Научный совет по проблемам генетики и селекции, Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Учреждение Российской академии наук

Институт медико-биологических проблем РАН, Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова, Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений РАН, Институт канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина

Оргкомитет

VIII Международной конференции«Молекулярная генетика соматических клеток»

6- 9 декабря 2011 годаг. Звенигород, пансионат «Звенигородский» РАН

Е.Д. Свердлов, со-председатель(академик РАН)

С.В. Костров, со-председатель(член-корреспондент РАН, директор Института молекулярной генетики РАН)

В.З. Тарантул, заместитель председателей(докт. биол. наук, проф., зам. директора Института молекулярной генетики РАН)

Члены оргкомитета:

1. В.А. Гвоздев академик РАН ИМГ РАН2. Н.Н. Никольский академик РАН ИЦ РАН3. К.Г. Скрябин академик РАН Центр « Биоинженерия» РАН4. В.А. Ткачук академик РАН ФФМ МГУ им. М.В.Ломоносова 5. А.Г. Габибов член-корр. РАН ИБХ РАН6. С.А. Недоспасов член-корр. РАН ИМБ РАН7. Н.К .Янковский член-корр. РАН ИОГ РАН8. Л.Б. Буравкова д.м.н ИМБП РАН9. А.В. Васильев д.б.н ИБР РАН10. И.А. Гривенников д.б.н. ИМГ РАН11. Ю.И. Долгих д.б.н ИФР РАН12. Б.С. Народицкий д.б.н. ГУ НИИЭМ РАМН13. О.Л. Серов д.б.н. ИЦиГ РАН14. А.А. Ставровская д.б.н. ОНЦ РАМН15. Е.В. Новосадова к.б.н. ИМГ РАН

При поддержке Президиума РАН, Российского фонда фундаментальных исследований и Отделения биологических наук РАН.

1

ПРОГРАММА КОНФЕРЕНЦИИ( Звенигород, 6-9 декабря 2011г.)

6 декабря, вторник

17.00 – 19.00 Заезд и регистрация участников

19.00 – 20.00 Ужин

20.00 – 21.00 Открытие конференции

Вступительное слово:

20.00 – 20.10 член-корреспондент РАН Костров С.В.

20.10 – 20.20 академик РАН Свердлов Е.Д.

20.20 – 21.00 Недоспасов С.А. Институт молекулярной биологии РАН, МоскваПРИНЦИПЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО РАСПОЗНАВАНИЯ И НОБЕЛЕВСКАЯ ПРЕМИЯ 2011 Г.

21.00 Приветственный коктейль

7 декабря, среда

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ

Председатель: Костров С.В.

10.00 – 10.30 Кавсан В.М. 1 , Арешков П.А.1, Баклаушев В.П.2, Балынская Е.В.1, Авдеев С.С.1, Чехонин В.П.2, Меклер A.А.3, Зозуля Ю.А.4 1Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев; 2Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского, Москва; 3Институт мозга человека РАН, Санкт-Петербург; 4Институт нейрохирургии АМН Украины им. А.П. Ромоданова, Киев НОВЫЕ ОНКОГЕНЫ И ГЕНЫ-СУПРЕССОРЫ В ОПУХОЛЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

2

10.30 – 11.00 Карпухин А.В1, Бавыкин А.С.1, Коротаева А.А.1, Шубин В.П.1, Н.В.

Апанович1, Ковнацкий И.О.1, Петерс М.В.2, Черняев В.М.2, Кашурников А.Ю.2, Зенит-Журавлева Е.Г.1, Завадский С.В.1, Сырцев А.В.1, Любченко Л.Н.2, Грицай А.Н.2, Матвеев В.Б.2, Тюляндин С.А2.1Медико-генетический научный центр РАМН, Москва;2Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, МоскваОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ПРИ РАКЕ РЯДА ЛОКАЛИЗАЦИЙ

11.00 – 11.30 Карамышева А.Ф. 1 , Калитин Н.Н.1, Костюкова М.Н.2, Тупицын Н.Н.2

1НИИ канцерогенеза, 2НИИ клинической онкологии, Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва ИЗМЕНЕНИЯ VEGF-ЗАВИСИМЫХ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ В ПРОЦЕССЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

11.30 – 12.00 Воротников А.В., Тюрин-Кузьмин П.А., Агаронян К.М., Морозов Я.И., Ткачук В.АФакультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова, МоскваПЕРОКСИД ВОДОРОДА – НОВЫЙ ВТОРИЧНЫЙ ПОСРЕДНИК ТИРОЗИНКИНАЗНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

12.00 – 12.15 Перерыв (кофе)

12.15 – 12.35 Москалев А.А., Плюснина Е.Н.Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ГЕНА GADD45 НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ И СТАРЕНИЕ DROSOPHILA MELANOGASTER

12.35 – 12.50 Филатова Е.В. 1 , Шадрина М.И.1, Алиева А.Х.1, Карабанов А.В.2, Иллариошкин С.Н.2

1Институт молекулярной генетики РАН, Москва 2Научный центр неврологии РАМН, Москва ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА

12.50 – 13.05 Лахин А.В., Тарантул В.З., Ефремова А.С., Шрам С.И., Генинг Л.В.Институт молекулярной генетики РАН, МоскваПОДАВЛЕНИЕ ОШИБОЧНОГО СИНТЕЗА В ЭКСТРАКТАХ КЛЕТОК ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ SCOV-3 И HL-60 АПТАМЕРОМ IKL5 К ДНК-ПОЛИМЕРАЗЕ ЙОТА

13.05 – 13.20 Акулов А.Н., Горшков О.В., Чернов В.М., Румянцева Н.И.Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казань ЭКСПРЕССИЯ 1-ЦИС ПЕРОКСИРЕДОКСИНА В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ С РАЗЛИЧНОЙ МОРФОГЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ

3

13.20 – 13.35 Рафиева Л.М., Скаковская Е.С., Леусенко П.А., Гасанов Е.В. Институт молекулярной генетики РАН, МоскваВЛИЯНИЕ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА РАЗВИТИЕ МЕХАНОРЕЦЕПТОРНЫХ КЛЕТОК НА МОДЕЛИ БОКОВОЙ ЛИНИИ DANIO RERIO

13.35 – 14.00 Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С.Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, МоскваСИНЕРГИЗМ Toll- И NOD-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ И ЕГО ЗНАЧЕНИЕ В ИНДУКЦИИ РЕАКЦИЙ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА

14.00 – 15.00 Обед

15.00 – 15.30 Кочетков C .Н. Институт молекулярной биологии РАН, МоскваВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ ГЕПАТИТА С С КЛЕТОЧНЫМИ МИШЕНЯМИ

15.30 – 15.45 Фёдорова И.А. 1 , Зудина И.В.1, Иванова Е.В.1, Дерюгина Л.А.2, Рожкова Д.В.2

1Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского,2НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского,СаратовПОИСК МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ РИСКА РЕАЛИЗАЦИИ АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОГО ПОЛИКИСТОЗА ПОЧЕК У ДЕТЕЙ

15.45 – 16.00 Перерыв

4

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Председатель: Тарантул В.З.

16.00 – 16.40 Сломинский П.А., Бондаренко Е.А., Лимборская СЛ.. Скворцова В.И. Институт молекулярной генетики РАН, Москва Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва ПОЛНОГЕНОМНЫЙ АССОЦИАТИВНЫЙ АНАЛИЗ ОСТРОГО ИНСУЛЬТА В РОССИЙСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

16.40 – 17.00 Кирсанов К.И.,.Лесовая Е.А, Белицкий Г.А., Якубовская М.Г.НИИ Канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва ВЫЯВЛЕНИЕ РЕКОМБИНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ УЗКОБОРОЗДОЧНЫХ ЛИГАНДОВ ПО ИНДУКЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛОНОВ WTS У ЛИЧИНОК DROSOPHILA MELANOGASTER

17.00 – 17.20 Колотвин А.В. 1,2 Николаева Л.И. 1, Самоходская Л.М. 2, Самохвалов Е.И. 1, Альховский C.В. 1, Макашова В.В. 3, Таратина О. В., Арутюнова М.А., Гибадулин Р.А. 1

1ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» МЗСР, 2Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова 3ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ПАТОГЕНА И ХОЗЯИНА В ФОРМИРОВАНИИ УСТОЙЧИВОГО ВИРУСОЛОГИЧЕСКОГО ОТВЕТА НА ПРОТИВОВИРУСНУЮ ТЕРАПИЮ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С

17.30 – 19.00 Стендовая сессия

19.00 – 20.00 Ужин

20.00 – 21.00 Стендовая сессия

5

8 декабря, четвергСТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

Председатель: Гривенников И.А.

10.00 – 10.30 Ткачук В.А.Факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова.

ГЕННО-КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ

10.30 – 11.00 Васильев А.В. Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, Москва ПОСТНАТАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ: ГРАНИЦЫ ПЛАСТИЧНОСТИ

11.00– 11.30 Буравкова Л.Б. , Гершович П.М., Гершович Ю.Г.ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, МоскваМОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГРАВИЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК (ММСК)

11.30 – 12.00 Александрова М.А.Учреждение Российской Академии наук Институт биологии развития РАН, МоскваРЕГЕНЕРАЦИЯ В МОЗГЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛЕТОЧНЫХТЕХНОЛОГИЙ

12.00 – 12.20 Перерыв (кофе)

12.20 – 12.50 Румянцева Н.И. Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОРФОГЕННЫХ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ НЕМОРФОГЕННЫХ КАЛЛУСОВ ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ

12 .50 – 13.20 Serov O. L., Matveeva N.M., Khabarova A.A.Institute of Cytology and Genetics, Academy of Sciences of Russia Siberian Branch, Novosibirsk REPROGRAMMING MEDIATED BY CELL FUSION TECHNOLOGY

6

13.20 – 13.50 Павлова Г.В., Ревищин А.В.Институт биологии гена РАН, ООО «ИМТК», МоскваУПРАВЛЕНИЕ НЕЙРАЛЬНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКОЙ СТВОЛОВЫХ/ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК

14.00 – 15.00 Обед

Председатель: Серов О.Л.

15.00 – 15.15 Горностаева А.Н., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б.Учреждение Российской академии наук Российской Федерации Государственный научный центр Институт медико-биологических проблем РАН, Москва МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ ЦИТОКИНОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ ММСК И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ, ПРИ РАЗНОМ НАПРЯЖЕНИИ КИСЛОРОДА

15.15 – 15.30 Шаровская Ю.Ю.1, Филоненко Е.С.2, Киселёв С.Л.2, Лагарькова М.А.3

1Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ, 2НИЦ Курчатовский институт, 3Институт общей генетики им. Вавилова РАН, МоскваМЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЧЕРЕЗ ЩЕЛЕВЫЕ КОНТАКТЫ ПРИ РЕПРОГРАММИРОВАНИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

15.30 – 15.45 Лебедева О.С. 1,2 , Честков И.В.2, Некрасов Е.Д.2, Васина Е.М.2, Гривенников И.А.1, Лагарькова М.А.2

1Институт молекулярной генетики РАН, 2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва ПОЛУЧЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ОТ ПАЦИЕНТОВ, СТРАДАЮЩИХ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ (БОЛЕЗНЬ ПАРКИНСОНА, БОЛЕЗНЬ ГЕНТИНГТОНА)

15.45 – 16.00 Шутова М.В 1 , Сурдина А.В. 2, Лагарькова М.А. 1, Киселев С.Л. 2

1Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 2НИЦ "Курчатовский институт", Москва

МОДЕЛЬНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ДО ПЛЮРИПОТЕНТНОГО СОСТОЯНИЯ

16.00 – 16.15 Перерыв

7

ГЕНОТЕРАПИЯ И ГЕНОДИАГНОСТИКА

Председатель: Кавсан В.М.

16.15 – 16.45 Габибов А.Г. Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва КАТАЛИТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕГРАДАЦИИ АНТИГЕНОВ

16.45 – 17.15 Кульбачинский А.В. Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Москва ДНК КАК МАТЕРИАЛ ДЛЯ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЙ

17.15 – 17.35 Деев Р.В. 1 , Киселев С.Л.1, Исаев А.А.1, Калинин Р.Е.2, Червяков Ю.В.3, Мжаванадзе Н.Д.2, Нерсесян Е.Г.3, *Грязнов С.В.2, Староверов И.Н.3, Швальб П.Г.2

1Институт стволовых клеток человека, Москва2ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова», Рязань3ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия», ЯрославльРЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ ПЕРВОГО ГЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ

17.35 – 17.45 Перерыв

17.45 -18.15 1 Иллариошкин С.Н., 2 Народицкий Б.С., 3 Тарантул В.З., 1 Захарова М.Н., 1 Завалишин И.А., 2Шмаров М.М., 1Исмаилов Ш.М., 2Логунов Д.Ю.,1 Барсков И.В., 2Тутыхина И.Л., 2Верховская Л.В., 1Брылев Л.В., 1Викторов И.В.1Научный центр неврологии РАМН (Москва); 2НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития России (Москва); 3Институт молекулярной генетики РАН (Москва) ПЕРВЫЙ ОПЫТ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ БОКОВОГО АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА

18.15 – 18.45 Прокофьева М.М., Прасолов В.С.Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, МоскваСИСТЕМА БЕЗОПАСНОГО СКРИНИНГА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ-БЛОКАТОРОВ РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ-1

8

18.45 – 19.00 Лесовая Е.А., *Емельянов А.Ю., Кирсанов К.И., *Будунова И.В., Якубовская М.Г.НИИ Канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва*Northwestern University, Feinberg Medical School, Department of Dermatology, ChicagoСЕЛЕКТИВНАЯ АКТИВАЦИЯ ТРАНС-РЕПРЕССОРНОЙ ФУНКЦИИ ГЛЮКОКОРТИКОИДНОГО РЕЦЕПТОРА В КЛЕТКАХ ГЕМОБЛАСТОЗОВ

19.00 – 20.00 Ужин

9 декабря, пятница

ТРАНСГЕНОЗ

Председатель: Андреева Л.Е.

10.00 – 10.30 Милешина Д.В.2, Клименко Е.С.1, Катышев А.И.1, Шмаков В.Н.1, Черникова В.В.1, Кулинченко М.В.1, Вебер-Лотфи Ф.2, Лактионов П.П.4, Дейнеко Е.В.3, Диетриш А.2, Константинов Ю.М. 1 1Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, 2Институт молекулярной биологии растений НЦНИ, Страсбург, 3Институт цитологии и генетики СО РАН, пр. ак. Лаврентьева, 4Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, НовосибирскРАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПЕРЕНОСА ДНК В МИТОХОНДРИИ РАСТЕНИЙ: УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТА И ИНТЕГРАЦИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ IN ORGANELLO И IN VIVO

10.30 – 10.45 Лебедев В.Г., Подрезов А.С., Ковалицкая Ю.А., Шестибратов К.А.Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, , Пущино КО-ТРАНСФОРМАЦИЯ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫМ МЕТОДОМ И АНАЛИЗ ИНТЕГРАЦИИ Т-ДНК С РАЗЛИЧНЫХ ВЕКТОРОВ

10.45 – 11.15 Ралдугина Г.Н., Хоанг Тхи ЖангИнститут физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, , Москва ОБРАЗОВАНИЕ ХИМЕРНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ РАПСА

11.15 – 11.45 Эльконин Л.А ., Носова О.Н., Итальянская Ю.В.

Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока Россельхозакадемии, Саратов ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ СОРГО IN PLANTA И В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

9

11.45 – 12.00 Закрытие конференции 14.00 – 15.00 Обед

15.10 Отъезд в Москву

10

Стендовая сессия7 декабря (18 . 00 – 22 . 00)

1. Макарова И.В.1, Козикова Л.В.2, Макарова А.В.1, Хайдарова Н.В.1, Ненашева В.В.1, Посохин А.В.3, Казаков А.А.1, Генинг Л.В.1, Тарантул В.З.1, Андреева Л.Е. 1 ТРАНЗИЕНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ И АКТИВНОСТЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ЙОТА ЧЕЛОВЕКА В РАННИХ ЭМБРИОНАХ ВЬЮНА MISGURNUS FOSSILIS L.1Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, пл. Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, Россия2 ГНУ ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, 196625 Санкт-Петербург-Пушкин, Московское шоссе 55а 3 Учреждение Российской академии наук Институт нанотехнологий и микроэлектроники РАН, Ленинский пр., 32А, МоскваE-mail: leandr@img.ras.ru

2. Андронова Н.В. 1 , Зарецкая Н.В.1, Доронина О.А.1, Быковская О.С.1, Рутман Б.К.2, Юткин Е.В.2, Яковенко С.А.2,3

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ ГЕНОМНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ХРОМОСОМНОГО ДИСБАЛАНСА У НОСИТЕЛЕЙ СБАЛАНСИРОВАННЫХ ХРОМОСОМНЫХ ТРАНСЛОКАЦИЙ.1ФГУ Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.КулаковаМинздравсоцразвития России,ул. Академика Опарина, д. 4, Москва117997;2Клиника «Альтра вита», ул.Нагорная,д.4а, Москва117186, Россия;3Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова,Москва119991, ГСП-1, Ленинские горы, Россия.E-mail: andronowa @ mail . ru

3. Антонов С.А., Арсеньева Е.Л., Лебедева О.С., Мануилова Е.С., Сафина Д.Р., Хайдарова Н.В., Гривенников И.А.

ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ, ТРАНСФИЦИРОВАННЫХ ФАКТОРОМ РОСТА НЕРВОВ ЧЕЛОВЕКА ПОД РЕГУЛЯЦИЕЙ КОНСТИТУТИВНЫХ И РЕГУЛИРУЕМЫХ ПРОМОТОРОВ.Институт молекулярной генетики РАН, пл . Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияЕ-mail: igorag@img.ras.ru

4. Воронина Е.С. 1 , Виноградова М.С.2, Кулешов Н.П.1, Никитина В.А.1, Бочков Н.П.1

СТАТИСТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ КРИТЕРИЕВ КЛОНООБРАЗОВАНИЯ В КУЛЬТУРАХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА.1Учреждение Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН, ул. Москворечье, д.1, Москва 115478, Россия2Московский государственный технический университет им. Н.Э. Баумана, 2-я Бауманская ул., д.5, Москва 105005, Россия E-mail: vekats@inbox.ru

11

5. Рудимов Е.Г., Горностаева А.Н., Шубенков А.Н.

ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКА БИОБЕЗОПАСНОСТИ НАНОЧАСТИЦ НА ОСНОВЕ КРЕМНИЯ IN VITRO.Учреждение Российской академии наук Российской Федерации Государственный научный центр РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе 76-аE-mail: HindIII@yandex.ru

6. Гринчук Т.М., Земелько В.И., Домнина А.П., Шилина М.А., Алексеенко Л.Л., Никольский Н.Н.

КРАТКОВРЕМЕННОЕ УВЕЛИЧЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПРИВОДИТ К ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ ГЕНОМА НА УРОВНЕ КАРИОТИПА.Институт цитологии РАН, Тихорецкий пр. д.4, Санкт-Петербург, 194064, Россия E-mail: grintat@bk.ru

7. Данцевич О.Н., Тарантул В.З., Холодий Г.Я.

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ НОВОГО УЧАСТКА ИНИЦИАЦИИ РЕПЛИКАЦИИ В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА .Институт молекулярной генетики РАН, пл . Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияЕ-mail: odancevich@ya.ru

8. Жаворонков А. 2 , Колесов А.1, Кантор Ч.1

АВТОМАТИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ НАУЧНЫХ ПРОЕКТОВ И МЕТОДЫ МАШИННОГО ОБУЧЕНИЯ.1ФНКЦ Детской Гематологии, Онкологии и Иммунологии Росдрава2ФГУ "ФНКЦ ДГОИ": 117997, Россия, г. Москва, Ленинский проспект, д. 117, корп.2E-mail: alex@biogerontology.org

9. Иванов А.Д., Тухбатова Г.Р., Узаков Ш.С., Кулешова Е.П., Степаничев М.Ю., Маркевич В.А., Гуляева Н.В., Саложин С.В.

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В МОЗГЕ КРЫС ПРИ ЛОКАЛЬНОЙ ЛЕНТИВИРУСНОЙ ТРАНСДУКЦИИ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ.Учреждение Российской Академии Наук Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН. Москва 117485, ул. Бутлерова, д. 5А.Е-mail: ivanov - andre @ mail . ru

10. Катломина Н.М. 1,2 , Шубин А.В.2, Гасанов Е.В.2, Рафиева Л.М.2

СОЗДАНИЕ ЭКСПРЕССИОННЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НЕПРОЦЕССИРУЕМОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА НЕЙРОТРОФИНА BDNF.1Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Миусская пл., д.9, Москва, 125047, Россия2Институт молекулярной генетики РАН, пл . акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, Россия

12

Е-mail: kat - nad 7@ mail . ru

11. Кожухарова И.В., Веселов Н.В.

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ВЫЗЫВАЕТ ИЗМЕНЕНИЕ ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ДОКСОРУБИЦИНУ.Институт цитологии РАН, Тихорецкий пр., д.4, Санкт-Петербург 194164, РоссияE-mail: kojuxarova @ mail . ru

12. Кошелев Ю.А., Георгиев Г.П.

ПОИСК НОВЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ВЛИЯНИЯ БЕЛКА S100A4 /MTS1 НА ИНВАЗИВНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК.Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН, ул. Вавилова, д. 34/5, Москва 119334, РоссияЕ-mail: yakoshelev@mail.ru

13. Кузьмич А.И., Копанцев Е.П., Виноградова Т.В.

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ДЕТЕКЦИИ ГЕНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ В КЛЕТКАХ МЕЛАНОМНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА ОСНОВЕ НАТРИЙ-ЙОДИДНОГО СИМПОРТЕРА (NIS).Институт Биоорганической химии РАН, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, д.16/10, Москва 117997, Российская ФедерацияЕ-mail: akrubik@gmail.com

14. Левандовская А.А., Белоусов А.И., Саложин С.В.

СОЗДАНИЕ ЛЕНТИВИРУСНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ЛОКАЛЬНОГО ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ДОФАМИНОВОГО РЕЦЕПТОРА 1 ТИПА У КРЫС ЛИНИИ WAG/RIJ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СВЯЗИ ДОФАМИНЭРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ И АБСАНСНОЙ ЭПИЛЕПСИИ.Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН, ул. Бутлерова, д.5а, Москва 117485, Россия.E-mail: blueflower @ yandex . ru

15. Лощенова П. С., Роцкая У. Н., Синицина О. И.

ОТНОСИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДЕЛЕЦИИ В ГИППОКАМПЕ КРЫС ЛИНИЙ OXYS И WISTAR В ПРОЦЕССЕ СТАРЕНИЯ.Институт цитологии и генетики СО РАН, пр. Лаврентьева, 10, Новосибирск, 630090, Россия.E-mail: polilos @ bionet . nsc . ru

13

16. Марков Д.Д., Иноземцева Л.С., Яценко К.А., Долотов О.В., Гривенников И.А.

ВЛИЯНИЕ МЕЛАНОКОРТИНОВ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ПРО- И АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ В МОДЕЛЯХ ВОСПАЛЕНИЯ IN VITRO И IN VIVO.Институт молекулярной генетики РАН, пл. Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияE-mail: gorki - dm @ list . ru

17. Михайлов В.С., Буланенкова С.С., Потапов В.К., Николаев Л.Г., Свердлов Е.Д.

СПЕЦИФИЧНЫЙ ОТБОР ФРАГМЕНТОВ ДНК С ПОМОЩЬЮ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПОВЫШЕННЫМ СРОДСТВОМ К МАТРИЦЕ. Институт биоорганической химии РАН, ул. Миклухо-Маклая, ГСП-7, 16/10, 17997, Москва, РоссияE-mail: mihailov . vadim @ gmail . com

18. Михайлова Т.В., Левандовская А.А., Саложин С.В.

УВЕЛИЧЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА SERPINB1A ПРИ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ.Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН, ул. Бутлерова, д. 5а, Москва 117485, РоссияE-mail: tatyana.michailova@gmail.com

19. Пашковский П.П., Сошинкова Т.Н., Радюкина Н.Л.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ МИКРОРНК В КАЛЛУСНОЙ ЛИНИИ РАСТЕНИЙ THELLUNGIELLA SALSUGINEA ПРИ СТРЕССЕ.Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, ул. Ботаническая, д.35, Москва 127276, РоссияE-mail: pashkovskiy.pavel@gmail.com

20. Левицка И.В.1, Туманова Л.Г.1, Ратушняк Я.И. 2

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ФЕРТИЛЬНЫХ АСИММЕТРИЧНЫХ СОМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДОВ Lycopersicon esculentum Mill. + L. peruvianum var. dentatum Dun.1Институт генетики АН Республики Молдова, ул. Лесная, д.20, Кишинев 2002, Молдова 2Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, ул. Академика Заболотного, д.148, Киев ДСП-22 03680, УкраинаE-mail: yakivr@yahoo.com

14

21. Сайдакова Е.В., Шмагель К.В.

СОЗДАНИЕ СТАНДАРТНОЙ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ ДЛЯ АБСОЛЮТНОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА КОЛЬЦЕВЫХ ДНК α-ЦЕПИ Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА.Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН. ул. Голева, д.13, г. Пермь, 614081, РоссияE-mail: radimira @ list . ru

22. Семенов А.Г., Ильинских Е.Н., Ильинских И.Н., Семенов А.Г., Чередникова Е.А.

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ И ГЕТЕРОМОРФИЗМ ПЕРИЦЕНТРОМЕРНОГО РАЙОНА 9 ХРОМОСОМЫ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ.Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, Московский тракт, д. 2, г. Томск, 634050, РоссияE-mail: infconf 2009@ mail . ru

23. Смирнихина С.А., Воронина Е.С., Лавров А.В., Бочков Н.П.

ВЛИЯНИЕ ДИОКСИДИНА НА УРОВЕНЬ ПОЛНОГЕНОМНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ IN VITRO.Учреждение Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН, ул. Москворечье, д. 1, Москва, 115478, РоссияE-mail: smirnikhinas @ gmail . com

24. Орлова Е.В. 1 , Степанова А.Ю.1, Терешонок Д.В.1, Осипова Е.С.1, Долгих Ю.И.1, Картель Н.А.2

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ДЛЯ ФИТОРЕМЕДИАЦИИ.1Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН; ул. Ботаническая 35, Москва, 127276, Россия2 Институт цитологии и генетики НАН Беларуси, ул. Академическая, 27, Минск, 220072, Республика БеларусьE-mail: ekatia @ inbox . ru

25. Толынева Д.В., Куст Н.Н., Павлова Г.В.

ВЕКТОРА С РЕГУЛИРУЕМЫМ ТЕМПЕРАТУРОЧУВСТВИТЕЛЬНЫМ ПРОМОТОРОМ И РЕГУЛЯТОРНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В КЛЕТКИ И ТКАНИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН117984 Москва, ул. Вавилова, 34/5, тел: 8-(499)-135-25-41Е-mail: Casanova-di-fellini@yandex.ru

15

26. Тухбатова Г.Р., Иванов А.Д., Кулешова Е.П., Степаничев М.Ю., Гуляева Н.В., Саложин С.В.

СОЗДАНИЕ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНАХ СЕПТУМА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА.Учреждение академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, ул. Бутлерова, дом 5А, Москва, 117485, РоссияЕ-mail: tugu @ mail . ru

27. Шубин А.В., Лунина Н.А., Рощина М.П., Демидюк И.В.ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ПРОТЕАЗЫ 3С ВИРУСА ГЕПАТИТА А ВЫЗЫВАЕТ ГИБЕЛЬ РАКОВЫХ КЛЕТОК.

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Москва, 123182, пл. акад. Курчатова, 2E-mail: shav @ inbox . ru

28. Шумская В.С., Прохорчук А.В. РОЛЬ БЕЛКА КАИЗО В ФОРМИРОВАНИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ ПОЗВОНОЧНЫХ.Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН 117312 Россия, Москва, пр-т 60-летия Октября д.7, корп.1Е-mail: shumskaya87@mail.ru

29. Панищева Л.А.,. Какпакова Е.С, Рыбалкина Е.Ю., Ставровская А.А.МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПОПУЛЯЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ПРОТЕОСОМНОМУ ИНГИБИТОРУ, ПРОТИВООПУХОЛЕВОМУ ПРЕПАРАТУ БОРТЕЗАМИБУ.Институт канцерогенеза Российского онкологического научного центр имени Н.Н. Блохина РАМН, МоскваE-mail: panlidia@gmail.com

16

ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИИ

СЕКЦИЯ 1

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ КЛЕТОК________________________________________________

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ ГЕНОМНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ХРОМОСОМНОГО ДИСБАЛАНСА У НОСИТЕЛЕЙ СБАЛАНСИРОВАННЫХ ХРОМОСОМНЫХ ТРАНСЛОКАЦИЙ.

Андронова Н.В 1 . , Зарецкая Н.В1., Доронина О.А1., Быковская О.С1., Рутман Б.К2., Юткин Е.В2., Яковенко С.А.2

1ФГУ Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова Минздрав соцразвития России, ул. Академика Опарина, д. 4, Москва117997;2Клиника «Альтра вита», ул.Нагорная,д.4а, Москва 117186, Россия; Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Москва119991, ГСП-1, Ленинские горы, Россия. E-mail: andronowa@mail.ru

Носительство сбалансированных хромосомных транслокаций является доказанным этиологическим фактором патологии репродукции и аномалий фенотипа потомства. Целью настоящего исследования явилась разработка современного подхода к профилактике неблагоприятных репродуктивных исходов (невынашивания беременности и врожденных пороков развития (ВПР) плода) у носителей сбалансированных хромосомных транслокаций с учетом новых методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), включая преимплантационную генетическую диагностику и донорство гамет. Были изучены репродуктивные исходы у 62 супружеских пар носителей сбалансированных хромосомных транслокаций в группах естественного зачатия, традиционных ВРТ (экстракорпорального оплодотворения, ЭКО и интрацитоплазматического введения единичного сперматозоида в ооцит, ИКСИ), а также в группе преимплантационной генетической диагностики (ПГД). ПГД выполняли методом FISH-анализа (флуоресцентная гибридизация in situ) локусов хромосом, вовлеченных в транслокацию, а также хромосом, наиболее часто образующих анеуплоидии. Дизайном исследования явилось проспективное когортное исследование. Обнаружено, что применение ПГД ассоциируется со снижением риска невынашивания беременности на 45%, вероятно – со снижением риска повторных случаев ВПР плода, достоверно – с уменьшением времени обследования и лечения, затрачиваемого до наступления успешной беременности. В ходе работы стали очевидны ограничения исследования проблемы на хромосомном уровне. Вследствие значительной гетерогенности хромосомных транслокаций, высокой индивидуальной и групповой вариабельности их фенотипических проявлений затруднено построение генотипически-фенотипических

17

корреляций, проблематично создание моделей прогнозирования и точной оценки риска аномалий фенотипа, включая неблагоприятные репродуктивные исходы. В исследованиях последних лет были описаны особенности молекулярной структуры локусов, граничащих с точками хромосомных разрывов при транслокациях: наличие микроделеций, сложных многокомпонентных микроперестроек (Baptista J., 2008; Verkerk A., 2010). Предполагается, что наличие данных структурных особенностей, а также их локализация (в кодирующей или регуляторной области гена – эффект положения гена) может иметь этиологическое значение в формировании хромосомного дисбаланса, лежащего в основе аномалий фенотипа у носителей сбалансированных хромосомных перестроек, включая транслокации. Представляется перспективным дальнейшее исследование проблемы методами геномного анализа, их адаптация для генетической диагностики у данной группы пациентов на преимплантационном и пренатальном этапе.

ВЫЯВЛЕНИЕ РЕКОМБИНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ УЗКОБОРОЗДОЧНЫХ ЛИГАНДОВ ПО ИНДУКЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛОНОВ WTS У ЛИЧИНОК DROSOPHILA MELANOGASTER.

Кирсанов К.И., Лесовая Е.А., Белицкий Г.А., Якубовская М.Г.

НИИ Канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Каширское ш., д.24, Москва 115478, РоссияE-mail: mrkir @ rambler . ru

Потеря гетерозиготности в результате гомологичной рекомбинации (loss of heterozygosity, LOH), приводящая к манифестации рецессивных мутаций, представляет один из наиболее распространенных типов генетических перестроек при канцерогенезе. Именно этот процесс является основной причиной развития опухолей у пациентов с наследственной ретинобластомой и синдромом Ли-Фраумени. Распространенные краткосрочные тесты на мутагенную активность химических соединений направлены на выявление событий пяти основных типов: точечные мутации, появление микроядрышек, анеуплоидию, повреждение ДНК, измеряемое по репарационному синтезу, и клеточную трансформацию. Обычно рекомбиногенная активность химических соединений не тестируется. Способность химических соединений индуцировать потерю гетерозиготности может быть легко выявлена в тесте на соматический мутагенез и рекомбинацию на дрозофиле (somatic mutation and recombination test, SMART). Данный метод основан на манифестации рецессивного аллеля у гетерозигот в результате точечной мутации, хромосомных делеций и потери гетерозиготности. Недавно нам удалось усовершенствовать тест SMART, направив его на определение бластомогенной активности тестируемых агентов путем использования гетерозиготных личинок wts P4/+. Ген wts вовлечен в регуляцию клеточного цикла и гомологичен гену супрессора опухолевого роста lats млекопитающих. В представленном исследовании мы продемонстрировали преимущества данной системы при тестировании генотоксических эффектов классических узкобороздочных лигандов, бисбензимидазольных флуоресцентных красителей, Хехст33258 и Хехст33342, широко применяемых в молекулярно-биологических исследованиях. Генотоксический эффект данных соединений выявить достаточно сложно, так как они не обладают ни алкилирующей активностью, ни способностью образовывать межнитевые сшивки, а связываются с ДНК по узкой бороздке за счет образования электростатических, водородных и ван-дер-

18

ваальсовых связей, что приводит к ингибированию ферментов метаболизма ДНК, вызывая ее повреждение опосредовано. Такой тип взаимодействия с ДНК приводит к тому, что эффект Хехстов в классических тестах на мутагенную активность, которые основаны на индукции реверсных мутаций (тест Эймса на S.typhimurium и тест на фибробластах китайского хомяка V79), в нетоксических концентрациях выявить невозможно. В нашем исследовании оба бисбензимидазола в нетоксичных дозах вызывали существенное повышение частоты опухолевых клонов wts. Наблюдалась дозовая зависимость эффекта, причем Хехст 33342 оказывал более сильное действие по сравнению с Хехстом 33258, что хорошо согласуется с данными по проницаемости клеточной мембраны этими соединениями. Запрет рекомбинации путем использования специальной генетической конструкции – балансера, приводил к отсутствию бластомогенного эффекта бисбензимидозолов. Мы продемонстрировали, что данные соединения ингибируют активность одного из ферментов метаболизма ДНК, топоизомеразы I, повышая частоту одноцепочечных разрывов. Таким образом, наше исследование бластомогенного эффекта узкобороздочных лигандов на личинках дрозофил демонстрирует важность выявления рекомбиногенной активности у химических соединений.

РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ПАТОГЕНА И ХОЗЯИНА В ФОРМИРОВАНИИ УСТОЙЧИВОГО ВИРУСОЛОГИЧЕСКОГО ОТВЕТА НА ПРОТИВОВИРУСНУЮ ТЕРАПИЮ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С.

Колотвин А.В, 1,2 Николаева Л.И. 1, Самоходская Л.М.2, Самохвалов Е.И. 1,Альховский C.В.1, Макашова В.В. 3, Таратина О. В., Арутюнова М.А., Гибадулин1 Р.А.

1ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» МЗСР, 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.2Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, 119192, г.Москва, Ломоносовский проспект, д.31, корп.53ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, 111123, Москва, ул. Новогиреевская,д. 23аE-mail: protey8484@mail.ru

В последние годы была показана зависимость частоты достижения устойчивого вирусологического ответа (УВО) при противовирусной терапии (ПВТ) от генетических особенностей пациентов (расовых, национальных и популяционных). Цель нашего исследования - выявить зависимость между частотой достижения УВО и генетическими параметрами вируса гепатита С (ВГС) и полиморфизмом генов больных людей восточно-славянского происхождения.

Исследованы образцы крови от 64 человек (38 мужчин и 26 женщин, возраст 38,8±1,6 года) с хроническим гепатитом С без предцирроза и цирроза. Через 6 месяцев после окончания стандартной комбинированной терапии ИФН-α и рибавирином были сформированы группы пациентов c УВО и без вирусологического ответа (БВО). Анализировали генетические параметры ВГС: генотип, количество квазивариантных форм, вирусная нагрузка и наличие межгенотипной рекомбинации.. Определяли частоту выявления мутантных аллелей генов цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-10, TGF-β1).

19

В группе с УВО выявлена умеренная вирусная нагрузка (7,07+/-2,2)х106, преобладание генотипов вируса 1b и 3a, количество квазивариантных форм 2-5, межгенотипная рекомбинация отсутствовала. В группе БВО вирусная нагрузка составила (5,81+/-2,9)х106, преобладал генотип вируса 1b, количество квазивариантных форм 2-9, у 2-х пациентов обнаружена межгенотипная рекомбинация ВГС - 1b/2k. Среди генетических параметров ВГС только генотип 3а был достоверно ассоциирован с более частым достижением УВО. Среди проанализированных нами однонуклеотидных полиморфизмов генов цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-10, TGF-β1) выявлены значимые различия только для гена IL-6. Установлено преобладание генотипа СС (-174 G/C), приводящего к низкой продукции IL-6, среди пациентов с УВО (р=0,008) В заключение отметим, что предикторами неблагоприятного результата ПВТ у больных являются: инфицирование вирусом подтипа 1b, высокая вирусная нагрузка и отсутствие у пациента аллельного варианта СС (локус -174 G/C) гена IL-6.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ФЕРТИЛЬНЫХ АСИММЕТРИЧНЫХ СОМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДОВ Lycopersicon esculentum Mill. + L. peruvianum var. dentatum Dun.

Левицка И.В1., Туманова Л.Г1., Ратушняк Я.И. 2

1Институт генетики АН Республики Молдова, ул. Лесная, д.20, Кишинев 2002, Молдова 2Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, ул. Академика Заболотного, д.148, Киев ДСП-22 03680, УкраинаE-mail: yakivr@yahoo.com

Половые поколения F1 и F2 из двенадцати и двух семян, соответственно, были получены после самоопыления пяти клонов асимметричных соматических гибридов Lycopersicon esculentum + L. peruvianum var. dentatum, что сделало возможным проследить уровень генетической изменчивости/стабильности ядерного генома последних в процессе двух мейотических циклов. С этой целью фертильные трансгеномные гибриды и их половое потомство изучали с помощью морфологического, цитогенетического и молекулярно-биологического методов анализа. Все F1 растения по своим морфологическим признакам куста, стеблей, листьев, соцветий, цветков и плодов были сходными с родительскими формами гибридов. Однако плоды имели светло-зеленую окраску вместо желто-зеленой и по размеру были в два раза меньше родительских. И, напротив, морфология растений F2

существенно отличалась по всем показателям, среди которых c особой контрастностью выделялась форма листьев. Как и исходные соматические гибриды, их половое потомство F1 в основном содержало анеуплоидное количество хромосом, но в отличие от первых, где их модальное число было близким к тетраплоидному уровню (2n=4x=48), все растения F1, за исключением одного клона, имели набор хромосом близкий к триплоидному (2n=3x=36). Методами молекулярно-генетического анализа ядерного генома (Саузерн - и ПЦР - анализов тотальной ДНК) для большинства генотипов асимметричных гибридов и растений F1 были обнаружены новые фрагменты ДНК, отсутствующие у обоих родительских видов. При анализе ПЦР профилей у растений F2 присутствовал уникальный фрагмент ДНК, несвойственный ни родительским видам, ни исходным соматическим гибридам, ни их половому потомству F1, что соответственно коррелировало как со значительными фенотипическими изменениями у растений второго поколения, так и, возможно, с дальнейшим уменьшением их плоидности. Попытки идентификации утерянных хромосом при помощи молекулярных маркеров были ограничены из-за отсутствия однозначных корреляций между исчезновением маркера на ПДРФ профилях и

20

вероятной потерей соответствующей ему хромосомы, как это имело место в случае с молекулярным маркером двенадцатой хромосомы TG50. Так, если у большинства клонов асимметричных гибридов и их полового потомства F1, вероятно, произошла элиминация двенадцатой хромосомы дикорастущего родителя, то у двух клонов растений F1 (1F18D и 2F18D) по сравнению с клоном 8D соматического гибрида вдобавок элиминировала уже и соответствующая хромосома культурного томата. Таким образом, нами выявлена генетическая нестабильность асимметричных соматических гибридов L. esculentum + L. peruvianum var. dentatum, которая проявлялась в частичной элиминации и рекомбинации ядерной ДНК культурного и перуанского томатов, фенотипической изменчивости и уменьшении плоидности у растений двух половых поколений.

ОТНОСИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДЕЛЕЦИИ В ГИППОКАМПЕ КРЫС ЛИНИЙ OXYS И WISTAR В ПРОЦЕССЕ СТАРЕНИЯ.

Лощенова П. С., Роцкая У. Н., Синицина О. И.

Институт цитологии и генетики СО РАН, пр. Лаврентьева, 10, Новосибирск, 630090, Россия.E-mail: polilos@bionet.nsc.ru

Согласно свободнорадикальной теории митохондрии, являясь главным источником активных форм кислорода (АФК), обладают более высокой скоростью накопления мутаций (как точковых, так и структурных) в мтДНК по сравнению с ядерной ДНК. В результате нарушения работы системы окислительного фосфорилирования повышается образование АФК, и происходит дисфункция митохондрий. Благодаря клональной экспансии в отдельной клетке способны постепенно накапливаться мутантные молекулы мтДНК, что в итоге может привести к ее гибели. В связи с высоким потреблением энергии АТФ и малой регенеративной способностью головной мозг наиболее чувствителен к мутациям в мтДНК.В данной работе была исследована возрастная динамика количества мтДНК и накопления крупных делеций мтДНК в гиппокампе в процессе старения с использованием модельных лабораторных животных. Работу проводили на преждевременно стареющих крысах линии OXYS, созданной в ИЦиГ СО РАН селекцией крыс линии Wistar, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы. Животные линии OXYS характеризуются рядом дегенеративных заболеваний, а также дисфункцией митохондрий. Было показано, что количество мтДНК в гиппокампе практически не изменяется для крыс обеих линий с 1-го по 810-ый день. Было выявлено повышенное содержание протяженной делеции мтДНК у крыс линии OXYS по сравнению с таковым в контрольной линии. Межлинейная разница в количестве делетированной ДНК формируется ко второму дню и сохраняется на протяжении трех исследованных лет. В течение первого месяца динамика содержания протяженной делеции между линиями противоположна: для крыс линии OXYS характерно увеличение доли делетированной мтДНК, тогда как для крыс линии Wistar – снижение. К трем месяцам содержание делеции достигает стационарного уровня (с сохранением межлинейной разницы) и не изменяется на протяжении жизни.

21

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ УСТОЙЧИВОСТИ СПОРТСМЕНОВ К ГИПОКСИИ.

Моссэ И.Б.1, Гончар А.Л.1, Жур К.В.1, Кундас Л.А.1, Моссэ К.А.2, Моссэ Н.И.2, Малашевич П.Н.3, Семеняков А.В.4

1.Институт генетики и цитологии НАН Б., ул. Академическая 27, 220072, Минск, Беларусь2 РНПЦ «Мать и дитя» МЗ РБ, ул. Орловская, 66, Минск, 220033, Беларусь3.Республиканский центр спортивной медицины», ул. Свердлова 9, Минск, 220030, Беларусь4. Министерство спорта и туризма РБ, ул. Кирова, 8, 220000, Минск, БеларусьЕ-mail: i.mosse@igc.bas-net.by

Гипоксия является одним из ведущих факторов, лимитирующих спортивные показатели практически во всех циклических и в большинстве игровых видов спорта. Цель данной работы - установление частот аллельных вариантов генов, присутствующих в генотипах элитных спортсменов, для выявления наиболее информативных маркеров, определяющих адаптацию к гипоксии. В этой связи нами протестированы образцы ДНК членов Национальных команд Беларуси по биатлону и по хоккею как потенциальных носителей наиболее благоприятных генотипов.Для тестирования на устойчивость к гипоксии нами отобраны 10 полиморфных вариантов в 8 генах, кодирующих белки, непосредственно участвующие в реакции организма на недостаток кислорода. Исследованы образцы ДНК спортсменов национальных команд Беларуси по биатлону и по хоккею. В качестве контроля исследована ДНК людей, профессионально не занимающихся спортом. Биологическим материалом для исследования служила ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови. Молекулярно-генетический анализ геномной ДНК спортсменов выполнен методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для определения каждого полиморфизма генов использована двухпраймерная система. После амплификации специфических ДНК-последовательностей генов идентификацию аллелей полиморфизмов проводили с применением различных разработанных нами методических подходов. Недостаток кислорода ведет к активации гена HIF1A, который в свою очередь запускает экспрессию гипоксия-зависимых генов – АСЕ, eNOS, PAI-1, BDKRB2, EPO,VEGF и ENDT-1. В гене HIF1A имеются полиморфизмы 582C/T и 588G/A, ассоциированные с высокими аэробными возможностями. Обнаружение этих редких полиморфизмов у элитных спортсменов свидетельствует о более высокой устойчивости их носителей к физическим нагрузкам и о важности данного маркера для отбора спортсменов. Исследованы также гены, детерминирующие факторы адаптации к гипоксии сердечно-сосудистой системы (АСЕ eNOS, BDKRB2), подгруппа генов роста эндотелия сосудов (VEGF. PAI-1), и гены, детерминирующие факторы адаптации системы транспорта кислорода (EPO, МВ). Показано, что частоты генотипов, определяющих повышенную функциональную активность ряда генов, у биатлонистов и хоккеистов высшей квалификации превышают средние показатели, характерные для лиц, не занимающихся спортом профессионально. Это подтверждает наличие у данных спортсменов генетической составляющей устойчивости к гипоксии, необходимой для достижения высоких спортивных показателей. Кроме того, у ряда спортсменов обнаружены редкие варианты генов, существенно повышающие физическую выносливость. Выявление отдельных неблагоприятных генных вариантов у представителей национальных команд дает возможность корректировки соответствующих эффектов с помощью индивидуального медико-биологического обеспечения, что будет способствовать повышению спортивных результатов.

22

ОЦЕНКА ГЕНОТОКСИЧНОСТИ БРОМАТА КАЛИЯ.

Никитина В.А., Катосова Л.Д., Чаушева А.И., Платонова В.И., Воронина Е.С.

Медико-генетический научный центр РАМН, ул. Москворечье, д. 1, Москва 115478, РоссияЕ-mail: vanikitina @ mail . ru

Бромат калия (KBrO3) – сильный окислитель, является побочным продуктом процедуры дезинфекции воды, входит в состав ряда средств бытовой химии и лекарственных препаратов для местного применения. Бромат калия крайне токсичен для человека. Отравление броматом калия может привести к развитию острой почечной недостаточности, потере слуха. Канцерогенные и мутагенные свойства бромата калия показаны в ряде экспериментов на животных, однако, на культурах клеток человека in vitro мало изучены, а концентрационные зависимости не описаны.Методом учета хромосомных аберраций и гель-электрофореза единичных клеток (ДНК-комет) изучена генотоксичность KBrO3 при 4-часовой экспозиции с лимфоцитами периферической крови человека. Бромат калия исследовали в концентрациях от 0.01 до 2.0 mМ.Во всех исследованных концентрациях выявлен выраженный повреждающий эффект, составивший от 7.5 до 69.7% аберрантных метафаз и от 8.4 до 29% ДНК в хвосте комет. При сопоставлении уровней повреждений, зарегистрированных разными методами, выявлена прямая взаимосвязь процессов индукции броматом калия повреждений ДНК и хромосомных аберраций (коэффициент корреляции 0,85). Концентрационная зависимость доли аберрантных метафаз при экспозиции KBrO3 описывается S-образной кривой и удовлетворяет уравнению: ρ=1-exp-(0.31+2x0.23С)2

, где ρ – доля поврежденных метафаз, С – концентрация KBrO3, exp-(a+2b)2 – доля неповрежденных метафаз при С=0.Таким образом, бромат калия индуцирует хромосомные аберрации и ДНК-повреждения в лимфоцитах человека при культивировании in vitro. Выявлена прямая корреляция между процессами образования ДНК- и хромосомных повреждений. Описан дозо-зависимый эффект повышения частоты хромосомных аберраций при увеличении концентрации бромата калия.

СОЗДАНИЕ СТАНДАРТНОЙ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ ДЛЯ АБСОЛЮТНОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА КОЛЬЦЕВЫХ ДНК α-ЦЕПИ Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА.

Сайдакова Е.В., Шмагель К.В.

Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН. ул. Голева, д.13, г. Пермь, 614081, РоссияE-mail: radimira @ list . ru

Определение количества копий отдельных генетических последовательностей в образце ДНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) основано на использовании стандартной калибровочной кривой. Информация о силе флуоресцентного сигнала, поступающего от образцов с известным количеством специфических молекул,

23

позволяет произвести перерасчет данных ПЦР-РВ от исследуемых проб в абсолютное количество копий гена. Целью нашего исследования являлось создание калибровочной кривой для исследования кольцевых ДНК α-цепи Т-клеточного рецептора и ее стандартизация.Созданы плазмиды, содержащие вставки генов человеческого альбумина и αTREC (T cell receptor excision circles – эксцизионные кольца Т-клеточного рецептора). Стандартизация количества копий генов в разведениях каждой из плазмид проведена по схеме:– получение культура лимфоцитов и сделаны последовательные разведения образца с известным количеством клеток;– нуклеиновая кислота каждого образца выделялась лизисом с использованием протеиназы К. Данный метод позволил рассчитать количество копий гена (из расчета две копии на клетку) в микролитре полученной ДНК;– проведена ПЦР-РВ с генетическим материалом культуры лимфоцитов в качестве матрицы. В результате получены данные, необходимые для построения первой стандартной кривой;– количество копий гена альбумина в последовательно разведенном образце плазмидной ДНК определялось в постановке ПЦР-РВ «серийные разведения плазмид со вставкой гена человеческого альбумина против первой стандартной кривой»;– полученные данные были приняты за вторую стандартную кривую, отражающую абсолютное количество плазмид в каждой точке стандарта, и использованы для расчета числа копий αTREC в серийных разведениях соответствующей плазмидной ДНК. Так как эффективность амплификации разных генов отличается, сравнение производили не по вставкам гена альбумина и αTREC, но по структурному гену лактозного оперона (lacZ), присутствующему в составе обеих плазмид.Таким образом была создана третья калибровочная кривая, представляющая собой стандарт для исследования количества кольцевых ДНК α-цепи Т-клеточного рецептора.Исследование выполнено при поддержке гранта молодежных инновационных проектов УрО РАН 2011года.

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ И ГЕТЕРОМОРФИЗМ ПЕРИЦЕНТРОМЕРНОГО РАЙОНА 9 ХРОМОСОМЫ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ.

Семенов А.Г., Ильинских Е.Н., Ильинских И.Н., Семенов А.Г., Чередникова Е.А.

Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, Московский тракт, д. 2, г. Томск, 634050, РоссияE-mail: infconf 2009@ mail . ru

Установлено, что способностью вызывать цитогенетические нарушения in vivo и in vitro обладают не только факторы физической (ионизирующее излучение) или химической (мутагенные соединения) природы, но и некоторые инфекционные агенты, включая вирусы и бактерии. Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), вызванный боррелиями комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato, можно отнести к числу наиболее распространенных на территории России природно-очаговых инфекций, часто имеющих тенденцию к хроническому течению. Патогенетические механизмы хронизации этого заболевания и специфика влияния боррелий на клетки иммунной системы до сих пор остаются мало изученными. Цель настоящей работы заключалась в характеристике цитогенетического статуса больных ИКБ и в изучении цитогенетических эффектов возбудителя этого заболевания в условиях in vitro.

24

Фитогемагглютинин-стимулированные 72-часовые культуры мононуклеарных клеток периферической крови для стандартного хромосомного анализа были получены от 3 групп, включавших 12 больных острым ИКБ, 10 пациентов из этой же группы в период реконвалесценции через 3 месяца после курса антибиотикотерапии, а также контрольную группу из 12 здоровых лиц. Кроме того, были проведены эксперименты с добавлением в культуры лимфоцитов, полученных от контрольной группы, живых или инактивированных боррелий вида B. garinii (одного из наиболее распространенных в Западной Сибири возбудителей ИКБ) в соотношении 1:20 за 48 ч до конца культивирования с последующей оценкой числа клеток с цитогенетическими нарушениями. Для дифференциального окрашивания хромосом использовали технику G-бэндов с обработкой препаратов трипсином, а для выявления гетерохроматиновых блоков нами было использован С-метод окраски препаратов с обработкой препаратов гидроксидом бария.В культурах лимфоцитов, полученных от больных острым ИКБ, по сравнению с группами реконвалесцентов и контроля было установлено существенное повышение числа клеток с одиночными или парными фрагментами хромосом, а также увеличение числа гипоплоидных и полиплоидных лимфоцитов. Добавление в культуры мононуклеарных клеток здоровых людей живых и, в меньшей степени, инактивированных боррелий приводило к выраженным кластогенным и анеугенным эффектами и увеличению числа клеток с теми же типами цитогенетических нарушений, что и в лимфоцитах больных людей. Кроме того, в культурах лимфоцитов периферической крови всех обследованных нами больных острым ИКБ были выявлены от 4 % до 24% клеток, имеющих одну или две гомологичных хромосомы 9 с увеличенным районом вторичной перетяжки, что не имело наследственный характер, поскольку изучение этого признака в динамике у тех же пациентов в период реконвалесценции не выявило подобных изменений 9 хромосомы. Добавление живых боррелий в культуры здоровых людей, позволило воспроизвести появление клеток с хромосомой 9 с увеличенным районом вторичной перетяжки.На основании проведенных экспериментов нами выдвинуто предположение о том, что боррелии и их антигены способны не только за счет прямых или опосредованных механизмов вызывать повреждение ДНК, но также индуцировать развитие стресса и связанного с ним ответа, сопровождающегося изменением видимой при рутинной окраске морфологической структуры, а, возможно, и активности гетерохроматинового района перицентромерной области длинного плеча 9 хромосомы.

ПОЛНОГЕНОМНЫЙ АССОЦИАТИВНЫЙ АНАЛИЗ ОСТРОГО ИНСУЛЬТА В РОССИЙСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ.

Сломинский П.А. 1, Бондаренко Е.А. 2, Лимборская С.А. 1, Скворцова В.И. 2

1 Институт молекулярной генетики РАН, пл. Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, Россия2 Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова, ул. Островитянова, д. 1, Москва 117997, РоссияE – mail:slomin@img.ras.ru

В развитии предрасположенности человека к многофакторным частым заболеваниям важную роль играют как генетическая конституция индивидуума, так и действие факторов внешней среды. При этом соотношение средовых и генетических факторов сильно варьирует при различных заболеваниях - так, при сахарном диабете первого типа ведущая роль принадлежит генетическим факторам, а при сахарном диабете второго типа вопрос о соотношении генетической и средовой компонент остается открытым.

25

Также остается открытым вопрос о роли генетической компоненты в развитии сердечно-сосудистых заболеваний и в частности острого инсульта. Несмотря на выявление значительного числа кандидатных генов заболевания и ДНК маркеров, ассоциированных с развитием инсульта, вопрос о генетических факторах риска окончательно не решен. Перспективы его решения связывают с развитием методов полногеномного ассоциативного анализа (GWAS), и нами проведен такой анализ на выборке из 1290 больных острым инсультом и соответствующей ей контрольной выборке с исполь-зованием ДНК микрочипов типа HumanCytol2 v.2 ("Illumina", США), позволяющих типировать более 300000 однонуклеотидных полиморфных сайтов и участков с изменением копийности (CNV). Получаемые первичные данные были обработаны в пакетах программ «Genome Studio» и SVS и была выявлена ассоциация с риском развития острого ишемического инсульта восьми ОНП ДНК маркеров при анализе различных генетических моделей наследования предрасположенности к развитию инсульта. Ни один из этих маркеров ранее не был выявлен при полногеномных ассоциативных исследованиях острого инсульта в других популяциях - но для одного из маркеров показана ассоциация с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом.

МУТАЦИОННЫЙ СТАТУС ГЕНА FGFR3 У БОЛЬНЫХ С РАКОМ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ В РЕСПУБЛИКЕ БЕЛАРУСЬ.

Смаль М П. 1, Ролевич А.И. 2, Красный С.А. 2, Гончарова Р.И. 1

1 Институт генетики и цитологии Национальной Академии наук Беларуси, ул. Академическая, д.27, Минск 220072, Республика Беларусь2 Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова, п. Лесной, 223040, Минский район, Республика Беларусь Е-mail: R.Goncharova@igc.bas-net.by

Рак мочевого пузыря (РМП) относится к распространенным онкологическим заболеваниям, частота обнаружения которого возрастает с каждым годом во всех странах. По клиническим и гистологическим критериям РМП разделяется на поверхностный и мышечно-инвазивный. Согласно литературным данным большинство опухолей ( до 75%) на момент постановки диагноза являются поверхностными и не представляют большой угрозы для жизни. При мышечно-инвазивном раке (≥pT2), несмотря на часто применяемую цистэктомию, наблюдается высокая смертность за 5-летний период. В тоже время у большинства пациентов с папиллярным поверхностным раком (до 70-80%) после трансуретральной резекции (ТУР) возникают одиночные или множественные рецидивы, а у части больных развивается мышечно-инвазивный рак. Необходимость длительного диспансерного наблюдения, частого проведения цистоскопий и профилактической иммуно- и химиотерапии обуславливает самые высокие затраты на лечение пациентов с поверхностным РМП по сравнению с другими типами раковых заболеваний. Прогноз развития болезни и выбор тактики лечения таких пациентов представляет большие трудности, поскольку стандартные клинико-патологические факторы прогноза не обеспечивают корректной стратификации пациентов на группы низкого, промежуточного и высокого риска (Sylvester et al., 2006).

РМП рассматривается как гетерогенная группа заболеваний и развитие уротелиальной карциномы определяется двумя различными молекулярно-генетическими путями. Первый путь обуславливает развитие поверхностного рака и характеризуется высокой частотой мутаций гена FGFR3 в опухолях рТа/Т1,G1/2, низким риском прогрессии и благоприятным клиническим прогнозом. Для мышечно-инвазивного рака характерно

26

преобладание мутаций гена TP53 и неблагоприятный прогноз. В ряде работ было показано, что мутации гена FGFR3 представляют ценный прогностический маркер опухолей с низким потенциалом злокачественности и коррелируют с благоприятным прогнозом, в том числе и для больных с мышечно-инвазивными опухолями, позволяя выделить подгруппу пациентов для органосохраняющего лечения. Целью нашей работы является характеристика молекулярно-генетического статуса гена FGFR3 у белорусских пациентов с РМП и разработка прогностической классификации больных, основанной на клинических факторах и мутационном статусе гена FGFR3. Были изучены первичные опухоли от 207 пациентов и рецидивные опухоли от 40 больных. Мутации определяли согласно multiplex SNaPshot assay (van Oers et al., 2005), детальное описание которого получено от Ellen Zwarthoff. Мутации гена FGFR3 выявлены в 42,5 % первичных опухолей, при этом для опухолей рТа зарегистрировано 63%, рТ1 – 52%, рТ2 – 26%, рТ3/4 – 6% мутаций. Распределение мутаций в соответствии со степенью дифференцировки опухолей было следующим: G1 – 63%, G2 – 40%, G3– 11%. Рецидивные опухоли в 52,5 % случаев имели мутации в гене FGFR3. В первичных опухолях обнаружено 6 различных мутаций, локализованных в экзонах 7 (87%), 10 (12%) и 15 (1%).

ВЛИЯНИЕ ДИОКСИДИНА НА УРОВЕНЬ ПОЛНОГЕНОМНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ IN VITRO.

Смирнихина С.А., Воронина Е.С., Лавров А.В., Бочков Н.П.

Учреждение Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН, ул. Москворечье, д. 1, Москва, 115478, РоссияE-mail: smirnikhinas@gmail.com

Наряду с изменениями на генном и хромосомном уровне при индуцированном химическом мутагенезе изменения также могут затрагивать и эпигенетический уровень. Доказано, что токсины и другие экзогенные вещества могут действовать на геном неспецифически (вызывая общее гипометилирование ДНК и гипоацетилирование гистонов) и специфически (вызывая гипо- и гиперметилирование определенных генов). Целью работы явилось изучение влияния диоксидина на полногеномное метилирование в культуре лимфоцитов периферической крови человека.Исследование проведено с участием 14 здоровых доноров в возрасте 20-40 лет. Через 24 часа после начала культивирования цельной крови доноров в культуру добавляли диоксидин в конечной концентрации 0,01 и 0,1 мг/мл. Через 1 час культуру отмывали и проводили оценку уровня метилирования с помощью метилчувствительного гель-электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК-комет») с дополнительным этапом рестрикции ферментами HpaII и MspI. Метилирование оценивали в лимфоцитах до культивирования, через 25 часов после начала культивирования, а также при добавлении диоксидина в двух концентрациях. Уровень метилирования определяли отношением процентного содержания ДНК в хвосте кометы при рестрикции обоими ферментами.Обнаружено, что до культивирования и через 25 часов культивирования уровень метилирования не различается (45,28% и 44,80%, соответственно). При добавлении диоксидина в малой концентрации происходит повышение уровня метилирования до 46,14% (р=0,0002). Диоксидин в концентрации 0,1 мг/мл приводит к уменьшению уровня метилирования в культуре лимфоцитов до 42,31% (p<0,0000001). Также отмечены значительные индивидуальные различия в уровнях метилирования как в норме, так и при воздействии диоксидина в обеих концентрациях. Неспецифическое

27

гипометилирование может вносить независимый вклад в увеличение геномной нестабильности под воздействием диоксидина, что в свою очередь является предпосылкой к развитию различных опухолей.

АНАЛИЗ ПРИРОДЫ ПОЛИМОРФНЫХ ФРАГМЕНТОВ, ОБНАРУЖЕННЫХ ПОСЛЕ КРИОСОХРАНЕНИЯ МЕТОДОМ ДЕГИДРАТАЦИИ.

Соловьева А.И., Осипова Е.С., Долгих Ю.И., Высоцкая О.Н.

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Ботаническая ул., 35, Москва 127276, Россия E-mail: slvjova.aleksandra@rambler.ru

В настоящее время хранение культивируемых in vitro тканей растений при температуре жидкого азота (–196°С) рассматривается как самый надежный способ долговременного сохранения генетических ресурсов. Вместе с тем, криосохранение – сложная, многостадийная процедура, включающая подготовку клеток, дегидратацию, замораживание в жидком азоте и восстановление тканей, в ходе которых клетки испытывают стресс и в результате могут возникать генетические изменения. Важно определить не только какие именно факторы криосохранения могут их вызывать, но и природу данных изменений генома.В нашем исследовании был проанализирован весьма перспективный для криосохранения тканей растений метод дегидратации. Для изучения использовали каллусы шести самопыленных линий яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) и протокол криосохранения, который был разработан в группе криосохранения отдела биологии и биотехнологии ИФР РАН. После каждого из этапов криосохранения (предкультивирование, дегидратация и замораживание-оттаивание) часть каллусов отсаживали на агаризованную среду для культивирования, оставшаяся часть переходила на следующий этап. Из каждого из вариантов для выделения ДНК были отобраны по две случайные пробы. Образцы ДНК анализировали по двум ISSR- и четырем REMAP-маркерам. В результате в единичных пробах одной из линий, отобранных после дегидратации и после замораживания-оттаивания, с помощью REMAP-метода было отмечено появление новых фрагментов идентичных по молекулярному весу. Полиморфные фрагменты были клонированы и секвенированы. Затем их нуклеотидные последовательности сравнили с последовательностями, имеющимися в базах данных. Согласно полученным данным последовательности двух полиморфных фрагментов, обнаруженных в пробах, полностью совпадают. Таким образом, появление новых фрагментов в обоих случаях происходило именно после дегидратации, и остальные воздействия стадий криосохранения не вызывали изменения ДНК-маркеров. С одного конца они фланкированы микросателлитным повтором, с другого – LTR ретротранспозона. Длина последовательности между праймерами у полиморфного фрагмента составила 24 нуклеотида. Поиск в базах данных позволил обнаружить сходство фрагмента с неидентифицированной последовательностью ДНК, принадлежащей геному мягкой пшеницы (T. aestivum) - BH759170 (клон из BAC библиотеки). Однако ввиду того, что обнаруженный фрагмент имеет очень малую протяженность, он может совпадать с большим числом нуклеотидных последовательностей ДНК генома мягкой пшеницы, в том числе несеквенированных к настоящему моменту времени. Таким образом, на основании поиска в базах данных сложно говорить о природе обнаруженных отклонений, но наиболее вероятной причиной является встраивание новой копии ретротранспозона, спровоцированной стрессом, испытываемым клетками во время дегидратации.

28

СЕКЦИЯ 2

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ

_____________________________________________________________

ЭКСПРЕССИЯ 1-ЦИС ПЕРОКСИРЕДОКСИНА В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ С РАЗЛИЧНОЙ МОРФОГЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ.

Акулов А.Н., Горшков О.В., Чернов В.М., Румянцева Н.И.

Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30, Казань, 420111, РоссияE-mail: akulov_anton@mail.ru

Пероксиредоксины относятся к ферментам антиоксидантной защиты и найдены у животных и растений. Они представляют собой тиоловые, негемовые пероксидазы и катализируют разрушение различных перекисей, в том числе гидроперекисей фосфолипидов и пероксинитритов. Среди изученных пероксиредоксинов растений 1-Цис пероксиредоксины (1-Цис ПР) экспрессируются преимущественно в тканях семени. Существующие данные позволяют говорить о тесной взаимосвязи между экспрессией 1-Цис ПР и его участием в зиготическом и соматическом эмбриогенезе. Целью работы являлось изучение экспрессии 1-Цис ПР в морфогенном и неморфогенном каллусах каллусе гречихи татарской. Морфогенный каллус гречихи татарской имеет типичный нодулярный морфотип и состоит из проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК) и "мягкого" каллуса, сохраняет морфологию, диплоидное число хромосом и способность соматическому эмбриогенезу в течение длительного времени культивирования. Неморфогенный каллус состоит и крупных паренхимоподобных клеток, отличается высокой скоростью роста, хромосомной изменчивостью и полным отсутствием способности к морфогенезу. Двумерный электрофорез растворимых белков каллусов с последующей идентификацией методом пептидного фингерпринта при использовании MALDI-TOF-масс-спектрометрии выявили наличие белка гомологичного 1-Цис ПР гречихи культурной только в морфогенном каллусе гречихи татарской. На основании имеющейся в GenBank последовательности кДНК гена 1-Цис ПР гречихи культурной были подобраны праймеры, проведена ПРЦ с использованием в качестве матрицы геномной ДНК морфогенного и неморфогенного каллусов, и установлено наличие гена 1-Цис ПР в геноме как морфогенного, так и неморфогенного каллусов. Дальнейший сиквенс полученных в результате ПЦР ампликонов не выявил отличий в первичной нуклеотидной последовательности этого гена у морфогенного и неморфогенного каллусов. Несмотря на наличие одинаковой последовательности гена 1-Цис ПР в морфогенном и в неморфогенном каллусе, в неморфогенном каллусе наличие мРНК этого гена выявлено не было. Отсутствие кодирующей мРНК гена 1-Цис ПР в

29

неморфогенном каллусе может быть связано как с изменением промоторного участка гена в результате мутации, так и с ингибированием его транскрипции различными эндогенными факторами.

Таким образом нами показано, что экспрессия 1-Цис ПР наблюдается в только в морфогенных культурах гречиха татарской, что позволяет говорить о его вовлечении воспроизводство ПЭКК и соматический эмбриогенез. Наши дальнейшие исследования будут направлены на выявление цитологической локализации и на установление возможных функций 1-Цис ПР в морфогенном каллусе гречихи татарской.

ПЕРОКСИД ВОДОРОДА – НОВЫЙ ВТОРИЧНЫЙ ПОСРЕДНИК ТИРОЗИНКИНАЗНЫХ РЕЦЕПТОРОВ.

Воротников А.В., Тюрин-Кузьмин П.А., Агаронян К.М., Морозов Я.И., Ткачук В.А.

Факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова, Ломоносовский проспект, д.31, корп.5, Москва 119192, РоссияЕ-mail: vorotnikov@fbm.msu.ru

В последнее время пероксид водорода рассматривается как новый вторичный посредник (second messenger), действующий в сигнальных каскадах, запускаемых тирозинкиназными рецепторами с поверхности клетки. Эта небольшая молекула удовлетворяет большинству критериев вторичных посредников, сформулированных около 40 лет назад Э. Сазерлэндом, получившим Нобелевскую премию за открытие цАМФ – первого вторичного посредника:

пероксид водорода образуется, действует и метаболизирует внутри клетки;

(1)он опосредует физиологические реакции клетки на активацию рецепторов;(2)при рецепторной активации изменяется его внутриклеточный уровень;(3)известен молекулярный механизм действия пероксида водорода;(4)у него есть специфические мишени в клетке.Однако пока остается неясным, как долго пероксидный сигнал поддерживается в клетке, где он локализован и как сопрягается с физиологическими реакциями клетки. В контексте этих вопросов, мы обнаружили, что ингибирование НАДФН-оксидазы плазматической мембраны, ответственной за образование Н2О2 в клетках, полностью снимает стимулирующее действие ростовых факторов на пролиферацию и миграцию клеток. Действие Н2О2 сопровождалось повышением силы и времени активации тирозинкиназных рецепторов и PI3-киназного каскада – главного регулятора направленного движения клеток. Чтобы проследить внутриклеточную динамику Н2О2 в живых клетках мы использовали HyPer – генетически-кодируемый внутриклеточный биосенсор к пероксиду водорода (Belousov VV et al., 2006, Nat Methods 3: 281-286). Мы выяснили, что динамика Н2О2 при активации рецепторов принципиально отличается от таковой при попадании в клетку внешнего Н2О2. Подавление рецептор-зависимой сборки НАДФН-оксидазы отменяло длительный перекисный ответ клетки, который был связан с эндосомальным компартментом и, вероятно, эндоцитозом активных рецепторов. Как следствие, ингибирование эндоцитоза блокировало рецептор-зависимую миграцию клеток. С помощью HyPer, генетически слитого с различными сигнальными молекулами, мы выяснили, что пероксид водорода избирательно образуется на переднем крае движущихся клеток. Изменение положения области накопления Н2О2 внутри клетки сопровождалось соответствующим смещением зоны псевдоподиальной активности и изменением направления движения клетки. Таким образом, пероксид водорода представляется новым

30

важным регулятором рецептор-зависимых сигнальных каскадов и направленного движения клеток.

ВЛИЯНИЕ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА РАЗВИТИЕ МЕХАНОРЕЦЕПТОРНЫХ КЛЕТОК НА МОДЕЛИ БОКОВОЙ ЛИНИИ DANIO RERIO.

Рафиева Л.М., Скаковская Е.С., Леусенко П.А., Гасанов Е.В.

Институт молекулярной генетики РАН, пл . Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияЕ-mail: zubocyte @ front . ru

Нейротрофины (НТФ) – семейство факторов роста, определяющих развитие и функционирование нервной системы (НС) позвоночных, включая специфические рецепторные системы, такие как органы зрения и слуха. Эти белки синтезируются в виде предшественников – пронейротрофинов (проНТФ), имеющих в своем составе пропептид и зрелую часть, определяющую нейротрофическую активность этих факторов роста. Биологические функции пропептидов, а также проНТФ на сегодня изучены недостаточно. Существуют данные, что проНТФ способны оказывать противоположные зрелым НТФ эффекты, в т.ч. запускать механизм программируемой клеточной смерти. Большая часть исследований действия зрелых НТФ и их предшественников выполнена на моделях in vitro и незначительная – ex vivo. В связи с этим поиск удобных моделей для исследования влияния нейротрофических факторов на развитие и функционирование нервной системы in vivo весьма актуален. Костистая рыба Danio rerio является одним из наиболее перспективных биологических объектов, моделирующих развитие и функционирование НС. Среди преимуществ D. rerio как модели: внеутробное развитие эмбриона, его доступность для различных манипуляций и наблюдений, возможность генноинженерных модификаций.

Один из ключевых нейротрофических факторов – фактор головного мозга, BDNF, у человека и рыбы практически идентичен: гены имеют схожую интронно-экзонную организацию, а уровень гомологии аминокислотной последовательности зрелых нейротрофинов ~92%, таким образом, костистая рыба D. rerio может использоваться в качестве системы, моделирующей биологическое действие BDNF in vivo. В частности, рецепторная система боковой линии (БЛ) D. rerio является признанным аналогом слухового аппарата человека. Функционально, фенотипически и генотипически чувствительные клетки БЛ соответствуют специфическим рецепторным клеткам, расположенным во внутреннем ухе человека. При этом БЛ рыб расположена на поверхности тела и, следовательно, доступна для наблюдения и различных манипуляций. Показано, что в клетках БЛ D. rerio в эмбриональный период развития экспрессируется специфический для BDNF клеточный рецептор – TrkB, однако роль различных форм нейротрофических факторов в развитии БЛ и органа слуха человека до настоящего времени не изучена.

Нами получены генетические конструкции, позволяющие экспрессировать в клетках рыбы D. rerio следующие варианты BDNF: зрелый нейротрофин, предшественник BDNF, непроцессируемый мутантный вариант предшественника, а также пропептид BDNF. Показано, что гиперэкспрессия всех перечисленных вариантов на ранних этапах эмбриогенеза не вызывает заметных патологических изменений. В то же время, с использованием флуоресцентных маркерных элементов продемонстрировано, что нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) влияет на

31

развитие механорецепторных клеток – основы сенсорной системы боковой линии Danio rerio.

THE ROLE OF INTERLEUKIN 23 IN COLITIS-ASSOCIATED AND SPONTANEOUS COLON CANCER.

Grivennikov S., Wang K., Mucida D, Jauch D, Yu G-Y, Eckmann L., Cheroutre H, Karin M

Department of Pharmacology and Department of Medicine, School of Medicine, University of California San Diego, La Jolla, CA, USALa Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA, USAE-mail:sgrivennikov@ucsd.edu

Colitis associated cancer (CAC) is a serious complication of inflammatory bowel diseases (IBD). Many of tumor-promoting effects of inflammation are mediated by cytokines produced in tumor microenvironment. Cytokines such as Interleukin-6 (IL-6) have profound effects on cancer cells themselves and stimulate their survival and proliferation. Other cytokines, such as IL-23 do not signal directly to epithelial cells but are critical to shape tumor environment and to stimulate the production of downstream pro-tumorigenic effector cytokines. These cytokines are also upregulated in murine and human spontaneous colorectal cancer (CRC). Using mouse model of azoxymethane-dextrane sulfate sodium induced CAC and conditional inactivation of APC gene in the colon as a model of CRC, we demonstrated that IL-23 is an important tumor promoter during CAC and CRC tumorigenesis. IL-23 is expressed by tumor-associated myeloid cells, and acts on various hematopoietic cells to trigger the production of pro-tumorigenic cytokines, such as IL-6, IL-17 or IL-22. These cytokines particularly act of intestinal epithelial and pre-malignant cells promoting their survival and proliferation. These cytokines also act on the cells of innate and adaptive arms of the immunity in the tumor microenvironment. In CAC model, IL-23 deficient animals demonstrated decreased tumor number and growth. In CRC model, the absence of IL-23 led to the significant decrease in tumor size. We concluded that IL-23 regulates multiple stages of colonic tumorigenesis, particularly tumor initiation and growth.

THE FT-LIKE ZCN8 GENE FUNCTIONS AS A FLORAL ACTIVATOR AND IS INVOLVED IN PHOTOPERIOD SENSITIVITY IN MAIZE. Meng X., Muszynski M.G., and Danilevskaya O.N Pioneer Hi-Bred International, a DuPont Business, Johnston, Iowa 50131-0552Department of Genetics, Development, and Cell Biology, Iowa State University, Ames, Iowa 50011-3260 E-mail:olga.danilevskaya@pioneer.com

The mobile floral-promoting signal, florigen, is thought to consist of, in part, the FT protein named after the Arabidopsis thaliana gene FLOWERING LOCUS T. FT is transcribed and translated in leaves and its protein moves via the phloem to the shoot apical meristem where it promotes the transition from vegetative to reproductive development. In our search for a maize FT-like floral activator(s), seven Zea mays CENTRORADIALIS (ZCN) genes encoding FT homologous proteins were studied. ZCN8 stood out as the only ZCN having the requisite characteristics for possessing florigenic activity. In photoperiod sensitive tropical lines, ZCN8

32

transcripts were strongly upregulated in a diurnal manner under floral-inductive short days. In day-neutral temperate lines, ZCN8 mRNA level was independent of daylength and displayed only a weak cycling pattern. ZCN8 is normally expressed in leaf phloem, but ectopic expression of ZCN8 in vegetative stage shoot apices induced early flowering in transgenic plants. Silencing of ZCN8 by artificial microRNA resulted in late flowering. ZCN8 was placed downstream of indeterminate1 and upstream of delayed flowering1, two other floral activator genes. We propose a flowering model linking photoperiod sensitivity of tropical maize to diurnal regulation of ZCN8.

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ НОВОГО УЧАСТКА ИНИЦИАЦИИ РЕПЛИКАЦИИ В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА.

Данцевич О.Н., Тарантул В.З., Холодий Г.Я.

Институт молекулярной генетики РАН, пл . Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияЕ-mail: odancevich@ya.ru

Репликация хроматина у человека контролируется сложным и тонким механизмом, нарушение которого влечет за собой нестабильность генома, наследственные и онкогенные заболевания. Разобраться в механизмах контроля репликации в ходе онтогенеза – крайне важная задача современной биологии. Ее решение невозможно без знания общих и специфических черт устройства цис-доминантных участков хроматина, где инициируется репликация ДНК. Даже сейчас, когда картина событий с участием каскада эволюционно консервативных белков на этапе инициации репликации прояснилась, и стало ясно, что эпигенетические факторы являются важной составляющей этого механизма, получены только первые данные по структуре участков инициации репликации ДНК (УИР) высших эукариот. Мы попытались заполнить этот пробел, предприняв попытку изучить структуру и функционирование нового УИР, расположенного вблизи локуса IFNA2 человека, и сделали первые шаги. Поскольку многочисленные попытки изучения УИР многоклеточных эукариот в составе автономно-реплицирующихся плазмид оказались безрезультатными (из-за их нестабильности в клетках соответствующих организмов), мы воспользовались специальным подходом. Мы перенесли изучаемый нами УИР в неприродное (эктопическое) место клеточного генома. Оказалось, что наиболее протяженная версия этого УИР (2067 п.н.) и его делеционные производные (1888, 1283 и 458 п.н.) были способны функционировать в эктопическом месте, причем примерно с одинаковой эффективностью. Найденная нами версия функционирующего УИР (458 п.н.) является самой короткой среди известных в настоящее время версий УИР многоклеточных эукариот.

33

НОВЫЕ ОНКОГЕНЫ И ГЕНЫ-СУПРЕССОРЫ В ОПУХОЛЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА.

Кавсан В.М. 1 , Арешков П.А.1, Баклаушев В.П.2, Балынская Е.В.1, Авдеев С.С.1, Чехонин В.П.2, Меклер A.А.3, Зозуля Ю.А.4

1Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, ул. Заболотного 150, Киев 03680, Украина, 2Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского, Кропоткинский пер. 23, Москва 119991, Россия3Институт мозга человека РАН, ул. академика Павлова 9, Санкт-Петербург 197376, Россия 4Институт нейрохирургии АМН Украины им. А.П. Ромоданова, ул. Мануильского 32, Киев 04050, УкраинаЕ-mail: kavsan@imbg.org.ua

Недавно обновленные списки раковых генов включают более 450 генов, которые, как полагают, причастны к развитию злoкaчeствeнных новooбразoвaний. В этой работе мы описываем идентификацию и характеристику новых онкогенов и генов-супрессоров, которые мoгут участвoвaть в развитии глиальных опухолей головного мозга человека. CHI3L1, кодирующий секретируемый хитиназа 3-подобный белок 1, и CHI3L2, кодирующий секретируемый хитиназа 3-подобный белок 2, oтнoсятся к генам с наиболее выраженным увеличением экспрессии в глиoмax. CHI3L1 уменьшает время удвоения клеток и позволяет им расти на мягком агаре независимо от подложки; стабильная экспрессия CHI3L1 делает человеческие эмбриональные клетки 293 онкогенными: эти клетки стимулируют инициацию опухолей после иx трансплантации в мозг крыс. Клетки 293_CHI3L1 отличаются от клеток 293, трансфицированных «пустым» вектором, размерами, способностью прилипать к культуральному планшету, расти в мягкoм aгape и coдepжaт активированныe киназы ERK1/2, локализованныe в цитоплазме и ядрах, a тaкжe прoтeин киназу B (AKT), локализованную только в цитоплазме. Cуперэкспрессия CHI3L1, вероятно, играет важную роль в онкогенезе глиальных и нeкoтopых дpугиx опухолей, которую можно использовать в качестве мишени, а ортотопическая имплантация трансформированных клеток человека с суперэкспрессированным онкогеном человека CHI3L1 в головной мозг крысы представляет собой новую модель человеческой опухоли головного мозга для разработки противоопухолевых препаратов.

Ген TSC22 является антагонистом онкогена CHI3L1 в глиальных опухолях головного мозга, его экспрессия снижена кaк на уровне мРНК, тaк и на уровне белка. TSC22 ингибирует пролиферацию клетoк и служит медиатором апоптоза, стимулированного TGFß1. Кинетику активации/инактивации сигнального пути МАРК, опосредованного ERK1/2, связывают со специфическими последствиями для cудьбы клетки. Белoк CHI3L2, близкород-ственный белку CHI3L1, также повышеннo экспрессируeтcя в глиальных опухолях на уровнях РНК и белка и стимулирует активацию МАРК через фосфорилирование ERK1/2 в клетках 293 и глиальных клетках U373. В отличие от кopoткoй активации фосфорилирования ERK1/2 с помощью CHI3L1, которая приводит к пролиферации (по аналогии с EGF в клетках PC12), активация фосфорилирования ERK1/2 с помощью CHI3L2 (по аналогии с NGF в клетках PC12) приводит к трaнcлокации фосфорилированных ERK1/2 в ядро и тормозит митогенез и пролиферацию, тем самым демонстрируя анти-онкогенные свойства CHI3L2. Добавление обоих белков ингибировало включениe [3H]тимидина в клетках 293 и U373, стимулированное добавлением лишь CHI3L1, и наоборот,

34

апоптoзный эффект CHI3L2 подавлялся при добавлении CHI3L1. Мы обсудим тaкжe некоторые другие гены, которые обладают онкогенной либо опухоль-супрессорной активностью, и иx вoзмoжнoe участие в развитии опухолей головного мозга человека.

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ПРИ РАКЕ РЯДА ЛОКАЛИЗАЦИЙ.

Карпухин А.В.1, Бавыкин А.С.1, Коротаева А.А.1, Шубин В.П.1, Апанович Н.В. 1, Ковнацкий И.О.1, Петерс М.В.2, Черняев В.М.2, Кашурников А.Ю.2, Зенит-Журавлева Е.Г.1, Завадский С.В.1, Сырцев А.В.1, Любченко Л.Н.2, Грицай А.Н.2, Матвеев В.Б.2, Тюляндин С.А2.

1 Медико-генетический научный центр РАМН, ул. Москворечье, д.1, 115478, Москва;2 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва;Е-mail: karpukhin@med-gen.ru

Накопленные к настоящему времени данные указывают на молекулярную гетерогенность раковых опухолей даже одной локализации. Однако конкретные характеристики такой гетерогенности недостаточно изучены. Помимо недостатка информации о механизмах злокачественной трансформации клеток, это обстоятельство затрудняет выбор оптимальных схем лечения и противоопухолевых препаратов. В частности, эффективное применение активно разрабатываемых ингибиторов действия генов, участвующих в развитии опухоли (таргетные препараты), возможно только на основе выяснения молекулярных особенностей опухоли каждого больного, что позволит индивидуализировать терапию.

В работе методом ПЦР в реальном времени изучали профили экспрессии генов, существенных для злокачественной трансформации клеток, при раке ряда локализаций – почки, предстательной и молочной желез, яичников, а также в культивируемых клетках колоректального рака. Гены, участвующие в ангиогенезе (VEGFR1, VEGFR2, VEGF121, PDGFRα, PDGFRβ), наиболее часто были активированы при раке почки. Профили их экспрессии различались при раке разной локализации и одновременная активация всех пяти генов не наблюдалась. Наиболее частой комбинацией одновременно активированных генов при раке молочной железы было сочетание VEGFR1 и PDGFRα, в то время как при раке почки наблюдали частое понижение экспрессии PDGFRα. Как правило, пониженная экспрессия гена PTEN, регулирующего по обратной связи путь PI3K/AKT/ mTOR, сопровождалась повышенной экспрессией PI3K и mTOR. В то же время, повышение экспрессии гена PTEN только примерно в половине случаев приводило к ингибированию экспрессии mTOR. То есть, альтернативный путь активации mTOR наблюдается довольно часто.Из полученных результатов следует наличие нередкой активации одновременно нескольких терапевтических генов-мишеней при всех изученных локализациях рака, что указывает на необходимость в этих случаях применения комбинированной терапии.Для нескольких линий культивируемых клеток колоректального рака показаны как различия профилей экспрессии, так и соответствующие им различия в ответе на ингибирование функции генов с помощью малых интерферирующих РНК и цитотоксическое воздействие.Изучены функциональные процессы в микроокружении опухоли и их связь с экспрессией генов в опухоли. Показано, в частности, координированное изменение уровней экспрессии генов-супрессоров BRCA1 и BRCA2 в злокачественной опухоли яичников и ткани ее ближайшего окружения.

35

СОЗДАНИЕ ЭКСПРЕССИОННЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НЕПРОЦЕССИРУЕМОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА НЕЙРОТРОФИНА BDNF.

Катломина Н.М. 1.2 , Шубин А.В.2, Гасанов Е.В.2, Рафиева Л.М.2

1 Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Миусская пл., д.9, Москва, 125047, Россия2 Институт молекулярной генетики РАН, пл . акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияЕ-mail: kat-nad7@mail.ru

Нейротрофины – семейство факторов роста, играющих ключевую роль в развитии и функционировании нервной системы. Эти белки синтезируются в клетках в виде предшественников – препронейротрофинов, имеющих в своем составе сигнальный пептид, N-концевую пропоследовательность и, собственно, зрелую часть, которая, как полагали долгое время, и обладает всеми свойствами, описанными для данных факторов роста. Сравнительно недавно было показано, что клетками секретируются не только зрелые нейротрофины, но и их проформы. При этом пронейротрофины, как оказалось, обладают собственной биологической активностью. В частности, показано, что в некоторых случаях проформы нейротрофинов могут запускать механизм клеточной смерти. Таким образом, пронейротрофины и зрелые белки способны оказывать противоположные эффекты на клетки, а процессинг в таком случае может служить своего рода механизмом регуляции функциональной активности нейротрофических факторов. Таким образом, детальное изучение предшественников нейротрофинов и их эффектов необходимо для понимания механизмов функционирования нервной системы человека в норме и при патологии.Ранее авторами был клонирован ген одного из ключевых нейротрофинов человека – нейротрофического фактора головного мозга, BDNF. Были разработаны прокариотические экспрессионные системы на основе E. coli для получения интактного предшественника (proBDNF), индивидуального зрелого белка (BDNFmat) и индивидуального пропептида (BDNFpro) этого фактора роста. Также были подобраны условия выделения, очистки и ренатурации этих белков, проанализирована их биологическая активность в системе ex vivo на двух разных клеточных моделях – HepG2, U373MG. Однако для адекватного изучения эффектов пронейротрофина BDNF созданных систем недостаточно. В первую очередь необходимо было разработать систему, позволяющую получать непроцессируемый предшественник BDNF. Для этого, используя метод ПЦР с перекрытием (overlapping PCR), были введены мутации в сайт узнавания пропротеин-конвертазами (сайт процессинга) - AVGA/RVRR. После чего было осуществлено клонирование полинуклеотидного фрагмента, кодирующего непроцессируемый proBDNF (proBDNFmut), в плазмидные векторы для эукариотической (под контролем цитомегаловирусного промотора) и прокариотической экспрессии (система E. coli pET/BL21-DE3). Таким образом, были разработаны две экспрессионные системы – прокариотическая и эукариотическая, позволяющие наработать непроцессируемую проформу BDNF.Для дальнейших исследований биологической активности предшественника BDNF будет использована линия клеток карциномы легкого человека А549, экспрессирующая весь набор рецепторов для этого фактора роста – специфический рецептор TrkB, универсальный рецептор всех нейротрофинов р75 и сортилин. Полученные экспрессионные векторы позволят изучить биологические эффекты как эндогенного

36

BDNF, так и добавленного извне. Для сравнительного анализа эффектов пронейротрофина BDNF будут использованы другие формы этого белка, а именно, proBDNF, BDNFmat и BDNFpro, экспрессионные конструкции для которых были получены ранее.

Работа поддержана грантами РФФИ №№ 09-04-00870-а, 11-08-01046-а.

ПОВЫШЕННЫЙ УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО БЕЛОК ЯДРЫШКА SURF-6, И ВЫЯВЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ ПАРТНЕРОВ SURF-6 В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА.

Кордюкова М.Ю., Малышева М.М., Моралева А.А., Шишова К.В., Ползиков М.А., Зацепина О.В.

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Российская Федеpация, 117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10E-mail: maria-ufa86@rambler.ru

Белок ядрышка SURF-6 (у человека 361 а.о, pI 10.51) относится к эволюционно консервативным и жизненно необходимым белкам эукариот, гомологи которого присутствуют в ядрышках разных биологических видов – от пекарских дрожжей до человека. На данный момент лучше всего изучены гомологи SURF-6 мыши и пекарских дрожжей, а SURF-6 человека практически не изучался. Нами показано, что ген SURF-6 практически не экспрессируется в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров, но начинает активно экспрессироваться после активации нормальных лимфоцитов к пролиферации in vitro. Содержание SURF-6 также повышено в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями по сравнению с нормальными лимфоцитами. Для изучения возможной функции белка SURF-6 в нормальных и опухолевых клетках человека мы клонировали кДНК Surf-6 человека в бактериальный экспрессионный вектор pGEX-2T. Рекомбинантный белок GST-SURF-6 экспрессировали в E.coli и очищали аффинной хроматографией. Очищенным белком иммунизировали мышей и впервые получили моноклональные антитела, специфичные к SURF-6 человека и мыши. Рекомбинантный белок GST-SURF-6 и антитела к SURF-6 использовали для выявления возможных белковых партнеров SURF-6 в клетках HeLa. Полученные результаты показали, что SURF-6 образует РНК-независимый комплекс с белками ядрышка B23/нуклеофозмином, Nop52 и EBP2. Согласно литературным данным, эти белки участвуют в процессинге второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) 47S пре-рРНК и созревании 28S рРНК. В пользу возможного взаимодействия SURF-6 с B23/нуклеофозмином, Nop52 и EBP2 in vivo свидетельствует их практически полная колокализация в ядрышках интерфазных клеток, выявляемая методом лазерной сканирующей микроскопии. В целом, полученные результаты говорят о том, что продукт экспрессии гена Surf-6 человека – белок ядрышка SURF-6, подобно дрожжевому гомологу белку RRP-14 и SURF-6 мыши участвует в процессинге ITS2 и сборке 60S рибосомных частиц. Связь SURF-6 человека с B23/нуклеофозмином свидетельствует о возможной вовлеченности SURF-6 в регуляцию клеточного цикла, а с белком EBP2 – в развитие инфекции, вызываемой вирусом Эпштейн-Барр. Работа финансировалась за счет средств грантов Министерства и образования РФ (ГК 14.740.11.0121 14.740.11.0116).

37

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ ГЕПАТИТА С С КЛЕТОЧНЫМИ МИШЕНЯМИ.

Кочетков С.Н.

Институт молекулярной биологии РАНE-mail:kochet@eimb.ru

ПОИСК НОВЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ВЛИЯНИЯ БЕЛКА S100A4 /MTS1 НА ИНВАЗИВНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК.

Кошелев Ю.А., Георгиев Г.П.

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН, ул. Вавилова, д. 34/5, Москва 119334, РоссияЕ-mail: yakoshelev@mail.ru

В ряде экспериментов было достоверно показано, что белок S100A4(MTS1) увеличивает клеточную подвижность и инвазивность опухолевых клеток, как in vitro, так и in vivo. Две наиболее обоснованные экспериментально гипотезы о механизме влияния S100A4 на эти процессы основаны на способности данного белка, во-первых, регулировать динамику сборки-разборки миозиновых филаментов in vitro и, во-вторых, индуцировать экспрессию и секрецию активных форм некоторых разрушающих внеклеточный матрикс металлопротеаз, как через взаимодействие с гипотетическими мембранными рецепторами, так и через активацию тканевого активатора плазминогена непосредственно на клеточной поверхности. Однако, обе эти гипотезы недостаточны для объяснения молекулярного механизма влияния S100A4/MTS1 на подвижность нормальных и инвазивность опухолевых клеток.Для обнаружения новых внутриклеточных взаимодействий S100A4 был использован метод аффинной хроматографии, где в качестве аффинного сорбента выступал рекомбинантный S100A4, иммобилизованный на бромциан-сефарозу. На аффинный матрикс наносили цитоплазматические фракции лизата клеток линий CSML-100 и CSML-0. Эти клетки имеют общее происхождение (карциносаркома молочной железы мыши), но клетки линии CSML-100 экспрессируют высокий уровень белка S100A4 и метастазируют в легкие в 100% случаев, а клетки линии CSML-0 не экспрессируют S100A4 на детектируемом уровне и не дают метастазов. Впервые было обнаружено селективное взаимодействие с S100A4-сефарозой септинов Sept2, Sept7 и Sept11, а также тяжелой цепи цитоплазматического динеина первого типа. Паттерн септинов, выделяемых на S100A4-сефарозе из цитоплазматической фракции лизата клеток линии CSML-0, не формирующих метастазы, отличается от паттерна, наблюдаемого в аналогичном эксперименте с использованием клеток линии CSML-100, обладающих высоким метастатическим потенциалом. Аффинная хроматография на S100A4-сефарозе в совокупности с хроматографией на Sept7/Sept6-Ni-NTA-сефарозе подтверждают возможность специфического взаимодействия эндогенного белка S100A4, экспрессируемого опухолевыми клетками, с гетеро-димерами и гетеро-олигомерами септинов, содержащими Sept7. Септиновые гетерофиламенты образуют в том числе и подмембранные комплексы, которые обеспечивают эволюционно консервативный механизм управления структурой и временной организацией больших

38

участков цитоплазмы под клеточной мембраной, идущий от дрожжей до клеток высших эукариот. Возможно, что в формировании выростов цитоплазмы и определении их дальнейшей судьбы важную роль играют комплексы, формирующиеся на филаментах, образованных Sept2/7/11, Sept2/7/6 или другими комбинациями различных септинов. Это происходит как при почковании дрожжей, так и при формировании ответвлений аксонов нервных клеток, а также при поляризации и направленном продвижении клетки через внеклеточный матрикс и эндотелий. Этот процесс, возможно, регулируется такими вторичными модификациями септинов, как фосфорилирование, на которое может влиять S100A4/MTS1. Конкретный механизм подобной регуляции еще предстоит выяснить в дальнейших исследованиях.

ПОДАВЛЕНИЕ ОШИБОЧНОГО СИНТЕЗА В ЭКСТРАКТАХ КЛЕТОК ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ SCOV-3 И HL-60 АПТАМЕРОМ IKL5 К ДНК-ПОЛИМЕРАЗЕ ЙОТА.

Лахин А.В., Тарантул В.З., Ефремова А.С., Шрам С.И., Генинг Л.В.

Институт молекулярной генетики РАН, пл . Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, Россия Е-mail: lahin 9@ mail . ru

ДНК-полимераза йота (Pol ι) относится к Y-семейству ДНК-полимераз и является крайне неточной, точность синтеза которой зависит от сиквенс-контекста матрицы. Во многих работах показано, что в опухолевых тканях различного происхождения отмечается резкое увеличение активности Pol ι. Данное повышение синтеза может обуславливать не только само злокачественное перерождение клетки, но и повышенную адаптивность опухоли в целом. В связи с этим нами с помощью процедуры in vitro SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) был получен РНК-аптамер с очень высокой аффинностью к Polι человека, обозначенный как аптамер IKL5. Показано, что аптамер IKL5 осуществляет эффективное ингибирование ДНК-полимеразной активности гомогенного препарата фермента. В то же время аптамер IKL5 не ингибирует гомогенные препараты ДНК-полимераз бета и каппа человека, демонстрируя тем самым высокую специфичность действия. С целью изучения ингибирующего воздействия аптамера IKL5 на активность Pol ι в клетках культуры, нами был охарактеризован синтез ДНК в опухолевых культурах клеток SCOV-3 и HL-60. Было показано, что экстракты этих клеток демонстрируют высокую активность Pol ι и способны продолжать синтез ДНК после неверно включенного ферментом нуклеотида. Добавление аптамера в реакционную среду в конечной концентрации 1 мкМ полностью подавляло продолжение синтеза ДНК после неверно включенного ферментом нуклеотида и значительно снижало активность Pol ι, вырожаюшуюся в образовании первичного продукта с неверно включенным нуклеотидом. При этом подавление активности Pol ι в клеточных экстрактах опухолевых культур клеток происходило без изменения общего характера синтеза ДНК прочими ДНК-полимеразами. Полученный результат демонстрирует возможность использования аптамера IKL5 как перспективное лекарственное средство нового поколения для подавления ошибочного синтеза ДНК, обусловленного активностью Pol ι, в целях предотвращения злокачественного перерождения клетки и снижения устойчивости опухолей к терапевтическим воздействиям.Работа поддержана грантом РФФИ 10-04-01-434а.

39

ВЛИЯНИЕ МЕЛАНОКОРТИНОВ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ПРО- И АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ В МОДЕЛЯХ ВОСПАЛЕНИЯ IN VITRO И IN VIVO.Марков Д.Д., Иноземцева Л.С., Яценко К.А., Долотов О.В., Гривенников И.А.

Институт молекулярной генетики РАН, пл. Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияE-mail: gorki - dm @ list . ru

Природные меланокортины и их синтетические аналоги являются важными регуляторами физиологических функций. Показано, что эти вещества регулируют процессы формирования памяти, модулируют половое и пищевое поведение, оказывают влияние на работу сердечно-сосудистой системы, обладают нейротрофическими и нейропротекторными свойствами, а также проявляют противовоспалительные эффекты. Такой широкий спектр свойств меланокортинов делает возможным их использование в качестве основы для создания лекарственных препаратов, воздействующих на различные патологии. В связи с этим, особо интересным представляется изучение молекулярных механизмов функционирования и тонкого взаимодействия иммунной и центральной нервной системы и роли меланокортинов в этом взаимодействии. К настоящему времени накоплен достаточно большой объем данных о важной роли воспалительных процессов в развитии различных патологий ЦНС, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона, инсульт, травматическое повреждение мозга. Несмотря на достаточно хорошо охарактеризованные нейропротекторные эффекты меланокортинов, механизмы этих эффектов изучены недостаточно. Целью нашей работы являлось исследование противовоспалительных эффектов меланокортинов в моделях воспаления in vivo и in vitro. Нами было показано, что α-меланоцитстимулирующий гормон (α-МСГ) в концентрации 1 мкM в присутствии бактериального эндотоксина (LPS) 100 нг/мл, достоверно снижает в культуре астроцитов гиппокампа крысы экспрессию мРНК фактора некроза опухолей альфа (TNFα) через 24 часа после введения. В то же время значимых изменений в уровне экспрессии других провоспалительных цитокинов (IL1 и IL6) и антивоспалительного цитокина (IL10) обнаружено не было. В экспериментальной модели воспаления in vivo при внутрибрюшинном введении α-МСГ (100 мкг/кг) и АКТГ1-10 (70 мкг/кг) обнаружено снижение экспрессии мРНК TNFα в образцах цельной крови крысы в присутствии бактериального эндотоксина (25 мкг/кг) через 1.5 часа после введения. Методом иммуноферментного анализа было показано значительное снижение уровня TNFα в плазме крови крысы как в присутствии α-МСГ, так и АКТГ1-10. Кроме того, в присутствии α-МСГ снижается экспрессия мРНК и другого провоспалительного цитокина – IL1. Эффектов АКТГ1-10 на изменение уровня экспрессии мРНК IL1 обнаружено не было.Полученные данные свидетельствуют о способности природных и синтетических меланокортинов регулировать экспрессию ряда провоспалительных факторов при развитии воспалительных процессов в центральной нервной системе и на периферии.Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 10-04-01804)

40

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ, ВОВЛЕЧЁННЫХ В ПАТОГЕНЕЗ ДИФФУЗНЫХ КРУПНОКЛЕТОЧНЫХ В-КЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОМ (ДКВЛ), ЧЕРЕЗ ПОИСК ГЕНОВ С ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ В ЛИМФОМАХ ДАННОГО ТИПА И БЕЛКОВ, ФИЗИЧЕСКИ ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С ПРОДУКТАМИ ЭТИХ ГЕНОВ.

Мартыненко А.В. 1, Максимов В.В. 2, Арман И.П. 1, Тарантул В.З. 1

1 Институт молекулярной генетики РАН, пл. акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, Россия2 Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», пл. акад. Курчатова, д.1, Москва 123182, РоссияE-mail: tarantul@img.ras.ru

Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ДКВЛ) – это агрессивный тип лимфомы. Этот диагноз ставится примерно в 24% случаев не-Ходжкинской лимфомы, что составляет около 5% всех случаев лейкемии. Понимание молекулярных механизмов патогенеза ДКВЛ создаёт основу для рационального дизайна лекарств против этого заболевания. Одним из подходов к изучению молекулярных механизмов данного типа лимфомогенеза является определение генов с повышенной экспрессией в ДКВЛ и белков, физически взаимодействующих с продуктами этих генов.Мы провели вычитающую гибридизацию библиотек кДНК двух ДКВЛ обезьян против библиотеки кДНК В-лимфоцитов здоровой обезьяны и обнаружили ряд генов с повышенной экспрессией в ДКВЛ обезьян. Эти гены можно условно разделить на 2 категории: (1) гены с известной функцией и (2) гены с неизвестной функцией. Среди генов с известной функцией выделяется группа генов, вовлечённых в синтез белка. Интересно, что многие из этих генов имеют внерибосомные функции, которые могут быть важны для лимфогенеза. В частности, нами было показано, что полиаденилированные транскрипты гена 16S рибосомальной РНК кодируют антиапоптотический пептид гуманин и высказано предположение, что гуманин является онкопептидом. Методом дрожжевого двухгибридного скрининга мы идентифицировали ряд белков, физически взаимосвязанных с гуманином. Oдин из этих белков – MPP8 – увеличивает инвазивность и подвижность опухолевых клеток. Мы подтвердили взаимодействие гуманина с MPP8 методом ко-иммунопреципитации in vivo и определили участки гуманина и MPP8, которые отвечают за это взаимодействие. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы выяснить роль взаимодействия между гуманином и MPP8 в лимфомогенезе.Работа поддержана грантом РФФИ 10-04-00656-а

СПЕЦИФИЧНЫЙ ОТБОР ФРАГМЕНТОВ ДНК С ПОМОЩЬЮ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПОВЫШЕННЫМ СРОДСТВОМ К МАТРИЦЕ. Михайлов В.С., Буланенкова С.С., Потапов В.К., Николаев Л.Г., Свердлов Е.Д.

Институт биоорганической химии РАН, ул. Миклухо-Маклая, ГСП-7, 16/10, 17997, Москва, РоссияE-mail: mihailov.vadim@gmail.com

Регуляция экспрессии генов представляет собой сложный процесс, в котором принимают участие как цис-регуляторные элементы генома, так и разнообразные белки

41

и их комплексы. Важную роль в регуляции играет пространственное расположение регуляторных элементов. Благодаря пространственному сближению за счет взаимодействий с белками и ДНК, регуляторные элементы, разделенные протяженными участками ДНК, получают возможность взаимодействовать друг с другом. Выявление такого рода ДНК-белковых взаимодействий является одной из актуальных задач современной молекулярной биологии. Одним из направлений исследований в данной области является разработка методов, позволяющих выявлять взаимодействие между пространственно сближенными в ядре участками ДНК, опосредованное белковыми комплексами. Нами был предложен подход, позволяющий отбирать ДНК-белковые комплексы, содержащие в своем составе фрагменты ДНК известной последовательности. Отбор основан на гибридизации 5’- или 3’-конца одной из цепей фрагмента-мишени с синтетическим олигонуклеотидом (strong binding oligonucleotide – SBO), содержащим в своем составе модифицированные нуклеотидные остатки. Олигонуклеотид ковалентно связан с молекулой биотина, что позволяет улавливать отобранные комплексы на носителе с молекулами стрептавидина. На первом этапе работы было показано, что при отборе фрагмента-мишени из смеси фрагментов геномной ДНК достигается 100-кратное обогащение данным фрагментом по сравнению с другими за один цикл отбора. Данный результат показывает потенциальную эффективность использования SBO для отбора ДНК-белковых комплексов с известными последовательностями ДНК.

УВЕЛИЧЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА SERPINB1A ПРИ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ.

Михайлова Т.В., Левандовская А.А., Саложин С.В..

Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН, ул. Бутлерова, д. 5а, Москва 117485, РоссияE-mail: tatyana.michailova@gmail.com

Показано, что для дифференцировки нейрональных стволовых клеток, нейросфер, миобластов и некоторых других типов клеток необходима активация каспазы-3. Данный фермент относится к группе эффекторных каспаз, вовлеченных в процесс запрограммированной клеточной гибели [A.C. LeBlanc, 2003]. Тот факт, что активация каспазы-3 при дифференцировке не приводит к апоптозу, говорит о существовании универсальных регуляторов активности данного фермента.Работу проводили на культуре клеток линии РС12 (клетки феохромоцитомы мозгового вещества надпочечников крыс). Индуцировали апоптоз (добавлением в культуральную среду стауроспорина) и дифференцировку (добавлением в культуральную среду фактора роста нервов). Исследовали изменение уровня экспрессии пяти генов, отвечающих за синтез ингибиторов протеаз (c-IAP1, c-IAP2, XIAP, Serpinb1a и StefinA2-like2). Достоверные различия в экспрессии, как при апоптозе, так и при дифференцировке клеток, были показаны только для гена serpinb1a (ингибитора сериновых и цистеиновых протеаз). Этот ген был выбран для дальнейшей работы по изучению влияния увеличения или уменьшения экспрессии ингибиторов протеаз на дифференцировку и клеточную гибель. Используя метод обратной транскрипции с последующей ПЦР получили ПЦР-продукт, соответствующий полноразмерной кДНК гена serpinb1a, причем на С-конец была добавлена последовательность, кодирующая Flag-эпитоп (DYKDDDDK). Продукт полимеразной цепной реакции был клонирован в

42

вектор, содержащий внутренний сайт посадки рибосомы (IRES) и ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), под контролем промотора CMV. Кроме того, были получены три конструкции, кодирующие короткие интерферирующие РНК к гену serpinb1a. Эффективность увеличения и подавления экспрессии проверяли методами иммуногистохимии и иммуноблотинга на трансфецированных клетках РС12. В дальнейших экспериментах мы планируем использовать данные конструкции для изучения роли исследуемого ингибитора в процессах дифференцировки и клеточной гибели.Работа выполнена при поддержке РФФИ № 09-04-01109-а.

ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ГЕНА GADD45 НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ И СТАРЕНИЕ DROSOPHILA MELANOGASTER.

Москалев А.А., Плюснина Е.Н.

Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, ул. Коммунистическая, д.28, Сыктывкар 167982, РоссияЕ-mail: amoskalev @ list . ru

Старение является неотъемлемой заключительной стадией онтогенеза многоклеточного организма. Одной из причин старения является возрастзависимое изменение экспрессии генов. Нами показано, что ген dGADD45 у дрозофилы, принадлежащий к высококонсервативному в эволюции семейству генов ответа на повреждение ДНК, с возрастом снижает свою спонтанную активность в 10 раз по сравнению с таковой у молодых животных.Конститутивная и кондиционная сверхэкспрессия дополнительной копии гена dGADD45 в нервной системе дрозофил привела к существенному увеличению медианной и максимальной продолжительности жизни самцов и самок дрозофилы. Величина продолжительности жизни положительно коррелировала с уровнем увеличения экспрессии гена в изучаемой ткани. При этом не наблюдалось ухудшения плодовитости или активности, однако устойчивость к оксидативному стрессу, тепловому шоку и голоданию увеличивалась.Проведенный компьютерный анализ генных сетей, ассоциированных с возрастзависимыми патологиями человека, показал ключевое значение генов семейства GADD45 в развитии нейродегенеративных заболеваний, атеросклероза, иммуностарения.

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЛИМФОМОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ГЕНА PUB (TRIM14).

Ненашева В.В., Андреева Л. Е., Ковалева Г. В., Макарова И. В., Новосадова Е. В., Хайдарова Н. В., Тарантул В. З.

Институт молекулярной генетики РАН, пл . Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияЕ-mail: nenasheva@img.ras.ru

Pub (TRIM14) относится к семейству TRIM (tripartite motif) белков, для которых характерно наличие так называемого TRIM мотива. Известно, что многие TRIM белки вовлечены в широкий спектр биологических процессов, включающих регуляцию

43

транскрипции, контроль клеточной пролиферации и дифференцировки, онкогенез и апоптоз, а также защиту клеток от вирусов (в частности, от ВИЧ). Функции принадлежащего к TRIM семейству гена pub, который был выявлен нами как специфичный для ВИЧ-ассоциированных лимфом, пока мало изучены. Ранее нами были получены линии эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши с повышенной и пониженной экспрессией гена pub. В данной работе мы выявили с помощью метода вычитающей гибридизации ряд генов, чья экспрессия изменяется в ЭС клетках мыши под действием повышенной экспрессии гена pub. В результате двух последовательных дифференциальных скринингов были отобраны следующие гены, повышенно экспрессирующиеся в клетках ЭС, трансфецированных pub по сравнению с контрольными ЭС: гены белка, ассоциированного с микрофибриллами (microfibrillar-associated protein 3 (Mfap3)), coiled-coil domain containing 99 (Ccdc99), ring finger protein 181 (Rnf181), белка теплового шока (Hsp90ab1), COP9 (constitutive photomorphogenic) homolog, subunit 4 (Arabidopsis thaliana) (Cops4), AT rich interactive domain 2 (Arid2), селенофосфат синтазы 2 (Sephs2), 3-гидрокси-3-метилглютарил-СoA лиазы (Hmgcl), alpha-глюкозидазы 2 (Ganab), family with sequence similarity 120, member A (Fam120a), proline rich 13 (Prr13), FK506 binding protein 3 (Fkbp3), субъединица p58 ДНК праймазы, timeless interacting protein (Tipin), high mobility group box transcription factor 1 (Hbp1); а так же гены, чья экспрессия понижалась в клетках ЭС, трансфецированных pub по сравнению с контрольными ЭС: гены динеина (Dync1h1) и негативного фактора элонгации TH1-like homolog (Drosophila) (Th1l). Некоторые из этих генов, по литературным данным, связаны с канцерогенезом (Ccdc99, Sephs2, Hsp90ab1, Ganab, Fam120a, Prr13, Fkbp3). Для других показано участие в ответе организма на действие вирусов (в частности, ВИЧ): Prr13, Tipin, Hbp1, Hsp90ab1, Ganab, субъединица p58 ДНК праймазы. Полученные данные подтверждают предположение об активном участие гена pub в вирус-ассоциированном лимфомогенезе.С целью изучения свойств гена pub in vivo нами были получены трансгенные вьюны (Misgurnus fossilis L.) с повышенной экспрессией гена pub человека под металлотионеиновым (МТ) и цитомегаловирусным (CMV) промоторами, а так же содержащие сконструированный нами слитый ген pub-GFP под CMV промоторами. По результатам 6 экспериментов на 3-5-й день развития зародышей вьюнов наблюдается небольшое увеличение количества аномальных особей по сравнению с контрольными, что может свидетельствовать о некотором негативном влиянии повышенной экспрессии гена pub на раннее развитие вьюнов.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПОПУЛЯЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ПРОТЕОСОМНОМУ ИНГИБИТОРУ, ПРОТИВООПУХОЛЕВОМУ ПРЕПАРАТУ БОРТЕЗАМИБУ.

Панищева Л.А.,. Какпакова Е.С, Рыбалкина Е.Ю., Ставровская А.А.

Институт канцерогенеза Российского онкологического научного центр имени Н.Н. Блохина РАМН, МоскваE-mail: panlidia@gmail.com

Одним из наиболее известных и уже применяемых в онкологической клинике протеасомных ингибиторов является бортезомиб (PS-341, Velcade). Механизмы и закономерности эволюции популяций малигнизированных клеток при воздействии бортезомиба не ясны. Целью данной работы является изучение участия транспортных

44

белков семейства АВС в ответе опухолевых клеток на бортезомиб и исследование эволюции популяций малигнизированных клеток при длительном воздействии препарата. В работе использованы линия клеток хронического миелолейкоза человека К 562 и ее сублиния, K 562/iS9, гиперэкспрессирующая Р-гликопротеин (Pgр); линия клеток эпидермоидной карциномы полости рта человека КВ 3–1 и клетки сублинии КВ 8–5, гиперэкспрессирующие Pgр, отобранные на резистентность к колхицину; клетки линии MCF7, аденокарциномы молочной железы человека. С помощью иммуноцитохимического анализа белков, иммунноцитохимического определения внутриклеточной локализации белка YB-1, Вестерн-блот-анализ, ОТ-ПЦР нами было показано, что в клетках KB 8-5 бортезомиб увеличивает количество фосфорилированной формы киназы Akt и снижает количество фосфорилированной ERK1/2 киназы. При сравнении резистентных (КВ 8-5) и чувствительных (КВ 3-1) клеток этот эффект наблюдали только в резистентном варианте. Мы обнаружили, что при продолжительном воздействии бортезомиба на клетки резистентной линии К562/i-S9 в популяции накапливались варианты с конститутивно активированной киназой Akt. После длительного культивирования в клетках наблюдалась повышение экспрессии Pgр и маркера стволовых кроветворных клеток CD34. Обработка бортезомибом клеток MCF-7 приводила к перемещению белка YB-1 из цитоплазмы в ядра клеток, однако бортезомиб не оказывал влияния на количество мРНК гена YB-1 в этих клетках.

Таким образом, бортезомиб оказывает влияние на активность киназы Akt при краткосрочном и длительном воздействии на резистентные за счет гиперэкспрессии Pgр клетки. По-видимому, гиперэкспрессия Pgр - элемент клеточного контекста, который может способствовать активации Akt под влиянием бортезомиба. Бортезомиб способствует накоплению вариантов с фенотипом стволовых кроветворных клеток (CD34+; Pgр). Обработка бортезомибом культур опухолевых клеток может индуцировать перемещение белка YB-1 в ядра многих клеток популяции и способствовать повышению активности белка YB-1 в качестве фактора транскрипции. Это может быть механизмом адаптации популяций малигнизированных клеток к бортезомибу.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ МИКРО РНК В КАЛЛУСНОЙ ЛИНИИ РАСТЕНИЙ THELLUNGIELLA SALSUGINEA ПРИ СТРЕССЕ.

Пашковский П.П., Сошинкова Т.Н., Радюкина Н.Л.

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, ул. Ботаническая, д.35, Москва 127276, РоссияE-mail: pashkovskiy.pavel@gmail.com

Изучение устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов остается одним из важных направлений физиологии растений. Регуляция стрессорного ответа может осуществляться на различных уровнях организации. Одним из важных элементов посттранскрипционной регуляции активности генов является механизм умолкания генов, обусловленный механизмами РНК-интерференции (РНКи). В последнее время стало очевидно, что в основе механизмов РНКи лежат процессы сайленсинга генов, обусловленные экспрессией малых РНК. Большая часть малых РНК экспрессируется в клетках растений для регуляции процессинга собственных белков в нормальных условиях и при стрессе. Известно, что miR398 является стресс зависимой микроРНК и способна регулировать экспрессию мРНК Cu/Zn-СОД, мРНК шаперона меди для СОД CCS1. Каллусные культуры, получая необходимые вещества из питательной среды, снижают свою ассимиляционную активность и, как следствие, в

45

некоторых случаях частично переходят к гетеротрофному питанию. Некоторые изоформы Cu/Zn-СОД (CSD2) имеют хлоропластную локализацию. Также известно, большая часть белков CCS1 также локализуются в хлоропластах. В связи с этим, можно предположить, что в каллусных культурах могут инактивироваться некоторые элементы регуляции метаболических процессов важных для целого растения. Для исследования конститутивной и стресс-зависимой экспрессии miR398 были проведены эксперименты по обработке метилвиологеном каллусных линий Th. salsuginea, выращенных в темноте и на свету. Содержание miR398 оценивали медом Нозерн-блот. В контрольных каллусах, произраставших в нормальных условиях, miR398 экспрессировались конститутивно. Под действием метилвиологена, на свету, экспрессия miR398 в каллусах снижалась в течение 24 часов. При обработке паракватом каллусов, выросших в темноте, ни конститутивной, ни стресс-индуцируемой экспрессии miR398 не наблюдалось. Таким образом, экспрессия miR398 обнаруживалась только в каллусах, произраставших на свету, что может указывать на инактивацию miR398 опосредованной регуляции генов в темноте. Это можно объяснить возможным переходом к гетеротрофному типу питания и деградацией хлоропластов, в каллусах, выросших в темноте. В каллусных линиях Th. salsuginea выросших на свету экспрессия miR398 носила стресс-зависимый характер и инактивировалась в первые часы после обработки паракватом.

ИНТЕГРИНЫ И БЕЛКИ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА В НОРМАЛЬНОМ МОРФОГЕНЕЗЕ ВОЛОСЯНЫХ ФОЛЛИКУЛОВ У МЫШЕЙ С57BL6.

Риппа А. Л., Воротеляк Е.А., Терских В.В.

Институт биологии развития РАН, ул. Вавилова, д.26, Москва 119334, РоссияЕ-mail: rippa 86@ yandex . ru

Межклеточные взаимодействия и взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом играют существенную роль в морфогенезе волосяного фолликула (ВФ). Их изучение позволит не только продвинуться в понимании клеточных механизмов фолликулогенеза, но и облегчить создание более совершенных систем культивирования для индукции формирования ВФ in vitro.Целью нашего исследования являлось сравнительное изучение экспрессии белков внеклеточного матрикса и рецепторов к ним в процессе формирования ВФ у линейных мышей дикого типа C57Bl6 и безволосых мутантов we/we/wal/wal. Мыши, двойные гомозиготы we/we wal/wal, рождаются с нормальной шерстью, волнистость которой начинает проявляться к 5-7 дню после рождения. На 14 день после рождения волосы начинают выпадать. К 21 дню постнатального развития все мыши we/we wal/wal имеют четко выраженную алопецию. В норме в развитии ВФ выделяют 8 стадий. Ранним свидетельством начала морфогенеза ВФ является образование эпителиальных плакод и нижележащих дермальных конденсатов. Далее эпителиальная плакода инвагинирует и окружает дермальный конденсат. В ВФ выделяют два места локализации стволовых клеток- выпуклость наружнего корневого влагалища (bulge) и дермальная папилла в луковице волоса. Представляет интерес выяснить, экспрессия каких белков ВКМ и рецепторов к ним характеризует эти области.Проведенные нами исследования показали, что эпидермальные плакоды отличаются пролиферативной активностью, судя по экспрессии маркера пролиферирующих клеток Ki67. На 16,5 и 18,5 день эмбрионального развития мышей дикого типа будущие ВФ

46

характеризуются заметной ассиметричной экспрессией Е-кадгерина. Дермальная составляющая была нами четко идентифицирована по эндогенной экспрессии щелочной фосфатазы. В наружном корневом влагалище волосяных фолликулов экспрессируются следующие интегрины: α5β1 и αvβ5. Базальные кератиноциты интерфолликулярного эпидермиса экспрессируют α5β1, αvβ5 и α1β1 интегрин. Все вышеперечисленные интегрины заметно экспрессируются в дермальной папилле и эмбриональной дерме. Базальная мембрана, окружающая формирующиеся волосяные фолликулы отличалась повышенной экспрессией ламинина 5.Полученные данные позволяют охарактеризовать морфогенез ВФ дикого типа с точки зрения динамики межклеточных и матрикс-клеточных взаимодействий и приступить к сравнительному анализу.

СИНЕРГИЗМ TOLL- И NOD-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ И ЕГО ЗНАЧЕНИЕ В ИНДУКЦИИ РЕАКЦИЙ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА.

Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С.

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации ул.Гамалеи 18, г.Москва,123098, РФE-mail: ldenisy @ yahoo . com

К настоящему моменту, у человека идентифицировано пять семейств паттерн-распознающих рецепторов (PRR): Toll-подобные рецепторы, лектиновые рецепторы С-типа, RIG-подобные рецепторы, NOD-подобные рецепторы, фикколины, а также пентраксины и коллектины, относимые к суперсемейству лектиновых рецепторов С-типа.Было установлено, что эти рецепторы, в отличие от Т- и В-клеточных рецепторов адаптивного иммунитета, узнают не уникальные эпитопы антигенов, а определенные высококонсервативные молекулярные структуры (паттерны) (pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)), находящиеся в составе клеток патогенных организмов.В качестве PAMPs могут выступать молекулы различной химической природы, такие, как липополисахарид (ЛПС) грамотрицательных бактерий, флагеллин, бактериальные липопептиды, бактериальная и вирусная ДНК и другие.На сегодняшний день получено множество данных, доказывающих участие данных паттерн-распознающих рецепторов в целом спектре иммунных реакций: усилении фагоцитоза, секреции антибактериальных пептидов, активации макрофагов, активации и созревании дендритных клеток, процессинге и презентации антигена дендритными клетками, активации зрелых T-клеток, повышении экспрессии костимуляторных молекул СD80 и CD86 (необходимых для активации наивных CD4+-T-клеток), пролиферации и созревания В-клеток во время инфекции, прямой активации B клеток памяти и последующей продукции антител, в том числе IgG, и других.В связи с тем, что в структуре патогенов присутствуют одновременно несколько патоген-ассоциированных паттернов, сегодня наиболее актуальным представляется изучение активации не отдельных изолированных паттерн-распознающих рецепторов, а их различных комбинаций, а также роли совместной активации PRR в формировании иммунных реакций организмаВ нашей работе было показано, что последовательная стимуляция NOD и TLR рецепторов по сравнению с изолированной стимуляцией данных рецепторов приводит к 5-10 кратному повышению уровня активации NF-kB в условиях in vitro и in vivo, а также

47

вызывает увеличение уровня секреции цитокинов в периферической крови и тканях тонкого кишечника. На модели инфекции мышей летальными дозами Salmonella typhimurium было показано, что животные, которым последовательно вводились лиганды NOD1 и TLR5 рецепторов, характеризовались повышенной выживаемостью по сравнению с животными, получавшими инъекции индивидуальных лигандов PRR.Полученные данные доказывают значимость совместного участия различных паттерн-распознающих рецепторов врождённого иммунитета в формировании эффективных защитных реакций организма и являются существенными для понимания одного из принципов функционирования иммунной системы.

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА.

Филатова Е.В. 1 , Шадрина М.И.1, Алиева А.Х.1, Карабанов А.В.2, Иллариошкин С.Н.2

1Институт молекулярной генетики РАН, пл. Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, Россия. 2Научный центр неврологии РАМН, Волоколамское ш., д.80, Москва 125367, РоссияЕ-mail: FilatovaEV@img.ras.ru

Заболеваниям нервной системы отведено важное место в работах по изучению роли генома при патологических процессах. Некоторые из таких заболеваний достаточно широко распространены, затрагивают важнейшие функции организма и приводят к быстрому наступлению инвалидности, а иногда и смерти больного. К числу тяжелых и распространенных неврологических патологий относится болезнь Паркинсона (БП). Оно имеет неуклонно прогрессирующее течение и обусловлено дегенерацией и гибелью дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции головного мозга. На данный момент выявлен ряд генов и определено несколько механизмов, объясняющих причины селективной и прогрессирующей гибели дофаминэргических нейронов. Однако до конца причины развития данного заболевания остаются не изученными. Поскольку регуляция любых процессов происходит на разных уровнях, изучение возможных изменений экспрессии различных генов при БП имеет важное значение для лучшего понимания патогенеза данного заболевания. В связи с этим нами начата работа по анализу изменения экспрессии как отдельных генов, так и больших массивов генов в периферической крови больных БП и на токсической модели БП. Работа ведется с использованием современных методов анализа: полимеразной цепной реакции в реальном времени и микрочиповых технологий.

48

ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ РИСКА РЕАЛИЗАЦИИ АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОГО ПОЛИКИСТОЗА ПОЧЕК У ДЕТЕЙ.

Фёдорова И.А. 1 , Зудина И.В.1, Иванова Е.В.1, Дерюгина Л.А.2, Рожкова Д.В.2

1Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского,ул. Астраханская, 83, Саратов, 410026, Россия2НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского,ул. Большая Казачья, д.112, Саратов,410012, Россия Е-mail: irina - genet @ rambler . ru

Аутосомно-рецессивный поликистоз почек является распространенным наследственным почечным заболеванием у детей и характеризуется кистозными изменениями собирательных канальцев почек и желчных протоков печени. Основными симптомами являются веретенообразные эктазии почечных и печеночных протоков, а также фиброз печени и почек. Причиной аутосомно-рецессивного поликистоза почек и врожденного фиброза печени служит возникновение мутаций в гене PKHD1 (M.Gunay-Aygun, M. Tuchman, E. Font-Montgomery et al., 2010). Диапазон клинических проявлений и прогноза тяжести заболевания широк: от мертворождений и смерти в неонатальном периоде до выживания и проявления во взрослом состоянии. Учитывая высокую степень риска перинатальной гибели, возникает необходимость в ранней и надежной пренатальной диагностике. В связи с некоторыми ограничениями в применении метода дородового УЗИ диагностику возможно провести с помощью молекулярной генетики. Идентификация гена PKHD1 служит основой для прямого тестирования мутаций.Цель исследования - поиск молекулярно-генетических критериев диагностики аутосомно-рецессивного поликистоза почек у детей. Исследованы кровь и биопсийный материал коркового и мозгового вещества почек абортированного плода (девочки) 25-26 нед. с аутосомно-рецессивным поликистозом почек и кровь родителей. Методом аллель-специфической ПЦР проанализированы последовательности экзонов 3, 32, 55 и 58 гена PKHD1. Не были обнаружены SNP в экзоне 3 (Genebank, rs28939383) и делеции в экзонах 32 (g.58890delC, c.3766delC) и 58 (g.337007delA, c.9689delA), которые, как предполагалось, могли быть причиной развития поликистоза у плода из-за смещения рамки считывания в исследуемом гене. Однако установлено, что девочка гомозиготна по мутантному аллелю G, расположенному в экзоне 55 (g.312171A>G, c.8581A>G). По мнению некоторых авторов (L.Furu, L.F.Onuchic, A.Gharavi et al., 2003), данная мутация приводит к замене серина на глицин в продукте гена PKHD1 и, как следствие, к нарушению его функции. Выявление и характеристика прогностических маркеров аутосомно-рецессивного поликистоза почек позволят повысить эффективность пренатальной диагностики данного заболевания.

49

ИЗМЕНЕНИЯ VEGF-ЗАВИСИМЫХ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ В ПРОЦЕССЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ.

Карамышева А.Ф., Калитин Н.Н., *Костюкова М.Н., *Тупицын Н.Н.

НИИ канцерогенеза, *НИИ клинической онкологии, Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Каширское шоссе, 24, Москва 115478, РоссияE-mail: aikaram @ yandex . ru

Факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) и связанные с ними сигнальные системы являются одними из основных регуляторов ангиогенеза, т.е. процесса образования новых сосудов из ранее существующих. Исследование факторов роста эндотелия сосудов и их рецепторов (VEGFR) приобрело особое значение в связи со способностью опухолевых клеток стимулировать ангиогенез для обеспечения растущей опухоли кислородом и питательными веществами. Идея подавления опухолевого неоангиогенеза привела к созданию антиангиогенных лекарственных препаратов, уже применяющихся в клинике. Вместе с тем, эффективность применения таких лекарственных средств зависит от состояния сигнальных систем, на которые направлено их действие. При этом активность сигнальных систем может изменяться в процессе опухолевой прогрессии и связанной с этим трансформацией клеток.Полученные в нашей работе данные указывают на то, что экспрессия как факторов роста VEGF, так и их рецепторов может в значительной степени меняться в процессе роста и развития опухоли. Так, у больных множественной миеломой (ММ) уровень экспрессии мРНК рецепторов VEGF падал в тех случаях, когда процент плазматических клеток в аспиратах костного мозга превышал 50-60%. Однако в вопросе о том, как связано процентное содержание плазматических клеток со степенью их трансформации, в настоящее время нет окончательной ясности. Мы сопоставили уровень экспрессии мРНК факторов роста VEGF и их рецепторов с экспрессией некоторых маркеров дифференцировки и рядом биологических характеристик 3-х культур клеток ММ: IM9, RPMI 1640 и RPMI 8226. Оказалось, что рецептор VEGFR1 экспрессирован только в клетках IM9, положительных по маркеру дифференцировки CD45 и негативных по CD56, тогда как в клетках RPMI 1640 и RPMI 8226 (CD45-/CD56+) экспрессия VEGFR1 отсутствует. Маркеры дифференцировки CD45 и CD56, по-видимому, связаны со степенью трансформации и прогрессией ММ. Существуют данные, указывающие на то, что прогноз выживаемости для больных ММ, у которых отсутствует экспрессия CD45, хуже, чем у CD45-положительных больных. С другой стороны, CD56 не встречается в нормальных плазмоцитах. И таким образом, возможно, что экспрессия рецепторов VEGF связана с дифференцировкой плазматических клеток и также может служить одним из показателей степени их трансформированности.

50

СОЗДАНИЕ ЛЕНТИВИРУСНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ЛОКАЛЬНОГО ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ДОФАМИНОВОГО РЕЦЕПТОРА 1 ТИПА У КРЫС ЛИНИИ WAG/RIJ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СВЯЗИ ДОФАМИНЭРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ И АБСАНСНОЙ ЭПИЛЕПСИИ.

Левандовская А.А., Белоусов А.И., Саложин С.В.

Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН, ул. Бутлерова, д.5а, Москва 117485, Россия. E-mail: blueflower@yandex.ruДофаминергичеcкая система – одна из основных медиаторных систем мозга. Она важна для мотивации, внимания, эндокринной регуляции и регуляции сна, отвечает за прием пищи, влияет на кратковременную и долговременную память, а также связана со многими патологиями нервной системы. Так, из литературных данных известно, что дофаминергическая система задействована в регуляции пик-волновых разрядов, служащих отличительным признаком малых эпилептических припадков [Deransart et al., 2000; de Bruin et al., 2001]. Результаты исследований поведения у крыс с малыми эпилептическими припадками, проведенные в нашем институте, указывают на нарушения работы дофаминэргической системы у этих животных, предположительно связанные с уменьшением уровня экспрессии рецептора дофамина первого типа [Базян А.С. и др.2001]. Кроме того, было показано, что инъекция агонистов дофаминого рецептора 1 типа (DRD1a) в прилежащее ядро приводит к снижению пик-волновых разрядов. Мы предполагаем, что локальное изменение количества рецепторов DRD1a будет иметь схожее действие, как и добавление агонистов.

Основная цель данной работы – исследование фундаментальных механизмов развития абсансной эпилепсии, более конкретно – роль рецепторов дофамина в развитии патологии. Мы планируем локально модулировать уровень экспрессии рецепторов дофамина первого типа в прилежащем ядре с помощью метода лентивирусной трансдукции in vivo. Для этого в нашей лаборатории были созданы и протестированы генетические конструкции для увеличения или, наоборот, подавления с помощью коротких интерферирующих РНК экспрессии рецептора дофамина первого типа. К настоящему моменту проведены эксперименты на культурах клеток НЕК293, а также на первичных культурах гиппокампальных нейронов. На следующем этапе мы планируем использовать созданные конструкции для получения суспензии лентивирусов и инъецировать ее крысам линии WAG/Rij (генетическая модель абсансной эпилепсии), после чего сравнить развитие патологии у контрольных животных и животных с измененным уровнем экспрессии рецептора дофамина первого типа.Работа поддержана грантом РФФИ 11-04-12137-офи-м-2011.

51

ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОГО БЕЛКА YB-1 НА РАЗМНОЖЕНИЕ И ПОДВИЖНОСТЬ КЛЕТОК ЛИНИЙ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

Моисеева Н.И., Стромская Т.П., Рыбалкина Е.Ю., Овчинников Л.П.*, Ставровская А.А.

Российский Онкологический Научный Центр имени Н.Н.Блохина РАМН, Каширское шоссе, д. 24, Москва 115478, Россия.*Институт белка РАН, ул. Институтская, д. 4, Московская область г. Пущино 142290, Россия.E-mail: N.I.Moiseeva@gmail.com

Многофункциональный белок YB-1, участвующий во многих ДНК/РНК-связанных событиях в клетке (транскрипция, сплайсинг, трансляция), продолжает оставаться перспективным прогностическим и предиктивным маркером при различных новообразованиях человека. Недавно при изучении белка YB-1 было обнаружено, что он может секретироваться клетками, выполняя функции ауто- и паракринного митогенного фактора. Эти результаты были получены на мезангиальных клетках почки и моноцитах (B. C. Frye et. al., EMBO reports, 2009). Представляется интересным изучение воздействия секретируемого белка YB-1 на судьбу метастатических опухолевых клеток рака молочной железы. Рекомбинантный белок YB-1 получен в Институте Белка РАН (Пущино). Мы исследовали влияние секретируемого белка YB-1 на разные линии клеток рака молочной железы человека (линии MCF-7 и BT-474) и иммортализованнх клетках молочной железы HBL-100. Изучаемыми параметрами были: скорость пролиферации клеток, движение в рану, выживаемость под действием цитотоксических препаратов, используемых в клинической практике. Основными дозами рекомбинантного белка YB-1 были 50 и 500 нг/мл. На всех исследуемых линиях показано увеличение скорости пролиферации клеток, но в разной степени. Стоит отметить, что эффект рекомбинантного YB-1 на пролиферацию более очевиден при сывороточном голодании культур. Рекомбинантый YB-1 не изменял устойчивость клеток к цитостатическим препаратам, для доксорубицина обнаружена тенденция к повышению чувствительности к препарату (линия MCF-7). Белок YB-1 увеличивал скорость закрытия раны в опытах с линией иммортализированных клеток молочной железы HBL-100. Наши опыты свидетельствуют в пользу того, что экзогенный белок YB-1 может влиять на агрессивность опухолевых клеток рака молочной железы.

52

СЕКЦИЯ 3

ТРАНСГЕНОЗ_____________________________________________________________

ТРАНСФОРМАЦИЯ РЫЖИКА ПОСЕВНОГО (CAMELINA SATIVA CRANTZ).

Захарченко Н.С.1, Каляева М.А.2, Бурьянов Я.И.1

1Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, пр-т Науки, 6, г. Пущино 142290, Россия. 2ArborGen. 180 Wesrvaco Road, Summerville, SC 29484, СШАE-mail:zachar@fibkh.serpukhov.su

Разработка методов трансформации ценных сельскохозяйственных культур имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение. Рыжик посевной или рыжей (Camelina sativa Crantz) – яровое масличное растение. Семена содержат около 29% масла, приравнимаемого по качеству к маслу кунжута. Ценность рыжикового масла заключается в высоком содержании ненасыщенных жирных кислот, которое достигает 91%, в высоком содержании жирорастворимых витаминов: 0.5 – 2.0 мг% каротиноидов, что значительно превышает их количество в подсолнечном, соевом и других маслах. Масло богато витамином Е - 104,9 мг%, который является мощным антиоксидантом. Рыжиковое масло производится с 2000 г и является продуктом диетического питания для больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Растение неприхотливо в возделывании, в основном его выращивают в Полтавской, Черниговской, Киевской и Херсонской областях. Площадь посевов и спрос на его семена за границей постоянно увеличивается. Кроме того, рыжик посевной можно использовать в биотехнологии растений, как хорошее модельное растение на уровне арабидопсиса. Для генетической трансформации использовали агробактерии GV3101(pMP90RK), содержащие вектор pGA482 с геном антибактериального пептида цекропина Р1. Ночную культуру бактерий разводили до оптической плотности 0.7 при 600 нм и добавляли до 0.01% Silwet L-77 (поверхностно-активное вещество). Для трансформации использовали цветочные незрелые почки. Растительные почки, находящихся в вазонах, помещали в суспензию агробактерий и выдерживали в условиях вакуума -0.8 Атм 5 мин. После этого растения переносили в теплицу и выращивали до образования семян. Полученные семена стерилизовали и проращивали на среде Мурисига-Скуга с 50 мг/л канамицина. Проростки анализировали с помощью ПЦР с праймерами к гену цекропина Р1. Анализ ДНК 25 растений показал наличие трансгена у 65% из них. Полученные трансгенные растения рыжика поколения Р0 были высажены в теплицу, доведены до цветения и получены семена Р1. Трансгенные растения, содержащие ген антибактериального пептида цекропина Р1, проявляли повышенную устойчивость к бактериальным и грибным фитопатогенным микроорганизмам: Erwinia carotovora и Sclerotinia sclerotiorum. Таким образом, используемый метод вакуумной инфильтрации цветочных почек позволил получить трансгенные растения ценной масличной культуры - рыжика посевного, что может способствовать увеличению урожая этого перспективного растения.Работа поддержана грантами РФФИ № 10-04-00037, 11-08-00413

53

КО-ТРАНСФОРМАЦИЯ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫМ МЕТОДОМ И АНАЛИЗ ИНТЕГРАЦИИ Т-ДНК С РАЗЛИЧНЫХ ВЕКТОРОВ.

Лебедев В.Г., Подрезов А.С., Ковалицкая Ю.А., Шестибратов К.А.

Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, проспект Науки, д.6, Пущино 142290, РоссияE-mail: vglebedev @ mail . ru

Трансгенные растения с сочетанием двух и более новых признаков, кодируемых перенесенными генами, приобретают все большее распространение в мире. Трансформация несколькими генами также необходима для придания растениям полигенных признаков и модификации сложных путей метаболизма. Кроме того, ко-трансформация различными генами с их последующим расщеплением в потомстве является удобным способом удаления селективных генов для обеспечения биобезопасности трансгенных растений. Особенный интерес представляет перенос нескольких генов в геном древесных растений. Например, этот способ может применяться для одновременного встраивания различных хозяйственно-ценных генов с генами индукции стерильности для предотвращения утечки генов с пыльцой. Мы провели ко-трансформацию осины (Populus tremula L.) и березы пушистой (Betula pubescens Ehrh.) различными генами и изучали частоту их ко-интеграции. В работе мы использовали систему, состоящую из бинарного вектора и обезоруженной Ti-плазмиды pCBE21 с двумя участками Т-ДНК, находящихся в одном штамме Agrobacteruim tumefaciens. Бинарные векторы, использованные нами, помимо селективного гена nptII содержали маркерный ген uidA (pBI121), ген глутаминсинтетазы сосны GS1 (pGS), ген ксилоглюканазы Xeg (pBI-Xeg) и РНК-интерференционную конструкцию для ингибирования экспрессии гена 4-кумарат-КоА-лигазы 4CL (pBI-4CL). Всего было получено и проанализировано более 40 трансгенных линий осины и около 30 линий березы. Частота ко-трансформации генами с Ti-плазмиды варьировала от 30 до 100%, причем ген из TL-области переносился в два раза чаще, чем из TR-области. Перенос генов из всех трех Т-ДНК был отмечен в среднем у 10% трансгенных линий, полученных после трансформации векторами pBI121 и pGS. При использовании вектора pBI121 частоты ко-трансформации генами с обоих областей Т-ДНК плазмиды рСВЕ21 были выше, чем при использовании вектора pGS. Схожие результаты были получены и на растениях, трансформированных векторными плазмидами pBI-Xeg и pBI-4CL. Полученные данные свидетельствуют о необходимости проверки трансгенных растений на перенос нецелевых нуклеотидных последовательностей, который может происходить с достаточно высокой частотой.

54

ТРАНЗИЕНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ И АКТИВНОСТЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ЙОТА ЧЕЛОВЕКА В РАННИХ ЭМБРИОНАХ ВЬЮНА MISGURNUS FOSSILIS L.

Макарова И.В.1, Козикова Л.В.2, Макарова А.В.2, Хайдарова Н.В.1, Ненашева В.В.1, Посохин А.В.3 , Казаков А.А.1, Генинг Л.В., Тарантул В.З.1, Андреева Л.Е. 1

1Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, пл. Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, Россия2 ГНУ ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, 196625 Санкт-Петербург-Пушкин, Московское шоссе 55а 3 Учреждение Российской академии наук Институт нанотехнологий и микроэлектроники РАН, Ленинский пр., 32А, МоскваE-mail: leandr@img.ras.ru

ДНК-полимераза йота человека (Pol ι) относится к Y-семейству ДНК-полимераз. Биохимической особенностью Pol ι млекопитающих является преимущественное включение дГТФ напротив Т ДНК-матрицы (метод “misGvA” – misincorporation of G versus A activity), что позволяет тестировать ее активность непосредственно в экстрактах органов животных по наличию двойной полосы напротив тимина матрицы (Генинг и др., 2006, Makarova et al., 2011). Ранее с помощью данного метода после инъекции в оплодотворенные икринки вьюна плазмиды pPINC, содержащей кДНК POLI, кодирующей Pol ι человека под контролем промотора CMV, была показана транзиентная активность трансгена у 2 – 15-суточных эмбрионов и личинок. Для прижизненного контроля над экспрессией трансгена была создана рекомбинантная конструкция pEGFP-POLI, кодирующая химерную Pol ι человека, слитую с зеленым флуоресцентным белком. Экспрессия трансгенов pPINC и pEGFP-POLI была подтверждена Вестерн-блот анализом. При введении плазмиды pEGFP-POLI в икринки вьюна EGFP-флуоресценция в эмбрионах коррелировала с наличием в их экстрактах “misGvA” активности Pol ι. Интенсивность прижизненного флуоресцентного свечения pEGFP-Pol ι и уровень “misGvA” активности в экстрактах у 2 – 5-суточных эмбрионов были выше у эмбрионов с аномалиями развития по сравнению с нормально развивающимися зародышами.С целью изучения влияния экспрессии Pol ι человека на жизнеспособность эмбрионов вьюна в икринки инъецировали плазмиду pPINC и контрольные плазмиды pCI-neo, pEGFP, pCMV-LacZ. Дополнительным контролем служили интактные зародыши и зародыши, инъецированные дистиллированной водой. На цитологических препаратах 4-суточных эмбрионов проводили анализ пролиферации и клеточной гибели по количеству делящихся клеток и пикнотических ядер. Показано, что у эмбрионов, инъецированных pPINC, количество пикнотических ядер достоверно выше (p<0,001) как у нормально, так и аномально развивающихся зародышей, по сравнению с эмбрионами контрольных групп. Особенно эта разница была ярко выражена среди аномально развивающихся зародышей.

55

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПЕРЕНОСА ДНК В МИТОХОНДРИИ РАСТЕНИЙ: УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТА И ИНТЕГРАЦИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ IN ORGANELLO И IN VIVO.

Милешина Д.В.2, Клименко Е.С.1, Катышев А.И.1, Шмаков В.Н.1, Черникова В.В.1, Кулинченко М.В.1, *Вебер-Лотфи Ф.2, Лактионов П.П.4, Дейнеко Е.В.3, Диетриш А.2, Константинов Ю.М. 1

1Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, ул. Лермонтова, д.132, Иркутск, 664033, Россия; 2Институт молекулярной биологии растений НЦНИ, ул. Генерала Циммера, д. 12, Страсбург, 67084, Франция; 3Институт цитологии и генетики СО РАН, пр. ак. Лаврентьева, 10, Новосибирск, 630090, Россия;4Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, пр. ак. Лаврентьева, д.8, Новосибирск, 630090, РоссияЕ-mail: yukon@sifibr.irk.ru

Разработка технологии переноса ДНК в митохондрии различных представителей эукариот, наряду с теоретическим приложением, в исследованиях функциональной роли отдельных генов и некодирующих последовательностей в составе митохондриальных геномов имеет важное прикладное значение, поскольку метод эффективной трансфекции митохондрий может быть не только использован для решения задач сельскохозяйственной и медицинской биотехнологии (создание новых типов ЦМС у сельскохозяйственных растений, клонирование в митохондриях генов, кодирующих применяемые в медицинской практике пептиды и др.), но необходим также в медицине, где он может применяться в генотерапии митохондриальных болезней. Поскольку обычные методы генетической трансформации не применимы к митохондриям, особый интерес представляют исследования механизмов природного транспорта нуклеиновых кислот в эти органеллы. Нами обнаружено, что митохондрии различных представителей эукариот (растений, млекопитающих и дрожжей) обладают природной способностью к активному поглощению (импорту) ДНК (Koulintchenko et al., 2003; Koulintchenko et al., 2006; Weber-Lotfi et al., 2009). В развитие этих исследований нами осуществлена детальная характеристика импорта и экспорта ДНК in organello в митохондриях растений (Solanum tuberosum) c использованием метода количественной ПЦР. Установлено, что митохондриальный транспорт рекомбинантной плазмиды pBluescript IIKS (+) размером 3050 п.н. и фрагмента размером 89 п.н. повтора LINE1 человека осуществляется при помощи разных мембранных механизмов. В то же время независимо от длины полинуклеотидной цепи транспорт ДНК в митохондрии является обратимым процессом. С целью разработки технологии переноса ДНК в митохондрии растений in vivo получена и использована в экспериментах генетическая конструкция NtPcob-sod3.1-IGR-cob* со свойствами интегративного вектора, включающая селективный и целевой гены под контролем митохондриальных промоторов. В качестве селективного гена нами использован модифицированный вариант гена апоцитохрома b табака, нуклеотидная замена G128T (G43V) в структуре которого (Ortega et al., 2000) обеспечивает устойчивость клеток к действию антимицина A. В качестве целевого гена использован ген кукурузы sod3.1, кодирующий Mn-содержащую супероксиддисмутазу. Перенос конструкции NtPcob-sod3.1-IGR-cob* биобаллистическим методом в каллусную культуру клеток и листовые высечки табака с последующей селекцией трансформантов на среде с антимицином А позволил получить каллусные линии, сохраняющие высокую скорость роста в

56

присутствии антибиотика в отличие от контрольных нетрансформированных линий. ПЦР-анализ ДНК трансформантов показал наличие в клетках 8 из 56 трансформированных каллусных линий гетерологичной последовательности гена sod3.1 кукурузы и интеграцию элементов конструкции в митохондриальный геном табака.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (№ 09-04-00992), Президиума РАН (проект ФНМ-16) и Интеграционных проектов СО РАН (проекты №№ 7, 83, 98).

ПРИНЦИПЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО РАСПОЗНАВАНИЯ И НОБЕЛЕВСКАЯ ПРЕМИЯ 2011.

Недоспасов С.А.Институт молекулярной биологии РАНSergei.nedocpasov@googlemail.ru

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ДЛЯ ФИТОРЕМЕДИАЦИИ.

Орлова Е.В. 1 , Степанова А.Ю.1, Терешонок Д.В.1, Осипова Е.С.1, Долгих Ю.И.1, Картель Н.А.2

1Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН; ул. Ботаническая 35, Москва, 127276, Россия2Институт цитологии и генетики НАН Беларуси, ул. Академическая, 27, Минск, 220072, Республика БеларусьE-mail: ekatia @ inbox . ru

В настоящее время для фиторемедиации актуально использование трансгенных растений, что позволяет интенсифицировать процесс удаления загрязнений из почвы по сравнению с обычными растениями. Рамнозилтрансфераза – фермент, участвующий в образовании рамнолипидов, которые, являясь наиболее эффективными природными поверхностно активными веществами, биосурфактантами, используются для удаления гидрофобных веществ из загрязненных почв. Конструкция с одним из таких генов - геном рамнозилрансферазы (rhlA) из Pseudomonas aeruginosa - была создана в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси. Целью нашей работы является повышение эффективности экспрессии целевого гена путем модификации генетической конструкции. В работе были поставлены следующие задачи: создание генетической конструкции с геном rhlA, агробактериальная трансформация растений табака (Nicotiana tabacum cv. Petitе Havana) и проверка их фиторемедиационных свойств. В нашей работе в качестве вектора использовали плазмиду pBI121. Были предложены три модификации генетической конструкции: в первом случае перед старт-кодоном целевого гена (rhlA) была встроена консенсусная последовательность Kozak, которая по данным многих авторов, способствует увеличению экспрессии генов в несколько раз; во втором случае была введена нуклеотидная последовательность, соответствующая upstream region; в третьей конструкции перед старт-кодоном не было введено никакой дополнительной нуклеотидной последовательности. Все три конструкции были встроены в штаммы Agrobacterium tumefaciens: LBA4404, EHA105, AGL0. Трансформацию проводили путем инкубации эксплантов (листьев табака) на

57

газоне Agrobacterium tumefaciens. Канамицин-устойчивые растения проверяли методом ПЦР, экспрессию введенных генов – ОТ-ПЦР. Было показано, что частота появления ПЦР-положительных растений была примерно одинакова для всех использованных векторов и составляла 30-38%. После проверки ПЦР-положительных растений методом ОТ-ПЦР было выяснено, что только в случае трансформации листьев табака штаммом EHA 105, содержащим вектор с консенсусной последовательностью Kozak, были получены растения с транскрипцией целевого гена rhlA. Полученные трансгенные растения и контроль (растения-регенеранты, содержащие ген nptII) были испытаны в условиях нефтяного загрязнения. Было показано, что введение целевого гена rhlA способствовало повышению фиторемедиационных свойств табака. У всех трансгенных растений степень деградации нефти по окончанию эксперимента была в два раза выше, по сравнению с растениями контрольной группы, что свидетельствует о перспективности получения растений с геном рамнозилтрансферазы.

ОБРАЗОВАНИЕ ХИМЕРНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ РАПСА.

Ралдугина Г.Н., Хоанг Тхи Жанг

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Ботаническая ул., д.35, Москва 127276, Россия E-mail: galina @ ippras . ru

В настоящее время трансформация растений является одним из главных направлений в исследовании биологии растений и является ключевым практическим методом для улучшения с/х культур. Она позволяет решать коренные задачи селекции биологических объектов на устойчивость, высокую продуктивность и качество продукции. Однако при трансформации растений существует достаточно много проблем, в том числе и проблема повышения эффективности генетической трансформации. Растения-трансформанты часто бывают химерными по трансгенам, т.е. их ткани состоят как из трансформированных, так и из нетрансформированных клеток. Это явление затрудняет дальнейшую работу с полученными трансформантами, т.к. возникают сложности при наследовании встроенных генов, не передавая свойства трансгенности последующим поколениям растений. Поэтому для получения генетически однородных растений-трансформантов очень важно знать, в каких случаях образуются химерные растения, чтобы исключить причины их образования. Целью нашей работы являлось выяснение зависимости формирования химерных растений-трансформантов от генотипа и ткани используемого экспланта. С помощью Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0, содержащих генетическую конструкцию с маркерным геном gfp, трансформировали семядольные и листовые экспланты двух сортов рапса (Вестар и Подмосковный). Флуоресценцию GFP наблюдали в флюоресцентном микроскопе или лупе при освещении синим светом (440-480 нм). Наследуемость трансгена gfp изучали с помощью ПЦР. При проведении анализа 1-го семенного поколения растений-трансформантов было обнаружено, что у 70% полученных трансгенных линий расщепление отклонялось от ожидаемого расщепления по менделевской наследственности для моногенного признака, или вообще не имелось трансгенных потомков, хотя у растений Т0 было доказано наличие и экспрессия трансгена с помощью ПЦР и микроскопического анализа. При изучении наследования у растений-регенерантов, полученных из ткани листовых эксплантов обоих исследованных сортов, трансгены отсутствовали во всех растениях-потомках. При трансформации семядольных эксплантов число растений с неменделевским наследованием составляло от 2 до 70%

58

трансформантов в зависимости от возраста проростков, используемых для получения эксплантов, а также от сорта рапса. Таким образом, можно предположить, что большинство полученных нами при трансформации растений-регенерантов являются химерными, «расхимериваясь» при образовании цветоносных побегов, т.е. разделяясь на составляющие генотипы с преобладанием нетрансформированных клеток, а основным фактором образования химер являлся тип ткани экспланта.

РОЛЬ БЕЛКА КАИЗО В ФОРМИРОВАНИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ ПОЗВОНОЧНЫХ.

Шумская В.С., Прохорчук А.В.

Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН 117312 Россия, Москва, пр-т 60-летия Октября д.7, корп.1. Е-mail: shumskaya87@mail.ru

Метилирование является общим для позвоночных организмов процессом, одна из основных функций которого заключается в фиксации транскрипционно неактивного состояния генов. Белок Каизо является белком, специфично узнающим метилированные районы ДНК. Своими доменами «цинковый палец» Каизо связывается с метилированным участком ДНК и привлекает к ней репрессионные комплексы за счет BTB/POZ домена, например корепрессор NCoR в комплексе с гистоновой деацетилазой. Каизо также является парнером катенина p120, белка, связывающегося с Е-кадxерином, участвующим в регуляции клеточной адгезии. Генетический нокаут Каизо у мышей не приводит к ярко выраженному фенотипу, однако у них наблюдается устойчивость к возникновению рака кишечника в модели APC/Min. Было показано также, что у лягушек, Xenopus laevis, Каизо необходим для нормального развития, уменьшение его количества приводит к активации транскрипции генов зиготы на две стадии раньше стадии средней бластулы эмбриогенеза, поэтому эмбрионы не могут преодолеть стадию гаструляции, развивается апоптоз и эмбрионы погибают.

Известно, что белок Каизо убиквитарно экспрессируется в различных органах мыши. Однако уровень эксперссии Каизо сильно варьируется между различными типами клеток, например, в фибробластах Каизо экспрессируется на базальном уровне, в то время как в стволовых клетках его уровень экспрессии в несколько раз выше. При тестировании клеток тестисов мышей нокаутных по Каизо и дикого типа на микрочипах показана значительная разница в уровнях экспрессии значительного числа генов у дикого типа и нокаута. Для того чтобы определить гены, в регуляции уровня экспрессии которых принимает участие белок Каизо на разных стадиях развития и дифференцировки клеток от стволовых до специализированных, мы дифференцируем мышиные эмбриональные стволовые клетки (ES) (нокаутные и дикого типа) in vitro, и, используя метод иммуномагнитного сортинга, характеризуем различия в уровне экспрессии генов при помощи экспрессионных микрочипов. Для оценки скорости регенерации стволовых клеток тестисов, во время восстановления сперматогенеза у взрослых мышей мы вводим мышам бусульфан (алкилирующий мутаген). В результате мы наблюдаем не только деградацию сперматогенеза, но и как побочный эффект химеотерапии выпадение шерсти у животных дикого типа, но не у животных 102 линии. Это позволяет предположить, что Каизо может быть вовлечен в активацию P53-зависимого апоптозного пути, который в нокаутных животных не активируется, либо у этих животных изменена скорость регенерации волосяного фоликула.

59

Для определения локализации белка Каизо в органах и разных отделах мозга мы использовали метод иммуногистохимии. Было показано присутствие Каизо в эпителиальнах клетках матки, пищевода, трахеи, эпидидимуса, кожи, в тимусе и молочной железе и др., а также в различных структурах мозга. Более детальное изучение распределения Каизо в органах и мозге даст нам возможность судить о специфичности локализации в определенных типах клеток, позволит оценить общность процессов, протекающих в данном типе клеток, что укажет в итоге на гены, в регуляции экспрессии которых участвует белок Каизо.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ СОРГО IN PLANTA И В КУЛЬТУРЕ IN VITRO.

Эльконин Л.А., Носова О.Н., Итальянская Ю.В.

Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока Россельхозакадемии, ул. Тулайкова, д.7, г. Саратов, 41010, РоссияE-mail: lelkonin@gmail.com

Изменение состава запасных белков эндосперма является одним из важнейших направлений селекции растений, обеспечивающим повышение питательной ценности зерна. Особую актуальность эта проблема представляет для сорго – уникальной по своей засухоустойчивости злаковой культуры, характеризующейся сравнительно низкой перевариваемостью запасных белков (кафиринов). Генная инженерия предоставляет большие возможности для решения этой задачи. Однако высокоэффективная генетическая трансформация у сорго, несмотря на значительное количество сообщений о получении трансгенных растений, остается серьезной проблемой. Основными препятствиями являются низкая частота регенерации трансгенных растений и интенсивный сайленсинг трансгенов.Для изучения разных подходов к решению этих проблем нами проводились эксперименты по генетической трансформации двух фертильных линий зернового сорго, Желтозерного 10 и КВВ 114, с использованием штамма Agrobacterium tumefaciens AGL0/p35SGIB (Pniewski, Kapusta: J Appl Genet, 2005, 46: 139-147). Данный штамм содержит в составе Т-ДНК гены bar и gus-intron под контролем nos и 35S-промоторов, соответственно. В наших экспериментах были использованы разные методы агробактериальной трансформации: in planta, путем инокуляции цветущих метелок (Эльконин и др., Биотехнология, 2009, № 1:23-30), и широко используемый метод инокуляции незрелых зародышей в условиях культуры in vitro с получением эмбриогенного каллуса и регенерацией растений. В обоих методах для активации vir-генов агробактериальную клеточную суспензию перед инокуляцией выращивали в среде АВ с добавкой ацетосирингона при t0 22-230 C.Метод, основанный на использовании техники культуры in vitro, был эффективен для получения трансгенных растений у линии Желтозерное 10, незрелые зародыши которой после сокультивирования с агробактериальной суспензией формировали быстро растущий эмбриогенный каллус на среде M11 (Elkonin, Pakhomova, PCTOC, 2000, 61: 115-123 ). Ключевым фактором получения трансгенных растений был низкий уровень селективного агента (глюфосината аммония) в среде для выращивания эмбриогенного каллуса и его полное отсутствие в среде для регенерации. В таких условиях частота незрелых зародышей, продуцировавших каллусы, из которых были регенерированы трансгенные ПЦР-положительные растения, составляла в среднем 4.5%. Потомство таких растений проявляло устойчивость к выращиванию на питательной среде, содержавшей глюфосинат аммония. У линии КВВ 114, незрелые зародыши которой не способны к формированию

60

эмбриогенного каллуса, трансгенные растения были получены путем инокуляции цветущих метелок. В потомстве каждой инокулированной метелки частота ПЦР-положительных трансгенных растений, выживших после обработки листьев раствором гербицида БАСТА, составляла в среднем 1%. В потомстве таких трансгенных растений присутствовали ПЦР-положительные проростки, устойчивые к глюфосинату аммония.Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант 10-04-00-475.

61

СЕКЦИЯ 4

ГЕНОТЕРАПИЯ И ГЕНОДИАГНОСТИКА

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕГРАДАЦИИ АНТИГЕНОВ.

Габибов А.Г.

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков РАН М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва Е-mail: gabibov@ibch.ru

РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ ПЕРВОГО ГЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ.

Деев Р.В. 1 , Киселев С.Л.1, Исаев А.А.1, Калинин Р.Е.2, Червяков Ю.В.3, Мжаванадзе Н.Д.2, Нерсесян Е.Г.3, Грязнов С.В.2, Староверов И.Н.3, Швальб П.Г.2

1Институт стволовых клеток человека, ул. Губкина д. 2, стр. 3, Москва 199911, Россия2ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова», ул. Высоковольтная д. 9, Рязань3ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия», Революционная д. 5, 150000, ЯрославльЕ-mail: romdey @ gmail . com

В рамках регистрационных действий проведены 1-2а и 2б-3 фазы клинических исследований отечественного геннотерапевтического препарата «Неоваскулген». В исследование было включено 144 пациента (119 – в клиническую группу и 25 – в контрольную) c хронической ишемией нижних конечностей IIа-III ст. (по А.В. Покровскому-Фонтейну). Препарат вводился двукратно внутримышечно, в дозах 1,2 мг, максимально близко к зонам ишемии, с интервалом 7 или 14 сут. У пациентов контролировали: длину безболевой ходьбы (ДБХ), лодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ), транскутанно определяемое напряжение кислорода (ТКНК), линейную скорость кровотока (ЛСК) в пораженном сегменте, ангиографию, качество жизни по опроснику SF-36. Исследование было рассчитано на 6 мес. Установлено, что ДБХ увеличивается на 110%, что статистически значимо отличается от контроля (Р=0,000). По остальным критериям эффективности в клинической группе получены следующие данные: ЛПИ - прирост 11,11% (Р=0,000); ТКНК - прирост 11,38% (Р=0,000); ЛСК – прирост 55,12% (Р=0,000). Ангиографически определяется усиление контрастирования микроциркуляторного русла за счет новообразованных коллатеральных сосудов по сравнению с исходной картиной. У пациентов клинической группы установлено статистически значимое улучшение физического компонента здоровья (Р=0,000) и

62

наблюдается тенденция к улучшению психологического компонента здоровья (Р=0,241). При интегральной оценке результатов лечения показано, что частота успешных исходов за период 6 мес. в клинической группе (94,0%) была значимо больше, чем в контрольной - 37,5% (Р=0,000). Таким образом, следует констатировать эффективность применения препарата Неоваскулген для пациентов с ХИНК IIa-III стадии по А.В. Покровскому-Фонтейну.

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МАРКЕР ГЕН HUMARA В ДИАГНОСТИКЕ КЛЕТОЧНОЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ У БОЛЬНЫХ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ СИСТЕМЫ КРОВИ.

Ермакова Т.А., Мисюрин А.В., Цыба Н.Н., Михайлова Е.А., Колодей С.В., Цветаева Н.В.

ФБГУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития РФ, Новый Зыковский проезд, д.4а, Москва 125167, РоссияE-mail: tanyaswi @ yandex . ru

Идентификация моно/поликлонального гемопоэза у женщин по полиморфным локусам гена HUMARA применяется в медицинских европейских центрах при подозрении на опухолевую пролиферацию лейкоцитов при гемобластозах наряду с цитогенетическими методами оценки клональной эволюции клеток.Цель настоящей работы - выявить и оценить моноклональную пролиферацию лейкоцитов у женщин, больных различными гематологическими заболеваниями методом ПЦР гена HUMARA и оптимизировать выделение ДНК для скрининговой диагностики. Для решения поставленной задачи использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови здоровых и больных женщин с последующим расчетом аллельных отношений (А/О) аллельных локусов гена HUMARA. Женщины с одинаковыми аллелями гена исключались из исследования. Референсными значениями нормы А/О являлись: мин А/О – 0,65 и макс А/О – 1,70. Интервал этих значений характерен для группы здоровых женщин. Чувствительность метода составила 10%. Исследовали кровь 15 здоровых женщин в качестве нормы, 16 больных женщин с хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в качестве положительного контроля, а также 28 женщин с различными заболеваниями системы крови. Наряду со стандартной фенольной экстракцией ДНК был использован набор “ДНК-экстракт” (Гентех, Москва) для выделения ДНК из лейкоцитов 7 больных с целью сокращения времени проведения исследования. Результаты. В исследование были включены больные на момент постановки диагноза и находящиеся на лечении: 2 больных с миелодиспластическим синдромом (МДС) с выявленным моноклональным гемопоэзом (А\О равным 0,28 и 3,70); 2 больных с пароксизмальной ночной гемоглобинурией (ПНГ) с поликлональным гемопоэзом (А/О равным 1,70 и 0,80); 1 больная с хроническим активным гепатитом (ХАГ) с моноклональным гемопоэзом (А/О равным 0,35); 6 больных рефрактерной анемией (РА) с апластическим синдромом, из которых 4 оказались с моноклональным гемопоэзом с А/О в диапазоне 0,20-0,31 и 2 с поликлональным (с А/О равным 1,07 и 1.20); 10 больных апластической анемией, из которых 5 с моноклональным (А/О в диапазоне 0,33 - 0,53 и в интервале 2,20 - 3,45, а 5 – с поликлональным гемопоэзом на момент исследования в диапазоне нормальных значений. Среди 7 больных, обследованных по оптимизированной методике выделения ДНК с помощью набора “ДНК-экстракт”, у 2-x аутоиммунной гемолитической анемией и 1-ой больной с ПНГ выявился поликлональный гемопоэз (А/О варьирует в пределах нормы). У 2-х больных с МДС и 2-х больных РА был выявлен моноклональный лейкопоэз (с А/О

63

равным 3,18, 0,29 и 2,08, 0,50 соответственно). Заключение. Метод ПЦР молекулярного маркера гена HUMARA выявляет моноклональность лейкоцитов в 50 % случаев среди женщин, больных заболеваниями системы крови. Он может быть применен в комплексной диагностике лимфо- и миелопролиферативных заболеваний при подозрении на опухолевую пролиферацию лейкоцитов, особенно в тех случаях, когда у предполагаемого заболевания не известен молекулярный дефект. Метод может также применяться как дополняющий стандартную диагностику выявления онкогематологических заболеваний; с учетом сокращения в 10 раз времени пробоподготовки ДНК ускоряет получение результатов исследования.

АВТОМАТИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ НАУЧНЫХ ПРОЕКТОВ И МЕТОДЫ МАШИННОГО ОБУЧЕНИЯ.

Жаворонков А. 2 , Колесов А.1, Кантор Ч.1

1ФНКЦ Детской Гематологии, Онкологии и Иммунологии Росдрава2 ФГУ "ФНКЦ ДГОИ": 117997, Россия, г. Москва, Ленинский проспект, д. 117, корп.2E-mail: alex@biogerontology.org

International Aging Research Portfolio (IARP) - система управления знаниями на английском языке, объединяющая информацию о научных грантах и публикациях. Система включает в себя базы данных грантов Национального Института Здоровья и Национального Научного Фонда США, Европейской Коммиссии, национальных исследовательских институтовКанады, Австралии и других стран, а также MEDLINE - базу данных абстрактов научных публикаций.Кроме расширенного поиска и инструментов для визуального анализа трендов, система содержит каталог исследовательских проектов, распределённых по категориям, относящимся к геронтологии. Каталог проверяется редакторами-экспертами в своих категориях и членаминаучного консультативного совета. Для распределения исследовательских проектов в соответствующие категории система использует автоматические алгоритмы классификации с элементами машинного обучения: Support Vector Machines (SVM) и Boolean Factor Algorithm (BFA). Точность автоматической классификации постоянно растет.Реф. статья:Zhavoronkov A, Cantor CR (2011) Methods for Structuring ScientificKnowledge from Many Areas Related to Aging Research. PLoS ONE 6(7):e22597. doi:10.1371/journal.pone.0022597http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0022597

64

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В МОЗГЕ КРЫС ПРИ ЛОКАЛЬНОЙ ЛЕНТИВИРУСНОЙ ТРАНСДУКЦИИ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ.

Иванов А.Д., Тухбатова Г.Р, Узаков Ш.С., Кулешова Е.П., Степаничев М.Ю., Маркевич В.А., Гуляева Н.В., Саложин С.В.

Учреждение Российской Академии Наук Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН. Москва 117485, ул. Бутлерова, д. 5А.Е-mail: ivanov-andre@mail.ru

Согласно обширным литературным данным развитие нейродегенерации при болезни Альцгеймера можно замедлить путем введения нейротрофических факторов в соответствующие структуры ЦНС. Однако, ввиду относительно большого размера, а также возникающих побочных эффектов, доставка нейротрофических факторов к клеткам центральной нервной системы затруднена. Наиболее перспективной современной стратегией для лечения целого ряда нейропатологий является применение основанных на лентивирусах систем доставки генетической информации в клетки. Это открывает перспективы локализованных и контролируемых генетических манипуляций в нервной системе.

Для исследования влияния увеличенной концентрации трофических факторов на физиологические свойства нейронов при моделировании болезни Альцгеймера было проведено долговременное увеличение концентрации фактора роста нервов в гиппокампе лабораторных животных (крыс Вистар). Для получения суспензии лентивирусов была использована плазмидная конструкция pCSC_CaMKII_hNGF-IRES-EGFP, несущая последовательность для экспрессии фактора роста нервов человека под контролем нейрон-специфичного промотора CaMKII. Через 14-16 дней после введения суспензии в гиппокампе крыс наблюдалось увеличение концентрации NGF в гиппокампе на 50% по сравнению с образцами, полученными из контрольных животных.

Для исследования влияния увеличенной экспрессии фактора роста нервов на параметры долговременной потенциации проводили записи суммарной электрической активности нейронов зубчатой извилины гиппокампа in vivo. Усиление экспрессии NGF не приводило к увеличению средней амплитуды вызванных постсинаптических потенциалов после тетанизации, но предотвращало ингибирующее влияние фрагмента бета-амилоида (25-35). Эти данные свидетельствуют о положительном влиянии повышенной экспрессии NGF на функциональное состояние нейронов гиппокампа при введении бА(25-35). В дальнейшей работе будет исследована зависимость продемонстрированного эффекта от действия NGF на активность холинергических нейронов.Работа поддержана грантами РФФИ 09-04-01157-а, ФЦП «Кадры» ГК № П608 от 18.05.2010 и Программой президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине».

65

БОКОВОЙ АМИОТРОФИЧЕСКИЙ СКЛЕРОЗ: ТЕЧЕНИЕ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОГО ПРОЦЕССА И ВОЗМОЖНОСТИ ГЕНОТЕРАПИИ.

Иллариошкин С.Н.1, Народицкий Б.С.2, Тарантул В.З.3, Захарова М.Н.1, Завалишин И.А.1, Шмаров М.М.,2 Исмаилов Ш.М.,1Логунов Д.Ю.2, Барсков И.В.1, Тутыхина И.Л.2, Верховская Л.В.2, Брылев Л.В.,1 Викторов И.В.1.

1Научный центр неврологии РАМН (Москва); 2НИИ эпидемиологии и микробиологии им. 2Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития России (Москва); 3Институт молекулярной генетики РАН (Москва) E-mail:

Среди нейродегенеративных заболеваний человека одним из наиболее тяжелых является боковой амиотрофический склероз (БАС). Он характеризуется прогрессирующей гибелью мотонейронов спинного мозга и мозгового ствола, что приводит к развитию атрофических параличей, нарастающей дыхательной недостаточности и смерти больных через 2–5 лет от момента манифестации симптомов. Эффективных методов лечения БАС не существует. К числу наиболее перспективных направлений терапии БАС, разрабатываемых в последние годы, относится применение пептидных факторов роста. Показано, что фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF), помимо его роли в ангиогенезе, способствует выживаемости мотонейронов в условиях гипоксии. Полиморфизмы в гене VEGF ассоциированы с повышением риска развития БАС в 1,8 раза, а у больных БАС выявлены корреляции уровня VEGF в ликворе с формой и характером прогрессирования заболевания. Аналогичная ассоциация с БАС установлена и для другого фактора неоангиогенеза – ангиогенина (ANG). На трансгенной модели БАС у мышей, экспрессирующих мутацию G93А в гене Cu/Zn-супероксиддисмутазы (SOD1), внутримышечная, интраперитонеальная либо интравентрикулярная доставка рекомбинантного гена VEGF замедляла нарастание двигательных симптомов и увеличивала выживаемость. Имеющиеся данные свидетельствуют и о высоком терапевтическом потенциале гена ANG на культурах мотонейронов и у трансгенных SOD1-G93A мышей. Нами впервые в мире реализован (в эксперименте и в клинике) протокол генной терапии БАС на основе использования рекомбинантного аденовирусного вектора, осуществляющего ретроградную доставку генов VEGF и ANG в мотонейроны спинного мозга при внутримышечном введении конструкций Ad5v-VEGF и Ad5v-ANG. Успешность доставки целевых генов в спинной мозг трансгенных мышей была подтверждена иммуногистохимически и молекулярно-генетически (rt-PCR). Введение генноинженерных конструкций Ad5v-VEGF, Ad5v-ANG и их комбинации в мышцы передних, задних конечностей и спины трансгенных животных осуществлялось каждые 2 недели с 2-месячного возраста. Динамическая оценка неврологического статуса и двигательной активности экспериментальных и контрольных мышей показала, что комбинация Ad5v-VEGF + Ad5v-ANG способствует более поздней манифестации БАС и удлинению сроков жизни животных (в среднем на 8%). В клинике больные с шейно-грудной формой БАС были рандомизированы на 2 группы: Ad5v-VEGF+ANG либо плацебо. Внутримышечное введение препарата (или плацебо) проводилось в m.trapezius, m.deltoideus, m.quadriceps с каждой стороны каждые 4 недели в течение 2 лет. На фоне проводимого лечения показана безопасность и хорошая переносимость препарата. Введение Ad5v-VEGF/-ANG не влияло на прогрессирование нарушений жизненной емкости легких, но у больных основной группы имело место четкое увеличение продолжительности жизни, связанное предположительно с повышением устойчивости мотонейронов к гипоксии. К настоящему времени завершается вторая фаза протокола генной терапии БАС с участием 50 больных, получающих в различной комбинации Ad5v-VEGF, Ad5v-ANG и Ad5v-IGF (инсулиноподобный фактор роста).

66

Работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-01786.

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ДЕТЕКЦИИ ГЕНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ В КЛЕТКАХ МЕЛАНОМНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА ОСНОВЕ НАТРИЙ-ЙОДИДНОГО СИМПОРТЕРА (NIS).

Кузьмич А.И., Копанцев Е.П., Виноградова Т.В.

Институт Биоорганической химии РАН, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, д.16/10, Москва 117997, Российская ФедерацияЕ-mail: akrubik @ gmail . com

Генотерапия является одним из перспективных направлений в создании противоопухолевых препаратов. При разработке генотерапевтических противоопухолевых препаратов важно добиться экспрессии терапевтических генов, ограниченной опухолевыми клетками. В связи с этим существует проблема детекции продуктов терапевтических генов в рамках всего модельного организма. Hатрий-йодидный симпортер (NIS) – трансмембранный белок, осуществляющий перенос йодид-ионов внутрь клеток. Ранее было показано, что доставка гена NIS в клетки различного происхождения обеспечивает эффективное концентрирование йодид-ионов, использование радиоактивных изотопов йода позволяет детектировать NIS-синтезирующие клетки в организме лабораторных животных любого размера. Помимо неинвазивной детекции симпортер можно использовать в качестве терапевтического агента, так как накопление радиоизотопов в клетках может приводить к облучению и деструкции опухолевых тканей. Представляется перспективной разработка генетической системы на основе гена NIS, позволяющей определять локализацию клеток, получивших и экспрессирующих гены в составе генотерапевтического агента. Нами была клонирована кДНК гена rNIS из щитовидной железы серой крысы. На базе полученной последовательности были получены экспрессионные конструкции, содержащие последовательность rNIS под контролем различных эукариотических промоторов, а также экспрессионная конструкция, кодирующая белок rNIS, слитый с FLAG-эпитопом на N-конце (FLAG-rNIS).Методом вестерн-блот анализа было показано, что трансфекция клеток линии HEK293 генетической конструкцией, кодирующей FLAG-rNIS, приводит к образованию большого количества белка FLAG-rNIS. При этом обнаруживается несколько форм белка, отличающихся электрофоретической подвижностью. Электрофоретическая подвижность различных форм FLAG-rNIS совпадает с литературными данными, полученными для белка rNIS. На линиях клеток меланомного происхождения M3 и A375 было показано, что транзиентная трансфекция экспрессионными конструкциями с геном rNIS приводит к образованию функционально активного белка. В экспериментах in vitro трансфецированные геном rNIS клетки поглощали значительно больше радиоактивного йодида (125I) из среды по сравнению с контрольными клетками. При этом добавление в среду специфического ингибитора NIS, перхлората натрия, снижало поглощение радиойодида трансфецированными клетками до уровня контрольных клеток. На линиях клеток меланомного происхождения M3 и A375 было проведено сравнение генетических конструкций, содержащих rNIS под контролем различных промоторов. Показано, что трансфекция клеток обеих линий конструкцией, содержащей rNIS под контролем мелономоспецифического регуляторного элемента, обеспечивает высокий

67

уровень активности симпортера, сопоставимый с уровнем активности, обеспечиваемым конститутивно активным промотором цитомегаловируса (CMV).

ДНК КАК МАТЕРИАЛ ДЛЯ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЙ.

Кульбачинский А.В.

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, пл. Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияЕ-mail: akulb@img.ras.ru

ДНК может служить перспективной основой для создания целого ряда новых биосовместимых материалов и наноустройств. Возможность создания этих материалов определяется следующими факторами: (1) способностью ДНК формировать высоко специфичные комплементарные взаимодействия между цепями, (2) способностью однонитевых молекул ДНК сворачиваться в сложные техмерные структуры, (3) возможностью создания стабильных разветвленных структурных элементов из коротких олигонуклеотидов, (4) возможностями химического синтеза молекул ДНК (в том числе, с широким спектром модификаций), (5) высокой биосовместимостью и низкой иммуногенностью. Использование различных структурных блоков, собранных из олигонуклеотидов, позволяет конструировать на основе ДНК двумерные и трехмерные структуры различной геометрии и формы, такие как двумерные решетки, многогранники и трехмерные нанообъекты произвольной структуры. Наноматериалы на основе ДНК предполагается использовать в дальнейшем для контролируемой локализации других объектов (включая молекулы различной природы и клетки) и сборки сложных надмолекулярных конструкций. Другим направлением развития нанотехнологий с использованием ДНК является создание наноустройств, способных к контролируемым перемещениям и манипуляциям, что в будущем может найти применение в различных бионанотехнологиях.

СЕЛЕКТИВНАЯ АКТИВАЦИЯ ТРАНС-РЕПРЕССОРНОЙ ФУНКЦИИ ГЛЮКОКОРТИКОИДНОГО РЕЦЕПТОРА В КЛЕТКАХ ГЕМОБЛАСТОЗОВ.

Лесовая Е.А. 1 , Емельянов А.Ю.2, Кирсанов К.И.1, Будунова И.В.2, Якубовская М.Г.1

1НИИ Канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Каширское ш., д.24, Москва 115478, Россия2Northwestern University, Feinberg Medical School, Department of Dermatology, Chicago, Illinois 60611-3008, USAЕ-mail: lesovenok @ yandex . ru

Глюкокортикоиды (GC) широко используются в химиотерапии гемобластозов, в частности, в терапии лейкозов. Их действие реализуется посредством активации глюкокортикоидного рецептора (GR), который запускает транс-активацию респонсивных генов и транс-репрессию ряда транскрипционных факторов. Наряду с терапевтическим действием глюкокортикоиды могут вызывать ряд тяжелых побочных эффектов. Как оказалось, в развитии многих метаболических осложнений преимущественную роль играет транс-активация. В связи с этим актуальной задачей является поиск лигандов GR, которые способны запускать преимущественно GR-

68

опосредованную транс-репрессию, обеспечивающую лечебное действие. Представленное исследование было направлено на оценку эффектов нового перспективного селективного агониста GR, 2-(4-ацетоксифенил)-2-хлор-N-метилэтиламмоний хлорида, или CpdA, на клетки лейкозов и лимфом, предварительно охарактеризованных по экспрессии и функциональной активности GR. Во всех пяти линиях клеток большую часть экспрессируемого белка составляла изоформа GR-α, которая отвечает за основные функции рецептора. Для анализа роли GR в эффектах CpdA на клетки гемобластозов были получены трансформированные клетки с измененным статусом рецептора. На данной модельной системе мы впервые продемонстрировали антипролиферативный и проапоптотический эффекты CpdA на клетки лейкозов и лимфом, сравнимые с действием глюкокортикоидов. CpdA, в отличие от глюкокортикоидов, не вызывает уменьшения экспрессии рецептора, что является одним из механизмов сохранения чувствительности клеток к его действию. Эти данные согласовывались с отсутствием увеличения экспрессии генов FKBP51 и МКР1, которые играют существенную роль в развитии резистентности к глюкокортикоидам. Способность CpdA активировать механизм GR-зависимой транс-репрессии также была нами показана в случае транскрипционных факторов NF-kB и АР-1, а также NF-kB и АР-1-зависимых генов IL-1 и IL-6. В то же время было продемонстрировано отсутствие запуска транс-активационного механизма при инкубации клеток с CpdA: данное соединение не вызывало ни увеличение активности репортерного гена, находящегося под GRE-содержащим промотором, ни увеличения экспрессии генов, несущих в своем составе регуляторные элементы глюкокортикоидов.

В работе проведена оценка совместного действия CpdA с ингибитором протеасом Бортезомибом на клетки лейкозов и лимфом. Бортезомиб является перспективным препаратом для терапии гематологических новообразований. Нами было показано синергическое антипролиферативное и проапоптотическое действие данных соединений на клетки лейкозов и лимфом. В то же время было продемонстрировано, что при комбинировании Бортезомиба с CpdA, он не подавляет «диссоциированные» свойства CpdA, а наоборот, оказывает потенцирующее действие на ингибирование активности транскрипционных факторов NF-kB и АР-1. Таким образом, в данной работе на клетках лейкозов и лимфом были охарактеризованы эффекты нового селективного лиганда GR, CpdA и продемонстрировано синергическое действие данного соединения и Бортезомиба.

СИСТЕМА БЕЗОПАСНОГО СКРИНИНГА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ-БЛОКАТОРОВ РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ-1.

Прокофьева М.М., Прасолов В.С.

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, ул. Вавилова, д. 32, Москва, 119991, РоссияЕ-mail: prassolov 45@ mail . ru

Вирусы иммунодефицита человека первого и второго типа (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), относящиеся к роду лентивирусов семейства ретровирусов, вызывают одно из широко распространенных и опасных для жизни человека заболеваний – синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Несмотря на значительные усилия, до сих пор не создано ни одной действенной профилактической или терапевтической анти-ВИЧ вакцины. Поиск новых соединений, обладающих анти-ВИЧ активностью, с целью создания эффективных лекарственных анти-ВИЧ препаратов, является крайне важной и актуальной задачей

69

современной вирусологии и медицинской химии. При этом необходимым представляется создание новых относительно безопасных для пациента агентов, активных в отношении как ВИЧ дикого типа, так и его постоянно возникающих мутантных лекарственно-устойчивых форм.Важным этапом разработки новых антиретровирусных препаратов является проверка их эффективности. В разработанной нами безопасной системе используются псевдо-ВИЧ-1 частицы на основе рекомбинантного лентивирусного генома, несущего фрагмент генома ВИЧ-1, лишенный областей, кодирующих белки вируса, и содержащий ген зеленого флуоресцентного белка в качестве маркера. Отсутствие в таком рекомбинантном геноме всех вирусных генов гарантирует безопасность работы с ним, поскольку псведо-ВИЧ-1 частицы представляют собой, по сути, вирус одноразового действия. В нашей работе мы получили псевдо-ВИЧ-1 частицы, содержащие вирусные белки (обратную транскриптазу и интегразу ВИЧ-1) и рекомбинантную геномную РНК, не содержащую последовательностей, кодирующих эти белки. Трансдукция такими ВИЧ-подобными частицами клеток-мишеней приводит к тому, что в этих клетках на рекомбинантном РНК-геноме осуществляется синтез ДНК-провируса, содержащего маркерный ген, встраивание которого в геном клетки-мишени сообщает ей способность флуоресцировать. Мы получили модельные псевдо-ВИЧ-1-частицы, содержащие в качестве белка оболочки gp160 (белок оболочки ВИЧ-1) или белки оболочки других оболочечных вирусов, в том числе белок оболочки G вируса везикулярного стоматита.

Исследовали активность ряда ингибиторов обратной транскриптазы и интегразы ВИЧ-1, как применяющихся в медицинской практике, так и находящихся на разных стадиях лабораторных исследований. С использованием ряда линий клеток человека и мыши, включая линии T-лимфобластного лейкоза человека Jurkat и CEM-SS, показали, что созданная нами система безопасного скрининга потенциальных ингибиторов-блокаторов репликации ВИЧ-1 позволяет проводить испытания ингибиторной активности соединений, действие которых направлено как на обратную транскриптазу и интегразу ВИЧ-1 дикого типа, так и на их мутантные лекарственно-устойчивые формы. Полученные нами данные согласуются с опубликованными другими исследователями данными, полученными с использованием инфекционного ВИЧ-1.

РЕКОМБИНАТНЫЙ РЕПЛИКАЦИОННО-КОМПЕТЕНТНЫЙ ГАММА-РЕТРОВИРУС КАК ЭФФЕКТИВНЫЙ ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ СКРИНИНГА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

Прокофьева М.М., Степанов О.А., Прасолов В.С.

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, ул. Вавилова, д. 32, Москва, 119991, РоссияЕ-mail: prassolov45@mail.ru

Два основных подхода, используемых в настоящее время для определения эффективности потенциальных противовирусных препаратов, это:1) ингибиторный анализ in vitro с использованием очищенных вирусных ферментов;2) работа с инфекционными вирусами. При реализации первого подхода невозможно установить эффективность взаимодействия ингибиторов с клеткой in vivo, а именно: взаимодействие с клеточными рецепторами, способность проникать в клетку, их стабильность, отсутствие цитотоксичности, эффективность и специфичность противовирусного действия. Второй подход может быть применен в ограниченном числе лабораторий, специально предназначенных для работы с

70

высокопатогенными вирусами человека. Эти проблемы существенно затрудняют поиск и тестирование новых противовирусных препаратов. Разработанная нами система основана на применениии репликационно-компетентного вируса лейкоза мышей Молони (Mo-MuLV), т.е. является прямой и в то же время безопасной, т.к. вирус лейкоза мышей Молони может заражать только клетки грызунов (мышей и крыс). С помощью этой системы возможен скрининг потенциальных ингибиторов, препятствующих взаимодействию простых и сложных ретровирусов с первичными клеточными рецепторами на поверхности заражаемых клеток, что предотвращает заражение чувствительных клеток-мишеней. В качестве модельного ретровируса в этой системе использовали рекомбинатный ретровирус Mo-MuLV(eGFP), в геном которого, в 3’- концевой области, встроен ген усиленного зеленого флуоресцирующего белка (eGFP), разделенный с предшествующим ему геном белка оболочки вируса env последовательностью IRES. В ходе ретровирусной инфекции клетки, зараженные таким вирусом, приобретают способность флуоресцировать и, в свою очередь, становятся источником вновь образованных инфекционных частиц Mo-MuLV(eGFP), способных заражать новые клетки. Такая система позволяет проводить скрининг потенциальных ингибиторов широкого спектра, направленных на подавление продуктивного контакта (взаимодействия) ретровируса и клетки мишени с помощью эффективного и малозатратного метода проточной цитофлуорометрии. Мы исследовали влияние ряда полисахаридов, как природного происхождения, так и модифицированных, на распространение вирусной инфекции в предложенной нами системе. Исследованные потенциальные противовирусные препараты не оказывают цитотоксического и цитостатического влияния на культуры клеток SC-1 и NIH-3T3 в концентрациях до 100мкг/мл включительно. Они характеризуются вирулицидными свойствами в отношении вируса Mo-MuLV(eGFP), и способны значительно подавлять продукцию вируса. Нами была показана специфичность воздействия сульфатированных полисахаридов на вирусы, для которых клеточными рецепторами являются гепаран сульфаты.

ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКА БИОБЕЗОПАСНОСТИ НАНОЧАСТИЦ НА ОСНОВЕ КРЕМНИЯ IN VITRO.

Рудимов Е.Г., Горностаева А.Н., Шубенков А.Н.

Учреждение Российской академии наук Российской Федерации Государственный научный центр РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе 76-аE-mail: HindIII@yandex.ru

Стремительно развивающиеся исследования свойств наночастиц (НЧ) и постоянно расширяющиеся области их применения ставят задачу поиска и апробации методов оценки их биобезопасности, как на уровне всего организма, так и отдельных клеток.

В настоящей работе проведен анализ влияния кремний-содержащих НЧ SiO2 и интеркалированных ионами серебра и церия НЧ монтмориллонита на жизнеспособность, пути клеточной гибели и пролиферативную активность в экспресс-культуре лимфоцитов периферической крови человека. Для анализа были взяты следующие образцы: НЧ SiO2, размер частиц 7нм, (№1), НЧ, интеркалированные Ce3+

(20-200 нм, №2) и Ag+ (20-200 нм, №3). Лимфоциты выделяли из периферической крови человека и культивировали в среде RPMI-1640+5%ФТС из расчета 1х106

клеток/мл с НЧ в концентрациях 100, 10 и 1 мкг/мл. Клетки без НЧ, инкубировавшиеся

71

в тех же условиях, были использованы для определения исходных значений изучаемых показателей. После 24-х или 72-х часовой инкубации клеток с НЧ цитофлюориметрически (Epics XL (Beckman Coulter)) определяли: цитотоксическй эффект по уменьшению доли живых клеток, соотношение некротического/апопототического путей гибели лимфоцитов (окрашивание аннексин V-FITC - иодид пропидия); пролиферативную активность (ПИ) ФГА-активированных лимфоцитов, окрашенных CFSE. Образец №1 не оказывал влияния на жизнеспособность лимфоцитов при всех концентрациях, а № 3 был токсичен только при 100 мкг/мл. Инкубация с № 2 (100 мкг/мл) приводила к гибели 2/3 общей популяции клеток, цитотоксический эффект при меньших концентрациях отсутствовал. Оценка доли апоптотических и некротических клеток показала, что часть лимфоцитов одновременно окрашены PI и Аннексин V – FITC. Количество таких клеток даже в контроле было достаточно велико. Инкубация с образцом №1 не влияла на долю апоптотических клеток, а образцы №2 и №3 только в концентрации 100 мкг/мл дополнительно индуцировали апоптоз в лимфоцитах. После 72 часов инкубации с НЧ №№1-3 в концентрации 100 мкг/мл большая часть ФГА-активированных лимфоцитов погибла. В связи с этим пролиферативный индекс (ПИ) клеток был определен только после инкубации с меньшими концентрациями НЧ. После инкубации с НЧ ПИ ФГА-лифоцитов либо уменьшался, либо не изменялся, как в случае образца №3 в концентрации 1 мкг/мл. Для образцов №1 и №3 снижение пролиферативной активности лимфоцитов было обратно пропорционально концентрации НЧ. Для образца №3 уменьшение ПИ было более выраженным при самой маленькой концентрации НЧ, причем такой эффект был отмечен у всех 3 доноров, включенных в исследование (данные не приведены).

Таким образом, проведенное исследование показало, что присутствие в среде культивирования лимфоцитов кремний-содержащих НЧ SiO2 и интеркалированных ионами Ag+ и Ce3+ НЧ монтмориллонита в концентрации до 10 мкг/мл не оказывает влияния на их жизнеспособность, но сопровождается уменьшением их пролиферативной активности. Среди всех исследованных образцов НЧ SiO2 обладают наименьшей цитотоксичностью по сравнению с НЧ, интеркалированными ионами металлов.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №11-02-12210-офи-м

ВЕКТОРЫ С РЕГУЛИРУЕМЫМ ТЕМПЕРАТУРОЧУВСТВИТЕЛЬНЫМ ПРОМОТОРОМ И РЕГУЛЯТОРНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В КЛЕТКИ И ТКАНИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Толынева Д.В., Куст Н.Н., Павлова Г.В.

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН117984 Москва, ул. Вавилова, 34/5, тел: 8-(499)-135-25-41E-mail: Casanova-di-fellini@yandex.ru

Широкое распространение при лечении различных заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием стволовых клеток, которые обладают большим потенциалом к развитию в различных направлениях. Существенное значение имеет управление путями их специализации при операциях трансплантации. В таком случае необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в направлении, нужном для успешного осуществления клеточно- и генно-терапевтического лечения. Нами предлагаются

72

регуляторные элементы генома дрозофилы, которые имеют определенные преимущества перед ретровирусными элементами в силу своей большей безопасности для терапевтического применения. В ходе исследований было обнаружено, что промотор гена белка теплового шока Drosophila melanogaster может активизироваться не только в тканях дрозофилы, но и в клетках и тканях млекопитающих. Таким образом, на основании полученных результатов, был получен вектор, содержащий промотор гена белка теплового шока дрозофилы для активизации вводимых генов, с целью использования его в клетках млекопитающих. Было обнаружено, что активность промотора изменяется при использовании в регуляторной зоне элементов теплового шока. Было получено два вектора, содержащих промотор гена белка теплового шока Hsp70 Drosophila melanogaster с регуляторной последовательностью (4 элемента теплового шока (HSE) в одном случае и 8 элементов теплового шока в другом), зону полилинкера, ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Полученные векторы отличаются регуляторной зоной промотора гена белка теплового шока Drosophila melanogaster. В регуляторной зоне данного промотора ранее были обнаружены консервативные последовательности, основное значение в которых имеет 3-нуклеотидный фрагмент GAA, названного HSE элементом. Мы обнаружили, что насыщенность регуляторной области HSE элементами влияет на активность промотора гена белка теплового шока Hsp70 Drosophila melanogaster в клетках млекопитающих. Однако, было обнаружено, что использование увеличенного количества встроенных HSE зон в регуляторную область промотора hsp70 дрозофилы снижало температуру активации до 39 оС и изменяло активность экспрессии контролируемого гена. Данные результаты являются новыми, так как ранее утверждалось, что исследуемый промотор в клетках млекопитающих активизируется при 42°С, что крайне травматично для клеток, и снижает возможности использования данного промотора в практике. Эффект включения данного промотора был проверен с помощью метода трансфекции полученных векторов в культуру эмбриональных стволовых клеток HEK293. Максимальная экспрессия белка GFP наблюдалась при 410С уже спустя 24 часа после прогрева. Установлено, что оптимальное время действия температурной активации составляет 60 минут, а максимальное свечение зеленого флуоресцентного белка GFP наблюдается через 24 часа после воздействия температуры. Был выявлен эффект повторного включения промотора и возникновения свечения зеленого флуоресцентного белка после повторного воздействия температуры.

СОЗДАНИЕ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНАХ СЕПТУМА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА.

Тухбатова Г.Р., Иванов А.Д, Кулешова Е.П., Степаничев М.Ю., Гуляева Н.В., Саложин С.В.

Учреждение академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, ул. Бутлерова, дом 5А, Москва, 117485, РоссияЕ-mail: tugu @ mail . ru

Лентивирусная трансдукция является на данный момент одним из самых эффективных методов переноса генетического материала в клетки, что делает данный метод наиболее предпочтительным при работе с клетками центральной нервной системы in vivo. Данная технология может быть использована для различных целей, в том числе при разработке подходов к коррекции функциональных нарушений мозга при патологических состояниях. Известно, что характерной чертой многих

73

нейродегенеративных заболеваний является изменение уровня экспрессии нейротрофических факторов, поэтому наличие инструмента, позволяющего менять уровень экспрессии факторов роста в определенных структурах мозга, является очень важным как для моделирования, так и для разработки подходов к компенсации патологий нервной системы.

В представленной работе были найдены оптимальные условия для получения лентивирусных частиц для последующего введения в ЦНС экспериментальных животных. Показано, что получаемая суспензия имеет титр, достаточный для трансдукции нейронов in vivo. Затем были созданы лентивирусные векторы, содержащие последовательности для экспрессии фактора роста нервов (ФРН), нейротрофического фактора, выделенного из мозга (BDNF), нейротрофического фактора, выделенного из глиальных клеток (GDNF) под нейрон-специфичным промотером - альфа-кальмодулин-зависимой киназы II (CAMKII). Работоспособность конструкции для экспрессии фактора роста нервов (ФРН) была проверена in vitro на клетках линии РС12. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в нейроноподобные при добавлении в культуральную среду фактора роста нервов. Результаты трансфекции клеток полученной конструкцией показали, что экспрессия доставляемого в клетки гена NGF приводит к образованию секретируемого функционально активного белка.

На следующем этапе мы инъецировали суспензию лентивирусов, полученных с использованием данных конструкций, в область медиального септума. Данная область была выбрана, поскольку именно в ней высока концентрация холинергических нейронов, в первую очередь подвергающихся нейродегенерации при болезни Альцгеймера. Показано, что доставляемый ФРН экспрессируется in vivo.

В настоящее время на амилоидной модели болезни Альцгеймера мы проводим исследования увеличения уровня экспрессии фактора роста нервов на выживаемость холинергических нейронов септума в этой же модели нейродегенерации.Работа поддержана грантами РФФИ 09-04-01157-а, ФЦП «Кадры» ГК № П608 от 18.05.2010 и Программой президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине».

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ПРОТЕАЗЫ 3С ВИРУСА ГЕПАТИТА А ВЫЗЫВАЕТ ГИБЕЛЬ РАКОВЫХ КЛЕТОК.

Шубин А.В., Лунина Н.А., Рощина М.П., Демидюк И.В.

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Москва, 123182, пл. акад. Курчатова, 2E-mail: shav @ inbox . ru

Развитие генной терапии даёт надежду на разработку новых эффективных методов лечения рака. Одной из современных парадигм генной терапии злокачественных опухолей является введение в раковые клетки генов, которые способны индуцировать клеточную гибель. В рамках этого подхода создан ряд перспективных лекарственных средств, часть из которых находится в стадии доклинических и клинических испытаний. В то же время, в связи с разнообразием раковых опухолей не представляется возможным найти универсальное средство для лечения всех онкологических заболеваний. Поэтому поиск новых генов – агентов противораковой терапии остаётся чрезвычайно актуальным. В данной работе исследована возможность использования гена протеазы 3С вируса гепатита А человека (3Cpro) в качестве противоракового геннотерапевтического агента.

74

Цитотоксическое действие гена 3Cpro было оценено с использованием раковых клеток лёгкого человека линий A549 и Calu-1. Тип клеточной гибели определяли по морфологическим признакам, проницаемости клеточной мембраны, активности каспаз и экспонированию фосфатидилсерина на внешней стороне цитоплазматической мембраны.

Введение гена 3Сpro вызывает смерть более 80% раковых клеток. При этом гибель клеток происходит по нескольким механизмам. Первый характеризуется активацией каспаз и другими признаками, характерными для апоптоза. Второй механизм является каспазонезависимым и сопровождается интенсивным накоплением в цитоплазме вакуолей предположительно лизосомального происхождения. Агенты, запускающие альтернативные апоптозу механизмы клеточной гибели, рассматриваются как перспективные благодаря их способности вызывать смерть клеток, резистентных к индукторам апоптоза.Полученные результаты позволяют считать ген протеазы 3C потенциальным агентом противораковой генной терапии.

75

СЕКЦИЯ 5

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

-НЕЙРАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА И РЕГЕНЕРАЦИЯ В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ.

Александрова М.А.

Учреждение Российской Академии наук Институт биологии развития РАНE-mail: mariaaleks@inbox.ru

Источник и условия культивирования стволовых клеток являются важнейшими факторами, в значительной степени определяющими дальнейшую судьбу клеток после трансплантации и регенераторные процессы в мозге реципиента. В настоящей работе исследовали ряд молекулярно-генетических механизмов в ходе развития нейральных стволовых и прогениторных клеток (НСКП) неокортекса и нейральной сетчатки человека in vivo и in vitro. Установлен паттерн экспрессии генов транскрипционных факторов PAX6, PROX1, NANOG и семейства OCT4 в нативных тканях 8- 20 недель развития. Экспрессии PAX6 и PROX1 отражают специфику клеточной дифференцировки в изученных структурах, в то время как экспрессии NANOG и генов семейства OCT4 свидетельствуют о наличии пула клеток с высокой пластичностью. В тоже время, при культивировании клетки нейральной сетчатки проявляют большую консервативность в экспрессии этих генов по сравнению с клетками неокортекса.

На основе полученных данных, изучали способность к дедифференцировке в нейральном направлении клеток ретинального пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаза взрослого человека при разных условиях в культуре. ПЦР анализ показал, что in vitro стволовые свойства РПЭ проявляются в экспрессии генов NANOG, генов семейства OCT4, PROXI, PAX6, NS и MUSASHI. Клетки РПЭ, в средах для нейральных стволовых клеток с FGF и EGF и в средах кондиционированных НСПК из мозга, образуют агрегаты наподобие нейросфер. Иммуногистохимический анализ предполагает, что экспрессия культивируемыми клетками РПЭ глиальных и нейрональных маркеров отражает пластичность этих клеток in vitro. Одновременная экспрессия Pax6, нестина и GFAP клетками РПЭ in vitro свидетельствует о нахождение их на стадии ранних прогениторов/нейральных стволовых клеток. Увеличение ко 2-ому пассажу доли клеток, несущих маркеры beta-тубулин-III, NF, Prox1 и CNPase, свидетельствует о дифференцировке клеток в нейральном направлении в процессе культивирования. Иммуноферментный анализ и проточная цитофлуориметрия свидетельствовали, что в условиях культивирования клетки РПЭ сохраняют способность к синтезу и секреции важных регулирующих факторов PEDF и VEGF. К 4-пассажу клетки снижают экспрессию ряда нейральных маркеров, что подчеркивает необходимость подбора факторов стабилизирующих их дифференцировку, поскольку РПЭ могут быть потенциальным источником аутологичных клеток с нейральными свойствами для восстановления поврежденных тканей головного мозга и сетчатки.

76

ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ, ТРАНСФЕЦИРОВАННЫХ ФАКТОРОМ РОСТА НЕРВОВ ЧЕЛОВЕКА ПОД РЕГУЛЯЦИЕЙ КОНСТИТУТИВНЫХ И РЕГУЛИРУЕМЫХ ПРОМОТОРОВ.

Антонов С.А., Арсеньева Е.Л., Лебедева О.С., Мануилова Е.С., Сафина Д.Р., Хайдарова Н.В., Гривенников И.А.Институт молекулярной генетики РАН, пл . Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияЕ-mail: igorag@img.ras.ru

Нейротрофины (НФ) - семейство факторов роста, определяющих выживаемость и фенотип клеток нервной системы (НС), рост нейритов, а также влияющих на синаптическую пластичность в НС хордовых. НФ способны при различных нейропатологиях замедлять или предотвращать гибель клеток НС. Для наиболее изученного члена семейства НФ, фактора роста нервов (NGF) активно исследуются возможности терапевтического применения. Одной из основных проблем применения в медицине белковых препаратов является их способ доставки к ткани-мишени. Перспективным методом доставки белка является клеточная терапия, когда необходимый белок продуцируется транплантированными клетками. Неограниченным источником любых дифференцированных типов клеток, в т.ч. клеток НС, являются эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Задачей данной работы было получение ЭСК, секретирующих человеческий NGF (hNGF), для использования полученных из них дифференцированных клеток НС в трансплантации на животных моделях нейропатологий. На первом этапе нашей работы нами был сконструирован вектор pcNGF, в котором ген hngf находится под управлением конститутивного цитомегаловирусного промотора (P CMV). С помощью липосомального метода ЭСК мыши линии R1 были трансфицированы этим вектором. Интеграция трансгена в геномную ДНК показана с помощью ПЦР, причем вставка наследовалась стабильно по мере пассирования клеток. Было показано, что трансфекция ЭСК геном hngf не влияла на пролиферативную активность полученных трансгенных линий и на их способность формировать эмбриоидные тела. Клетки HeLa трансфицированные pcNGF показали гиперэкспрессию hngf. Хотя в клетках HeLa этот промотор способен давать высокий уровень трансгенной мРНК hngf, на ЭСК линии R1 экспрессия трансгенной мРНК была слабо детектируемой. С помощью ИФА в линиях R1-pcNGF был измерен уровень тотального NGF в клетках и кондиционированных средах от них. По сравнению с контрольными линиями в недифференцированых и дифференцированных клетках уровень белка не отличался вплоть до 21 дня дифференцировки in vitro. Далее, нами был получен вектор pMT-NGF, в котором ген hngf находится под управлением регулируемого промотора металлотионеина мыши 1 (P MT-1). P MT-1 способен давать высокий уровень базальной экспресии трансгена, который усиливается в присутствии ионов двухвалентных тяжелых металлов, таких как Zn2+. ЭСК мыши линии R1 были трансфицированы этим вектором, и получена линия R1-MT-NGF. Из популяции клеток этой линии были отобраны клоны, у которых отсутствует экспрессия мРНК hngf при культивации в обычной среде, но при добавлении 150-300 mkM Zn2+ индуцируется экспресия трансгенa, а также клоны, у которых наблюдается гиперэкспрессия трансгена в отсутствии индуктора. В дальнейшей работе планируется исследовать свойства полученных клонов при трансплантации животным с моделями нейропатологий.Выполнено при поддержке грантов РФФИ 09-04-01464 и ФЦП «Кадры» ГК № 14.740.11.0171 от 21.02.2011 г.

77

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГРАВИЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК (ММСК).

Буравкова Л.Б., Гершович П.М., Гершович Ю.Г.

ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Хорошевское ш., 76-а, МоскваE-mail: buravkova@imbp.ru

Современные исследования показали, что различные типы культивируемых клеток чувствительны к изменению гравитационного окружения. Предполагается, что ответ на микрогравитацию обуславливают структуры в составе актинового цитоскелета, вовлеченные в механизмы клеточной механочувствительности. Реорганизация цитоскелета в условиях микрогравитации, сопровождаемая изменениями в паттерне экспрессии генов, может приводить к нарушению основных клеточных функций. Нами было показано, что при моделировании эффектов микрогравитации изменяется пространственная структура актинового цитсокелета ММСК, снижается пролиферативная активность клеток и их способность к остеогенной дифференцировке. Нарушения в пространственной организации F-актина сопровождались изменением уровня экспрессии генов некоторых цитоскелетных белков: α-актина, β-тубулина, кофилина и малой ГТФ-азы RhoA. Интересно, что после 120 ч воздействия моделированной микрогравитации, значимых различий в уровне экспрессии большинства исследуемых генов не было обнаружено, схожие данные были получены после 24 ч реадаптации. Таким образом, изменение уровня экспрессии некоторых генов, ассоциированных с актиновым цитоскелетом, можно рассматривать как один из ранних механизмов адаптации клеток-предшественников, к измененной гравитации.Последнее время активно обсуждается роль механических сигналов в выборе пути коммитирования и реализации многочисленных программ дифференцировки ММСК. Изучение всей совокупности факторов поможет выявить механизмы, которые необходимы для поддержания тонкого баланса между двумя направлениями дифференцировки стволовых клеток, возможное нарушение которого в условиях микрогравитации может приводить к таким тяжелым клиническим проявлениям, как остеопения или остеопороз. В организме существует удивительная взаимосвязь между остегенезом и адипогенезом, которая обусловлена существованием общих сигнальных путей регуляции, которые определяют приоритет в развитии одного направления в ущерб другому, исходя из поступающих к клеткам сигналов, и сохраняется при культивировании клеток-предшественников. Ключевым транскрипционным фактором адипогенеза является PPARγ2, который функционирует как доминантный негативный регулятор остеогенеза. Специфическая активация PPARγ2 ведет к полной супрессии основных транскрипционных факторов остеогенеза – cbfa1/Runx2 и Osterix, и конверсии бипотентных мезенхимальных предшественников в адипоциты, не влияя на морфофункциональное состояние остеобластов при завершении их дифференцировки. Показано, что механические стимулы приводят к увеличению уровня экспрессии Msx2, активирующего остеогенную дифференцировку за счет синергизма с BMP-2 и действующего как супрессор адипогенеза, ингибируя PPARγ2.Исследование транскрипционного профиля ММСК человека (84 гена, участвующих во внутриклеточной сигнализации, регуляции пролиферации и дифференцировки стволовых клеток человека) при моделировании микрогравитации показало достоверное (не менее чем в 10 раз) увеличение экспрессии 30 генов (регуляторы клеточного цикла и пролиферации, адгезии и межклеточного взаимодействия, внутриклеточной сигнализации

78

и транскрипции). Паттерн из 24 генов, уровень экспрессии которых достоверно уменьшался (более чем в 10 раз), включал регуляторы самоподдержания стволовых клеток и маркеры коммитирования и дифференцировки. Таким образом, в условиях моделирования эффектов микрогравитации в ММСК происходило угнетение экспрессии генов, отвечающих за свойства плюрипотентности и дифференцировки стволовых клеток различных типов при участии двух антагонистических сигнальных путей (Notch и Wnt), что, по-видимому, обуславливает поддержание менее дифференцированного состояния мезенхимальных клеток-предшественников.

ПОСТНАТАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ: ГРАНИЦЫ ПЛАСТИЧНОСТИ.

Васильев А.В.

Институт биологии развития им. Кольцова РАН, Москва113162@bk.ru

СТАТИСТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ КРИТЕРИЕВ КЛОНОБОРАЗОВАНИЯ В КУЛЬТУРАХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА.

Воронина Е.С. 1 , Виноградова М.С.2, Кулешов Н.П.1, Никитина В.А.1, Бочков Н.П. 1

1Учреждение Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН, ул. Москворечье, д.1, Москва 115478, Россия2Московский государственный технический университет им. Н.Э. Баумана, 2-я Бауманская ул., д.5, Москва 105005, Россия E-mail: vekats @ inbox . ru

Культивирование стволовых клеток с целью увеличения их количества для трансплантации может приводить к появлению клонов с хромосомными и геномными мутациями. Целью работы было статистически обосновать критерии клонообразования в культурах стволовых клеток человека, исходя из экспериментальных данных по учету анеуплоидных клеток, прошедших разное число клеточных делений. Статистический анализ клонообразования проводился на основе полученных нами ранее экспериментальных данных по оценке анеуплоидии в культурах мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) костного мозга человека. Единицей расчетов динамики клеточных популяций взят клеточный цикл, длительность которого определяли на основе кратности прироста клеток за время пассажей. Продолжительность каждого пассажа была равна 7-ми суткам (168 часов). Для достижения поставленной цели проведены расчеты 1) продолжительности и числа клеточных циклов при разном числе пассажей, 2) ожидаемой доли анеуплоидных клеток при их селективном преимуществе в размножении, а также 3) величин выборок проанализированных клеток для оценки клонообразования.1) Продолжительность клеточного цикла рассчитывали по результатам оценки кратности прироста клеток, т.е. по отношению количества клеток, полученного с данного пассажа, к числу клеток, посаженному на предыдущем пассаже (К = ni/ni-1). На основе данных о динамике прироста МСК можно рассчитать число клеточных циклов за разное число пассажей. Расчет числа делений клеток (m) к i-ому пассажу проводился по формуле:

79

mi = log2ki, где: mi- число делений клетки за i–ый пассаж; i – номер пассажа; k – кратность прироста за один пассаж. Зная число циклов и продолжительность культивирования, т.е. число пассажей, можно определить продолжительность клеточных циклов на разных сроках культивирования. 2) Для выявления клонообразования в культурах МСК был произведен расчет ожидаемой доли анеуплоидных клеток при их селективном преимуществе в размножении по формуле: LevK = [Pa(vn*(1+La))k]/[vn

k*(1-Pa)+(vn(1+La))k*Pa], где: Lev – доля аномальных клеток; k – число циклов деления нормальной клетки; Pa – контрольный уровень анеуплоидных клеток; vn – число удвоений нормальной клетки за 1 цикл (в нашем случае vn равно 2, т.е. все клетки делятся один раз); La – сокращение продолжительности клеточного цикла.3) Для расчета числа проанализированных клеток, необходимого для обнаружения изменения уровня анеуплоидии в процессе размножения клеток, была использована интегральная теорема Лапласа. Расчеты показали, что при существенном повышении частоты анеуплоидии выборки могут быть уменьшены. Проведенные расчеты можно использовать не только для оценки клонов анеуплоидных клеток, но и отдельно для трисомных или моносомных клеток и любых других аномальных клонообразующих клеток.Работа проведена при поддержке гранта РФФИ №09-04-00948а.

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ ЦИТОКИНОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ ММСК И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ, ПРИ РАЗНОМ НАПРЯЖЕНИИ КИСЛОРОДА.

Горностаева А.Н., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б.

Учреждение Российской академии наук Российской Федерации Государственный научный центр Институт медико-биологических проблем РАН123007, г Москва, Хорошевское шоссе 76-аE-mail: HindIII @ yandex . ru

Иммуносупрессивным свойствам мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) в настоящее время уделяется особое внимание в связи с возможностью их применения в регенеративной медицине. Взаимодействие ММСК и лимфоцитов в организме может происходить при разном cодержании кислорода. Ранее нами было показано, что независимо от содержания кислорода, при сокультивировании с ММСК пролиферативный индекс ФГА-активированных лимфоцитов снижается в среднем в три раза, а доля живых клеток не изменяется.

Целью настоящего исследования было охарактеризовать цитокиновый профиль в смешанной культуре ММСК и лимфоцитов в течение 72 часов при разном содержании кислорода (20% и 5% О2). Концентрацию цитокинов измеряли методом проточной цитофлуориметрии (Beckton Dickenson) с использованием набора Bender Medsystems для мультиплексного определения 11 цитокинов человека ( ИЛ-12р70, ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-8, ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-1β, ФНО-α, ФНО- β). Был проведен сравнительный анализ провоспалительных (ИФН-γ, ИЛ-8, ИЛ-6, ИЛ-1β, ФНО-α) и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов. В кондиционированной среде (КС) от ММСК детектировались ИЛ-6 и ИЛ-8, концентрация которых не зависела от содержания кислорода в среде, только ИЛ-1β был обнаружен при 5%О2, в то время как при 20% О2 его концентрация равнялась нулю. При культивировании неактивированных лимфоцитов был обнаружен только ИЛ-8, концентрация которого не

80

менялась в зависимости от содержания кислорода в среде. При активации лимфоцитов ФГА в КС помимо ИЛ-8 были обнаружены ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-1β, ФНО-α. Причем, концентрация ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-8, ИЛ-6, ИЛ-1β не зависела от содержания кислорода, а продукция ФНО-α при 5%О2 увеличивалась в 1,8 раза, по сравнению с таковой при 20%О2. При сокультивировании ММСК и ФГА-лимфоцитов в смешанной культуре при 5%О2 снижалась концентрация ИЛ-1β, ФНО-α по сравнению с таковой при 20%О2, а продукция ИФН-γ, ИЛ-8, ИЛ-6 не изменялась в зависимости от содержания кислорода Сопоставление концентрации цитокинов в среде от ФГА-лимфоцитов и от смешанной культуры показало, что при сокультивировании увеличивалась концентрация ИФН-γ (в 3 раза), ИЛ 6 (в 2 раза), ИЛ-10 (в 2 раза), появлялся ИЛ-1β, снижалась концентрация ИЛ-8 ( в 2 раза), ФНО-α (в 1,8 раза). Концентрация ИЛ-1β и ФНО-α, при 20%О2 была выше, чем при 5%.

Таким образом, при сокультивировании ММСК с лимфоцитами наблюдалось разнонаправленное изменение продукции провоспалительных цитокинов и повышение концентрации противовоспалительного ИЛ-10. Полученные результаты показывают, что описанные нами ранее иммуносупрессивные эффекты ММСК являются результатом сбалансированного действия паракринных факторов, количество которых, в свою очередь, определятся взаимодействием продуцирующих их клеток. Несмотря на то, что пониженное содержание кислорода, снижает концентрацию некоторых цитокинов, оно не оказывает существенного эффекта на исход взаимодействия.Работа выполнена при поддержке программы ОФФМ РАН

КРАТКОВРЕМЕННОЕ УВЕЛИЧЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПРИВОДИТ К ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ ГЕНОМА НА УРОВНЕ КАРИОТИПА.

Гринчук Т.М., Земелько В.И., Домнина А.П., Шилина М.А., Алексеенко Л.Л., Никольский Н.Н.

Институт цитологии РАН, Тихорецкий пр. д.4, Санкт-Петербург, 194064, РоссияE-mail: grintat@bk.ru

Использование культуры ЭСК человека в регенеративной медицине подразумевает в качестве одной из характеристик их плюрипотентного статуса наличие нормального, неперестроенного кариотипа. Тем не менее, на сегодняшний день нет однозначного ответа на вопрос о стабильности кариотипического набора ЭСК при культивировании. По одним данным ЭСК могут длительное время сохранять кариотипическую стабильность в процессе культивирования, по другим - стабильность кариотипа в процеcсе культивирования нарушается. Одним из ключевых факторов в обеспечении оптимальных условий для поддержания клеточной культуры ЭСК является постоянство температурного режима.

Целью работы было проанализировать структуру кариотипа ЭСК после термостресса, вызванного кратковременным повышением температуры в процессе культивирования. В качестве объекта исследования были использованы ЭСК линии С910 (пассаж 15), полученной в Институте цитологии РАН. Выбранный в качестве термического воздействия температурный режим (450 C, 10 мин.) не оказывал летального воздействия на клеточную культуру. После возвращения к нормальным условиям культивирования (37 Со) клетки продолжали пролиферировать. Анализ структуры кариотипа ЭСК С910 проводился с применением метода дифференциальной

81

окраски метафазных хромосом на G-диски. Кариотипирование ЭСК через 24 часа после кратковременного изменения температурного режима (культивирование при 45 Со, вместо 37 Со) наряду с нормальными клетками, доминирующими в популяции, выявило наличие клеток с нарушениями в структуре кариотипа, несвойственными данной культуре в стандартных условиях. Отклонения от нормы были связаны с хромосомными поломками, с появлением специфической двуплечей хромосомы нового типа – изохромосомы, с увеличением частоты встречаемости анеутетраплоидных клеток, природу которых, как и происхождение изохромосомы, связывают с нарушением механизма клеточного деления. Возникшая в результате кратковременнго изменения температурного режима кариотипическая нестабильность рассматривается как генетический фонд кариотипической изменчивости, который при определенных условиях может привести к селективному отбору генетически дефектных клеток. Интересно, что аналогичные хромосомные изменения, в частности хромосомные поломки, наблюдались нами в клетках китайского хомячка (линия CНL V-79 RJK) на первых этапах их селекции на устойчивость к культивированию при повышенной температуре. Важно, что в процессе длительного культивирования варианты с поломками имели селективное преимущество.

Полученные данные позволяют делать вывод о том, что даже кратковременное изменение температурного режима при культивировании ЭСК, сопряженное с дестабилизацией клеточного генома, может стать причиной последующей клеточной трансформации.Работа поддержана грантом ГК № 16.512.11.2191

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ВЫЗЫВАЕТ ИЗМЕНЕНИЕ ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ДОКСОРУБИЦИНУ.

Кожухарова И.В., Веселов Н.В.

Институт цитологии РАН, Тихорецкий пр., д.4, Санкт-Петербург 194164, РоссияE-mail: kojuxarova @ mail . ru

В настоящее время применение эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в клинической практике ограничено из-за недостаточной изученности поведения чЭСК в ответ на любые изменения микроокружения клеток. Необходимо изучение влияния различных стрессовых воздействий не только на чЭСК, но и на их дифференцированные аналоги, так как индукция дифференцировки чЭСК является необходимым условием применения их в трансплантации.Исследовано действие противоопухолевого препарата доксорубицина (ДР) на чЭСК линии С910 (Кожухарова и др,2009) и на, полученные из них путем спонтанной дифференцировки, фибробласты. Показано, что недифференцированные чЭСК имеют более высокую чувствительность к цитотоксическому действию ДР. Порог чувствительности чЭСК (гибель 50% клеток через 24 ч) составляет 0,025 мкг/мл, а для фибробластов 0,1 мкг/мл. Гибель чЭСК происходит путем быстрого запуска апоптоза, тогда как в фибробластах апоптоз не был зарегистрирован. Пороговые концентрации ДР по-разному влияют на пролиферацию недифференцированных и дифференцированных чЭСК. В дифференцированных фибробластах наблюдается длительный цитостатический эффект, а чЭСК через 5 сут возобновляют размножение клеток. Различия в ответе на цитотоксическое действие ДР между чЭСК и полученными из них фибробластами, может быть связано с наличием экспрессии генов abcg2 и p53 в чЭСК и значительном снижении ее при спонтанной дифференцировке.Работа поддержана грантом РФФИ 11-04-12077 офи-м.

82

ПОЛУЧЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ОТ ПАЦИЕНТОВ, СТРАДАЮЩИХ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ (БОЛЕЗНЬ ПАРКИНСОНА, БОЛЕЗНЬ ГЕНТИНГТОНА).

Лебедева О.С. 1, 2, Честков И.В. 2, Некрасов Е.Д. 2, Сюсина М. 2, Васина Е.М. 2, Гривенников И.А. 1, Лагарькова М.А. 2

1 Институт молекулярной генетики РАН, пл . Акад. Курчатова, д.2, Москва 123182, Россия2 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, ул. Губкина, дом 3, Москва 119991, РоссияE-mail: lebedevaolgasergeevna@gmail.com

Нейродегенеративные заболевания широко распространены в человеческой популяции. Болезнь Паркинсона — это хроническое прогрессирующее дегенеративное заболевание центральной нервной системы, клинически проявляющееся нарушением произвольных движений. Болезнь Гентингтона является наследственным аутосомно-доминантным заболеванием и проявляется в виде деменции и двигательных нарушений. Для обоих этих заболеваний характерен летальный исход. В России 1 из 500 человек в общей популяции и 1 из 50 человек в популяции старше 80 лет страдает болезнью Паркинсона. От болезни Гентингтона страдает 5-10 человек из 100000 населения, наибольшее количество больных отмечено в Европе. Медикаментозные методы лечения наследственных нейродегенеративных заболеваний приносят лишь временное облегчение, замедляют развитие болезни, но никак не влияют на её причину. На данный момент наиболее перспективным методом лечения таких недугов представляется клеточная терапия, т.к. она позволяет заменить погибшие и нефункциональные клетки мозга. Отсутствует также и адекватный модельный объект для изучения течения заболеваний и скрининга новых лекарственных препаратов. Новые нейроны для пациентов можно получить из их собственных клеток с использованием технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Такие клеточные культуры могут стать хорошим модельным объектом, поскольку несут в своем геноме мутации, ответственные за развитие болезни. Индуцированные стволовые клетки человека можно получить практически из любой ткани. Для них характерен неограниченный пролиферативный потенциал и плюрипотентность (способность дифференцироваться во все типы клеток взрослого организма). В настоящее время разработаны способы направленной дифференцировки плюрипотентных клеток в различные специфические типы клеток, в том числе и в нейроны. Таким образом, получение культуры, обогащенной зрелыми нейронами до 70-90% вполне возможно.

В нашей лаборатории получение индуцированных плюрипотентных клеток человека из кожи пациентов с болезнью Паркинсона и болезнью Гентингтона осуществляется с помощью лентивирусной трансфекции кожных фибробластов векторами, несущими гены из «коктейля Яманака» Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc. Такой подход позволяет получать клоны, морфологически похожие на эмбриональные стволовые клетки, уже через две недели после инфекции. Далее была проведена характеристика полученных клонов на экспрессию основных маркеров плюрипотентного состояния Oct4, Sox2, Hesx1, Sall1, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA4 (метод ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией, и иммуноцитохимия). Показано, что полученные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки способны

83

дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков. Кроме того, осуществлена направленная дифференцировка в нейрональном направлении.

ИЗМЕНЕНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК МЫШИ ПРИ ПЕРЕХОДЕ ОТ IN VIVO К IN VITRO.

Морозова К.Н, Кизилова Е.А., Мензоров А.Г., Короткевич Е.Ю., Сульдина Л.А., Голубица А.Н., Железова А.И., Киселева Е.В.

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики СО РАН, пр. Акад. Лаврентьева, д. 10, Новосибирск 630090, РоссияE-mail: elka@bionet.nsc.ru

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), получаемые из клеток внутренней массы (ВКМ) бластоцисты, широко используются в фундаментальной биологии и медицине, так как могут дифференцироваться в различные типы клеток. Однако получение стабильных линий ЭСК не всегда удаётся, поскольку клетки первичной культуры, происходящие из ВКМ, могут терять плюрипотентность и необратимо дифференцироваться. До сих пор практически ничего не известно об ультраструктурных изменениях, сопровождающих переход ВКМ в ЭСК в условиях in vitro.

Нами проведен сравнительный анализ структурной организации клеток ВКМ на разных стадиях их культивирования при получении стабильных линий ЭСК. Для получения линий ЭСК мы использовали 15 бластоцист аутбредных гибридов 129хBALB. Клетки получали по протоколу Brija с соавторами (2006). Интактные бластоцисты на сроке 3.5 dpc, бластоцисты после культивирования на фидере (культура фибробластов мыши) (пассаж 0, день 6) и ЭСК второго (день 19) и четвертого (день 25) пассажах анализировали под световым микроскопом, и далее фиксировали для просвечивающей электронной микроскопии (ЭМ). Были получены 3 линии ЭСК: линии MA13 и MA15 имели колонии с морфологией ЭСК; популяция клеток MA14 имела два морфотипа – ЭСК и дифференцированные клетки. ЭМ анализ показал, что клетки ВКМ на большом протяжении тесно контактируют друг с другом и имеют сходное строение: крупное ядро с рыхлым ядрышком и обедненную органеллами цитоплазму с многочисленными полисомами. Для ЭСК характерны также гетерогенная популяция митохондрий с внутренними вакуолями и пучки специфических коротких фибрилл толщиной 15 нм. Популяции клеток, давшие впоследствии линии MA13 и MA15 и линию MA14, существенно отличаются по ряду признаков уже на пассаже 0, что, возможно, связано с присутствием в их составе клеток мурального и полярного трофобласта. Все три исследованные линии на этой стадии содержат гибнущие и гетерогенные по строению клетки, в которых много лизосом и практически не выявляются характерные для бластоцисты митохондрии и фибриллы. Гетерогенность клеток в линии MA14 выше, чем в линиях MA13 и MA15, и эта линия состоит из большого числа уплощённых клеток с многолопастными изрезанными ядрами, содержащими регулярно расположенные вблизи ядерной оболочки глыбки компактного хроматина и обогащенную органеллами цитоплазму. Протяженность контактов между клетками может существенно варьировать. Линии MA13 и MA15 обогащены ЭСК-подобными округлыми клетками, содержащими крупные ядра и обедненную органеллами цитоплазму. В клетках всех линий, как на втором, так и на четвертом пассажах выявленные различия сохраняются. Гетерогенность клеточных популяций снижается, в линиях MA13 и MA15 в направлении преобладания морфотипа ЭСК, а в линии MA14 часть клеток имеет морфотип клеток трофобласта.

84

Таким образом, анализ плюрипотентных клеток ВКМ в процессе культивирования in vitro и образованных из них ЭСК выявил изменение ультраструктурной организации клеток. Показано уменьшение гетерогенности популяции ЭСК при культивировании in vitro.Работа поддержана грантами РФФИ и МКБ РАН

СРАВНЕНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ mpub МЫШИ И hpub ЧЕЛОВЕКА НА МОДЕЛИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ.

Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Хайдарова Н.В., Арсеньева Е.Л., Гривенников И.А.

Институт молекулярной генетики РАН, пл.ак. Курчатова, д.2, Москва 123182, РоссияE-mail: novek-img@mail.ru

Pub относится к семейству TRIM белков. Гены, принадлежащие этому семейству, вовлечены в различные процессы, такие как клеточный рост, дифференцировка и регуляция транскрипции. Известно, что mpub играет важную роль в процессах клеточной дифференцировки, оказывая существенное влияние на активность транскрипционного фактора PU.1, который в свою очередь контролирует дифференцировку клеток гемопоэтического ряда. Совсем недавно было показано, что ген PU.1 участвует в поддержании плюрипотентности ЭС клеток, и начинает действовать на самых ранних этапах дифференцировки клеток.

Целью нашего исследования является изучение функционирования гена pub. Нами созданы экспериментальные модели ЭС клеток мыши с повышенной экспрессией гена hpub человека и повышеной экспрессией гена mpub мыши. Неоспоримым является тот факт, что правильное функционирование трансгена обуславливается не только его стабильной экспрессией, но и регуляцией данного гена на уровне транскрипции РНК, посттранскрипционной модификацией, процессингом, а также трансляцией белка, с тем, чтобы впоследствии обеспечить правильные белок-белковые взаимодействия. Это тем более является актуальным при использовании гетерологичных систем. В виду высокой гомологии генов человека hpub и мыши mpub, мы можем предположить что в результате трансфекции геном человека, в ЭС клетках мыши будет синтезироваться «зрелый» биологичеcки активный белок человека Pub. Для того чтобы проверить наше предположение, мы сравнили действие повышенной экспрессии генов hpub и mpub на культуре трансфицированных ЭС клеток.

В результате проведенных экспериментов было продемонстрировано одинаковое влияние повышенной экспрессии генов hpub и mpub на пролиферацию и образование эмбриоидных тел в культуре ЭС клеток мыши, также продемонстрировано негативное влияние гиперэспрессии этих генов на уровень экспрессии PU.1.

85

УПРАВЛЕНИЕ НЕЙРАЛЬНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКОЙ СТВОЛОВЫХ/ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК.

Павлова Г.В., Ревищин А.В.

Институт биологии гена РАН, Москва, Россия, ООО «ИМТК», Москва, Россия E-mail: lkorochkin @ mail . ru

Открытие стволовых клеток в нервной системе вызвало переоценку целого ряда устоявшихся представлений, в особенности касающихся восстановительных процессов в центральной нервной системе. Было обнаружено, что нейральная стволовая клетка, продуцирует прогениторные мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в нейроны, астроциты или олигодендроциты. На этом основаны надежды использовать стволовые и прогениторные клетки для терапии нейродегенеративных заболеваний. Важнейшим вопросом применения клеточного материала и в частности стволовых клеток в восстановительной медицине является направленная дифференцировка этих клеток. Направленность дифференцировки нейральной клетки в организме зависит от сигналов окружающих клеток. Нейрогенез клеток-предшественников зависит от трех условий: 1) от экспрессии собственных генов и от экспрессии генов окружающих клеток; 2) от ниши, в которой поддерживается стволовой статус клетки (эффект ниши); 3) от гормонального статуса организма. Материал, используемый для генно-клеточной терапии, наращивают и готовят к трансплантации в условиях культуры, где клетки лишены специфического влияния тканевого окружения, а стволовые клетки оказываются вне ниши, поддерживающей их статус. Наращивание клеточного материала сопровождается стимулированием пролиферации, что также нарушает процесс дифференцировки. Возможность управления дифференцировкой позволит снизить опасность образования тератом при трансплантациях, повысить жизнеспособность трансплантата и снизить плотность глиоза.Существует несколько способов управления дифференцировкой клеток в культуре, например: 1) ко-культивирование с клетками, синтезирующими необходимые факторы; 2) использование кондиционных сред для индукции; 3) использование отдельных индукторов (например, ретиноевой кислоты или нейротрофических факторов); 4) получение трансгенных клеток, синтезирующих индуцирующие факторы. В работе проанализированы все четыре способа управления нейральной дифференцировки прогениторных клеток. В ходе исследований отдельных индукторов было показано, что оптимальным вариантом было использование BDNF в сочетании с 5-азацитидином. Работа проводилась на стромальных клетках жировой ткани человека и мыши. Индуцированные клетки экспрессировали нейрональные маркеры и были более жизнеспособны после трансплантации в мозг подопытных животных, чем исходные клетки. При исследовании управления нейральной дифференцировкой при помощи трансгенных клеточных культур был выбран фактор GDNF. В мозге подопытных животных, которые прожили 18 дней после трансплантации, глиальная реакция в контрольной группе значительно превышала реакцию в опытной группе. Результаты подтверждают перспективность применения GDNF в качестве нейропротектора в тканевой терапии. Наиболее продуктивным мы считаем создание многокомпонентных генетических конструкций, содержащих несколько терапевтических факторов, усиливающих действие друг друга. Другим аспектом дальнейших разработок будет использование управляющих элементов, включающих экспрессию трансгенов в ответ на внешний сигнал и/или на патологическое состояние тканевого окружения. Работа выполнена при поддержке грантов ГК16.512.11.2100, РФФИ 11-04-01157-а, 11-04-00790-

86

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОРФОГЕННЫХ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ НЕМОРФОГЕННЫХ КАЛЛУСОВ ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ.

Румянцева Н.И.

Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, ул. Лобачевского, д.2/31, Казань 420111, РоссияE-mail: nat_rumyantseva@mail.ru

Эмбриоидогения является одним из основных типов гомофазной вегетативной репродукции цветковых растений, как in vivo, так и in vitro. Отличительной особенностью эмбриоидогенных, т.е. способных формировать эмбриоиды, каллусов большинства видов растений является присутствие в них проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК) – структур, из отдельных клеток которых формируются эмбриоиды. Морфогенный каллус гречихи татарской F.tataricum (L.) Gaertn. согласно морфологическим характеристикам является типичной эмбриоидогенной культурой. Он представлен ПЭКК, находящимися на поверхности мягкого каллуса-няньки, который образуется при циклическом разрыхлении ПЭКК и образован не делящимися, но метаболически активными клетками. Уникальной особенностью морфогенных каллусов F. tataricum является то, что они сохраняют морфологическую стабильность и способность формировать эмбриоиды в течение длительного времени культивирования (8-10 лет), а также характеризуются диплоидными хромосомными числами. Клетки ПЭКК имеют небольшие межклетники и тонкие клеточные стенки с большим количеством плазмодесм. Слои клеток в ПЭКК организованы по позиционному принципу, отличаются метаболической направленностью и имеют характерную ультраструктуру. Неморфогенные каллусы появляются на морфогенных очень редко в виде единичных рыхлых новообразований, что может свидетельствовать об их моноклональной природе, и первоначально отличаются медленным ростом. Рыхлые каллусы сформированы отдельными колониями паренхимоподобных клеток, которые разделены большими межклетниками. Частота их образования не зависит от возраста морфогенной культуры. Уже на стадии инициации для неморфогенных клонов характерны полиплоидия и анеуплоидия, а также аномалии деления в виде мостов и фрагментов. Клетки могут иметь два ядра разного размера. Ядра всегда сильно лопастные, часто содержат несколько ядрышек. После отделения от материнской культуры и пересадки на свежую среду рост неморфогенного клона значительно увеличивается и в дальнейшем по нарастанию биомассы в 4-5 раз превышает рост морфогенного каллуса. Показано, что в отличие от морфогенных культур рост неморфогенных не зависит от содержания в среде культивирования источника органического азота - гидролизата казеина. Установлено, что новообразование рыхлых клонов в морфогенных каллусах может быть индуцировано колхицином и ингибитором везикулярной секреции брефельдином А. Выявлено, что неморфогенные каллусы по сравнению с морфогенными менее устойчивы к агентам, вызывающим окислительный стресс. Анализируется изменение структуры и состава экстраклеточного матрикса, состава внутриклеточных и внеклеточных белков, полифенолов, изменение редокс-статуса клеток в неморфогенных каллусах по сравнению с морфогенными. Обсуждаются возможные механизмы образования неморфогенных клонов и длительного поддержания эмбриоидогенной способности в каллусах F.tataricum. Работа была поддержана грантом РФФИ-Поволжье № 09-04-97039-а.

87

REPROGRAMMING MEDIATED BY CELL FUSION TECHNOLOGY.

Serov O. L., Matveeva N.M., Khabarova A.A.

Institute of Cytology and Genetics, Academy of Sciences of Russia Siberian Branch,Lavrentiev Avenue, 10, Novosibirsk 630090, RussiaE-mail: serov@bionet.nsc.ru

This review is focused on recent advances in fusion-based reprogramming of cells of different pluripotent statuses or lineage origins. Recent findings are discussed from standpoints of both the developmental potency of hybrid cells generated by fusion of pluripotent embryonic stem (ES) cells, embryonal carcinoma (EC) cells and somatic cells as well as epigenetic mechanisms and other aspects involved in the reprogramming process. Complete reprogramming occurs at least 5-7 days after fusion and includes at least two steps: i) initiation at the heterokaryon stage and choice of the direction of reprogramming using an “all-or-none principle” to establish the dominance of one parental genome, and ii) “fixation” of the newly acquired expression profile by epigenetic mechanisms. The first step is realized without cell division, whereas the second requires cell proliferation. Reprogramming in hybrid cells is rapid and complete. Thus, cell fusion is a powerful tool for reprogramming.

ГЕННО-КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ.

Ткачук В.А.

Факультет фундаментальной медицины МГУ имни М.В.Ломоносова E-mail: tkachuk@fbm.msu/ru

МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЧЕРЕЗ ЩЕЛЕВЫЕ КОНТАКТЫ ПРИ РЕПРОГРАММИРОВАНИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА.

Шаровская Ю.Ю.1, Филоненко Е.С.2, Киселёв С.Л.2, Лагарькова М.А.3

1Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ, Ленинские горы, Москва, 119991, Россия.2НИЦ Курчатовский институт, пл. Акад. Курчатова, д.1, Москва, 123182, Россия.3Институт общей генетики им. Вавилова РАН, ул. Губкина д.3, Москва, 119991, Россия.

E-mail: len_soap@mail.ru

Одним из важных элементов при локальном межклеточном взаимодействии являются щелевые контакты (ЩК), которые обеспечивают диффузионную связь между соседними клетками. ЩК играют важную роль в процессах эмбрионального развития. Плюрипотентные клетки, культивируемые in vitro, представляют собой удобную модельную систему для установления роли ЩК в процессах дифференцировки. Ранее было показано, что эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) имеют функциональные ЩК. Недавно путём прямого репрограммирования соматических клеток до

88

плюрипотентного состояния был получен новый тип плюрипотентных клеток – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК). Мы проанализировали изменение в межклеточном взаимодействии через ЩК в чЭСК и иПСК и показали, что как чЭСК, так и иПСК, культивируемые в бесфидерных условиях, обладают сходным высоким уровнем диффузионной связи через ЩК. Однако не полностью репрограммированные клоны иПСК имеют более низкий уровень взаимодействий через ЩК, который восстанавливается при «дорепрограммировании». Наши данные свидетельствуют о том, что присутствие функциональных ЩК—дополнительная физиологическая характеристика репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния. Также мы показали, что дифференцировка плюрипотентных клеток ведёт к разрушению взаимодействий через ЩК между популяциями плюрипотентных и дифференцированных клеток, однако, взаимодействие через ЩК восстанавливается впоследствии de novo внутри отдельных гистотипов.

МОДЕЛЬНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ДО ПЛЮРИПОТЕНТНОГО СОСТОЯНИЯ.

Шутова М.В . 1 , Сурдина А.В. 2, Лагарькова М.А.1, Киселев С.Л. 2

1Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, ул. Губкина, дом 3, Москва 119991, Россия2НИЦ "Курчатовский институт", пл. Академика Курчатова, дом 1, Москва 123182, РоссияЕ-mail: mashutova@gmail.com

С момента получения первых стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью было репрограммировано много различных типов клеток человека. Однако, до сих пор остается невыясненным вопрос о том, насколько репрограммированные соматические клетки человека разных типов идентичны эмбриональным стволовым клеткам человека, и какая стратегия репрограммирования должна быть выбрана для каждого типа дифференцированных клеток человека. Для того, чтобы выяснить, насколько точно дифференцированные клетки человека возвращаются к своему плюрипотентному состоянию на молекулярном и физиологическом уровнях и разработать протоколы репрограммирования различных специализированных типов клеток, мы создали оригинальную модельную систему. Для этого были получены линии ЭСК человека, которые содержат необходимые для репрограммирования транскрипционные факторы под контролем доксициклин-индуцибельных промоторов. Для проверки точности репрограммирования дифференцированных клеток человека до плюрипотентного состояния, полученные линии ЭСК были дифференцированы в различные специализированные типы клеток (нейрональные, фибробластные, клетки зародышевого пути, и т.д.). Популяции дифференцированных клеток были обработаны доксициклином для индукции транскрипционных факторов плюрипотентности. Полученные индуцированные плюрипотентные клетки были проанализированы на функциональное и молекулярное сходство с аутологичными линиями ЭСК человека.

89

СПИСОК АВТОРОВ

Cheroutre H. 32Danilevskaya O.N. 32 Eckmann L. 32Grivennikov S., 32Jauch D. 32Karin M. 32Khabarova A.A. 88Matveeva N.M. 88Meng X. 32Mucida D. 32Muszynski M.G. 32Serov O. L. 88Wang K. 32Yu G-Y. 32

Авдеев С.С. 34Агаронян К.М. 30Акулов А.Н. 29Александрова М.А. 76Алексеенко Л.Л. 81Алиева А.Х. 48Альховский C.В. 19Андреева Е.Р. 80Андреева Л.Е. 43,55Андронова Н.В. 17Антонов С.А. 77Апанович Н.В. 35Арешков П.А. 34Арман И.П. 41Арсеньева Е.Л. 77,85Арутюнова М.А. 19

Бавыкин А.С. 35Баклаушев В.П. 34Балынская Е.В. 34Барсков И.В. 66Белицкий Г.А. 18Белоусов А.И. 51Бондаренко Е.А. 25Бочков Н.П. 27,79Брылев Л.В. 66Будунова И.В. 68Буланенкова С.С. 41Буравкова Л.Б. 78,80Бурьянов Я.И. 53Быковская О.С. 17Васина Е.М. 83Вебер-Лотфи Ф. 56

Верховская Л.В. 66Веселов Н.В. 82Викторов И.В. 66Виноградова М.С. 79Виноградова Т.В. 67Воронина Е.С. 23,27,79Воротеляк Е.А. 46Воротников А.В. 30Высоцкая О.Н. 28

Гасанов Е.В. 31,36Генинг Л.В. 39,55Георгиев Г.П. 38Гершович П.М. 78Гершович Ю.Г. 78Гибадулин Р.А. 19Голубица А.Н. 84Гончар А.Л. 22Гончарова Р.И. 26Горностаева А.Н. 71,80Горшков О.В. 29Гривенников И.А. 40,77,83,85Гринчук Т.М. 81Грицай А.Н. 35Грязнов С.В. 62Гуляева Н.В. 65,73

Данцевич О.Н. 33Деев Р.В. 62Дейнеко Е.В. 56Демидюк И.В. 74Дерюгина Л.А. 49Диетриш А. 56Долгих Ю.И. 28,57Долотов О.В. 40Домнина А.П. 81Доронина О.А. 17

Емельянов А.Ю. 68Ермакова Т.А. 63Ефремова А.С. 39

Жаворонков А.А. 64Железова А.И. 84Жур К.В. 22

90

Завадский С.В. 35Завалишин И.А. 66Зарецкая Н.В. 17Захарова М.Н. 66Захарченко Н.С. 53Зацепина О.В. 37Земелько В.И. 81Зенит-Журавлева Е.Г. 35Зозуля Ю.А. 34Зудина И.В. 49

Иванов А.Д. 65,73Иванова Е.В. 49Иллариошкин С.Н. 48,66Ильинских Е.Н. 24Ильинских И.Н. 24Иноземцева Л.С. 40Исаев А.А. 62Исмаилов Ш.М. 66Итальянская Ю.В. 60

Кавсан В.М. 34Казаков А.А. 55Какпакова Е.С. 44Калинин Р.Е. 62Калитин Н.Н. 50Каляева М.А. 53Кантор Ч. 64Карабанов А.В. 48Карамышева А.Ф. 50Карпухин А.В. 35Картель Н.А. 57Катломина Н.М. 36Катосова Л.Д. 23Катышев А.И. 56Кашурников А.Ю. 35Кизилова Е.А. 84Кирсанов К.И. 18,68Киселёв С.Л. 62,88,89Киселева Е.В. 84Клименко Е.С. 56Ковалева Г.В. 43Ковалицкая Ю.А. 54Ковнацкий И.О. 35Кожухарова И.В. 82Козикова Л.В. 55Колесов А. 64Колодей С.В. 63Колотвин А.В 19Константинов Ю.М. 56Копанцев Е.П. 67

Кордюкова М.Ю. 37Коротаева А.А. 35Короткевич Е.Ю. 84Костюкова М.Н. 50Кошелев Ю.А. 38Красный С.А. 26Кузьмич А.И. 67Кулешов Н.П. 79Кулешова Е.П. 65,73Кулинченко М.В. 56Кульбачинский А.В. 68Кундас Л.А. 22Куст Н.Н. 72

Лавров А.В. 27Лагарькова М.А. 83,88,89Лактионов П.П. 56Лахин А.В. 39Лебедев В.Г. 54Лебедева О.С. 77,83Левандовская А.А. 42,51Левицка И.В. 20Лесовая Е.А. 18,68Леусенко П.А. 31Лимборская С.А. 25Логунов Д.Ю. 47,66

Лощенова П.С. 21Лунина Н.А. 74Любченко Л.Н. 35

Макарова А.В. 55Макарова И.В. 43,55Макашова В.В. 19Максимов В.В. 41Малашевич П.Н. 22Малышева М.М. 37Мануилова Е.С. 77,85Маркевич В.А. 65Марков Д.Д. 40Мартыненко А.В. 41Матвеев В.Б. 35Меклер A.А. 34Мензоров А.Г. 84Мжаванадзе Н.Д. 62Милешина Д.В. 56Мисюрин А.В. 63Михайлов В.С. 41Михайлова Е.А. 63Михайлова Т.В. 42Моисеева Н.И. 52Моралева А.А. 37Морозов Я.И. 30

Морозова К.Н. 84Москалев А.А. 43Моссэ И.Б. 22Моссэ К.А. 22Моссэ Н.И. 22

Народицкий Б.С. 47,66Некрасов Е.Д. 83Ненашева В.В. 43,55Нерсесян Е.Г. 62Никитина В.А. 23,79Николаев Л.Г. 41Николаева Л.И. 19Никольский Н.Н. 81Новосадова Е.В. 43,85Носова О.Н. 60

Овчинников Л.П. 52Орлова Е.В. 57Осипова Е.С. 28,57

Павлова Г.В. 72,86Панищева Л.А. 44Пашковский П.П. 45Петерс М.В. 35Платонова В.И. 23Плюснина Е.Н. 43Подрезов А.С. 54Ползиков М.А. 37Посохин А.В. 55Потапов В.К. 41Прасолов В.С. 69,70Прокофьева М.М. 69,70Прохорчук А.В. 59

Радюкина Н.Л. 45Ралдугина Г.Н. 58Ратушняк Я.И. 20Рафиева Л.М. 31,36Ревищин А.В. 86Риппа А.Л. 46Рожкова Д.В. 49Ролевич А.И 26

Роцкая У.Н. 21Рощина М.П. 74Рудимов Е.Г. 71Румянцева Н.И. 29,87Рутман Б.К. 17Рыбалкина Е.Ю. 44,52

Сайдакова Е.В. 23Саложин С.В. 42,51,65,73

Самохвалов Е.И. 19Самоходская Л.М. 19Сафина Д.Р. 77Свердлов Е.Д. 41Семенов А.Г. 24Семенов А.Г. 24Семеняков А.В. 22

Синицина О.И. 21Скаковская Е.С. 31Скворцова В.И. 25Сломинский П.А. 25Смаль М.П. 26Смирнихина С.А. 27Соловьева А.И. 28Сошинкова Т.Н. 45Ставровская А.А. 44,52Староверов И.Н. 62Степаничев М.Ю. 65,73Степанов О.А. 70Степанова А.Ю. 57Стромская Т.П. 52Сульдина Л.А. 84Сурдина А.В. 89Сырцев А.В. 35Сюсина М. 83

Тарантул В.З. 33,39,41,43,55,66Таратина О.В. 19Терешонок Д.В. 57Терских В.В. 46Ткачук В.А. 30Толынева Д.В. 72Туманова Л.Г. 20Тупицын Н.Н. 50Тутыхина И.Л. 66Тухбатова Г.Р. 65,73Тухватулин А.И. 47Тюляндин С.А. 35Тюрин-Кузьмин П.А. 30

Узаков Ш.С. 65

Фёдорова И.А. 49Филатова Е.В. 48Филоненко Е.С. 88

Хайдарова Н. В. 43,55,77,85Хоанг Тхи Жанг 58Холодий Г.Я. 33

Цветаева Н.В. 63Цыба Н.Н. 63

Чаушева А.И. 23Червяков Ю.В. 62Чередникова Е.А. 24Черникова В.В. 56Чернов В.М. 29Черняев В.М. 35Честков И.В. 83Чехонин В.П. 34

Шадрина М.И. 48Шаровская Ю.Ю. 88Швальб П.Г. 62Шестибратов К.А. 54Шилина М.А. 81Шишова К.В. 37Шмагель К.В. 23

Шмаков В.Н. 56Шмаров М.М. 66Шрам С.И. 39Шубенков А.Н. 71Шубин А.В. 36,74Шубин В.П. 35Шумская В.С. 59Шутова М.В. 89

Эльконин Л.А. 60

Юткин Е.В. 17

Яковенко С.А. 17Якубовская М.Г. 18,68Яценко К.А. 40