【始めてみよう！】固相マイクロ抽出(SPME) の基礎‚·グマアルドリッチジャパン合同会社ライフサイエンス事業部 Customer Excellence Group

シグマアルドリッチジャパン合同会社ライフサイエンス事業部

Customer Excellence Group 西島宏和

JASIS 2017年9月6日（水）

【始めてみよう！】固相マイクロ抽出(SPME)の基礎

SPME ホルダー

SPME ファイバー

“SPME(Solid Phase Microextraction)の歴史と実績” SPMEは、カナダのウォータール大学 J.Powlisyan教授とそのグループにより開発された手法 1993年、特許取得と共に、当社Supelco®から製品化 2011年、上水試験方法のカビ臭物質検査法として公定法に採用本法は、迅速・簡便に試料を濃縮し、高感度でGC測定が出来ることから、多くの分野でご利用いただき、その研究発表も豊富です。更に、品質管理の現場でも数多くご利用いただき歴史と実績がある製品です。

SPMEといえば、Supelco , Sigma-Aldrich , Merck！


2

濃縮捕集：針先の捕集材に簡単/迅速濃縮！ ⇓ 全量注入 : 高感度 !

簡単で高感度なSPME(固相マイクロ抽出）法

ニードル

金属ワイヤー

1cm

外形110μmのフューズドシリカロッドの表面に各種液相を化学結合又はｺｰﾃｨﾝｸﾞしたファイバー膜厚7-100μm


3

-目次 -

どのようなときにSPMEを使うのか？

SPMEと他の方法の違い

SPMEの構造と原理

SPMEを始めるのに何が必要か？

1

2

3

4


4

5

大気分析

水質分析

法医学

科学捜査

食品品質管理農芸化学香料分析

カビ臭

VOC

農薬

カビ臭

VOC

火山

ビール

チーズ異臭タバコ

シャンプー

ブレンドテルペン

フェロモン

アルコール

薬物

不法投棄

火災調査

【始めてみよう！】固相マイクロ抽出(SPME)の基礎どのようなときにSPMEを使うのか？ 1

保存リンゴからの揮発性香気成分試料: 300-450g リンゴ丸ごと 3 L褐色フラスコ SPME: 65μm PDMS/DVB 抽出：ヘッドスペース法、4分間分析: カラム： SPB®-5 25m x 0.25mm ID, 0.34μm オーブン: 40°C (1.5 min) to 250°C at 50°C/min, hold 1 min キャリヤー：He, 1.5mL/min (44cm/min) 検出： GC/MS, m/z = 40-300

1. 2-Methyl butanol 2. Butyl acetate 3. Hexanol 4. 2-Methyl butyl acetate 5. Methylpropylbutanoate 6. Hexyl acetate 7. Butyl-2-methylbutanoate 8. Pentyl butanoate 9. Butyl hexanoate/Hexyl butanoate 10. p-Methyoxyalylbenzene 11. Hexyl-2-methylbutanoate 12. 3-Methylbutylhexanoate 13. Pentyl hexanoate 14. 2-Pentenylhexanoate 15. 2-Methylpropyl-2-methylbutenoate 16. Hexyl hexanoate 17. a-Farnesene


6

蝦夷松苗木からのシグナル化学物質


7

劣化ミルクの香気成分変化試料: 3g of 2% milk + 10uL/IS(20ug/mL) SPME: Carboxen®/PDMS 75μm 抽出：ヘッドスペース法、15分間、45°C 脱離：250°C/5 min 分析: カラム：Supel-QTM PLOT 30m x 0.32mm ID オーブン：70℃(2 min) to 140°C at 6°C/sec, 2 min hold to 220°C at 6°C/sec キャリヤー：He, 35cm/sec 注入：splitlesst(closed 2min) 0.75mm ID liner 検出：GC/MS ion trap m/z=33-300


日光暴露前

1時間日光暴露後

4

5

6

1. アセトン 2. 2-ブタノン 3. 3-メチルペンタン 4. ペンタナール 5. ジメチルスルフィド 6. ヘキサナール IS 4-メチル-2-ペンタノン (IS)

8

2-MIB Geosmin

2-MIB

R2 = 0.99

Geosimin

R2 = 0.99

0

20000

40000

60000

80000

0 2 4 6 8 10 12

Peak A

rea

濃度(ppt)

HS-SPME法によるカビ臭測定（1～10ppt）

2-MIB

R2 = 0.99

Geosimin

R2 = 0.99

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0 50 100 150

Peak A

rea

濃度(ppt)

HS-SPME法によるカビ臭測定（1～100ppt）

水中のカビ臭(10ppt) 1/2 試料: 10ppt of 2-MIB and Geosmin spiked in 20mL of MillQ with 4g of NaCl SPME : PDMS/DVB 抽出：ヘッドスペース法、30分間, 室温分析: カラム： SLB®-5MS, 30m x 0.25mm ID, 0.25μm film オーブン: 40°C (3 min) to 170°C at 10°C/min and to 250°C at 20°C/min キャリヤー：He, 40cm/sec 注入: 0.5 min, 270°C 検出: MS, --ｸﾞﾙｰﾌﾟ１; 時間:10.00分－15.00分 Ch1-m/z:95.00 Ch2-m/z:107.00 Ch3-m/z:108.00 --ｸﾞﾙｰﾌﾟ 2; 時間:15.01分－18.00分 Ch1-m/z:112.00 Ch2-m/z:126.00


9

10


水中のカビ臭(10ppt) 2/2 試料: 10ppt of 2-MIB and Geosmin

① バイアル: 20mL (SU860097 & SU860103) 検水: 10mL, NaCl: 3～5ｇ ② 内部標準物質: ジオスミン-d3: 25ng/mLを2uLバイアルセプタムより注入 ③ 攪拌、恒温（60～80℃）, ＞5分 ④ 捕集: ＞20分 StableFlex™ PDMS/DVB(57326-U,57293-U,57327-U) ⑤ 攪拌、恒温（60～80℃） ⑥ 注入: ＞230℃/3分, スプリットレス

① ② ③ ④⑤ ⑥

11

大気分析

水質分析

法医学

科学捜査

食品品質管理農芸化学香料分析

カビ臭

VOC

農薬

カビ臭

VOC

火山

ビール

チーズ異臭タバコ

シャンプー

ブレンドテルペン

フェロモン

アルコール

薬物

不法投棄

火災調査


P&T：パージアンドトラップ法 D-HS：ダイナミックヘッドスペース法 S-HS：スタティックヘッドスペース法


SPMEと他の方法の違い 2

香気製品を捕集する一般的な方法

12

13

固体吸着 (気-固平衡)

気-液平衡

② ③ ①

試料溶液中の目的成分 ↓

捕集（濃縮）〇

HS中の目的成分 ↓

捕集（濃縮）◎


SPME法


14

① ②





P&T（パージ＆トラップ）法

N2 or He



15

D-HS（ダイナミックヘッドスペース） ① ②

N2 or He


捕集（濃縮）△ ※短時間の捕集の為





16

S-HS（スタティックヘッドスペース） ① ②


捕集（濃縮）×


捕集（濃縮）×



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高濃縮低濃縮



SPME法は、P&T方に次ぐ感度が期待でき、捕集ラインの汚染がなく簡単・迅速に測定できる手法です！

尿中の覚醒剤分析 Sample: 1mL urine (100µg each analyte, 5µg d5-methamphetamine,0.7g K2CO3) in 12mL vial SPME Fiber: 100µm polydimethylsiloxane CAT. NO.: 57300-U (manual sampling) Extraction: headspace, 80°C, 5 min Desorption: 3 min, 250°C Column: polydimethylsiloxane, 15m x 0.53mm ID, 2.0µm film Oven: 110°C Carrier: nitrogen, 25mL/min Det.: FID, 250°C Inj.: splitless, 250°C

ヘッドスペース法 SPME法

1 2

1 2

1. Amphetamine 2. Metamphetamine



18

19

ビールのSPME法とHS法の比較 (同定：MSライブラリー検索) SPME法はHS法に比較して数十倍から数千倍以上の感度を示します

SPME Beer

HS(Syringe) Beer 0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

2 7 12 17 22

HS Beer

Rt(min)

成分名 Area(HS) Area(SPME) SPME/HS

3.2 酢酸 1,274,165 19,488,431 15

4.8 1-プロパノール 1,175,626 80,767,169 69

5.8 酪酸エチル NA 5,704,884 ∞

7.3 酢酸イソブチル 1,022,352 111,522,187 109

9.8 ヘキサン酸エチル 93,535 27,096,052 290

12.3 フェニルエチルアルコール 68,847 21,977,828 319

13.8 オクタン酸エチル 451,465 53,827,057 119

15.0 酢酸フェネチル NA 3,524,244 ∞

17.2 t-4-デセン酸エチル NA 2,316,698 ∞

17.3 デカン酸エチル NA 5,434,705 ∞

Beer



構造プランジャー

ニードル

コーテイングファイバー

金属ワイヤー

1cm

外形110μmのフューズドシリカロッドの表面に各種液相を化学結合又はコーティングしたファイバー膜厚7-100μm

SPME ホルダー

ファイバーアッセンブリー


【始めてみよう！】固相マイクロ抽出(SPME)の基礎 SPMEの構造と原理 3

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濃縮捕集：簡単で迅速 ! ⇓ 全量注入 : 高感度 !

簡単で高感度


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固体吸着 (気-固平衡)

気-液平衡

② ③ ①


捕集（濃縮）〇




高感度な測定！溶媒がGCに導入されません対象試料を全量がGCに導入（スプリットレス注入）


GCの注入口で加熱され試料がカラムに入ります

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ファイバー種類と対象化合物

ファイバー名膜厚耐ｐH 参考用途例

対象例分子量例

PDMS 7µm 2-11 無極性高分子化合物 125-600

30µm 2-11 無極性半揮発性化合物 80-500

100µm 2-10 揮発性化合物 60-275

Polyacrylate 85µm 2-11 半揮発性化合物 80-300

DVB/PDMS 65µm 2-11 揮発性化合物アミン、芳香族ニトロ化合物

50-300 StableFlex™ DVB/PDMS 65µm 2-11

StableFlex DVB/Carboxen/PDMS 50/30µm 2-11 C3-C20揮発性化合物 40-275

Carboxen®/PDMS 75µm 2-11 ガス状および低分子化合物 30-225

StableFlex Carboxen/PDMS 85µm 2-11

PEG 65µm 2-9 アルコールなどの極性化合物 40-275


24

ファイバー種類と構造 DVB/Carboxen®/PDMSのみ積層構造の為、表面剥離による捕集効率変化が激しい欠点があります

• DVB/PDMS • Carboxen/PDMS

•DVB/Carboxen/PDMS • PDMS • Polyacrylate • PEG

ファイバーの選定


25

PDMS（7μm → 30μm → 100μm）

CAR/PDMS

DVB/CAR/PDMS

Polyacrylate

PDMS/DVB

PEG

大

小

ファイバーの極性

小ファイバーの保持力

ファイバー種類と特性

種類により極性が相違 PDMSは高沸点化合物に有用 CARはカーボン系担体で保持が強い DVBは樹脂系担体で保持が強い

（極性化合物に有用） PEGは極性化合物に有用



26

ファイバー種類と感度（無極性化合物）

高沸点化合物は薄膜PDMSが有意カーボン系は平面構造の多環芳香

族の脱離が困難 4成分をバランス良く捕集できた

のは ■PDMS/DVB サンプル: 各75 ppb/25% NaCl 0.05M リン酸バッファー抽出: 直接浸漬法、30 min 攪拌脱離: 3 min、at 260-310°C. カラム: PTE-5 30m x 0.5mm x 0.25µm

0.00

7 0.

004

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

159 163 228 499

n-Dibutylnitrosoamine Dimethylphthalate Chrysene Decachlorobiphenyl

7μm PDMS

b.p. 283 - 284 °C b.p. 153 °C b.p. 448 °C m.p. 310 °C


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ファイバー種類と感度（極性化合物）

PDMSは極性化合物に低感度 5成分をバランス良く捕集でき

たのは

■ Carb/PDMS

■ ポリアクリレートサンプル: 各75 ppb/25% NaCl 0.05M リン酸バッファー抽出: 直接浸漬法、30 min 攪拌脱離: 3 min、at 260-310°C. カラム: PTE-5 30m x 0.5mm x 0.25µm

0.0

0.0

0.0

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.2

0.2

0.2

p-Nitroaniline 1,3,5-Trinitrobenzene p-Nitrophenol Phenol Benzoic acidb.p. : 332 °C 315 °C 279 °C 182°C 249°C

log Po/w: 1.39 1.18 1.91 1.46 1.88


28

SPME捕集時の検討事項

SPME ファイバー種

目的化合物種・分子量・極性

マトリックス種

抽出時間

温度

塩濃度

攪拌速度

浸漬/HS 分配係数

平衡化時間

試料のpH


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構造プランジャー

ニードル

コーテイングファイバー

金属ワイヤー

1cm

外形110μmのフューズドシリカロッドの表面に各種液相を化学結合又はコーティングしたファイバー膜厚7-100μm

SPME ホルダー

ファイバーアッセンブリー


【始めてみよう！】固相マイクロ抽出(SPME)の基礎 SPMEを始めるのに何が必要か？ 4

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マニュアル用ホルダー & ファイバー

SPMEを始めるのに何が必要か？ 4


オートサンプラー用ホルダー & ファイバー

１．ホルダーを選定


ファイバー種類バネ無しは、オートサンプラー用ハブ色と形状でファイバー種別を判別ノッチ形状で針ゲージを判別

針ゲージ 23ゲージ： 0.65mm 24ゲージ： 0.57mm ゲージにより吸着性能は変わりません 23ゲージは、針が曲がりにくいですが、セプタムの穴が大きくなります

ハブセプタム

ワイヤー（外径310μm）

ファイバー液相針ノッチ



２．ファイバーを選定

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２．ファイバーを選定同じ種類が3本/1箱で用意

カーバメイト系農薬 1. Propham 2. Siduron 3. Linuron 4. Chlorproham 5. Barban 6. Nuburon

PDMS/DVB

Carb/PDMS

２．ファイバーを選定ファイバーキットは初期検討にお勧めです！



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35



３．セプタムを選定４．GCインレットライナーを選定５．ヘッドスペースバイアルの選定内径違いのインレットライナー比較

サーモグリンLB-2

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６．その他のオプション

Merlin 社製マイクロシールセプタムバネ型開閉の為セプタム屑がでません

インレットガイド Agilent®社用

サンプリングスタンド捕集時のサポート器具

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３．セプタムを選定４．GCインレットライナーを選定５．ヘッドスペースバイアルの選定

１．ホルダーを選定マニュアル用 or オートーサンプラー用２．ファイバーを選定＜目的のファイバーを選定＞・６種のファイバー・異種混合ファイバーキット

サーモグリンLB-2

まとめ

初めてご利用の際は、特性の異なるファイバー（キット）による、スクリーニング調査をお勧めします。

食品品質管理香料分析水質分析農芸化学法医学科学捜査大気分析

多くの試料に適合

6種のファイバーを用意簡単に香気成分を捕集連続的に濃縮捕集で高感度 GCスプリットレスで全量注入

簡単・迅速・高感度

ホルダーファイバー GCセプタム GCインレットライナーヘッドスペースバイアル

始めに必用な製品

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製品に関するお問い合わせ Tel:03-6756-8245 E-mail:[email protected]

納期などご注文に関するお問い合わせ Tel:03-6756-8275 FAX:03-6756-8301 E-mail:[email protected]

SIGMA-ALDRICH MERCK

製品に関するお問い合わせ

Tel:03-4531-1140 E-mail:[email protected]

納期などご注文に関するお問い合わせ Tel:03-4531-1141 FAX:03-5434-4837

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2015年11月にメルクミリポアとシグマアルドリッチはひとつの会社メルクとして活動を開始しました。現在、世界65ヶ所の製造拠点を持ち、業界で高い評価を受けている多くのブランドを含む、30万を超える幅広い製品を提供しています。

主なお取扱いブランド：Millipore, Merck, Supelco, Sigma-Aldrich, Cerilliantなど

製品に関する疑問などございましたら、お気軽にお問い合わせください

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