がある

Positive phenotype:

Single siRNAs vs. siRNA Pools

アポトーシス関連の遺伝子をスクリーニングした例

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Negative control siRNAを導入した場合より - 2SD以下の値を示したもの

Phenotype 変化変化変化変化のののの確認確認確認確認：：：：

3種類の異なるsiRNAのうち2種類のsiRNAによって同様なphenotypeの変化が誘導された場合、siRNAの導入によって誘導されたphenotypeとする

Pool法はFalse PositiveやFalse Negativeとなる場合がある

Single siRNAs vs. siRNA Pools

アポトーシスアッセイ

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• 同一ターゲットのsiRNAであっても異なるphenotypeの変化を誘導する場合がある• mRNAレベルでの抑制が得られても目的とするphenotypeの変化を誘導できない場合がある• Pool法を用いると正しいphenotype誘導が行われないケースが多い

オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果による影響

False positiveのリスクを最小限にするために、同一ターゲットの複数のsiRNAを単独で使用し、同じphenotypeとなることを確認する必要がある

Single siRNAs vs. siRNA Pools

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Echeverri et al. Nature Methods Oct. 2006

•より確実なノックダウン•より高いノックダウン効率•より高い特異性•低毒性

Phenotype from

siRNA 3

Phenotype from

Phenotypefrom

Silencer® Select siRNA製品コンセプト

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Silencer® Select siRNAs複数のsiRNAを使用した実験により

裏付けられた高い信頼性

デザインアルゴリズム

バイオインフォマティックフィルター

化学修飾(LNA)

from siRNA 1

fromsiRNA 2

Silencer® Select siRNA低濃度で効率的なノックダウン

•デザインアルゴリズムにより低濃度でノックダウン可能な配列をデザイン

•他のsiRNAに対し、同濃度で最大100倍のノックダウン効率

•わずか3 nMの濃度で80%以上のノックダウン効率を実現

siRNA濃度とノックダウン効率の関係

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10 mRNA targets, 3-4 siRNAs per target

Silencer® Select siRNAデザインアルゴリズム改良によるノックダウン効率の向上

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デザインアルゴリズム改良によるノックダウン効率の向上40の標的遺伝子に対して155のsiRNAをSilencer Selectデザインアルゴリズムでデザインし、従来のデザイン(Silencer siRNA)と比較した。5 nMのsiRNAをHeLa細胞に導入し、48時間後のmRNA量をTaqMan Gene Expresssion Assayにより解析。

Mismatch Filter

Silencer® Select Toxicity Classifier

Natural miRNA

Silencer® Select siRNA特異性を高めるためのフィルタリング

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Natural miRNA Seed Region Filter

Antiviral Response Motif Filter

siRNA Seed Region Ranking

Selection of hyperfunctional siRNA with improved potency and specificity.Wang, X, et al., NAR, Oct. 21, 2009

Multiple rounds of selection,

40+ formats evaluated

Hundreds of siRNA tested

Silencer® Select siRNA最適な化学修飾パターンの探索

New ChemistryPattern

Modification

Potency testingMicroarray

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Silencer® Select siRNA

B

O

OO

O

LNA®

Potency testingStrand biasCell assay

MicroarrayPhenotypic

assaysToxicity

Silencer® Select Library

Protease

Kinases(710)

Phosphotase(298)

Nuclear Hormones (47)

Ion Channels

通常のチューブ製品以外に、スクリーニングにはsiRNAを96 wellまたは384 wellプレートにスポットしたプレートタイプが便利です。下の既製品以外に任意のsiRNAを選べるカスタムライブラリも可能です。

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Human Genome Collection (21,585)

Extended Druggable Genome (10,415)Extended Druggable Genome (10,415)

Druggable Genome (9,032)Druggable Genome (9,032)

GPCR (380)Protease (494)

Ion Channels (338)

Silencer Select siRNA Pre-made Libraryシリーズと対象遺伝子数

まとめ

siRNAのののの設計設計設計設計・・・・合成合成合成合成 siRNAのののの導入導入導入導入 ノックダウンのノックダウンのノックダウンのノックダウンの評価評価評価評価・・・・解析解析解析解析

•導入後の培養時間•mRNAレベル：24～48時間•タンパク質レベル：24～72時間

•mRNAの解析(qPCR等)•タンパク質解析（ウエスタンブロット等）•表現系解析（顕微鏡解析等）

•最適な導入方法を検討•Negative control•Positive control(GAPDH等)•蛍光修飾siRNA•目的のsiRNA

•Single法で複数のsiRNAを使用

•設計済みsiRNAを検索・合成または•アクセッション番号等をもとに設計•同一遺伝子に対し複数設計

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•

•優れたデザインアルゴリズムの化学修飾siRNASilencer ® Select siRNA

•Single法で複数のsiRNAを使用

•第一選択肢：siRNA専用トランスフェクション試薬Lipofectamine ® RNAiMAX

•第二選択肢：エレクトロポレーションNeon® Transfection System

•正確なmRNA定量TaqMan Gene Expression Assay